CN102775413B - 氨基取代吴茱萸次碱类似物及其合成方法与在制备抗肥胖症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，提供了一种氨基取代吴茱萸次碱类似物及其合成方法与在制备抗肥胖症药物中的应用。实验证明，本发明提供的氨基取代吴茱萸次碱类似物能够显著减少3T3-L1脂肪细胞的脂肪蓄积，并能减少高果糖诱导的FAO大鼠肝细胞的脂肪蓄积。细胞水平的试验表明该类化合物能减少脂肪积累，具有减轻肥胖症状和缓解脂肪肝的作用。所述氨基取代吴茱萸次碱类似物的化学式如下所示，式中R0=-NH(CH2)nR2，n=1、2、3、4或5，R2=-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、环戊胺基或环己胺基；或者R0=吗啉基、哌嗪基或甲基哌嗪基。

Description

氨基取代吴茱萸次碱类似物及其合成方法与在制备抗肥胖症药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及氨基取代吴茱萸次碱类似物及其合成方法与在制备抗肥胖症药物中的应用。
背景技术
肥胖症，是一种由于机体能量过剩和低活动量引起的长期能量摄入和能量消耗不平衡导致的临床代谢性疾病。世界卫生组织规定：体重指数(BMI即体重除以身高的平方)≥ 30kg/m2时即为肥胖。肥胖是导致2型糖尿病和心血管疾病等的重要原因。因此，肥胖症及其并发症已成为严重威胁人类健康和生活质量的世界性公共卫生问题。
由于生活方式和饮食结构的改变，近年来，肥胖症患者逐年增多。2005年世界卫生组织评估结果显示，全球成年超重和肥胖患者分别为16亿和4亿，预计到2015年上述两项数据将分别上升到23亿和7亿。在全球肥胖症快速发展的情况下，相关治疗药物的发展相对滞后，目前在全球范围内正式获准临床应用的抗肥胖药物仅有三个。其中两个是去甲肾上腺素能药物盐酸芬特明(phentermine hydrochloride)和盐酸安非拉酮(diethylpropion  hydrochloride)，另一个是脂酶抑制剂奥利司他(orlistat/Xenical, Alli)。可供选择的药物不仅数量少，且还存在疗效有限、长期服用的安全性问题和停药后体重易反弹等缺陷。因此，临床迫切需要有新的更有效、更安全的抗肥胖症药物。
肥胖症的发生与遗传和环境因素有关，发病机制具有多样性和复杂性。目前的研究认为，过度的脂肪生成和体内脂肪氧化能力的下降是导致肥胖的两个重要原因。因此在研究如何抑制脂肪生成或者提高脂肪酸氧化能力，从而减少脂肪蓄积的基础上，寻找和开发出新的抗肥胖症药物，是目前的研究热点之一。
吴茱萸是一种传统中药，是芸香科植物吴茱萸将近成熟的果实，始载于神农本草经，主要用于治疗胃肠道疾病、高血压、心绞痛、风湿性关节炎等。吴茱萸中含有多种生物碱、柠檬苦素、挥发油等。吴茱萸次碱(rutaecarpine, Rut，R1)是存在于吴茱萸中的一种吲哚喹唑啉类生物碱。近年来，国内外学者证明吴茱萸次碱具有抗胃黏膜损伤、抗炎镇痛、降血压、松弛血管等广泛的药理作用。
发明人研究发现，吴茱萸次碱能减少细胞的脂肪蓄积。但该化合物水溶性差，在水中的溶解度仅有0.05±0.02μg/m，导致口服吸收差，生物利用度低，这将会限制它在肥胖症治疗上的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基取代吴茱萸次碱类似物及其合成方法，以及该类化合物在制备抗肥胖症药物中的应用。
发明人在吴茱萸次碱结构基础上进行了结构修饰和优化研究，发现了活性更好、生物利用度更高的吴茱萸次碱类似物。本发明所涉及的吴茱萸次碱类似物（式I），其结构特征是将吴茱萸次碱结构中C环的六元环结构改为五元环，然后再在8位上引入不同的氨基侧链。药理学试验证明，式I化合物减少脂肪蓄积能力比吴茱萸次碱更强，而且成药性更好。
为达到上述目的，本发明提供的氨基取代吴茱萸次碱类似物的化学式如式I所示（以下简称为式I化合物）：
式I
式I中,  
