ES2966207T3 - Compuesto heterocíclico - Google Patents

Compuesto heterocíclico Download PDF

Info

Publication number
ES2966207T3
ES2966207T3 ES19774392T ES19774392T ES2966207T3 ES 2966207 T3 ES2966207 T3 ES 2966207T3 ES 19774392 T ES19774392 T ES 19774392T ES 19774392 T ES19774392 T ES 19774392T ES 2966207 T3 ES2966207 T3 ES 2966207T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
group
compound
ring
cells
optionally substituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19774392T
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshinori Yoshida
Kenji Miki
Akira Kaieda
Shigeru Kondo
Hiroshi Nara
Yoshinori Ikeura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Orizuru Therapeutics Inc
Original Assignee
Orizuru Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orizuru Therapeutics Inc filed Critical Orizuru Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2966207T3 publication Critical patent/ES2966207T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona un compuesto heterocíclico que tiene actividad para mejorar la maduración de un cardiomiocito. Un compuesto representado por la fórmula (I) [en la que cada símbolo es como se define en la descripción] o una sal del mismo tiene una actividad para mejorar la maduración de un cardiomiocito y, por lo tanto, es útil como potenciador de la maduración de cardiomiocitos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto heterocíclico
Campo técnico
La presente invención se refiere a un compuesto heterocíclico, particularmente a un compuesto heterocíclico que tiene actividad para promover la maduración de un cardiomiocito, y a un método de preparación de cardiomiocitos maduros.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades cardíacas son la principal causa de muerte en el mundo. El trasplante cardíaco, que actualmente es la única opción terapéutica para los pacientes con insuficiencia cardíaca grave, sufre de escasez de donantes. Una opción terapéutica potencial como alternativa al trasplante cardíaco es el trasplante de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre pluripotentes inducidas (células iPS, por sus siglas en inglés), células madre embrionarias (células ES, por sus siglas en inglés), etc.). Se ha deseado desarrollar rápidamente la opción alternativa. Además, los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes (por ejemplo, células iPS, células ES, etc.) también se requieren como células utilizadas para ensayos de toxicidad de fármacos y estudios de modelos de enfermedades cardíacas.
La mejora de la eficiencia y la seguridad es esencial para aplicar cardiomiocitos maduros derivados de células iPS a la medicina regenerativa. En cuanto a la eficiencia, existe un problema de eficiencia de bajo costo, porque el número de cardiomiocitos capaces de inducir la maduración es pequeño y las proteínas como los factores de crecimiento en un medio de cultivo son muy caras. En cuanto a la seguridad, existe el problema de que los cardiomiocitos tienen una baja pureza y las células proliferativas distintas de los cardiomiocitos pueden contaminarse, por lo que existe el riesgo de canceración.
Además, para las pruebas de toxicidad de fármacos y los estudios de modelos de enfermedades cardíacas que utilizan cardiomiocitos, es necesario recolectar un gran número de cardiomiocitos maduros que imiten suficientemente a los cardiomiocitos en el cuerpo vivo. Los cardiomiocitos pierden su potencial de división al mismo tiempo que nacen, y la regeneración de esas células es muy difícil. Debido a tales propiedades, se han realizado varios estudios para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en cardiomiocitos con el fin de obtener un gran número de cardiomiocitos (Documento de Patente 1, Documento de Patente 2, documento no relacionado con patente 1, documento no relacionado con patente 2 y documento que no relacionado con patente 3).
Sin embargo, en general, se dice que los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas permanecen en una etapa inmadura similar al de los cardiomiocitos fetales, y que su función de canal iónico es insuficiente en comparación con los cardiomiocitos adultos. Por tanto, con el propósito de evaluación de la toxicidad de los fármacos y agentes terapéuticos en relación con los canales iónicos, es necesario utilizar cardiomiocitos maduros.
Por lo tanto, se requieren cardiomiocitos maduros y un método de preparación de los mismos como células utilizadas para el trasplante de cardiomiocitos y para la evaluación de la toxicidad de fármacos y fármacos terapéuticos.
El Documento de Patente 3 describe el compuesto representado por la siguiente fórmula
en donde cada símbolo es como se define arriba,
como un derivado de bencimidazol útil para el tratamiento de enfermedades cardíacas, enfermedades pulmonares o trastornos del sistema nervioso central (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad isquémica).
Es posible obtener cardiomiocitos maduros cultivando cardiomiocitos inmaduros durante un período prolongado (por ejemplo, 1 año o más). Sin embargo, como método de preparación comercial de cardiomiocitos maduros, dicho método lleva demasiado tiempo y requiere un medio caro y aditivos para el medio.
Por lo tanto, todavía se desea el desarrollo de compuestos de bajo peso molecular que tengan una actividad para promover la maduración de un cardiomiocito, que pueda preparar eficazmente cardiomiocitos maduros con alta pureza en un período corto a bajo coste.
Lista de documentos
Documentos de patente
Documento de patente 1: WO 2007/002136
Documento de patente 2: WO 2009/118928
Documento de patente 3: DE 4212748
Documento no relacionado con una patente
Documento no relacionado con una patente 1: Yan P,et al,Biochem Biophys Res Commun. 379:115-20 (2009) Documento no relacionado con una patente 2: Laflamme MA, etal,Nat Biotechnol, 25:1015-1024 (2007) Documento no relacionado con una patente 3: Yang L etal,Nature, 453:524-528 (2008)
Compendio de la invención
Problemas a ser resueltos por la invención
La presente invención tiene como objetivo proporcionar compuestos de bajo peso molecular que tengan una actividad para promover la maduración de un cardiomiocito, que pueda preparar de manera eficiente cardiomiocitos maduros con alta pureza en un período corto a bajo coste.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores han descubierto que el compuesto representado por la siguiente fórmula (I) o una sal del mismo (en la presente memoria, a veces denominado compuesto (I)) tiene una actividad para promover la maduración de un cardiomiocito. Como resultado de estudios adicionales, han completado la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención es como sigue.
[1] Un compuesto representado por la fórmula (I):
en donde
en la fórmula (I),
el anillo A es un anillo benceno;
el anillo B es un anillo benceno;
el anillo C es un anillo de imidazol además opcionalmente sustituido con un grupo(s) alquilo de C<1-6>
L es un enlace o un grupo metileno;
R1 es
(1) un átomo de hidrógeno,
(2) un átomo de halógeno,
(3) un grupo mono- o di-alquilamino de Ci-6,
(4) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros, o
(5) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de C<1>-<6>; y
El anillo D es
(1) un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(a) un átomo de halógeno,
(b) un grupo hidroxilo,
(c) un grupo alquilo de C<1-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi de C<1>-<6>,
(d) un grupo alcoxi de C<1-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(i) un grupo carboxilo,
(ii) un grupo alcoxi de C<1>-<6>-carbonilo,
(iii) un grupo aralquiloxi de C7-16-carbonilo,
(iv) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyentes seleccionados de (I) grupo alquilo de C<1-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (A) un grupo cicloalquilo de C<3>-<10>,
(B) un grupo arilo de C<6>-<14>,
(C) un grupo arilamino de C<6-14>opcionalmente sustituido con 1 a 3 átomos de halógeno, (D) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros,
(E) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros, y
(F) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyentes seleccionados de un grupo alquilo de C<1-6>y un grupo aralquilo de C<7>-<16>,
(II) un grupo alquenilo de C<2-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos arilo de C<6>-<14>, (III) un grupo cicloalquilo de C<3-10>opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de C<1>-<6>, (IV) un grupo arilo de C<6-14>opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (A) un átomo de halógeno, y
(B) un grupo alquilo de C<1>-<6>,
(V) un grupo aralquilo de C<7>-<16>,
(VI) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros, y
(VII) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros, y
(v) un grupo heterociclilcarbonilo no aromático de 3 a 14 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(I) un grupo hidroxilo, y
(II) un grupo alquilo de C<1>-<6>, y
(e) un grupo aralquiloxi de C<7>-<16>,
(2) un anillo ciclohexano,
(3) un anillo piridina,
(4) un anillo isoxazol,
(5) un anillo tiofeno,
(6) un anillo de piperidina además opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi de C<i -6>-carbonilo, o (7) un anillo tetrahidropirano. ,o una de sus sales.
[2] El compuesto o la sal de acuerdo con [1] anteriormente mencionado, que es N-(1,1-Dióxido-2,3-dihidro-1-benzotiofen-5-il)-2-(4- (5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acetamida, o una sal del mismo.
[3] El compuesto o la sal de acuerdo con [1] anteriormente mencionado, que es 2-(2-(4-Bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(morfolin-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
[4] El compuesto o la sal de acuerdo con [1] anteriormente mencionado, que es 5-(Piperidin-1-il)-2-(2-(piridin-3-il)-1H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
[5] El compuesto o la sal de acuerdo con [1] anteriormente mencionado, que es 5-(Piperidin-1-il)-2-(2-(piridin-4-il)-1H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
[6] El compuesto o la sal de acuerdo con [1 ] anteriormente mencionado, que es 2-(2-(4-Hidroxifenil)-1 H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
[7] Un promotor de maduración de cardiomiocitos que comprende el compuesto o sal de [1] mencionado anteriormente.
[i] Un método para preparar un cardiomiocito maduro, que comprende un paso de cultivar un cardiomiocito inmaduro en presencia del compuesto o sal de [1] mencionado anteriormente.
Efecto de la invención
Dado que el compuesto (I) mencionado anteriormente tiene una acción de maduración de cardiomiocitos, es útil como promotor de la maduración de cardiomiocitos. El método para promover la maduración de los cardiomiocitos usando el compuesto mencionado anteriormente madura los cardiomiocitos inmaduros en un período corto a bajo coste, en comparación con un método para cultivar cardiomiocitos inmaduros durante un período prolongado.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1]
La Figura 1 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (control (sin adición)) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 2]
La Figura 2 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (control (adición de DMSO)) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 3]
La Figura 3 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (adición del compuesto del Ejemplo 8) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 4]
La Figura 4 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (adición del compuesto del Ejemplo 46) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 5]
La Figura 5 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (adición del compuesto del Ejemplo 45) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 6]
La Figura 6 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (adición del compuesto del Ejemplo 4) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 7]
La Figura 7 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry (adición del compuesto del Ejemplo 17) por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 2.
[Figura 8]
La Figura 8 muestra los resultados del análisis de expresión de mCherry por citometría de flujo en el Ejemplo Experimental 3. Las figuras muestran los resultados en los casos de control (sin adición), control (adición de DMSO), adición del compuesto del Ejemplo 8 y del compuesto A (Ejemplo 8: 8-9 días, compuesto A: 10-15 días) y la adición del compuesto del Ejemplo 8 y el compuesto A (Ejemplo 8: 8-15 días, compuesto A: 10-15 días), en orden desde arriba.
Descripción detallada de la invención
La definición de cada sustituyente usado en la presente memoria se describe a detalle en lo siguiente. A menos que se especifique de otra manera, cada sustituyente tiene la siguiente definición.
En la presente memoria, los ejemplos del “átomo de halógeno” incluyen flúor, cloro, bromo y yodo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquilo de C<1-6>” incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, 1 -etilpropilo, hexilo, isohexilo, 1, 1 -dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo y 2-etilbutilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquilo de C<1-6>opcionalmente halogenado” incluyen un grupo alquilo de C<1-6>que tiene opcionalmente de 1 a 7, preferiblemente de 1 a 5, átomos de halógeno. Ejemplos específicos de los mismos incluyen metilo, clorometilo, difluorometilo, triclorometilo, trifluorometilo, etilo, 2-bromoetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, tetrafluoroetilo, pentafluoroetilo, propilo, 2,2-difluoropropilo, 3,3,3-trifluoropropilo, isopropilo, butilo, 4,4,4-trifluorobutilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, 5,5,5-trifluoropentilo, hexilo y 6,6,6-trifluorohexilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquenilo de C<2-6>” incluyen etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1- propenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 4-metil-3-pentenilo, 1-hexenilo, 3-hexenilo y 5-hexenilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquinilo de C<2-6>” incluyen etinilo, 1 -propinilo, 2-propinilo, 1 -butinilo, 2- butinilo, 3-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 1 -hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 5-hexinilo y 4-metil-2-pentinilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo cicloalquilo de C<3-10>” incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, cicloctilo, biciclo[2.2.1]heptilo, bicilco[2.2.2]octilo, biciclo[3.2.1]octilo y adamantilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo cicloalquilo de C<3-10>opcionalmente halogenado” incluyen un grupo cicloalquilo de C<3-10>que tiene opcionalmente de 1 a 7, preferiblemente de 1 a 5, átomos de halógeno. Ejemplos específicos de los mismos incluyen ciclopropilo, 2,2-difluorociclopropilo, 2,3-difluorociclopropilo, ciclobutilo, difluorociclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, y ciclooctilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo cicloalquenilo de C<3-10>” incluyen ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo y ciclooctenilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo arilo de C<6-14>” incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 1 -antrilo, 2-antrilo y 9-antrilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo aralquilo de C<7-16>” incluyen bencilo, fenetilo, naftilmetilo y fenilpropilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alcoxilo de C<1-6>” incluyen metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentiloxi y hexiloxi.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alcoxilo de C<1-6>opcionalmente halogenado” incluyen un grupo alcoxilo de C<1-6>que tiene opcionalmente 1 a 7, de preferencia 1 a 5, átomos de halógeno. Ejemplos específicos de los mismos incluyen metoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, etoxi, 2,2,2-trifluoroetoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, 4,4,4-trifluorobutoxi, isobutoxi, sec-butoxi, pentiloxi y hexiloxi.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo cicloalquiloxi de C<3-10>” incluyen ciclopropiloxi, ciclobutiloxi, ciclopentiloxi, ciclohexiloxi, cicloheptiloxi y ciclooctiloxi.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquiltio de C<1-6>” incluyen metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, sec-butiltio, terc-butiltio, pentiltio y hexiltio.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquiltio de C<1-6>opcionalmente halogenado” incluyen un grupo alquiltio de C<1-6>que tiene opcionalmente 1 a 7, de preferencia 1 a 5 átomos de halógeno. Ejemplos específicos de los mismos incluyen metiltio, difluorometiltio, trifluorometiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, butiltio, 4,4,4-trifluorobutiltio, pentiltio y hexiltio.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquilo de C<i -6>-carbonilo” incluyen acetilo, propanoilo, butanoilo, 2-metilpropanoilo, pentanoilo, 3-metilbutanoilo, 2-metilbutanoilo, 2,2-dimetilpropanoilo, hexanoilo y heptanoilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquilo de C<1-6>-carbonilo opcionalmente halogenado” incluyen un grupo alquilo de C<1-6>-carbonilo que tiene opcionalmente de 1 a 7, preferiblemente de 1 a 5, átomos de halógeno. Ejemplos específicos de los mismos incluyen acetilo, cloroacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, propanoilo, butanoilo, pentanoilo y hexanoilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alcoxi de C<1-6>-carbonilo” incluyen metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, sec-butoxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo, pentiloxicarbonilo y hexiloxicarbonilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo arilo de C<6-14>-carbonilo” incluyen benzoilo, 1 -naftoilo y 2-naftoilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo aralquilo de C<7-16>-carbonilo” incluyen fenilacetilo y fenilpropionilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo heterociclilcarbonilo aromático de 5 a 14 miembros” incluyen nicotinoilo, isonicotinoilo, tenoilo y furoilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo heterociclilcarbonilo no aromático de 3 a 14 miembros” incluyen morfolinilcarbonilo, piperidinilcarbonilo y pirroidinilcarbonilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo mono- o di-alquilo de C<1-6>-carbamoilo” incluyen metilcarbamoilo, etilcarbamoilo, dimetilcarbamoilo, dietilcarbamoilo y N-etil-N-metilcarbamoilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo mono- o di-alquilo de C<7-16>-carbamoilo” incluyen bencilcarbamoilo y fenetilcarbamoilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquilsulfonilo de C<1-6>” incluyen metisulfonilo, etilsulfonilo, propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, butilsulfonilo, sec-butilsulfonilo y terc-butilsulfonilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo alquilsulfonilo de C<1-6>opcionalmente halogenado” incluyen un grupo alquilsulfonilo de C<1-6>que tiene opcionalmente 1 a 7, de preferencia 1 a 5, átomos de halógeno. Ejemplos específicos de los mismos incluyen metilsulfonilo, difluorometilsulfonilo, trifluorometilsulfonilo, etilsulfonilo, propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, butilsulfonilo, 4,4,4-trifluorobutilsulfonilo, pentilsulfonilo y hexilsulfonilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo arilsulfonilo de C<6-14>” incluyen fenilsulfonilo, 1-naftilsulfonilo y 2-naftilsulfonilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo hidrocarbonado” incluyen un grupo alquilo de C<1-6>, un grupo alquenilo de C<2-6>, un grupo alquinilo de C<2-6>, un grupo cicloalquilo de C<3-10>, un grupo cicloalquenilo de C<3-10>, un grupo arilo de C<6-14>y un grupo aralquilo de C<7-16>.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo heterocíclico aromático” (incluyendo “grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros”) incluyen un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (de preferencia, 5 a 10 miembros) que contiene, como un átomo constituyente de anillo además de átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos seleccionados de un átomo de nitrógeno, un átomo de azufre y un átomo de oxígeno.