R0 = -NH(CH2)nR2 ，n = 1、2、3、4或5，R2 = -N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、环戊胺基或环己胺基；或者，R0 = 吗啉基、哌嗪基或甲基哌嗪基。
本发明还提供了上述氨基取代吴茱萸次碱类似物的制备方法。
合成过程如下：
 
具体的制备方法步骤为：邻氨基苯甲酰胺1与原丙酸三乙酯反应（加热回流反应），得到化合物2。化合物2经溴化后得到化合物3。化合物3再与苯肼反应得到化合物4。化合物4经多聚磷酸缩合得到化合物5。化合物5经环合氯代后得到化合物6。化合物6再与不同的取代胺化合物反应，得到目标产物7（式1化合物）。
优选地，上述制备方法中的取代胺化合物为HR0，R0 = -NH(CH2)nR2，n = 1、2、3、4或5，R2 = -N(CH3)2、-N(CH2CH3)2、环戊胺基或环己胺基；或者R0 = 吗啉基、哌嗪基或甲基哌嗪基。
优选地，制备化合物4时，化合物3与苯肼的摩尔比为1：2~6。
优选地，化合物5在室温下与三氯氧磷反应，经环合氯代后得到化合物6。
上述制备方法的目标产物通过柱层析进行纯化。
本发明还提供了上述氨基取代吴茱萸次碱类似物在制备抗肥胖症药物中的应用。同时还能够用于制备抗脂肪肝以及由肥胖诱发的糖尿病和心血管疾病的药物。
通过细胞实验表明，本发明的氨基取代吴茱萸次碱类似物（式1）不仅能减少3T3-L1小鼠脂肪细胞的脂肪蓄积，还能减少高果糖诱导的FAO大鼠肝细胞的脂肪蓄积。这提示吴茱萸次碱类似物可能不仅能通过抑制脂肪生成来减少脂肪蓄积，还能通过促进脂肪酸的氧化的途径来减少脂肪积累。
本发明还提供了一种抗肥胖药物，该类药物具有减少脂肪积累、减轻肥胖、缓解脂肪肝等功效。该类化合物可用于治疗肥胖症以及肥胖引起的糖尿病、心血管疾病等相关疾病。该类药物含有上述的氨基取代吴茱萸次碱类似物以及药学上可接受的辅助剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服，经皮，静脉或肌肉注射。 
附图说明
图1：实施例10吴茱萸次碱R1和式I化合物对3T3-L1细胞的脂肪蓄积的影响（化合物浓度1μM）。
图2：实施例10吴茱萸次碱R1和式I化合物（R17、R18）浓度依赖性地减少3T3-L1细胞的脂肪蓄积；化合物浓度R1为0, 0.3, 1, 3, 10, 15μM ; R17和R18为0, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3μM；为方便作图，设0μM为0.0001μM。
图3：实施例10，细胞分化的第六天（Day6）显微镜4倍镜的视野下，基础对照组BM，DMSO空白对照组DM，以及不同药物组的细胞的形态。
图4：实施例10，15μM R1，R17和R18与细胞孵育6天（每三天换一次液），在第六天（Day6）用显微镜拍照所得图片；图中针状物为从培养基中析出来的R1固体。
图5：实施例11吴茱萸次碱R1和式I化合物（R17）浓度依赖性地减少了高果糖诱导的FAO大鼠肝细胞脂肪蓄积；化合物浓度R1为0, 0.3, 10, 20 μM ; R17为0, 0.1, 0.3, 10μM；为方便作图，设0μM为0.0001μM。
图6：化合物R1、R17、R18与细胞孵育24 h后用显微镜拍照所得图片，图中针状物为从培养基中析出来的R1固体。
具体实施方式
实施例1: 化合物2的合成
在10 ml的原丙酸三乙酯中加入0.01mol 邻氨基苯甲酰胺，155℃加热回流12h后，冷却至0℃静置 1～2h，小心滤取结晶，用少量的乙醇洗涤，真空干燥后得到白色针状结晶2。
产率：71% ； 1H-NMR (400 MHz, DMSO)δ(ppm)：12.12 (s, 1H), 8.08 (dd, J = 7.9, 1.4, 1H), 7.83–7.73 (m, 1H), 7.60 (d, J = 8.1, 1H), 7.51–7.41 (m, 1H), 2.62 (q, J = 7.5, 2H), 1.25 (t, J = 7.5, 3H)；ESI-MS m/z：175 [M+H]+.