Ejemplos preferibles del “grupo heterocíclico aromático” incluyen grupos heterocíclicos aromáticos monocíclicos de 5 o 6 miembros, tales como tienilo, furilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, triazinilo y similares; y
grupos heterocíclicos aromáticos policíclicos condensados (de preferencia bi o tricíclicos) de 8 a 14 miembros, tales como benzotiofenilo, benzofuranilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, bencisoxazolilo, benzotiazolilo, bencisotiazolilo, benzotriazolilo, imidazopiridinilo, tienopiridinilo, furopiridinilo, pirrolopiridinilo, pirazolopiridinilo, oxazolopiridinilo, tiazolopiridinilo, imidazopirazinilo, imidazopirimidinilo, tienopirimidinilo, furopirimidinilo, pirrolopirimidinilo, pirazolopirimidinilo, oxazolopirimidinilo, tiazolopirimidinilo, pirazolotriazinilo, nafto[2,3-b]tienilo, fenoxatiinilo, indolilo, isoindolilo, 1 H-indazolilo, purinilo, isoquinolilo, quinolilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo y similares.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo heterocíclico no aromático” (que incluye “grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros”) incluyen un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (de preferencia 4 a 10 miembros) que contiene, como un átomo constituyente de anillo además de átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos seleccionados de un átomo de nitrógeno, un átomo de azufre y un átomo de oxígeno.
Ejemplos preferibles del “grupo heterocíclico no aromático” incluyen grupos heterocíclicos no aromáticos monocíclicos de 3 a 8 miembros, tales como aziridinilo, oxiranilo, tiiranilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, tetrahidrotienilo, tetrahidrofuranilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, tiazolinilo, tiazoidinilo, tetrahidroisotiazolilo, tetrahidrooxazolilo, tetrahidroisooxazolilo, piperidinilo, piperazinilo, tetrahidropiridinilo, dihidropiridinilo, dihidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidropiridazinilo, dihidropiranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, azepanilo, diazepanilo, azepinilo, oxepanilo, azocanilo, diazocanilo y similares; y
grupos heterocíclicos no aromáticos policíclicos condensados (preferiblemente bi o tricíclicos) de 9 a 14 miembros, tales como dihidrobenzofuranilo, dihidrobencimidazolilo, dihidrobenzoxazolilo, dihidrobenzotiazolilo, dihidrobencisotiazolilo, dihidronafto[2,3-b]tienilo, tetrahidroisoquinolilo, tetrahidroquinolilo, 4H-quinolizinilo, indolinilo, isoindolinilo, tetrahidrotieno[2,3-c]piridinilo, tetrahidrobenzazepinilo, tetrahidroquinoxalinilo, tetrahidrofenantridinilo, hexahidrofenotiazinilo, hexahidrofenoxazinilo, tetrahidroftalazinilo, tetrahidronaftiridinilo, tetrahidroquinazolinilo, tetrahidrocinolinilo, tetrahidrocarbazolilo, tetra h i d ro-p-ca rbolinilo, tetrahidroacridinilo, tetrahidrofenazinilo, tetrahidrotioxantenilo, octahidroisoquinolilo y similares.
En la presente memoria, los ejemplos preferibles del “grupo heterocíclico puenteado de 7 a 10 miembros” incluyen quinuclidinilo y 7-azabiciclo[2.2.1]heptanilo.
En la presente memoria, los ejemplos del “grupo heterocíclico que contiene nitrógeno” incluyen un “grupo heterocíclico” que contiene al menos un átomo de nitrógeno como un átomo constituyente de anillo.
En la presente memoria, los ejemplos del “Grupo acilo” incluye un grupo formilo, un grupo carboxilo, un grupo carbamoilo, un grupo tiocarbamoilo, un grupo sulfino, un grupo sulfo, un grupo sulfamoilo y un grupo fosfono, teniendo cada uno opcionalmente “1 o 2 sustituyentes seleccionados de un grupo alquilo de C<i -6>, un grupo alquenilo de C<2-6>, un grupo cicloalquilo de C<3-10>, un grupo cicloalquenilo de C<3-10>, un grupo arilo de C<6-14>, un grupo aralquilo de C<7-16>, un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros y un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros, cada uno de los cuales tiene opcionalmente 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, un grupo alcoxilo de C<1-6>opcionalmente halogenado, un grupo hidroxilo, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo amino y un grupo carbamoilo”.
Ejemplos del “grupo acilo” también incluyen un grupo hidrocarbonado-sulfonilo, un grupo heterociclilsulfonilo, un grupo hidrocarbonado-sulfinilo y un grupo heterociclilsulfinilo.
Aquí, el grupo hidrocarbonado-sulfonilo significa un grupo sulfonilo unido a un grupo hidrocarbonado, el grupo heterociclilsulfonilo significa un grupo sulfonilo unido a un grupo heterocíclico, el grupo hidrocarbonado-sulfinilo significa un grupo sulfinilo unido a un grupo hidrocarbonado y el grupo heterociclilsulfinilo significa un grupo sulfinilo unido a un grupo heterocíclico.
Ejemplos preferibles del “grupo acilo” incluyen un grupo formilo, un grupo carboxilo, un grupo alquilo de C<1-6>-carbonilo, un grupo alquenilo de C<2-6>-carbonilo (por ejemplo, crotonoilo), un grupo cicloalquilo de C<3-1o>-carbonilo (por ejemplo, ciclobutanocarbonilo, ciclopentanocarbonilo, ciclohexanocarbonilo, cicloheptanocarbonilo), un grupo cicloalquenilo de C<3-1o>-carbonilo (por ejemplo, 2-ciclohexenocarbonilo), un grupo arilo de C<6-14>-carbonilo, un grupo aralquilo de C<7-16>-carbonilo, un grupo heterociclilcarbonilo aromático de 5 a 14 miembros, un grupo alcoxi de C<1-6>-carbonilo, un grupo ariloxi de C<6-14>-carbonilo (por ejemplo, feniloxicarbonilo, naftiloxicarbonilo), un grupo aralquiloxi de C<7-16>-carbonilo (por ejemplo, benciloxicarbonilo, fenetiloxicarbonilo), un grupo carbamoilo, un grupo mono- o di-alquilo de C<1-6>-carbamoilo, un grupo mono- o di-alquenilo de a C<2-6>-carbamoilo (por ejemplo, dialilcarbamoilo), un grupo mono- o di-cicloalquilo de C<3-1o>-carbamoilo (por ejemplo, ciclopropilcarbamoilo), un grupo mono- o di-arilo de C<6-14>-carbamoilo (por ejemplo, fenilcarbamoilo), un grupo mono- o di-aralquilo de C<7-16>-carbamoilo, un grupo heterociclilcarbamoilo de 5 a 14 miembros (por ejemplo, piridilcarbamoilo), un grupo tiocarbamoilo, un grupo mono- o di-alquilo de C<1-6>-tiocarbamoilo (por ejemplo, metiltiocarbamoilo, N-etil-N-metiltiocarbamoilo), un grupo mono- o di-alquenilo de C<2-6>-tiocarbamoilo (por ejemplo, dialiltiocarbamoilo), un grupo mono- o di-cicloalquilo de C<3-1o>-tiocarbamoilo (por ejemplo, ciclopropiltiocarbamoilo, ciclohexiltiocarbamoilo), un grupo mono- o di-arilo de C<6-14>-tiocarbamoilo (por ejemplo, feniltiocarbamoilo), un grupo mono- o di-aralquilo de C<7-16>-tiocarbamoilo (por ejemplo, benciltiocarbamoilo, fenetiltiocarbamoilo), un grupo heterocicliltiocarbamoilo aromático de 5 a 14 miembros (por ejemplo, piridiltiocarbamoilo), un grupo sulfino, un grupo alquilsulfinilo de C<1-6>(por ejemplo, metilsulfinilo, etilsulfinilo), un grupo sulfo, un grupo alquilsulfonilo de C<1-6>, un grupo arilsulfonilo de C<6-14>, un grupo fosfono y un grupo mono- o dialquilfosfono de C<1-6>(por ejemplo, dimetilfosfono, dietilfosfono, diisopropilfosfono, dibutilfosfono).
En la presente memoria, los ejemplos del “cicloalcano de C<3-10>” incluyen ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano.
En la presente memoria, los ejemplos del “cicloalqueno de C<3-10>” incluyen ciclopropeno, ciclobuteno, ciclopenteno, ciclohexeno, ciclohepteno y cicloocteno.
En la presente memoria, los ejemplos del “heterociclo aromático” incluyen un heterociclo aromático de 5 a 14 miembros (de preferencia, 5 a 10 miembros) que contiene, como un átomo constituyente de anillo además de átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos seleccionados de un átomo de nitrógeno, un átomo de azufre y un átomo de oxígeno. Ejemplos preferibles del “heterociclo aromático” incluyen heterociclos aromáticos monocíclicos de 5 o 6 miembros, tales como tiofeno, furano, pirrol, imidazol, pirazol, tiazol, isotiazol, oxazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, 1,2,4-oxadiazol, 1,3,4-oxadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, triazol, tetrazol, triazina y similares; y
heterociclos aromáticos policíclicos condensados (preferiblemente bi o tricíclicos) de 8 a 14 miembros, tales como benzotiofeno, benzofurano, bencimidazol, benzoxazol, bencisoxazol, benzotiazol, bencisotiazol, benzotriazol, imidazopiridina, tienopiridina, furopiridina pirrolopiridina, pirazolopiridina, oxazolopiridina, tiazolopiridina, imidazopirazina, imidazopirimidina, tienopirimidina, furopirimidina, pirrolopirimidina, pirazolopirimidina, oxazolopirimidina, tiazolopirimidina, pirazolopirimidina, pirazolotriazina, nafto[2,3-b]tiofeno, fenoxatiina, indol, isoindol, IH-indazol, purina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, carbazol, pcarbolina, fenantridina, acridina, fenazina, fenotiazina, fenoxatiina y similares.
En la presente memoria, los ejemplos del “heterociclo no aromático” incluyen un heterociclo no aromático de 3 a 14 miembros (de preferencia, 4 a 10 miembros) que contiene, como un átomo constituyente de anillo además de átomo de carbono, 1 a 4 heteroátomos seleccionados de un átomo de nitrógeno, un átomo de azufre y un átomo de oxígeno. Los ejemplos preferibles del "heterociclo no aromático" incluyen heterociclos no aromáticos monocíclicos de 3 a 8 miembros tales como aziridina, oxirano, tiirano, azetidina, oxetano, tietano, tetrahidrotiofeno, tetrahidrofurano, pirrolina, pirrolidina, imidazolina, imidazolidina, oxazolina, oxazolidina, pirazolina, pirazolidina, tiazolina, tiazolidina, tetrahidroisotiazol, tetrahidrooxazol, tetrahidroisoxazol, piperidina, piperazina, tetrahidropiridina, dihidropiridina, dihidrotiopirano, tetrahidropirimidina, tetrahidropiridazina, dihidropirano, tetrahidropirano, tetrahidrotiopirano, morfolina, tiomorfolina, azepano, diazepano, azepina, azocano, diazocano, oxepano y similares; y
heterociclos no aromáticos policíclicos (preferiblemente bi o tricíclicos) condensados de 9 a 14 miembros tales como dihidrobenzofurano, dihidrobencimidazol, dihidrobenzoxazol, dihidrobenzotiazol, dihidrobenzisotiazol, dihidronafto[2,3-b]tiofeno, tetrahidroisoquinolina, tetrahidroquinolina, 4H-quinolizina, indolina, isoindolina, tetrahidrotieno[2,3-c] piridina, tetrahidrobenzazepina, tetrahidroquinoxalina, tetrahidrofenantridina, hexahidrofenotiazina, hexahidrofenoxazina, tetrahidroftalazina, tetrahidronaftiridina, tetrahidroquinazolina, tetrahidrocinnolina, tetrahidrocarbazol, tetrahidro-pcarbolina, tetrahidroacridina, tetrahidrofenazina, tetrahidrotioxanteno, octahidroisoquinolina y similares.
En la presente memoria, los ejemplos del "grupo amino cíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros" incluyen un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros que contiene al menos un átomo de nitrógeno como un átomo que constituye el anillo y tiene un enlace átomo de nitrógeno, entre el "grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros". Los ejemplos específicos del mismo incluyen 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo, 1 -triazolilo, 1-tetrazolilo y similares.
En la presente memoria, los ejemplos del "grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros" incluyen un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros que contiene al menos un átomo de nitrógeno como un átomo que constituye el anillo y que tiene un enlace en el átomo de nitrógeno, entre el "grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros". Sus ejemplos específicos incluyen 1 -aziridinilo, 1 -azetidinilo, 1-pirrolinilo, 1 -imidazolidinilo, 1 -pirazolidinilo, 3-oxazolidinilo, 3-tiazolidinilo, 3-tetrahidroisoxazolilo, 3-tetrahidroisotiazolilo, 1 -piperidilo, 1 -piperazinilo, 4-morfolinilo, 4-tiomorfolinilo y similares.
La definición de cada símbolo en la fórmula (I) se explica en detalle a continuación.
El anillo A es un anillo benceno.
El anillo B es un anillo benceno.
El anillo C es un anillo imidazol además opcionalmente sustituido con un grupo(s) alquilo de C<1-6>(p. ej., metilo).
El anillo C es preferiblemente un anillo imidazol.
L es un enlace o un grupo metileno.
L es preferiblemente un enlace.
R1 es
(1) un átomo de hidrógeno,
(2) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo),
(3) un grupo mono o di alquilamino de C<1-6>(por ejemplo, dimetilamino, dietilamino)),
(4) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros, más preferiblemente un grupo amino cíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros (por ejemplo, 1 -pirrolilo)), o
(5) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros opcionalmente sustituido con de 1 a 3 grupos alquilo C<1-6>(preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros, más preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, 1 -piperidilo, 1 -piperazinilo, 4-morfolinilo)).
Cuando el número de los sustituyentes es 2 o más, los sustituyentes respectivos pueden ser iguales o diferentes. R1 es preferiblemente
(1) un átomo de hidrógeno,
(2) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo),
(3) un grupo mono o di alquilamino de C<1-6>(por ejemplo, dimetilamino, dietilamino)),
(4) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros, más preferiblemente un grupo amino cíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros (por ejemplo, 1 -pirrolilo)), o
(5) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 5 a 6 miembros), más preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1 -piperidilo, 1 -piperazinilo, 4-morfolinilo)) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo C<1-6>(p. ej., metilo).
R1 es aún más preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros (preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1 -piperidilo, 4-morfolinilo)).
R1 es aún más preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1 -piperidilo, 4-morfolinilo).
R1 es particularmente preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 6 miembros (por ejemplo, 1 -piperidilo, 4-morfolinilo).
El anillo D es
(1) un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo),
(b) un grupo hidroxilo,
(c) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi),
(d) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, hexiloxi) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(i) un grupo carboxilo,
(ii) un grupo alcoxi de C<1>-<6>-carbonilo (por ejemplo, metoxicarbonilo),
(iii) un grupo aralquiloxi de C7-16-carbonilo (por ejemplo, benciloxicarbonilo),
(iv) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado(s) de (I) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(A) un grupo cicloalquilo de C<3-10>(por ejemplo, ciclopropilo),
(B) un grupo arilo de C<6-14>(por ejemplo, fenilo),
(C) un grupo arilamino de C<6-14>(por ejemplo, fenilamino) opcionalmente sustituido con 1 a 3 átomos de halógeno (por ejemplo, un átomo de flúor),
(D) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros (por ejemplo, piridilo)),
(E) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, tetrahidropiranilo)), y
(F) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado entre un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo) y un grupo aralquilo de C<7>-<16>(por ejemplo, 2-feniletilo),
(II) un grupo alquenilo de C<2-6>(por ejemplo, pent-2-ilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos arilo de Ca-14 (por ejemplo, fenilo),
(III) un grupo cicloalquilo de C<3-10>(por ejemplo, ciclopropilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de Ci-a (por ejemplo, metilo),
(IV) un grupo arilo de Ca<-14>(por ejemplo, fenilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(A) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de flúor, un átomo de cloro), y
(B) un grupo alquilo de C<1>-a (por ejemplo, metilo),
(V) un grupo aralquilo de C7-1a (por ejemplo, bencilo),
(VI) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a a miembros (por ejemplo, piridilo)), y
(VII) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, tetrahidropiranilo), un grupo heterocíclico no aromático policíclico (preferiblemente bi- o tri-cíclico) condensado de 9 a 14 miembros (por ejemplo, 1,1-dioxidodihidrobenzotienilo)), y
(v) un grupo heterociclilcarbonilo no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterociclilcarbonilo no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, pirrolidinilcarbonilo, piperidilcarbonilo, morfolinilcarbonilo, 1,1 -dioxidotiazolidinilcarbonilo)) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(I) un grupo hidroxilo, y
(II) un grupo alquilo de C<1>-a (por ejemplo, metilo), y
(e) un grupo aralquiloxi de C7-1a (por ejemplo, benciloxi),
(2) un anillo ciclohexano,
(3) un anillo piridina,
(4) un anillo isoxazol,
(5) un anillo tiofeno,
(a) un anillo de piperidina además opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi-carbonilo de C<1>-a (por ejemplo, terc-butoxicarbonilo), o
(7) un anillo tetrahidropirano.
El anillo D es más preferiblemente un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo), y
(b) un grupo alcoxi de C<1>-a (por ejemplo, metoxi) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(i) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado(s) de (I) un grupo alquilo de C<1>-a (por ejemplo, metilo, isobutilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos cicloalquilo de C3-a (por ejemplo, ciclopropilo), y
(II) un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, tetrahidropiranilo), y
(ii) un grupo heterociclilcarbonilo no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, piperidilcarbonilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(I) un grupo hidroxilo, y
(II) un grupo alquilo de C<1>-a (por ejemplo, metilo).
Como otra realización, el Anillo D es aún más preferiblemente
(1) un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo)
(b) un grupo hidroxi, y
(c) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi) opcionalmente sustituido con grupo(s) carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido por grupo(s) heterocíclico(s) no aromáticos policíclico(s) condensado(s) (preferiblemente bi- o tri-cíclicos) de 9 a 14 miembros (por ejemplo, 1,1-dioxidodihidrobenzotienilo), o
(2) un anillo piridina.
En la modalidad, el Anillo D es particularmente preferiblemente un anillo de benceno sustituido adicionalmente por un sustituyente seleccionado de
(a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo), y
(b) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi) sustituido con grupo(s) carbamoilo mono-sustituido por un grupo heterocíclico no aromático policíclico (preferiblemente bi- o tri-cíclico) condensado de 9 a 14 miembros (por ejemplo, 1, 1 -dioxidodihidrobenzotienilo).
Los ejemplos preferibles del compuesto (I) incluyen los siguientes compuestos.
Compuesto C
Compuesto (I) en donde
El anillo A es un anillo de benceno;
El anillo B es un anillo de benceno;
El anillo C es un anillo de imidazol además opcionalmente sustituido con un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo); L es un enlace o un grupo metileno;
R1 es
(1) un átomo de hidrógeno,
(2) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo),
(3) un grupo mono- o di-alquilamino de C<1-6>(por ejemplo, dimetilamino, dietilamino),
(4) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros, más preferiblemente un grupo amino cíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros (por ejemplo, 1 -pirrolilo)), o
(5) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros), más preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1 -piperidilo, 1 -piperazinilo, 4-morfolinilo)) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo); y
El anillo D es
(1) un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo),
(b) un grupo hidroxilo,
(c) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi),
(d) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, hexiloxi) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(i) un grupo carboxilo,
(ii) un grupo alcoxi de C<1>-<6>-carbonilo (por ejemplo, metoxicarbonilo),
(iii) un grupo aralquiloxi de C7-16-carbonilo (por ejemplo, benciloxicarbonilo),
(iv) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado(s) de (I) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(A) un grupo cicloalquilo de C<3-10>(por ejemplo, ciclopropilo),
(B) un grupo arilo de C<6-14>(por ejemplo, fenilo),
(C) un grupo arilamino de C<6-14>(por ejemplo, fenilamino) opcionalmente sustituido con 1 a 3 átomos de halógeno (por ejemplo, un átomo de flúor),
(D) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros (por ejemplo, piridilo)),
(E) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, tetrahidropiranilo)), y
(F) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado(s) entre un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo) y un grupo aralquilo de C<7-16>(por ejemplo, 2-feniletilo),
(II) un grupo alquenilo de C<2-6>(por ejemplo, pent-2-ilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos arilo de C<6-14>(por ejemplo, fenilo),
(III) un grupo cicloalquilo de C<3-10>(por ejemplo, ciclopropilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo),
(IV) un grupo arilo de C<6-14>(por ejemplo, fenilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(A) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de flúor, un átomo de cloro), y (B) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo),
(V) un grupo aralquilo de C<7-16>(por ejemplo, bencilo),
(VI) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico aromático monocíclico de 5 a 6 miembros (por ejemplo, piridilo)), y
(VII) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, tetrahidropiranilo), un grupo heterocíclico no aromático policíclico (preferiblemente bi- o tri-cíclico) condensado de 9 a 14 miembros (por ejemplo, 1,1-dioxidodihidrobenzotienilo)), y
(v) un grupo heterociclilcarbonilo no aromático de 3 a 14 miembros (preferiblemente un grupo heterociclilcarbonilo no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, pirrolidinilcarbonilo, piperidilcarbonilo, morfolinilcarbonilo, 1,1 -dioxidotiazolidinilcarbonilo)) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(I) un grupo hidroxilo, y
(II) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo), y
(e) un grupo aralquiloxi de C<7-16>(por ejemplo, benciloxi),
(2) un anillo ciclohexano,
(3) un anillo piridina,
(4) un anillo isoxazol,
(5) un anillo tiofeno,
(6) un anillo de piperidina además opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi-carbonilo de C<1-6>(por ejemplo, terc-butoxicarbonilo), o
(7) un anillo tetrahidropirano.
Compuesto D
Compuesto (I) en donde
El anillo A es un de anillo benceno;
El anillo B es un de anillo benceno;
El anillo C es un anillo de imidazol;
L es un enlace;
R1 es un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1 -piperidilo, 4-morfolinilo)); y
El anillo D es un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo), y
(b) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(i) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado(s) de (I) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo, isobutilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos cicloalquilo de C<3-6>(por ejemplo, ciclopropilo), y
(II) un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, tetrahidropiranilo), y
(ii) un grupo heterociclilcarbonilo no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (por ejemplo, piperidilcarbonilo) opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(I) un grupo hidroxilo, y
(II) un grupo alquilo de C<1-6>(por ejemplo, metilo).
Compuesto E
Compuesto (I) en donde
El anillo A es un anillo de benceno;
El anillo B es un anillo de benceno;
El anillo C es un anillo de imidazol;
L es un enlace;
R1 es un grupo heterocíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (preferiblemente un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1 -piperidilo, 4-morfolinilo)); y
El anillo D es
(1) un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de
(a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo)
(b) un grupo hidroxilo, y
(c) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi) opcionalmente sustituido con grupo(s) carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido por grupo(s) heterocíclico(s) no aromáticos policíclico(s) condensado (s) (preferiblemente bi- o tri-cíclicos) de 9 a 14 miembros (por ejemplo, 1,1-dioxidodihidrobenzotienilo), o
(2) un anillo piridina.
Compuesto F
Compuesto (I) en donde
El anillo A es un anillo de benceno;
El anillo B es un anillo de benceno;
El anillo C es un anillo de imidazol;
L es un enlace;
R1 es un grupo amino cíclico no aromático monocíclico de 3 a 8 miembros (preferiblemente de 5 a 6 miembros) (por ejemplo, 1-piperidilo, 4-morfolinilo); y
El anillo D es un anillo de benceno sustituido adicionalmente por un sustituyente seleccionado de
(a) un átomo de halógeno (por ejemplo, un átomo de bromo), y
(b) un grupo alcoxi de C<1-6>(por ejemplo, metoxi) sustituido con grupo(s) carbamoilo mono-sustituido por un grupo heterocíclico no aromático policíclico (preferiblemente bi- o tri-cíclico) condensado de 9 a 14 miembros (por ejemplo, 1, 1 -dioxidodihidrobenzotienilo).
Compuesto G
N-(1,1-dióxido-2,3-dihidro-1-benzotiofen-5-il)-2-(4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acetamida, o una sal de la misma (Ejemplo 17).
2-(2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(morfolin-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal de la misma (Ejemplo 8).
5-(piperidin-1-il)-2-(2-(piridin-3-il)-1H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona, o una sal de la misma (Ejemplo 46).
5-(piperidin-1-il)-2-(2-(piridin-4-il)-1H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona, o una sal de la misma (Ejemplo 45).
2-(2-(4-hidroxifenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona, o una sal de la misma (Ejemplo 4).
Los ejemplos específicos del compuesto (I) incluyen los compuestos de los Ejemplos 1 a 73 mencionados a continuación.
Como sal de un compuesto representado por la fórmula (I) es preferible una sal farmacológicamente aceptable, y los ejemplos de dicha sal incluyen una sal con base inorgánica, una sal con base orgánica, una sal con ácido inorgánico, una sal con ácido orgánico, una sal con aminoácidos básicos o ácidos y similares.
Ejemplos preferibles de la sal con base inorgánica incluyen sales de metal alcalino, tales como sal de sodio, sal de potasio y similares, sales de metales alcalinotérreos, tales como sal de calcio, sal de magnesio y similares; sal de aluminio, sal de amonio y similares.
Los ejemplos preferidos de la sal con base orgánica incluyen sales con trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina[tris(hidroximetil)metilamina], terc-butilamina, ciclohexilamina, bencilamina, diciclohexilamina, N,N-dibenciletilendiamina y similares.
Ejemplos preferibles de la sal con ácido inorgánico incluyen sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares.
Ejemplos preferibles de la sal con ácido orgánico incluyen sales con ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y similares.
Ejemplos preferibles de la sal con aminoácido básico incluyen sales con arginina, lisina, ornitina y similares.
Ejemplos preferibles de la sal con aminoácido ácido incluyen sales con ácido aspártico, ácido glutámico y similares. El método de producción del compuesto (I) se explica a continuación.
El compuesto de materia prima y el reactivo utilizados y el compuesto obtenido en cada paso en el siguiente método de producción pueden estar cada uno en forma de una sal, y los ejemplos de dicha sal incluyen aquellos similares a las sales del compuesto representado por la fórmula (I), y similares.
Cuando el compuesto obtenido en cada paso es una forma libre, puede convertirse a una sal deseada de acuerdo con un método conocidoper se.Cuando el compuesto obtenido en cada paso es una sal, puede convertirse en la forma libre objetivo o en la otra sal de acuerdo con un método conocido per se.
El compuesto obtenido en cada paso se puede utilizar directamente como mezcla de reacción o como producto bruto para la siguiente reacción. Alternativamente, el compuesto obtenido en cada paso puede aislarse y purificarse a partir de una mezcla de reacción de acuerdo con un método conocido per se, por ejemplo, un medio de separación como concentración, cristalización, recristalización, destilación, extracción con disolvente, destilación fraccionada, cromatografía en columna y similares.
Cuando el compuesto de materia prima y el reactivo utilizados en cada paso están disponibles comercialmente, el producto disponible comercialmente también se puede utilizar directamente.
En la reacción de cada paso, si bien que el tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de reactivo y disolvente que se utilizará, generalmente es de 1 min a 48 h, preferiblemente de 10 min a 8 h, a menos que se especifique lo contrario. En la reacción de cada paso, si bien que la temperatura de reacción varía dependiendo del tipo de reactivo y disolvente a usar, generalmente es de -78 °C a 300 °C, preferiblemente de -78 °C a 150 °C, a menos que se especifique lo contrario.
En la reacción de cada paso, aunque la presión varía dependiendo del tipo de reactivo y disolvente a usar, generalmente es de 1 atm a 20 atm (101 kPa a 2026 kPa), preferiblemente 1 atm a 3 atm (101 kPa a 304 kPa), a menos que se especifique lo contrario.
Se puede usar un sintetizador de microondas tal como Initiator fabricado por Biotage y similares para la reacción en cada paso. Si bien la temperatura de reacción varía dependiendo del tipo de reactivo y disolvente a utilizar, generalmente es temperatura ambiente a 300 °C, preferiblemente 50 °C a 250 °C, a menos que se especifique lo contrario. Si bien el tiempo de reacción varía dependiendo del tipo de reactivo y disolvente a usar, generalmente es de 1 min a 48 h, preferiblemente de 1 min a 8 h, a menos que se especifique lo contrario.
En la reacción de cada paso, el reactivo se usa en una cantidad de 0,5 equivalentes a 20 equivalentes, preferiblemente 0,8 equivalentes a 5 equivalentes, con respecto al sustrato, a menos que se especifique lo contrario. Cuando un reactivo se usa como un catalizador, el reactivo se usa en una cantidad de 0,001 equivalentes a 1 equivalente, preferiblemente 0,01 equivalentes a 0,2 equivalentes, en relación al sustrato. Cuando el reactivo también es usado como un disolvente de reacción, el reactivo se usa en una cantidad de disolvente.
A menos que se especifique lo contrario, la reacción en cada paso se lleva a cabo sin disolvente, o disolviendo o suspendiendo el compuesto de materia prima en un disolvente adecuado. Ejemplos del disolvente incluyen aquellos descritos en los ejemplos y los siguientes disolventes.
alcoholes: metanol, etanol, alcohol terc-butílico, 2-metoxietanol y los similares;
éteres: dietiléter, difenil éter, tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano y los similares;
hidrocarburos aromáticos: clorobenceno, tolueno, xileno y los similares;
hidrocarburos saturados: ciclohexano, hexano y los similares;
amidas: N,N-dimetilformamida, N-metilpirrolidona y los similares;
hidrocarburos halogenados: diclorometano, tetracloruro de carbono y los similares;
nitrilos: acetonitrilo y los similares;
sulfoxidos: dimetil sulfóxido y los similares;
bases orgánicas aromáticas: piridina y los similares;
anhídridos: anhídrido acético y los similares;
ácidos orgánicos: ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético y los similares;
ácidos inorgánicos: ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y los similares;
ésteres: acetato de etilo y los similares;
cetonas: acetona, metiletilcetona y los similares;
agua.