化合物2。
实施例2: 化合物3的合成
将0.01mol化合物2和0.01mol乙酸钠溶解在 120ml的乙酸中，加热至60℃，一边加热，一边缓慢滴加溶有0.01mol液Br2的10ml乙酸溶液。滴加完后，反应液继续搅拌至反应液中液Br2的棕色消失（大约 3h），将反应液倒入300ml冰水中，产生大量白色的沉淀，滤取沉淀，真空干燥后得到白色的固体3。
产率：69%； 1H-NMR (400 MHz, DMSO)δ(ppm)： 12.46 (s, 1H), 8.16 – 8.09 (m, 1H), 7.87–7.80 (m, 1H), 7.69 (d, J = 8.1, 1H), 7.55 (t, J = 7.5, 1H), 5.10 (q, J = 6.8, 1H), 2.01 (d, J = 6.8, 3H)；ESI-MS m/z：253 [M+H]+.
化合物3。
实施例3: 化合物4的合成
将0.01mol化合物3和0.04mol苯肼溶解在80ml的乙醇中，加热回流10h，反应液冷却后产生大量的橙色的棉花状固体，滤取沉淀，用少量乙醇洗涤后干燥，再用乙醇重结晶后得到橙色的固体4。
产率：82%； 1H-NMR (400 MHz, DMSO)δ(ppm)：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.46 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 8.13 (dd, J = 7.9, 1.1, 1H), 7.85–7.76 (m, 1H), 7.67 (d, J = 8.1, 1H), 7.58 (d, J = 8.2, 2H), 7.48 (t, J = 7.5, 1H), 7.28 (t, J = 7.8, 2H), 6.89 (t, J = 7.3, 1H), 2.35 (s, 3H)；ESI-MS m/z：279 [M+H]+.
化合物4。
实施例4: 化合物5的合成
将0.0036mol化合物4加入到5ml的 PPA（多聚磷酸）中搅拌，加热到150℃持续搅拌2h 后，反应液倾入到50 ml水中产生大量墨绿色的沉淀，用KOH调节pH约为7，滤取沉淀，得到墨绿色粉末固体5.
产率：69%； 1H-NMR (400 MHz, DMSO)δ(ppm)：12.47 (s, 1H), 11.79 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.85 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.70–7.63 (m, 2H), 7.52 (dd, J = 18.3, 7.9 Hz, 2H), 7.23 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 7.4 Hz, 1H)；ESI-MS m/z：262.1[M+H]+.
化合物5。
实施例5: 化合物6的合成
在N2 保护的条件下，在0℃时将0.011molPOCl3滴加到25mlDMF中形成粘稠的黄色溶液，然后滴加0.01mol化合物5与DMF的混合液，0℃时大约滴加0.5h，然后室温搅拌反应24h，反应液倒入300ml冰水中，产生黄色固体，抽滤干燥后得棕黄色固体，粗品用氯仿柱层析，得到黄色固体6。
产率：30%；1H-NMR (400 MHz, DMSO)δ(ppm)：1H NMR (400 MHz, DMSO)δ12.77 (s, 1H), 11.22 (s, 1H), 8.36 (d, J = 8.3, 1H), 8.31 (d, J = 7.9, 1H), 8.26–8.11 (m, 2H), 7.97–7.89 (m, 1H), 7.68 (d, J = 8.2, 1H), 7.36 (t, J = 7.6, 1H), 7.28 (t, J = 7.5, 1H), 1.23 (s, 1H)；ESI-MS m/z：308.1[M+H]+.