El disolvente mencionado anteriormente se puede usar en una mezcla de dos o más tipos del mismo en una relación apropiada.
Cuando se usa una base para la reacción de cada paso, los ejemplos de la misma incluyen los descritos en los Ejemplos y las siguientes bases.
bases inorgánicas: hidróxido de sodio, hidróxido de magnesio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, bicarbonato de sodio y similares;
bases orgánicas: trietilamina, dietilamina, piridina, 4-dimetilaminopiridina, N,N-dimetilanilina, 1,4-diazabicido[2.2.2]octano, 1,8-diazabicido[5.4.0]-7-undeceno, imidazol, piperidina y los similares;
alcóxidos de metales: etóxido de sodio, terc-butóxido de potasio y similares;
hidruros de metales alcalinos: hidruro de sodio y similares;
amidas metálicas: amida de sodio, diisopropilamida de litio, hexametildisilazida de litio y similares;
litios orgánicos: n-butil-litio y similares.
Cuando se usa un ácido o un catalizador ácido para la reacción de cada paso, los ejemplos del mismo incluyen los descritos en los Ejemplos y los siguientes ácidos y catalizadores ácidos.
ácidos inorgánicos: ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico y similares.
ácidos orgánicos: ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido cítrico, ácido p-toluenosulfónico, ácido
10-canforsulfónico y similares;
Ácido de Lewis: complejo de trifluoruro de boro dietil éter, yoduro de zinc, cloruro de aluminio anhidro, cloruro de zinc anhidro, cloruro de hierro anhidro y similares.
A menos que se especifique de otra manera, la reacción de cada paso se lleva a cabo de acuerdo con un método conocidoper se,por ejemplo, los métodos descritos en Jikken Kagaku Kouza 5a edición, vol. 13 -19 (the Chemical Society of Japan ed.); Shin Jikken Kagaku Kouza, vol.14-15 (the Chemical Society of Japan ed.); Fine Organic Chemistry, 2da Edición Revisada (L. F. Tietze, Th. Eicher, Nankodo); Organic Name Reactions, the Reaction Mechanism and Essence, edición revisada (Hideo Togo, Kodansha); ORGANIC SYNTHESES Volumen colectivo I -VII (John Wiley & Sons Inc); Modern Organic Synthesis in the Laboratory, A Collection of Standard Experimental Procedures (Jie Jack Li, Ox Fo RD UNIVERSITY); Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Vol. 1 - Vol. 14 (Elsevier Japón); Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis (traducción de Kiyoshi Tomioka, Kagakudojin); Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc.), 1989 y los similares, o los métodos descritos en los ejemplos.
En cada paso, la reacción de protección o desprotección de un grupo funcional se lleva a cabo de acuerdo con un método conocido per se, por ejemplo, el método descrito en “Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed”, Wiley-Interscience, Inc., 2007 (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts); “Protecting Groups 3rd Ed.” Thieme, 2004 (P.J. Kocienski), o similares, o los métodos descritos en los ejemplos.
Ejemplos del grupo protector de un grupo hidroxilo de un alcohol y similares y un grupo hidroxilo fenólico incluyen grupos protectores tipo éter, tales como metoximetil éter, bencil éter, terc-butildimetilsilil éter, tetrahidropiranil éter y similares, grupos protectores tipo éster de carboxilato, tales como éster de acetato y similares, grupos protectores de tipo éster de sulfonato, tales como éster de metanosulfonato y similares, grupos protectores tipo éster de carbonato, tales como terc-butilcarbonato y similares, y similares.
Ejemplos del grupo protector de un grupo carbonilo de un aldehído incluyen grupos protectores de tipo acetal, tales como dimetilacetal y similares, grupos protectores de tipo acetal cíclico, tal como 1,3-dioxano y similares, y similares.
Ejemplos del grupo protector del grupo carbonilo de una cetona incluyen grupos protectores de tipo cetal, tales como dimetilcetal y similares; grupos protectores de tipo cetal cíclico, tales como 1,3-dioxano y similares; grupos protectores de tipo oxima, tales como O-metiloxima y similares; grupos protectores de tipo hidrazona, tales como N,N-dimetilhidrazona y similares, y similares.
Ejemplos del grupo protector de un grupo carboxilo incluyen grupos protectores de tipo éster, tales como éster de metilo y similares; grupos protectores de tipo amida tales como N,N-dimetilamida y similares, y similares.
Ejemplos del grupo protector de un tiol incluyen grupos protectores de tipo éter tales como bencil tioéter y similares; grupos protectores de tipo éster, tales como éster de tioacetato, tiocarbonato, tiocarbamato y similares, y similares.
Ejemplos del grupo protector de un grupo amino y un heterociclo aromático tales como imidazol, pirrol, indol y similares incluyen grupos protectores de tipo carbamato, tales como carbamato de bencilo y similares; grupos protectores de tipo amida, tales como acetamida y similares; grupos protectores de tipo alquilamina, tales como N-trifenilmetilamina y similares; grupos protectores de tipo sulfonamida tales como metanosulfonamida y similares, y similares.
Los grupos protectores se pueden eliminar de acuerdo con un método conocido per se, por ejemplo, empleando un método que usa ácido, base, rayos ultravioleta, hidrazina, fenilhidrazina, N-metilditiocarbamato de sodio, fluoruro de tetrabutilamonio, acetato de paladio, haluro de trialquilsililo (por ejemplo, yoduro de trimetilsililo, bromuro de trimetilsililo) y similares, un método de reducción y similares.
Cuando se lleva a cabo una reacción de reducción en cada paso, ejemplos del agente reductor a usar incluyen hidruros de metal, tales como hidruro de litio y aluminio, triacetoxiborohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, hidruro de diisobutilaluminio (DIBAL-H), borohidruro de sodio, triacetoxiborohidruro de tetrametilamonio y similares; boranos tales como complejo de borano y tetrahidrofurano y similares; níquel Raney; cobalto Raney; hidrógeno; ácido fórmico; trietilsilano y similares. Cuando se reduce un doble enlace o triple enlace carbono-carbono, se puede emplear un método que usa un catalizador tal como paladio-carbono, catalizador de Lindlar y similares.
Cuando se lleva a cabo una reacción de oxidación en cada paso, los ejemplos de un oxidante a usar incluyen peróxidos, tales como ácido m-cloroperbenzoico (mCPBA, por sus siglas en inglés), peróxido de hidrógeno, hidroperóxido de terc-butilo y similares; percloratos tales como perclorato de tetrabutilamonio y similares; cloratos tales como clorato de sodio y similares; cloritos tales como clorito de sodio y similares; peryodatos, tales como peryodato de sodio y similares; reactivos de yodo hipervalente, tales como yodosilbenceno y similares; reactivos que contienen manganeso tales como dióxido de manganeso, permanganato de potasio y similares; plomos tales como tetraacetato de plomo y similares; reactivos que contienen cromo, tales como clorocromato de piridinio (PCC, por sus siglas en inglés), dicromato de piridinio (PDC, por sus siglas en inglés), reactivo de Jones y similares; compuestos de halógeno tales como N-bromosuccinimida (NBS) y similares; oxígeno; ozono; complejo de trióxido de azufre piridina; tetraóxido de osmio; dióxido de selenio; 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ) y similares.
Cuando se lleva a cabo una reacción de ciclación de radicales en cada paso, los ejemplos del iniciador de radicales a usar incluyen compuestos azo, tales como azobisisobutironitrilo (AIBN) y similares; iniciadores de radicales solubles en agua, tales como ácido 4-4'-azobis-4-cianopentanoico (ACPA) y similares; trietilboro en presencia de aire u oxígeno; peróxido de benzoilo y similares. Los ejemplos del reactivo de radicales a utilizar incluyen tributilestannano, tristrimetilsililsilano, 1,1,2,2-tetrafenildisilano, difenilsilano, yoduro de samario y similares.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Wittig en cada paso, los ejemplos del reactivo de Wittig a utilizar incluyen alquiliden fosforanos y similares. Los alquiliden fosforanos pueden prepararse de acuerdo con un método conocidoper se,por ejemplo, sometiendo a reacción una sal de fosfonio con una base fuerte.
Cuando la reacción de Horner-Emmons se lleva a cabo en cada paso, ejemplos del reactivo a usar incluyen fosfonoacetatos, tales como dimetilfosfonoacetato de metilo, dietilfosfonoacetato de etilo y similares; y bases tales como hidruros de metales alcalinos, litios orgánicos y similares.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Friedel-Crafts en cada paso, se usa una combinación de un ácido de Lewis y un cloruro de ácido, o una combinación de un ácido de Lewis y un agente alquilante (por ejemplo, un haluro de alquilo, un alcohol, una olefina, etc.) como reactivo. De manera alternativa, un ácido orgánico o un ácido inorgánico también pueden usarse en lugar de un ácido de Lewis, y un anhídrido, tal como anhídrido acético y similares también pueden usarse en lugar de un cloruro de ácido.
Cuando se lleva a cabo una reacción de sustitución nucleofílica aromática en cada paso, se usan como reactivo un nucleófilo (por ejemplo, una amina, imidazol, etc.) y una base (por ejemplo, una base orgánica, etc.).
Cuando la reacción de adición nucleofílica por un carbanión, la reacción de adición 1,4 nucleofílica (reacción de adición de Michael) por un carbanión o la reacción de sustitución nucleofílica por un carbanión se lleva a cabo en cada paso, y los ejemplos de la base que se utilizará para la generación del carbanión incluyen litios orgánicos, alcóxidos metálicos, bases inorgánicas, bases orgánicas y similares.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Grignard en cada paso, los ejemplos del reactivo de Grignard a utilizar incluyen haluros de arilmagnesio tales como bromuro de fenilmagnesio y similares; y haluros de alquilmagnesio tales como bromuro de metilmagnesio y similares. El reactivo de Grignard puede prepararse de acuerdo con un método conocido per se, por ejemplo, sometiendo a reacción un haluro de alquilo o un haluro de arilo con magnesio metálico en un éter o tetrahidrofurano como un disolvente.
Cuando se lleva a cabo la reacción de condensación de Knoevenagel en cada paso, un compuesto que tiene un grupo metileno activado con dos grupos aceptores de electrones (por ejemplo, ácido malónico, malonato de dietilo, malononitrilo, etc.) y una base (por ejemplo, una base orgánica, un alcóxido metálico, una base inorgánica) se utilizan como reactivo.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Vilsmeier-Haack en cada paso, cloruro de fosforilo y un derivado de amida (por ejemplo, N,N-dimetilformamida etc.) se usan como un reactivo.
Cuando se lleva a cabo la reacción de azidación de un alcohol, un haluro de alquilo o un sulfonato en cada paso, los ejemplos del agente de azidación a utilizar incluyen difenilfosforilazida (DPPA, por sus siglas en inglés), trimetilsililazida, azida de sodio y similares. Por ejemplo, para la reacción de azidación de un alcohol, se emplea un método que usa difenilfosforilazida y 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), un método que usa trimetilsililazida y un ácido de Lewis, y similares.
Cuando se lleva a cabo una reacción de aminación reductiva en cada paso, ejemplos del agente reductor a ser usado incluyen triacetoxiborohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, hidrógeno, ácido fórmico y similares. Cuando el sustrato es un compuesto de amina, los ejemplos del compuesto de carbonilo que se va a usar incluyen paraformaldehído, aldehidos como acetaldehído y similares, y cetonas como ciclohexanona y similares. Cuando el sustrato es un compuesto de carbonilo, los ejemplos de la amina a utilizar incluyen amoníaco, aminas primarias tales como metilamina y similares; aminas secundarias tales como dimetilamina y similares, y similares.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Mitsunobu en cada paso, se usa un azodicarboxilato (por ejemplo, azodicarboxilato de dietilo (DEAD, por sus siglas en inglés), azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, por sus siglas en inglés), etc.) y una fosfina (por ejemplo, trifenilfosfina, tributilfosfina) como reactivo.
Cuando se lleva a cabo una reacción de esterificación, reacción de amidación o reacción de formación de urea en cada paso, los ejemplos del reactivo a utilizar incluyen haluros de acilo tales como cloruros de ácido, bromuros de ácido y similares; ácidos carboxílicos activados tales como anhídridos de ácido, ésteres activados, sulfatos y similares. Ejemplos del agente activador de ácido carboxílico incluyen agentes condensadores de carbodiimida, tales como hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (WSCD) y similares; agentes condensadores de triazina, tales como cloruro-n-hidrato de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMT-MM) y similares; agentes condensadores de carbonato, tales como 1,1-carbonildiimidazol (CDI) y similares; difenifosforil azida (DPPA); sal de benzotriazol-1-iloxi-trisdimetilaminofosfonio (reactivo BOP); yoduro de 2-cloro-1 -metil-piridinio (reactivo de Mukaiyama); cloruro de tionilo; haloformiatos de alquilo inferior, tales como cloroformiato de etilo y similares; hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU); ácido sulfúrico; combinaciones de los mismos y similares. Cuando se usa un agente de condensación de carbodiimida, se puede añadir al sistema de reacción un aditivo tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N-hidroxisuccinimida (HOSu), dimetilaminopiridina (DMAP) y similares.
Cuando se lleva a cabo una reacción de acoplamiento en cada paso, los ejemplos del catalizador metálico a usar incluyen compuestos de paladio, tales como acetato de paladio(II), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0), diclorobis(trifenilfosfina)paladio(II), diclorobis(trietilfosfina)paladio(II), tris(dibencilidenacetona)dipaladio(0), cloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno paladio(II) y similares, compuestos de níquel, tales como tetrakis(trifenilfosfino)níquel(0) y similares; compuestos de rodio, tales como cloruro de tris(trifenilfosfino)rodio(III) y similares; compuestos de cobalto; compuestos de cobre, tales como óxido de cobre, yoduro de cobre(I) y similares; compuestos de platino y similares. Además, se puede añadir una base al sistema de reacción, y los ejemplos de la misma incluyen bases inorgánicas y similares.
Cuando se lleva a cabo la reacción de tiocarbonilación en cada paso, se usa típicamente pentasulfuro de fósforo como agente tiocarbonilante. Alternativamente, un reactivo que tiene una estructura de 1,3,2,4-ditiadifosfetano-2,4-disulfuro (por ejemplo, 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,3,2,4-ditiadifosfetano-2,4-disulfuro (reactivo de Lawesson), etc.) también se puede utilizar en lugar de pentasulfuro de fósforo.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Wohl-Ziegler en cada paso, los ejemplos del agente halogenante a ser usado incluyen N-yodosuccinimida, N-bromosuccinimida (NBS), N-clorosuccinimida (NCS), bromo, cloruro de sulfurilo y similares. Además, la reacción puede acelerarse sometiendo un iniciador de radicales tal como calor, luz, peróxido de benzoílo, azobisisobutironitrilo y similares a la reacción del sistema de reacción.
Cuando se lleva a cabo la reacción de halogenación de un grupo hidroxi en cada paso, los ejemplos del agente halogenante que se utilizará incluyen ácidos hidrohálicos y haluros de ácido de ácidos inorgánicos, específicamente, ácido clorhídrico, cloruro de tionilo, oxicloruro de fósforo y similares para cloración, 48 % ácido bromhídrico y similares para la bromación. Además, se puede emplear un método para producir un haluro de alquilo haciendo reaccionar un alcohol con trifenilfosfina y tetracloruro de carbono o tetrabromuro de carbono o similares. Alternativamente, también se puede emplear un método para producir un haluro de alquilo mediante dos etapas que comprende convertir un alcohol en el correspondiente sulfonato y luego hacer reaccionar el sulfonato con bromuro de litio, cloruro de litio o yoduro de sodio.
Cuando se lleva a cabo la reacción de Arbuzov en cada paso, los ejemplos del reactivo a ser usado incluyen haluros de alquilo, tales como bromoacetato de etilo y similares; y fosfitos, tales como fosfito de trietilo, fosfito de tri(isopropilo) y similares.
Cuando se lleva a cabo una reacción de esterificación de sulfonato en cada paso, los ejemplos del agente sulfonante a usar incluyen cloruro de metanosulfonilo, cloruro de p-toluenosulfonilo, anhídrido metanosulfónico, anhídrido ptoluenosulfónico y similares.
Cuando se lleva a cabo reacción de hidrólisis en cada paso, se usa un ácido o una base como el reactivo. Para la reacción de hidrólisis ácida del éster terc-butílico, se puede añadir ácido fórmico, trietilsilano y similares para atrapar reductivamente el catión terc-butilo que es un subproducto.
Cuando se lleva a cabo una reacción de deshidratación en cada paso, ejemplos del agente deshidratante a ser usado incluyen ácido sulfúrico, pentaóxido de fósforo, oxicloruro de fósforo, N,N'-diciclohexilcarbodimiida, alúmina, ácido polifosfórico y similares.
El compuesto (I) puede ser producido a partir del compuesto (II) de acuerdo con el siguiente método.
en donde cada símbolo es como se definió anteriormente.
El compuesto (II) se puede producir de acuerdo con un método conocidoper seo un método análogo al mismo. El compuesto (III) se puede producir sometiendo el compuesto (II) a una reacción de amidación.
El compuesto (IV) se puede producir sometiendo el compuesto (III) a una reacción de Mitsunobu.
El compuesto (V) se puede producir sometiendo el compuesto (IV) a una reacción de reducción.
El compuesto (I) se puede producir sometiendo el compuesto (V) a una reacción de ciclación. Los ejemplos del reaccionante incluyen un aldehído, un cloruro de ácido y similares, que corresponden a -L- del Anillo D. Pueden añadirse al sistema de reacción hidrogenosulfito de sodio, trietilamina y similares.
En el compuesto (I) así obtenido, un grupo funcional intramolecular también puede convertirse en un grupo funcional objetivo mediante una combinación de reacciones químicas conocidasper se. Los ejemplos de la reacción química incluyen reacción de oxidación, reacción de reducción, reacción de alquilación, reacción de acilación, reacción de ureación, reacción de hidrólisis, reacción de aminación, reacción de esterificación, reacción de acoplamiento de arilo, reacción de desprotección y similares.
En el método de producción mencionado anteriormente, cuando un compuesto de partida tiene un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo carbonilo o un grupo mercapto como sustituyente, se puede introducir un grupo protector generalmente utilizado en la química de los péptidos en estos grupos, y el compuesto objetivo se puede obtener eliminando el grupo protector según sea necesario después de la reacción.
El compuesto (I) obtenido mediante el método de producción mencionado anteriormente puede aislarse y purificarse por medios conocidos, tales como extracción con disolvente, conversión líquida, transferencia de fases, cristalización, recristalización, cromatografía y similares.
Cuando el compuesto (I) contiene isómero óptico, estereoisómero, regioisómero y rotámero, estos compuestos también se incluyen en el compuesto (I) y cada uno puede obtenerse como un solo producto mediante un método de síntesis o un método de separación conocido per se. Por ejemplo, cuando existe un isómero óptico en el compuesto (I), un isómero óptico resuelto del compuesto también es abarcado en el compuesto (I).
Aquí, se puede producir un isómero óptico mediante un método conocido per se.
El compuesto (I) puede ser un cristal.
Se puede producir un cristal del compuesto (I) (de aquí en adelante algunas veces abreviado como el cristal de la presente invención) cristalizando el compuesto (I), aplicando un método de cristalización conocido per se.
En la presente memoria, el punto de fusión significa un punto de fusión medido, por ejemplo, por un aparato de micro punto de fusión (Yanako, MP-500D o Buchi, B-545), un aparato de análisis de calorimetría de barrido diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) (SEIKO, EXSTAR6000) y similares.
Generalmente, el punto de fusión a veces varía dependiendo del dispositivo de medición, las condiciones de medición y similares. El cristal en la presente memoria puede ser un cristal que muestre un punto de fusión diferente de los valores descritos en la presente memoria siempre que la diferencia esté dentro de un intervalo de error general. El compuesto mencionado anteriormente puede ser un hidrato, un no hidrato, un solvato o un no solvato.
Además, el compuesto mencionado anteriormente puede estar marcado o sustituido por isótopos (por ejemplo 2H, 3H, 11C, 14C, 18F, 35S, 125I y similares) y similares.
El compuesto mencionado anteriormente también incluye una forma de conversión de deuterio en donde 1H se convierte en 2H(D).
El compuesto mencionado anteriormente también incluye los tautómeros.
El compuesto mencionado anteriormente puede ser una sal de cocristal o cocristal farmacéuticamente aceptable. El cocristal o la sal de cocristal significa una sustancia cristalina constituida por dos o más sólidos especiales a temperatura ambiente, cada uno con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, estructura, punto de fusión, calor de fusión, higroscopicidad, solubilidad, estabilidad, etc.). El cocristal o la sal de cocristal pueden producirse mediante un método de cocristalización conocidoper se.
El promotor de maduración de cardiomiocitos de la presente invención se puede usar tal cual o mezclándolo con un vehículo farmacológicamente aceptable y formulando la mezcla de acuerdo con un método conocido per se.
Dado que el compuesto (I) tiene una excelente actividad para promover la maduración de un cardiomiocito, es útil como promotor de la maduración de un cardiomiocito. Por lo tanto, cultivando cardiomiocitos inmaduros en presencia del compuesto (I) o una sal del mismo, se pueden preparar cardiomiocitos maduros en un período más corto que cuando se cultivan solo en componentes del medio.
Como se usa en este documento, el término "pluripotencia" significa la capacidad de diferenciarse en varios tejidos o células que tienen diferentes morfologías y/o funciones, y de diferenciarse en cualquier serie de células de tres capas germinales. La “pluripotencia” no se puede diferenciar en blastodisco. Por lo tanto, la "pluripotencia" se distingue del término "totipotencia", que puede diferenciarse en cada tejido del cuerpo vivo, incluyendo el blastodisco, en que no tiene capacidad para formar un individuo.
Como se usa en la presente memoria, el término "multipotencia" significa capacidad para diferenciarse en una pluralidad de números limitados de series de células. Por ejemplo, las células madre mesenquimales, las células madre hematopoyéticas y las células madre neurales son multipotentes, pero no pluripotentes.
Como se usa en la presente memoria, los ejemplos de "células madre" incluyen células madre pluripotentes.
Los "cardiomiocitos" a los que se aplica el compuesto (I) no están particularmente limitados y se derivan preferiblemente de un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, hámster, conejo, gato, perro, vaca, oveja, cerdo, mono, humano), más preferiblemente derivado de ser humano.
Los cardiomiocitos cuya maduración puede ser promovida por el compuesto (I) no están particularmente limitados siempre que se pueda determinar que se encuentran en una etapa inmadura con base a los niveles de expresión, morfologías y estructuras de marcadores mencionados a continuación (por ejemplo, sarcómero, mitocondrias), propiedades (por ejemplo, pulsatilidad, madurez electrofisiológica) y similares.
Los cardiomiocitos cuya maduración puede ser promovida por el compuesto (I) también pueden ser células preparadas por inducción de diferenciación a partir de células madre pluripotentes, o cardiomiocitos inmaduros aislados de un cuerpo vivo (por ejemplo, cardiomiocitos derivados de un feto o recién nacido de ratón o rata).
Ejemplos de células madre pluripotentes incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias (ES, por sus siglas en inglés), células madre de línea germinal ("células GS", por sus siglas en inglés), células germinales embrionarias ("células EG", por sus siglas en inglés) y células madre pluripotentes inducidas (iPS, por sus siglas en inglés). Las células madre pluripotentes son preferiblemente células ES o células IPS.
(A) Células madre embrionarias
Las células ES son células madre establecidas a partir de la masa celular interna de un embrión temprano (por ejemplo, un blastocisto) de un mamífero como un ser humano, un ratón y similares, cuyas células tienen pluripotencia y capacidad de crecimiento por autorrenovación.
Las células ES son células madre derivadas de embriones que se originan en la masa celular interna de un blastocisto, que es el embrión formado después de la etapa de 8 células y la etapa de mórula de un óvulo fertilizado. Las células E<s>tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier célula que constituya un adulto, es decir, la denominada pluripotencia de diferenciación y la capacidad de crecimiento por autorrenovación. Las células ES se descubrieron en ratones en 1981 (M. J. Evans y M. H. Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), y esto fue seguido por el establecimiento de líneas de células ES de primates tales como humanos, monos y similares (J. A. Thomsonet al.(1998), Science 282: 1145-1147; J. A. Thomson etal.(1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; J. A. Thomson etal.(1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; J. A. Thomson y V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165).
Las células madre embrionarias se pueden establecer eliminando la masa celular interna del blastocisto de un óvulo fertilizado de un sujeto animal, seguido de cultivo de la masa celular interna en fibroblastos alimentadores. Las células se pueden mantener mediante subcultivo usando un medio de cultivo enriquecido con una sustancia o sustancias tales como factor inhibidor de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, por sus siglas en inglés) y similares. Los métodos de establecimiento y mantenimiento de células ES humanas y de mono se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.843.780 B; Thomson JA,et al.(1995), Proc Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7844-7848; Thomson JA, etal.(1998), Science. 282: 1145-1147; H. Suemori etal.(2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932; M. Ueno etal.(2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 9554-9559; H. Suemori etal.
(2001), Dev. Dyn., 222: 273-279; H. Kawasaki etal.(2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1580-1585; y Klimanskaya I, etal.(2006), Nature. 444: 481-485.
Con respecto al medio de cultivo para la preparación de células ES, las células ES humanas pueden mantenerse, por ejemplo, utilizando medio de cultivo Dm Em /F-12 enriquecido con 2-mercaptoetanol 0,1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, ácido L-glutámico 2 mM, 20 % de KSR y 4 ng/ml de bFGF a 37 °C en una atmósfera húmeda de 2 % de CO2/98 % de aire (O. Fumitaka etal.(2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224). Se requiere que las células ES se subcultiven cada 3 a 4 días, y el subcultivo se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, tripsina al 0,25 % y colagenasa IV 0,1 mg/mlml en PBS que contiene CaCb 1 mM y KSR al 20 %.
La selección de ES se puede llevar a cabo generalmente mediante el método de PCR en tiempo real usando, como un índice, la expresión de un marcador genético tal como fosfatasa alcalina, Oct-3/4, Nanog y similares. En particular, para la selección de células ES humanas, la expresión de un marcador genético como OCT-3/4, NANOG, ECAD y similares se puede utilizar como un índice (E. Kroon etal.(2008), Nat. Biotechnol., 26: 443-452).
Con respecto a las células ES, como células ES de ratón, se encuentran disponibles varias líneas celulares ES de ratón establecidas por el laboratorio de selección inGenious, Riken (Institute of Physical and Chemical Research), etc. y, como células ES humanas, están disponibles varias líneas celulares ES humanas establecidas por NIH, Riken, la Universidad de Kyoto, Cellartis, etc. Por ejemplo, los ejemplos de líneas celulares ES humanas incluyen la línea CHB-1 - CHB-12, línea RUES1, línea RUES2, línea HUES1 - HUES28, etc., de NIH, línea H1 y línea H9 de WisCell Research, y línea KhES-1, línea KhES-2, línea KhES-3, línea KhES-4, línea KhES-5, línea SSES1, línea SSES2, línea SSES3 etc., de Riken. Alternativamente, se pueden usar líneas celulares de grado clínico, líneas celulares de investigación o clínicas preparadas a partir de estas líneas celulares y similares.
Dado que las líneas celulares hES mencionadas se obtuvieron por destrucción de un embrión humano, no forman parte de la invención reivindicada.
(B) Células madre de línea germinal
Las células madre de línea germinal son células madre pluripotentes derivadas de los testículos y desempeñan un papel como origen de la espermatogénesis. De manera similar a las células ES, estas células pueden inducirse a diferenciarse en varias series de células y, por ejemplo, tienen la propiedad de permitir la preparación de un ratón quimérico mediante el trasplante de las células a un blastocisto de ratón (M. Kanatsu-Shinohara etal.(2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara etal.(2004), Cell, 119: 1001-1012). Las células madre de línea germinal son capaces de autorrenovarse en un medio de cultivo que contiene factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF, por sus siglas en inglés) y, al repetir su subcultivo en las mismas condiciones de cultivo que para las células ES, se pueden obtener células madre de la línea germinal (Masanori Takehashi etal.(2008), Experimental Medicine, 26(5) (edición extra): 41-46, Yodosha (Tokio, Japón)).
(C) Células germinales embrionarias
Las células germinales embrionarias se establecen a partir de células germinales primordiales fetales y tienen pluripotencia de manera similar a las células ES. Se pueden establecer cultivando células germinales primordiales en presencia de sustancias como LIF, bFGF, factor de células madre y similares (Y. Matsui etal.(1992), Cell, 70: 841 847; J. L. Resnick etal.(1992), Nature, 359: 550-551).
(D) Células madre pluripotentes inducidas
La "célula madre pluripotente inducida (iPSC, por sus siglas en inglés)" se refiere a una célula obtenida mediante la introducción de un determinado factor (factor de reprogramación nuclear) en una célula somática de mamífero o una célula madre indiferenciada para realizar la reprogramación. En la actualidad, existen varias “células madre pluripotentes inducidas”, y las que también se pueden utilizar son las siguientes: una iPSC establecida por Yamanaka, et al., mediante la introducción de cuatro factores, Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en un fibroblasto de ratón (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676); así como una iPSC derivada de una célula humana establecida mediante la introducción de los mismos cuatro factores en un fibroblasto humano (Takahashi K, Yamanaka S., etal.Cell,(2007) 131: 861-872.); una célula Nanog-iPS establecida mediante la introducción de los cuatro factores descritos anteriormente y luego realizando una selección con la expresión de Nanog como un índice (Okita, K., Ichisaka, T. y Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.); una célula iPS preparada con un método en el que c-Myc no está incluido (Nakagawa M, Yamanaka S., etal.Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106); y una célula iPS establecida mediante la introducción de seis factores con un método libre de virus (Okita K etal.Nat. Methods 2011 Mayo;8(5):409-12 , Okita K etal.Stem Cells. 31(3):458-66). Además, una célula madre pluripotente inducida preparada por Thomson, etal.,que se establece mediante la introducción de cuatro factores, OCT3/4, SOX2, NANOG y LIN28 (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), una célula madre pluripotente inducida preparada por Daley, etal.(Park IH, Daley GQ.et al.,Nature (2007) 451: 141-146), y una célula madre pluripotente inducida preparada por Sakurada,et al.(Solicitud de patente japonesa abierta al público No. 2008-307007), también puede ser usada.
Además, cualquiera de las células madre pluripotentes inducidas conocidas en la materia descritas en todos los artículos publicados (por ejemplo, Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol 3, Issue 5, 568-574; Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650; Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797), o patentes (por ejemplo, Solicitud de patente japonesa abierta al público No. 2008-307007, Solicitud de patente japonesa abierta al público No. 2008-283972, US 2008-2336610 , US 2009-047263, WO 2007-069666, WO 2008-118220, WO 2008-124133, WO 2008-151058, WO 2009-006930, WO 2009-006997, WO 2009-007852) también pueden usarse.
Como líneas celulares pluripotentes inducidas, están disponibles varias líneas iPSC establecidas por NIH, Riken, Universidad de Kyoto, etc. Por ejemplo, los ejemplos de líneas iPSC humanas incluyen la línea HiPS-RIKEN-1A, línea HiPS-RIKEN-2A, línea HiPS-RIKEN-12A y línea Nips-B2 de Riken, línea 253G1, línea 201B7, línea 409B2, línea 454E2, línea 606A1, línea 610B1 y línea 648A1 de la Universidad de Kyoto, y similares. Alternativamente, pueden usarse líneas celulares de grado clínico proporcionadas por la Universidad de Kyoto, Cellular Dynamics International, etc., líneas celulares de investigación o clínicas preparadas a partir de estas líneas celulares, y similares.