化合物6。
实施例6: 化合物R15的合成
将0.001mol化合物6加入到10 ml的甲苯中，吸取100 μL的三乙胺，650 μl的1-甲基哌嗪加入到反应液中，加热回流6h，停止反应后冷却至室温，蒸除甲苯，用氯仿/甲醇（15:1）柱层析纯化后得到棕黄色固体粉末R15。
产率：60%； 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ(ppm)：11.41 (s, 1H), 10.07 (s, 1H), 8.53 (d, J = 7.6, 1H), 7.91 (t, J = 8.5, 2H), 7.78 (d, J = 7.4, 1H), 7.50–7.45 (m, 2H), 7.31 (dd, J = 16.6, 8.1, 2H), 3.88 (s, 4H), 2.68 (s, 4H), 2.40 (s, 3H)；ESI-MS m/z：371[M+H]+.
化合物R15。
实施例7: 化合物R16的合成
将0.001mol化合物6加入到10 ml的甲苯中，吸取100 μL的三乙胺，350 μl的吗啡啉加入到反应液中，加热回流6h，停止反应后冷却至室温，蒸除甲苯，用氯仿/甲醇（10:1）柱层析纯化后得到棕黄色固体R16。
产率：62%； 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ(ppm)：11.41 (s, 1H), 10.03 ( s, 1H), 8.53 (d, J = 7.7, 1H), 7.94 (dd, J = 16.6, 8.3, 2H), 7.80 (t, J = 7.6, 1H), 7.53–7.47 (m, 2H), 7.35 (dd, J = 18.0, 7.4, 2H), 3.99–3.95 (m, 4H), 3.87–3.82 (m, 4H)；ESI-MS m/z：359[M+H]+.
化合物R16。
实施例8: 化合物R17的合成
将0.001mol化合物6加入到10 ml的甲苯中，吸取100 μL的三乙胺，650 μl的3-二甲胺基丙胺加入到反应液中，加热回流6h，停止反应后冷却至室温，蒸除甲苯，用氯仿/甲醇（15:1）柱层析纯化后得到棕黄色固体R17。
 产率：51%； 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ(ppm)：11.42 (s, 1H), 10.14 (s, 1H), 9.08 (s, 1H), 8.46 (d, J = 8.5, 1H), 7.76 (d, J = 8.3, 1H), 7.66 (t, J = 7.6, 1H), 7.56 (d, J = 8.1, 1H), 7.38 (dt, J = 6.8, 3.5, 2H), 7.24 (td, J = 13.0, 6.9, 5H), 3.75 (dd, J = 10.1, 5.5, 2H), 2.63–2.52 (m, 2H), 2.36 (s, 6H), 1.91–1.80 (m, 3H)；ESI-MS m/z：374[M+H]+.
化合物R17。
实施例9: 化合物R18的合成
方法同实施例6，所不同的是用3-二乙胺基丙胺代替3-二甲胺基丙胺，产物为棕黄色固体粉末R18。
产率：56%； 1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ(ppm)：11.48 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 9.04 (s, 1H), 8.52 (d, J = 7.5, 1H), 7.82 (d, J = 8.3, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.48 (d, J = 7.5, 2H), 7.35–7.29 (m, 2H), 5.30 (s, 1H), 4.01–3.68 (m, 2H), 2.85–2.69 (m, 4H), 1.97 (s, 2H), 1.25 (s, 2H), 1.31–1.09 (m, 6H)；ESI-MS m/z：402[M+H]+.
化合物R18。
以上所述的化合物2、3、4、5、6为中间产物，化合物R15、R16、R17、R18为目标氨基取代吴茱萸次碱类似物。
实施例10: 应用3T3-L1小鼠脂肪细胞模型，采用显微镜拍照以及甘油三酯含量测定试剂盒分析，在体外评价吴茱萸次碱 R1和式I化合物（R17、R18）对减少细胞脂肪蓄积的作用。
实验步骤：
该实验设定基础对照组BM，DMSO空白对照组DM，以及不同的药物组R1（吴茱萸次碱）组，R17组，R18组。具体操作如下：
将3T3-L1前脂肪细胞接种于48孔板。先用基础培养基培养，直至细胞接触抑制。两天后（Day0），加分化培养基诱导分化培养3天，然后（Day3）换成分化后培养基再培育3天（Day6）。药物组在Day0和Day3时，将相应药物稀释于新鲜的培养基，一同加入。而基础对照组以及DMSO空白对照组则加入相应量的DMSO。在Day6时用显微镜（4倍物镜）进行拍照以及用试剂盒进行甘油三酯含量分析。
（1）溶液配制和药物稀释：
药物溶液：溶于二甲亚砜（DMSO，dimethylsulfoxide），配成10mM浓度，-20℃低温冰箱保存，临用时用相应培养液稀释至所需浓度，使DMSO终浓度小于或等于0.1%（v／v）。
基础培养基：DMEM高糖培养基+10%新生牛血清
分化培养基：基础培养基中添加三联诱导剂0.5mM异丁基-甲基-黄嘌呤，1ng/ml地塞米松，2μg/mL胰岛素
分化后培养基：基础培养基中添加2μg/mL胰岛素
(2) 甘油三酯含量分析
上述细胞弃去培养基，用PBS清洗2次，加入50mM氢氧化钾溶液在60℃加热10min，使细胞充分裂解，匀浆细胞悬液，按甘油三酯测定试剂盒的使用说明测定甘油三酯的含量。
甘油三酯含量分析的最终结果以“100%对照”方式表示(即是（药物组的甘油三酯含量/对照组的甘油三酯的含量）*100%)。为了便于作浓度响应图，DMSO空白对照组的药物浓度为0μM设定为0.0001 μM。实验结果为三次独立实验的平均值。
评判标准：
药物组的甘油三酯含量，若比DMSO空白对照组的有所降低，并且两组数据在统计学上存在显著性差异，则说明该化合物能够减少3T3-L1脂肪细胞的脂肪蓄积。
实验结果：
图1中，DM是DMSO空白对照组，代表正常分化的细胞，有大量的脂肪积累；R1为吴茱萸次碱，R15-R18为氨基取代吴茱萸次碱类似物。阳性对照为3μM小檗碱（BBR）。与DMSO空白对照组（DM）相比，1μM的化合物R1、R15、R17、R18能够显著性地降低细胞的甘油三酯含量（*，P<0.5；**，P<0.1；***，P<0.001）。其中R17和R18的减少脂肪蓄积的效果最为显著。
图2显示，吴茱萸次碱R1和式I化合物（R17、R18）皆能浓度依赖性地减少3T3-L1细胞的脂肪蓄积（*，P<0.5；**，P<0.1；***，P<0.001），而R17和R18的活性更强。由图可知，经3μM R17和R18处理过的细胞，其甘油三酯的含量分别减少了93%和72%。而同一浓度下的R1组，其甘油三酯的含量只减少了34%。
图3中，BM为基础对照组，代表未分化的细胞，无脂肪积累。由图片可直观发现，基础对照组BM中几乎没有脂滴积累，而DMSO空白对照组DM则可以清楚地看到密集的脂滴，而药物组中的脂滴随着药物浓度的增加而逐渐减少。
图4中，在15μM R1的图片中，方框所示的针状物，即为R1因为水溶性差而从培养基中析出来的固体。而在同一条件下，15μM R17和R18的显微镜视野干净，并没有固体物析出。这说明了类似物R17和R18的水溶性确实比R1好。
实施例11: 应用另一细胞株FAO大鼠肝细胞作为模型，采用甘油三酯含量测定试剂盒以及BCA蛋白浓度测定试剂盒分析，在体外评价吴茱萸次碱R1和式I化合物（R17）对高果糖诱导的肝细胞脂肪蓄积减少作用。
实验步骤：
该实验设定基础对照组Bas(不含果糖)，DMSO空白对照组Fru(含高果糖), 以及不同的药物组R1组和R17组。具体操作如下：