El término "células somáticas" utilizado en la presente invención significa cualquier célula animal (preferiblemente células de mamíferos, incluyendo ser humano) excluyendo las células de línea germinal y las células totipotentes tales como huevos, ovocitos, células ES y similares. Los ejemplos de células somáticas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las células somáticas fetales, células somáticas neonatales y células somáticas maduras, sanas o enfermas, así como cualquiera de las células cultivadas primarias, células subcultivadas y líneas celulares establecidas. Los ejemplos específicos de células somáticas incluyen (1) células madre de tejido (células madre somáticas) tales como células madre neurales, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre de pulpa dental y similares; (2) células progenitoras de tejido; (3) células diferenciadas como linfocitos, células epiteliales, células endoteliales, células musculares, fibroblastos (células de la piel, etc.), células ciliadas, células hepáticas, células de la mucosa gástrica, enterocitos, células del bazo, células pancreáticas (células exocrinas pancreáticas, etc.), células cerebrales, células pulmonares, células renales, adipocitos y similares.
En la presente invención, el individuo mamífero del que se recogen las células somáticas no está limitado, y preferiblemente es un ser humano. En los casos en los que las células iPS obtenidas se vayan a utilizar para la medicina regenerativa humana, se prefiere especialmente recoger células somáticas del propio paciente o de otra persona que tenga el mismo o sustancialmente el mismo tipo de antígeno leucocitario humano (HLA, por sus siglas en inglés) con vistas a la prevención de la reacción de rechazo. Aquí, "sustancialmente el mismo" tipo de HLA significa que el tipo de HLA coincide en un grado que permite la supervivencia de las células trasplantadas mediante el uso de uno o varios inmunosupresores y/o similares cuando las células se obtienen por inducción de diferenciación a partir de células iPS derivadas de las células somáticas se trasplantan al paciente. Por ejemplo, significa que la persona tiene los mismos HLA principales (por ejemplo, en los tres locus de genes HLA-A, h LA-B y HLA-DR) que los del paciente (lo mismo se aplica a continuación). Por otro lado, en los casos en que las células no se administran (trasplantan) a seres humanos, por ejemplo, en un método para probar la toxicidad de un fármaco candidato para los cardiomiocitos, el origen de las células somáticas que se utilizarán como fuente de las células iPS no está limitado. En los casos en que las células iPS se utilizan como fuente de células para selección para la evaluación de la sensibilidad al fármaco o los efectos secundarios en un paciente, se prefiere recolectar células somáticas del propio paciente o de otra persona que tenga el mismo polimorfismo(s) genético asociado con la sensibilidad del fármaco o los efectos secundarios.
Como se usa en la presente, el término "cardiomiocito" significa una célula que expresa al menos un gen marcador seleccionado del grupo que consiste en troponina cardíaca (cTNT), aMHC (cadena pesada de miosina a, MYH6) y pMHC (MYH7). Los ejemplos de cTNT incluyen el número de acceso NCBI NM_000364 en el caso de un ser humano y NM_001130176 en un caso de ratón. Los ejemplos de aMHC incluyen el número de acceso de NCBI NM_002471 en el caso de un ser humano y NM_001164171 en un caso de ratón. Los ejemplos de pMHC incluyen el número de acceso de NCBI NM_000257 en el caso de un ser humano y NM_080728 en un caso de ratón.
Se sabe que se produce un cambio de isoforma en el que la expresión de troponina I1 (TNNI1) disminuye y la expresión de troponina I3 (TNNI3) aumenta, a medida que maduran los cardiomiocitos (Fikru B. Bedada, (2014) 3(4): 594-605 Como se usa en la presente invención, "el cardiomiocito es madurado (maduro)" significa que al menos la expresión de TNNI3 aumenta.
Con respecto a los métodos para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en cardiomiocitos inmaduros, se pueden preparar cardiomiocitos a partir de células madre pluripotentes mediante, por ejemplo, un método descrito por Laflamme MA etal.(Laflamme MA & Murry CE, Nature 2011, Review).
Otros ejemplos del método incluyen, pero no se limitan a, un método en el que se preparan cardiomiocitos mediante la formación de masa celular (cuerpos embrioides) mediante cultivo en suspensión de células madre pluripotentes inducidas, un método en el que se preparan cardiomiocitos en presencia de una sustancia que suprime la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) (WO 2005/033298), un método en el que se preparan cardiomiocitos mediante la adición de Activina A y BMP en este orden (WO 2007/002136), un método en el que se preparan cardiomiocitos en presencia de una sustancia que promueve la activación de la vía de señalización canónica Wnt (WO 2007/126077), un método en el que las células positivas para Flk/KDR se aíslan de células madre pluripotentes inducidas, seguido de preparación de cardiomiocitos en presencia de ciclosporina A (WO 2009/118928), y similares.
Además, un método para inducir la diferenciación en cardiomiocitos utilizando citocinas mediante la formación de cuerpos embrioides (Yang L,et al.,Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cellderived population., Nature., 2008 mayo 22;453(7194):524-8), un método para inducir la diferenciación en cardiomiocitos mediante cultivo de adhesión en condiciones libres de citocinas (Lian X, et al., Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling., Proc Natl Acad Sci U S A., 2012 julio 3;109(27):E1848-57), un método para inducir la diferenciación en cardiomiocitos mediante el uso de combinación de cultivo de adhesión y cultivo en suspensión en condiciones libres de citocinas (Minami I, et al., A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xenofree conditions., Cell Rep., 2012 Nov 29;2(5):1448-60) y similares también se sugieren.
El medio para obtener cardiomiocitos inmaduros a partir de células madre pluripotentes no está particularmente limitado, y se pueden utilizar medios conocidosper se.Ejemplos de los mismos incluyen medio IMDM, medio Medium 199, medio mínimo esencial de Eagle (EMEM, por sus siglas en inglés), medio aMEM, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), medio Ham's F12, medio RPMI 1640, medio de Fischer, medio Neurobasal (Life Technologies), StemPro34 (Invitrogen), medio después de eliminar la disolución C de StemFit AK02 (AJINOMOTO AK02, 400 mlml de disolución A y 100 mlml de disolución B, total 500 ml), medio Essential 6 (Thermo Fischer Scientific) y sus medios mixtos, y similares.
A estos medios se pueden añadir aditivos conocidos per se, dependiendo de las células y las condiciones de cultivo. Por ejemplo, el medio puede contener suero o puede estar libre de suero. Si es necesario, el medio puede contener uno o más reemplazos de suero como albúmina, transferrina, Reemplazo de suero Knockout (KSR, por sus siglas en inglés) (reemplazo de suero para FBS durante el cultivo de células ES), suplemento N2 (Invitrogen), suplemento B27 (Invitrogen), ácidos grasos, insulina, precursores de colágeno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 1-tiolglicerol y similares, y también puede contener una o más sustancias tales como lípidos, aminoácidos, L-glutamina, Glutamax (Invitrogen), aminoácidos no esenciales, vitaminas, factores de crecimiento, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, antioxidantes, ácido pirúvico, tampones, sales inorgánicas y similares. Entre ellos, el medio preferido es StemPro34 o un medio después de la eliminación de la disolución C de StemFit AK02, cada uno de los cuales contiene transferrina, 1-tiolglicerol, L-glutamina y ácido ascórbico, o RPMI1640 que contiene un suplemento B27.
Se usa una combinación de activina A, BMP4 y bFGF, o CHIR99021 como aditivo inicial para la inducción de la diferenciación en cardiomiocitos usando el medio mencionado anteriormente.
En el caso de la combinación de activina A, BMP4 y bFGF, las concentraciones de uso de estos aditivos son preferiblemente de 1 ng/mlml a 100 ng/mlml para activina A, 1 ng/mlml a 100 ng/mlml para BMP4 y 1 ng/mlml a 100 ng/ml para bFGF, más preferiblemente 6 ng/mlml para activina A, 10 ng/mlml para BMP4 y 5 ng/mlml para bFGF.
En el caso de CHIR99021, la concentración de uso es preferiblemente de 100 nM a 100<j>M, más preferiblemente de 4 a 6 j M.
Después de la adición del aditivo mencionado anteriormente, mediante la adición de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) y un inhibidor de Wnt al medio, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en cardiomiocitos.
La concentración del VEGF a utilizar es preferiblemente de 1 a 100 ng/ml, más preferiblemente de 10 ng/ml.
Los ejemplos del inhibidor de Wnt incluyen la proteína DKK1 (por ejemplo, No. de acceso NCBI: NM_012242 en un caso de ser humano), esclerostina (por ejemplo, No. de acceso NCBI: NM_025237 en un caso de ser humano), IWR-1 (Merck Millipore), IWP-2 (Sigma-Aldrich), IWP-3 (Sigma-Aldrich), IWP-4 (Sigma-Aldrich), PNU-74654 (Sigma-Aldrich), XAV939 (Sigma-Aldrich) y derivados de los mismos, y similares. Entre ellos, se utilizan preferiblemente IWP-3, IWP-4 e IWR-1.
La concentración del inhibidor de Wnt a usar no está particularmente limitada siempre que inhiba Wnt, y es preferiblemente de 1 nM a 50 j M, particularmente preferiblemente de 1 a 2 j M.
El período de cultivo para la preparación de cardiomiocitos inmaduros a partir de células madre pluripotentes es, por ejemplo, de 5 a 365 días, preferiblemente de 5 a 100 días, más preferiblemente de 5 a 60 días, más preferiblemente de 5 a 40 días, aún más preferiblemente de 5 a 30 días.
La cantidad del compuesto que se utilizará como promotor de la maduración de cardiomiocitos de la presente invención no está particularmente limitada y es, por ejemplo, de 0,01 a 100 j M, preferiblemente de 0,1 a 30 j M, más preferiblemente de 1 a 10<j>M, por 1*104 a 1*107 células de cardiomiocitos inmaduros.
El promotor de maduración de cardiomiocitos de la presente invención puede contener el compuesto específico descrito en la presente memoria solo o en combinación de uno o más. Alternativamente, el promotor de maduración de cardiomiocitos de la presente invención puede contener una combinación de uno o más de los compuestos específicos descritos en la presente memoria y uno o más compuestos que tienen una actividad para promover la maduración de un cardiomiocito diferente a los descritos en la presente invención (por ejemplo, compuestos que se puede confirmar que tienen una actividad para promover la maduración de un cardiomiocito de acuerdo con los métodos descritos en los ejemplos experimentales aquí, por ejemplo, 2-metoxi-5-((Z)-2-(3,4,5-trimetoxifenil)vinil)fenol, carbamato de (1-etil-1H-benzotriazol-5-il)metil (2-(2-metoxi-4-metilfenil)-4-metil-1,3-tiazol-5-ilo), (2'beta)-22-oxovincaleucoblastina, 2-(2-(4-clorofenil)etil)-6-(2-furil)-3H-imidazo[4,5-b]piridina, 4,5-anhidro-1,2-didesoxi-4-metil-2-((N-(morfolin-4-ilacetil)-L-alanil-O-metil-L-tirosil)amino)-1-fenil-L-treo-pent-3-ulosa, 3-(3-metoxifenil) N7,N7-dimetilisoquinolina-1,7-diamina, metil 4-(2-bencilbenzoílo)-2,5-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato, 2'-(4-aminofenil)-1H, 1'H-2,5'-bibencimidazol-5-amina y sales de los mismos).
Como índice de madurez de los cardiomiocitos, se puede usar el nivel de expresión del marcador para la maduración, morfología y estructura de los cardiomiocitos (por ejemplo, sarcómero, mitocondrias), propiedad (por ejemplo, pulsatilidad, madurez electrofisiológica) y similares. Estos índices pueden confirmarse mediante un método conocidoper se.
Por ejemplo, el nivel de expresión del marcador para la maduración de los cardiomiocitos se puede analizar midiendo el nivel de expresión del gen marcador usando PCR; analizado por el nivel de expresión de la proteína marcadora usando transferencia Western y similares; o analizado mediante etiqueta fluorescente usando microscopio o citometría de flujo. El índice de madurez electrofisiológica se puede analizar mediante la profundidad del potencial de membrana en reposo utilizando la técnica de sujeción por parche y similares. El índice de microestructura de sarcómero o mitocondrias se puede observar con microscopio electrónico; analizado por etiqueta fluorescente usando microscopio o citometría de flujo; o función analizada por analizador de flujo extracelular, y similares
Los cardiomiocitos maduros obtenidos usando el compuesto (I) de la presente invención se pueden usar en medicina regenerativa cardíaca. Por ejemplo, una composición que comprende la masa celular de los cardiomiocitos preparada mediante el método de la presente invención puede administrarse al corazón de un paciente que padece una enfermedad cardíaca. Específicamente, los cardiomiocitos obtenidos mediante el método de la presente invención se pueden trasplantar directamente al corazón de un paciente que padece una enfermedad cardíaca como una suspensión celular, o en forma de una lámina de cardiomiocitos (una o varias capas). Por ejemplo, se hace referencia a los documentos WO 2012/133945, WO 2013/137491, WO 2014/192909 y WO 2016/076368 para el método de preparación de láminas de cardiomiocitos.
Los cardiomiocitos obtenidos mediante el uso del compuesto (I) de la presente invención también se pueden usar para la selección de fármacos o la evaluación de la cardiotoxicidad de fármacos para el tratamiento de enfermedades cardíacas, ya que los cardiomiocitos están homogéneamente maduros. Por ejemplo, administrando un fármaco de prueba a los cardiomiocitos obtenidos mediante el método de la presente invención, y luego midiendo la respuesta de los cardiomiocitos, se puede evaluar el efecto y la toxicidad del fármaco de prueba.
Los cardiomiocitos con automaticidad reducida, que se obtienen usando el compuesto (I) de la presente invención, pueden usarse en medicina regenerativa cardíaca.
Ejemplos
La presente invención se explica en detalle a continuación haciendo referencia a Ejemplos y Ejemplos experimentales. Sin embargo, los ejemplos no limitan la presente invención y los ejemplos pueden modificarse dentro del alcance de la presente invención.
La "temperatura ambiente" en los siguientes ejemplos es generalmente de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 35 °C. La proporción para la mezcla de disolventes es, a menos que se especifique lo contrario, una proporción de volumen de mezcla y el % significa % en peso a menos que se especifique lo contrario.
La elución por medio de cromatografía de columna en los ejemplos se realizó bajo observación mediante TLC (cromatografía en capa fina) a menos que se indique de manera particular. En la observación por TLC, se usó 60 F<254>fabricado por Merck como una placa de TLC, el disolvente usado como disolvente de elución en cromatografía en columna se usó como eluyente y se usó un detector UV para la detección. En cromatografía de columna de gel de sílice, la indicación de NH significa el uso de gel de sílice unido a aminopropilsilano y la indicación de diol significa el uso de gel de sílice unido a 3-(2,3-dihidroxipropoxi)propilsilano. En HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución) preparativa, la indicación de C18 significa el uso de gel de sílice unido a octadecilo. La relación de disolventes de elución es, a menos que se especifique de otra manera, una relación de mezclado de volumen.
La 1H NMR se midió mediante la NMR con transformada de Fourier. Para el análisis de 1H NMR, se usaron software ACD/SpecManager (nombre comercial) y similares. A veces no se describen picos de un grupo hidroxilo, un grupo amino y similares, que tienen un pico de protón muy suave.
MS se midió mediante LC/MS. Como método de ionización, se usó el método ESI o el método APCI. Los datos indican el valor medido real (encontrado). Aunque generalmente se observa un pico de iones moleculares, a veces se observa un fragmento de ion. En el caso de una sal, en general, se observa un pico de ion molecular o un pico de un fragmento de ion de una forma libre.
La unidad de concentración de la muestra (c) mediante rotación óptica ([a]<D>) es g/100 ml.
El valor de análisis elemental (Anal.) se describe como valor calculado (Calcd) y valor medido real (Encontrado). Los picos por difracción de rayos X en polvo en los Ejemplos significan picos medidos a temperatura ambiente usando Ultima IV (Rigaku Corporation, Japón) con radiación Cu Ka como fuente de radiación. Las condiciones de medición son como sigue.
Presión eléctrica/corriente eléctrica: 40 kV/50 mA
Velocidad de barrido: 6 grados/min
Intervalo de barrido de 2 Theta: 2-35 grados
La cristalinidad mediante difracción de rayos X en polvo en los ejemplos se calculó mediante el método de Hermans. En los siguientes ejemplos, se usan las siguientes abreviaturas.
pf: punto de fusión
MS: espectro de masas
M: concentración molar
N: normalidad
CDCb: cloroformo deuterado
DMSO-d<6>: dimetilsulfóxido deuterado
<1>H NMR: resonancia magnética nuclear de protón
LC/MS: cromatografía de líquidos acoplado a espectrometría de masas
ESI: ionización por electrospray
APCI: Ionización química a presión atmosférica
THF: tetrahidrofurano
MeOH: metanol
EtOH: etanol
TEA: trietilamina
DEAD: (E)-diazeno-1,2-dicarboxilato de dietilo
Ejemplo 1
2-(2-fenil-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il) isoindolin-1-ona
A) 5-(piperidin-1-il)-2-benzofuran-1(3H)-ona
A una mezcla de 5-bromo-2-benzofuran-1(3H)-ona (25,0 g), piperidina (13,92 ml) y tolueno (250 ml) se le añadió acetato de paladio (263 g), 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1 '-binaftilo (10,96 g) y carbonato de cesio (2678 g) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a 100 °C durante 12 h. A una mezcla se le añadió diclorometano, la impureza se eliminó mediante filtración a través de Celite y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo) para dar el compuesto del título (13,0 g). MS: [M+H]<+>218.
B) N-(4-amino-3-nitrofenil)-2-(hidroximetil)-4-(piperidin-1-il)benzamida
A una mezcla de 2-nitrobenceno-1,4-diamina (9,17 g) y THF (200 ml) se le añadió gota a gota una disolución de trimetilaluminio 2M en tolueno (65,89 ml) a 0 °C, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A la mezcla de reacción se le añadió una mezcla de 5-(piperidin-1-il)-2-benzofuran-1(3H)-ona (13,0 g) y THF (100 ml) a temperatura ambiente y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 h. A una mezcla se le añadió una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio a 0 °C, la impureza se eliminó mediante filtración a través de Celite y el filtrado se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se separó, se lavó con salmuera saturada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH/diclorometano) para dar el compuesto del título (3,35 g).
MS[M+H]+371.
C) 2-(4-amino-3-nitrofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de N-(4-amino-3-nitrofenil)-2-(hidroximetil)-4-(piperidin-1-il)benzamida (3,35 g), tributilfosfina (2,9 ml) y THF (130 ml) se le añadió DEAD (5,12 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió agua y acetato de etilo, y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con acetato de etilo y se secó para dar el compuesto del título (1,68 g).
MS[M+H]+353.
D) 2-(3,4-diaminofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de 2-(4-amino-3-nitrofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (1,68 g) y EtOH (80 ml) se añadió paladio al 10 % sobre carbono (1,68 g) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó en una atmósfera de hidrógeno de 3,4 atm (344 kPa), a temperatura ambiente durante 12 h. El catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida para dar el compuesto del título (1,0 g).
MS[M+H]+323.
E) 2-(2-fenil-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de 2-(3,4-diaminofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (0,075 g) y THF (2 ml) se le añadió TEA (0,035 ml) y una mezcla de cloruro de benzoílo (0,027 ml) y THF (1 ml) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 min y luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y la disolución de reacción se concentró. El residuo obtenido se repartió entre acetato de etilo-THF-agua y la capa orgánica se lavó con una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y salmuera saturada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. Al residuo obtenido se le añadió MeOH (5 ml) y ácido clorhídrico conc. (0,3 ml), la mezcla se calentó a reflujo durante 12 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con acetato de etilo y se secó para dar el compuesto del título (0,037 g).
Ejemplo 2
2-(2-bencil-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de fenilacetaldehído (0,046 g) y EtOH (2 ml) se le añadió hidrogenosulfito de sodio (0,181 g) y 2-(3,4-diaminofenil)-5 (piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (0,125 g) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió agua y el sólido resultante se recogió por filtración y se lavó con agua. El residuo se purificó mediante HPLC (columna L ODS 2, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contiene ácido fórmico al 0,1 %)) para dar el compuesto del título (0,024 g).
Ejemplo 3
2-(2-(4-(benciloxi)fenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de 4-(benciloxi)benzaldehído (0,082 g) y EtOH (2 ml) se le añadió hidrogenosulfito de sodio (0,181 g) y 2-(3,4-diaminofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (0,125 g) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo se le añadió agua y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó. El residuo se purificó por HPLC (columna L ODS 2, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contiene acetato de amonio 10 mM)) para dar el compuesto del título (0,030 g).
Ejemplo 4
2-(2-(4-hidroxifenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de 2-(2-(4-(benciloxi)fenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (0,150 g), MeOH (6 ml) ) y THF (3 ml) se añadió paladio al 10 % sobre carbono (0,1 g) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a presión normal de una atmósfera de hidrógeno, a temperatura ambiente durante 16 h. El catalizador se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se lavó con éter dietílico y MeOH y se secó para dar el compuesto del título (0,070 g).
Ejemplo 5
(4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acetato de metilo
A una mezcla de (4-formilfenoxi)acetato de metilo (0,120 g) y EtOH (3 ml) se le añadió hidrogenosulfito de sodio (0,290 g) y 2-(3,4-diaminofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolina-1-ona (0,2 g) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió agua y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó. El sólido obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH/diclorometano) para dar el compuesto del título (0,120 g).
Ejemplo 6
Ácido (4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acético
A una mezcla de (4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acetato de metilo (1,3 g), THF (13 ml) y agua (13 ml) se le añadió hidróxido de litio (0,330 g) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y se añadió agua a la disolución de reacción. La mezcla se repartió entre acetato de etilo-agua y la capa acuosa se acidificó con ácido clorhídrico 1 N (pH <4). El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y MeOH, y se secó para dar el compuesto del título (0,710 g).
Ejemplo 8
2-(2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(morfolin-4-il)isoindolin-1-ona
A) 5-(4-morfolinil)-2-benzofuran-1 (3H)-ona
Una mezcla de acetato de paladio (0,948 g), 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1 '-binaftilo (3,95 g), carbonato de cesio (9,64 g) y tolueno (70 ml) se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 5 min. A esta mezcla se le añadieron 5-bromo-2-benzofuran-1(3H)-ona (9,0 g) y morfolina (4,4 ml) y la mezcla se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno a 100 °C durante 4 h. La mezcla se enfrió y se concentró a presión reducida. Se añadió cloroformo al residuo, se eliminó la sustancia insoluble mediante filtración a través de Celite y se concentró el filtrado a presión reducida. Al residuo se le añadió acetato de etilo y el sólido resultante se recogió por filtración para dar un producto en bruto. El producto en bruto se cristalizó en THF y acetato de etilo para dar el compuesto del título (6,39 g).
<1>H NMR (200 MHz, CDCl<a>) 83,31-3,36 (4H, m), 3,85-3,90 (4H, m), 5,22 (2H, s), 6,82 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 8,8, 2,2 Hz), 7,77 (1H, d, J = 8,8 Hz).
B) 2-(4-bromofenil)-5-nitro-1 H-bencimidazol
A una mezcla de 4-nitrobenceno-1,2-diamina (5,0 g), trietilamina (5,0 ml) y THF (80 ml) se le añadió gota a gota una mezcla de cloruro de 4-bromobenzoílo (7,17 g) y THF (20 ml) a 0 °C, y la mezcla se agitó durante 30 min y luego a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se concentró a presión reducida, se le añadió una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua para dar un producto en bruto. A una mezcla de este producto en bruto y metanol (100 ml) se le añadió ácido clorhídrico conc. (10 ml) y la mezcla se agitó a 80 °C durante 22 horas y se concentró a presión reducida. Al residuo se le añadió una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio, y el sólido resultante se recogió por filtración y se lavó sucesivamente con agua y acetato de etilo para dar el compuesto del título (8,84 g).
<1>H NMR (200 MHz, DMSO-d<6>) 87,71 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,81 (1H, dd, J = 9,0, 0,6 Hz), 8,17 (1H, dd, J = 8,9, 2,3 Hz), 8,28 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,50 (1H, d, J = 2,0 Hz).
C) 2-(4-bromofenil)-1 H-bencimidazol-5-amina
Se agitó una mezcla de 2-(4-bromofenil)-5-nitro-1H-bencimidazol (7,68 g), cloruro de estaño (II) dihidrato (27,2 g) y etanol (300 ml) a 65 °C durante 3 h. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se ajustó a pH=8 con una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y se concentró a presión reducida. Al residuo se le añadió acetato de etilo y agua, la sustancia insoluble se eliminó por filtración a través de Celite, y la capa acuosa se separó y se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y salmuera saturada, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron a presión reducida. El residuo se lavó con acetato de etilo para dar el compuesto del título (5,61 g).1
<1>H NMR (200 MHz, DMSO-d<6>) 84,96 (2H, br), 6,54 (1H, dd, J = 8,7, 2,1 Hz), 6,67 (1H, s), 7,29 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,70 (2H, d, J = 8,6 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 12,18 (1H, brs).
D) N-(2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-2-(hidroximetil)-4-(4-morfolinil)benzamida
A una mezcla de 2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-amina (1,0 g) y THF (100 ml) se le añadió gota a gota una disolución en hexano 1 M (13,9 ml) de cloruro de dimetilaluminio y la mezcla se agitó durante 5 min. Se le añadió 5-(4-Morfolinil)-2-benzofuran-1(3H)-ona (760,9 mg) y la mezcla se agitó durante 4 días. Se le añadió ácido clorhídrico 0,005 N en pequeñas porciones y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó sucesivamente con ácido clorhídrico 0,005 N, agua, disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y agua para dar un producto en bruto.
El producto se cristalizó a partir de THF-metanol para dar el compuesto del título (1,033 g).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d<a>) 83,22 (4H, m), 3,77 (4H, m), 4,69 (2H, d, J = 4,3 Hz), 5,43 (1H, t, J = 4,8 Hz), 6,93 (1H, dd, J = 8,7, 2,5 Hz), 7,16 (1H, d, J = 2,4 Hz), 7,44 (1H, s), 7,57 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,77 (2H, m), 8,09 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,20 (1H, s), 10,33 (1H, s), 12,92 (1H, s).
E) 2-(2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(morfolin-4-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de N-(2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-2-(hidroximetil)-4-(4-morfolinil)benzamida (0,95 g) y N,N-dimetilformamida (10 ml) se añadió tributilfosfina (1,75 ml), y luego se añadió gota a gota DEAD (1,36 ml). La mezcla se agitó durante 1 hora y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió acetato de etilo y una pequeña cantidad de agua, y la mezcla se calentó a reflujo durante 3 min. La mezcla se enfrió y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con acetato de etilo y se secó para dar el compuesto del título (807 mg).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 83,29 (4H, t, J = 4,7 Hz), 3,77 (4H, t, J = 4,3 Hz), 4,99 (2H, s), 7,11 (2H, m), 7,72 (5H, m), 8,14 (3H, m), 13,00 (1H, s).
Ejemplo 17
N-(1,1-dióxido-2,3-dihidro-1-benzotiofen-5-il)-2-(4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acetamida
A una mezcla de ácido (4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acético (15 mg), N,N-diisopropiletilamina (0,027 ml) y N,N-dimetilacetamida (1 ml), se añadió hexafluorofosfato de cloro-N,N,N',N'-bis(tetrametilen)formamidinio (16 mg) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 h. A una mezcla se le añadió 1, 1 -dióxido de 5-amino-2,3-dihidrobenzo[b]tiofeno (11,4 mg) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 3 días. La mezcla se filtró y el residuo se purificó por HPLC (YMCTriartC18, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contenía bicarbonato de amonio 10 mM)) para dar el compuesto del título (8,7 mg).
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 1,57-1,67 (6H, m), 3,36-3,39 (6H, m), 3,53-3,61 (2H, m), 4,87 (2H, s), 4,95 (2H, s), 7,01-7,13 (2H, m), 7,14-7,22 (2H, m), 7,49-7,79 (5H, m), 7,91 (1H, s), 7,98-8,28 (3H, m), 10,57 (1H, brs), 12,78 (1H, brs).
Ejemplos 9 a 16 y 18 a 28
A una mezcla de ácido 4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acético (0,029 g, 0,06 mmol), hexafluorofosfato de cloro-N,N,N',N'-bis(tetrametilen) formamidinio (0,030 g) y N,N-dimetilacetamida (1 ml), se añadió gota a gota N,N-diisopropiletilamina (0,052 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 h. A una mezcla se le añadió la amina correspondiente (0,12 mmol) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 2 h. A una mezcla se le añadió agua (0,5 ml) y la mezcla se concentró a 60 °C. El residuo se purificó por HPLC (YMCTriartC18, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contiene bicarbonato de amonio 10 mM)) para dar los compuestos de los Ejemplos 9 a 16 y 18 a 28.
Ejemplos 29 a 38
Una mezcla de la amina correspondiente (0,16 mmol), ácido 2-(4-(5-(5-morfolino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindolin-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acético (0,039 g, 0,08 mmol) (sintetizado de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 de los pasos A a C y los Ejemplos 5 y 6, excepto el uso de morfolina en lugar de piperidina), O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluroniohexafluorofosfato (0,037 g), N,N-diisopropiletilamina (0,056 mmol) y N,N-dimetilformamida (1 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y la mezcla se concentró a 60°C. El residuo se purificó por HPLC (YMCTriartC18, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contenía bicarbonato de amonio 10 mM)) para dar los compuestos del Ejemplo 29 a 38.
Ejemplo 45
5-(piperidin-1-il)-2-(2-(piridin-4-il)-1H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona
A una mezcla de 2-(3,4-diaminofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (0,125 g) y THF (3 ml) se le añadió TEA (0,119 ml) y una mezcla de clorhidrato de cloruro de isonicotinoilo (0,069 g) y THF (2 ml) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 30 min y luego a temperatura ambiente durante 16 h, y la disolución de reacción se concentró. El residuo obtenido se repartió entre acetato de etilo-THF-agua y la capa orgánica se lavó con una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y salmuera saturada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida. Al residuo obtenido se le añadió MeOH (10 ml) y ácido clorhídrico conc. (0,6 ml) y la mezcla se calentó a reflujo a 70 °C durante 16 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió una disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y el sólido resultante se recogió por filtración para dar un producto en bruto. Este producto en bruto se purificó por HPLC (columna L ODS 2, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contiene bicarbonato de amonio 10 mM)) para dar el compuesto del título (32 mg).1
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 81,62 (6H, brs), 3,37 (4H, brs), 4,96 (2H, s), 7,07-7,10 (2H, m), 7,57 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,69 (2H, q, J = 8,7 Hz), 8,09 (2H, d, J = 4,6 Hz), 8,19 (1H, s), 8,74 (2H, d, J = 4,9 Hz).
Ejemplo 46
5-(piperidin-1-il)-2-(2-(piridin-3-M)-1 H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1 -ona
A una mezcla de nicotinaldehído y EtOH se le añadió hidrogenosulfito de sodio (0,290 g) y 2-(3,4-diaminofenil)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona (0,200 g) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y la disolución de reacción se concentró. Al residuo obtenido se le añadió agua y el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para dar un producto en bruto. Este producto en bruto se purificó por HPLC (columna L ODS 2, fase móvil: agua/acetonitrilo (que contiene bicarbonato de amonio 10 mM)) para dar el compuesto del título (48 mg).