将FAO大鼠肝细胞以5*105个/孔接种于24孔板，培养24h， 然后换成果糖培养基，再培养24h，然后进行甘油三酯和蛋白含量测定，结果分析。此实验中，药物组是将药物用果糖培养基稀释至所需浓度，一同加入，孵育24h。而基础对照组以及DMSO空白对照组则加入相应量的DMSO，一同孵育24h。
(1) 溶液配制和药物稀释：
药物溶液：同试验实施例10
果糖培养基：低糖DMEM培养基中添加25mM的果糖，再添加10%新生牛血清
(2) 甘油三酯含量和蛋白含量分析
上述细胞弃去培养基，用PBS清洗2次，加入1M氢氧化钾溶液在60℃加热10min，使细胞充分裂解，匀浆细胞悬液，按甘油三酯测定试剂盒的使用说明测定每孔的甘油三酯的含量， 按BCA蛋白含量测定试剂盒的使用说明测定每孔的蛋白含量。
最后甘油三酯水平的分析结果以nmol/mg蛋白表示。但为了便于两个化合物之间的对照比较，又将此结果转换成“100%对照”方式表示(即是药物组的甘油三酯含量（nmol/mg蛋白）/对照组的甘油三酯的含量（nmol/mg蛋白）*100%)。为了便于作浓度响应图，DMSO空白对照组的药物浓度为0μM设定为0.0001 μM。实验结果为三次独立实验的平均值。
实验结果：
图5显示茱萸次碱R1和式I化合物（R17）浓度依赖性地抑制了高果糖诱导的FAO大鼠肝细胞脂肪积累。可以明显地看到，在浓度为10μM时，R1组高果糖诱导的脂肪蓄积减少了72%，而R17组减少了92% （*，P<0.5；**，P<0.1；***，P<0.001）。
图6 为化合物R1、R17、R18与细胞孵育24 h后用显微镜拍照所得图片。由图可以清晰地看到，由于水溶性差，R1在20μM下会从培养基中析出，而20μM 的R17和R18则不会出现此现象。图中方框所圈的针状物即为从培养基中析出来的固体。再次说明了类似物R17和R18的水溶性确实比R1好。

Claims (9)

1.一种氨基取代吴茱萸次碱类似物，其特征在于化学式为：
式中，R0 = -NH(CH2)nR2，n = 1、2、3、4或5，R2 = -N(CH3)2或-N(CH2CH3)2；或者R0 = 吗啉基、哌嗪基或甲基哌嗪基。
2.一种权利要求1所述氨基取代吴茱萸次碱类似物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
邻氨基苯甲酰胺1与原丙酸三乙酯反应得到化合物2，化合物2经溴化后得到化合物3，化合物3再与苯肼反应得到化合物4，化合物4经多聚磷酸缩合得到化合物5，化合物5经环合氯代后得到化合物6，化合物6再与取代胺化合物反应，得到目标产物7。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述取代胺化合物为HR0，R0 = -NH(CH2)nR2，n = 1、2、3、4或5，R2 = -N(CH3)2或-N(CH2CH3)2；或者R0 = 吗啉基、哌嗪基或甲基哌嗪基。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于制备化合物4时，化合物3与苯肼的摩尔比为1：2~6。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于化合物5在室温下与三氯氧磷反应，经环合氯代后得到化合物6。
6.根据权利要求2~5中任一项所述的制备方法，其特征在于目标产物7通过柱层析进行纯化。
7.权利要求1所述的氨基取代吴茱萸次碱类似物在制备抗肥胖症药物中的应用。
8.一种抗肥胖症药物，其特征在于含有权利要求1所述氨基取代吴茱萸次碱类似物以及药学上可接受的辅助剂。
9.根据权利要求8所述的抗肥胖症药物，其特征在于所述药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
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