<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d<6>) 8 1,62 (6H, brs), 3,37 (4H, brs), 4,96 (2H, d, J = 7,0 Hz), 7,07-7,10 (2H, m), 7,56-7,60 (3H, m), 7,72 (0,6H, d, J = 8,5 Hz), 7,88 (0,4H, d, J = 8,5 Hz), 8,09 (0,4H, brs), 8,29 (0,6H, brs), 8,47-8,51 (1H, m), 8,67-8,68 (1H, m), 9,34-9,36 (1H, m), 13,10 (1H, brs).
Los compuestos de los ejemplos se muestran en las siguientes tablas. MS en las tablas significa valor medido real. Los compuestos de los Ejemplos 7, 39 a 44 y 47 a 73 en las siguientes tablas se sintetizaron de acuerdo con los métodos mostrados en los Ejemplos mencionados anteriormente o un método análogo a los mismos.
Tabla 1-1
Tabla 1-2
Tabla 1-3
Tabla 1-4
Tabla 1-5
Tabla 1-6
Tabla 1-7
Tabla 1-8
Tabla 1-9
Tabla 1-10
Tabla 1-11
Tabla 1-12
Tabla 1-13
Tabla 1-14
Tabla 1-15
Tabla 1-16
Tabla 1-17
Tabla 1-18
Tabla 1-19
Tabla 1-20
Tabla 1-21
Tabla 1-22
Tabla 1-23
Tabla 1-24
Tabla 1-25
Ejemplo experimental 1
Para la detección de la maduración de los cardiomiocitos, se prepararon líneas celulares iPS humanas con doble knock-in (inserción), en las que las secuencias de proteínas indicadoras, EmGFP (Secuencia número 1) y mCherry (Secuencia número 2) se insertaron en los locus de genes para TNNI1 y TNNI3, respectivamente (las células iPS humanas se prepararon a partir de un vector episomal (gen cargado; OCT3/4, KLF4, SOX2, L-MYC, LIN28, p53DD de ratón) usando PBMC (LP_167, ID de muestra:20130318) adquirido de CTL (bibliografía de referencia; Okita Ket. all.
Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)).
El cultivo de mantenimiento de las líneas celulares de iPS indicadoras mencionadas anteriormente se llevó a cabo mediante un método convencional (Okita K, etal.Stem Cells. 2012 nov 29. doi: 10.1002/stem.1293).
Para la inducción de la diferenciación en cardiomiocitos, las líneas celulares iPS indicadoras se trataron con 0,5*TrypLE select (Life Technologies, diluido en 1/2 con EDTA/PBS 0,5 mM) durante 4 a 5 minutos, y las células se exfoliaron con un raspador de células (IWAKI), y luego se disocian en las células individuales mediante pipeteo. El medio se retiró por centrifugación (1000 rpm, 5 min), y las células obtenidas se sembraron en un biorreactor (ABLE) en 1*107 células por 30 ml de biorreactor, y luego se cultivaron en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, Inhibidor de Rock 10 pM (Y-27632), 2 ng/ml de BMP4 (R&D) y 0,5 % de Matrigel (Factor de crecimiento reducido) a un medio después de eliminar la disolución C de StemFit Ak 02 (AJINOMOTO AK02, 400 ml de disolución A y 100 ml de disolución B, total 500 ml), a 37 °C, en condiciones de oxígeno al 5 % (55 rpm, método de cultivo en suspensión agitada) para formar cuerpos embrioides (día 0).
Al día siguiente (1er día), 9 pL (concentración final 3 ng/ml) de 10 pg/ml de activina A, 15 pL (concentración final 5 ng/ml) de 10 pg/ml de bFGF y 24 pL (concentración final 10 ng/ml) de 10 pg/ml de BMP4 se añadieron al biorreactor, y las células se cultivaron a 37 °C durante 2 días adicionales, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Luego (3er día), los cuerpos embrioides obtenidos se recolectaron en un tubo de centrífuga de 50 ml y luego se sometieron a centrifugación (200 g, 1 min). Se retiró el medio y se cultivaron los cuerpos embrioides en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 ng/ml de VEGF, IWP-3 1 pM, dorsomorfina 0,6 pM y SB431542 5,4 pM a un medio después de la eliminación de la disolución C de StemFit AK02 (AJINOMOTO AK02, 400 ml de disolución A y 100 ml de disolución B, total 500 ml), a 37 °C por 3 días, en condiciones de oxígeno al 5 % (55 rpm, método de cultivo en suspensión agitada).
Luego (6° día), se dejó reposar el biorreactor para que precipitaran los cuerpos embrioides y se eliminó del 80 al 90 % del medio. Un medio preparado mediante la adición de 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a un medio después de la eliminación de la disolución C de StemFit AK02 (AJINOMOTO AK02, 400 ml de disolución A y 100 ml de disolución B, total 500 ml) se añadió al biorreactor para que el volumen total fuera de 30 ml, y los cuerpos embrioides se cultivaron durante 8 días, a 37 °C, en condiciones de oxígeno al 5 % (55 rpm, método de cultivo en suspensión agitada). Durante el cultivo, el medio se reemplazó con un medio en las mismas condiciones cada 2 a 3 días.
El día 14 después del inicio de la inducción de la diferenciación, los cuerpos embrioides se trataron con 2 mg/ml de colagenasa tipo I (Sigma) durante 2 horas, y luego con tripsina al 0,25 %/EDTA (Invitrogen) durante 10 minutos. Se añadió FBS al 50 %/IMDM (Thermo Fisher Science) y los cuerpos embrioides se disociaron en células individuales mediante pipeteo y luego se sometieron a centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 100 ml de medio AK02 basado en medio StemFit AK02 para la diferenciación de cardiomiocitos (preparado mediante la adición de ácido ascórbico 50 |jg/ml, L-glutamina 2 mM, transferrina 150 mg/ml, monotioglicerol 4*10'4 M y VEGF 5 ng/ml a AJINOMOTO AK02 (400 ml de disolución A y 100 ml de disolución B, total 500 ml)). Las células resuspendidas se sembraron en CellCarrier-384 Ultra Microplate (Perkin Elmer/6057300) pre-recubiertas con iMatrix-511 (comprado en Nippi, Inc.) en 1,0*104 células/pocillo, y se cultivaron en medio AK02 basado en Medio StemFit AK02 para la diferenciación de cardiomiocitos (preparado agregando ácido ascórbico 50 jg/ml, L-glutamina 2 mM, transferrina 150 mg/ml y monotioglicerol 4*10'4 M a AJINOMOTO AK02 (400 ml de disolución A y 100 ml de disolución B , total 500 ml) por 70 jL/pocillo).
El compuesto de prueba (1 o 30 j M, un compuesto por pocillo) se añadió a los pocillos en 50 jL/pocillo en el tercer y sexto día de cultivo. En el octavo día de cultivo, las células se fijaron con paraformaldehído (Wako Pure Chemical Corporation, 163-20145) y se sometieron a inmunotinción utilizando anti-mCherry de rata (Invitrogen, M11217) como anticuerpo primario y como anticuerpo secundario cabra anti IgG de rata Alexa 647 (Invitrogen, A-21247). El nivel de expresión de Alexa 647 se midió mediante el sistema HCS (cribado de alto contenido) (Perkin Elmer/OperaPhenix High Contents Imaging System) (modo de disparo; lente objetivo no confocal; 10*aire NA0.3).
La intensidad fluorescente promedio (promedio de n=60) del pocillo control (sin adición del compuesto de prueba) fue 797, calculada a partir de las intensidades fluorescentes medidas. Los resultados se muestran en la Tabla 2 (promedio de n=3 (Ejemplo 1 a 7, 9 a 59, 61 a 71) o n=6 (Ejemplo 8, 60, 72 y 73)). El símbolo “-” en la Tabla 2 significa que la intensidad fluorescente promedio no se puede evaluarse debido a la disminución de células.
Tabla 2-1
Tabla 2-2
Tabla 2-3
Ejemplo experimental 2
Para la detección de la maduración de los cardiomiocitos, se prepararon líneas celulares iPS humanas con doble knock-in (inserción), en las que las secuencias de proteínas indicadoras, EmGFP (Secuencia número 1) y mCherry (Secuencia número 2) se insertaron en los locus de genes para TNNI1 y TNNI3, respectivamente (las células iPS humanas se prepararon a partir de un vector episomal (gen cargado; OCT3/4, KLF4, SOX2, L-MYC, LIN28, p53DD de ratón) usando PBMC (LP_167, ID de muestra:20130318) adquirido de CTL (bibliografía de referencia; Okita Ket al.
Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)).
El cultivo de mantenimiento de las líneas celulares de iPS indicadoras mencionadas anteriormente se llevó a cabo mediante un método convencional (Okita K, etal.Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293).
Para la inducción de la diferenciación en cardiomiocitos, las líneas celulares iPS indicadoras se trataron con 0,5*TrypLE select (Life Technologies, diluido en 1/2 con EDTA/PBS 0,5 mM) durante 4 a 5 minutos, y las células se exfoliaron con un raspador de células (IWAKI), y luego se disocian en las células individuales mediante pipeteo. El medio se retiró por centrifugación (1000 rpm, 5 min) y las células obtenidas se suspendieron en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 |jg/ml, ácido ascórbico 50 |jg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 jM de inhibidor Rock (Y-27632), 2 ng/ml de BMP4 (R&D) y 0,5 % de Matrigel (Factor de crecimiento reducido) a stemPro-34 SFM (ThermoFisher) en una placa de 6 pocillos en 2x106 células/1,5 ml/pocillo, y luego se sometió a cultivo estático a 37 °C, en condiciones de oxígeno al 5 % para formar cuerpos embrioides (día 0).
Al día siguiente (1er día), un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 jg/ml, ácido ascórbico 50 jg/m l (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 1,8 jL (concentración 12 ng/ml) de 10 jg/m l de activina A, 15 jL (concentración 10 ng/ml) de 10 jg/m l de bFGF y 2,7 jL (concentración 18 ng/ml) de 10 jg/m l de BMP4 a 1,5 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene los cuerpos embrioides para ajustar el volumen combinado con el medio de 0 días a los 3 ml finales (activina A: 6 ng/ml, bFGF: 5 ng/ml, BMP4: 10 ng/ml), y los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días adicionales, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Luego (tercer día), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y después se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se añadió medio IMDM (ThermoFisher) a cada pocillo y, como se indicó anteriormente, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 jg/ml, ácido ascórbico 50 jg/m l (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 ng/ml de VEGF, 1 jM de IWP-3, 0,6 jM de dorsomorfina y 5,4 jM de SB431542 a 3 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 3 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Después (sexto día), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 jg/ml, ácido ascórbico 50 jg/m l (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher ) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Después (octavo día), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando (1) 1 % de L-glutamina, transferrina 150 jg/ml, ácido ascórbico 50 jg/m l (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF, y (2) el compuesto de prueba (cada 3 jM ) que se muestra en la Tabla 3 o DMSO (adición de 0,1 % con respecto al volumen del medio) a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Además (día 10), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando (1) 1 % de L-glutamina, transferrina 150 jg/ml, ácido ascórbico 50 jg/m l (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF, y (2) el compuesto de prueba (cada 3 jM ) que se muestra en la Tabla 3 o DMSO (adición de 0,1 % en relación con el volumen del medio) a 3 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 6 días, en condiciones generales de oxígeno. El día 13, el medio se reemplazó con un medio en las mismas condiciones.
El día 16, después de fotografiar los cuerpos embrioides en cada condición con un microscopio de fluorescencia, se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se agregaron 2 ml de PBS a cada pocillo y, como anteriormente, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el PBS para no succionar los cuerpos embrioides. A cada pocillo se le añadió una disolución preparada mediante la adición de DNasa 10 jg/m l y Liberasa 100 jg/m l a 3 ml de IMDM, y la placa se dejó reposar a 37 °C durante 1 hora, en condiciones generales de oxígeno. Después de 1 hora, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se agregaron 2 ml de PBS a cada pocillo y, como anteriormente, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el PBS para no succionar los cuerpos embrioides. Se añadió a cada pocillo una disolución preparada mediante la adición de DNasa 10 jg/m l a 2 ml de TrypLE select y se dejó la placa en reposo a 37 °C durante 10 minutos, en condiciones generales de oxígeno. Luego, un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 jg/ml, ácido ascórbico 50 jg/m l (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 5 ng/ml de VEGF y DNasa 10 jg/m l a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo, y los cuerpos embrioides se disociaron en células individuales mediante pipeteo, y luego se sometieron a centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante, las células se suspendieron en 1 a 2 ml de FBS/PBS al 2 % y se analizó la expresión de mCherry en células TNNI1 mediante citometría de flujo (clasificador de células BD FACSAria Fusion). Los resultados se muestran en la tabla 3 y en las figuras 1 a 7.
Tabla 3
Ejemplo experimental 3
Para la detección de la maduración de los cardiomiocitos, se prepararon líneas celulares iPS humanas con doble knock-in (inserción), en las que las secuencias de proteínas indicadoras, EmGFP (Secuencia número 1) y mCherry (Secuencia número 2) se insertaron en los locus de genes para TNNI1 y TNNI3, respectivamente (las células iPS humanas se prepararon a partir de un vector episomal (gen cargado; OCT3/4, KLF4, SOX2, L-MYC, LIN28, p53DD de ratón) usando PBMC (LP_167, ID de muestra:20130318) adquirido de CTL (bibliografía de referencia; Okita Ket al.
Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293)).
El cultivo de mantenimiento de las líneas celulares de iPS indicadoras mencionadas anteriormente se llevó a cabo mediante un método convencional (Okita K, etal.Stem Cells. 2012 Nov 29. doi: 10.1002/stem.1293).
Para la inducción de la diferenciación en cardiomiocitos, las líneas celulares iPS indicadoras se trataron con 0,5*TrypLE select (Life Technologies, diluido en 1/2 con EDTA/PBS 0,5 mM) durante 4 a 5 minutos, y las células se exfoliaron con un raspador de células (IWAKI), y luego se disocian en las células individuales mediante pipeteo. El medio se retiró por centrifugación (1000 rpm, 5 min) y las células obtenidas se suspendieron en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 pM de inhibidor Rock (Y-27632), 2 ng/ml de Bm P4 (R&D) y 0,5 % de Matrigel (Factor de crecimiento reducido) a StemPro-34 SFM (ThermoFisher) en una placa de 6 pocillos en 2x106 células/1,5 ml/pocillo, y luego se sometió a cultivo estático a 37 °C, en condiciones de oxígeno al 5 % para formar cuerpos embrioides (día 0).
Al día siguiente (1er día), un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 1,8 pL (concentración 12 ng/ml) de 10 pg/ml de activina A, 15 pL (concentración 10 ng/ml) de 10 pg/ml de bFGF y 2,7 pL (concentración 18 ng/ml) de 10 pg/ml de BMP4 a 1,5 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene los cuerpos embrioides para ajustar el volumen combinado con el medio de 0 días a los 3 ml finales (activina A: 6 ng/ml, bFGF: 5 ng/ml, BMP4: 10 ng/ml), y los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días adicionales, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Luego (tercer día), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y después se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se añadió medio IMDM (ThermoFisher) a cada pocillo y, como se indicó anteriormente, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 ng/ml de VEGF, 1 pM de IWP-3, 0,6 pM de dorsomorfina y 5,4 pM de SB431542 a 3 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 3 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Después (sexto día), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Después (octavo día), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando (1) 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF, y (2) el compuesto del Ejemplo 8 (3 pM) o DMSO (adición del 0,1 % con respecto al volumen del medio) a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
En el décimo día, el medio se reemplazó con un medio preparado mediante la adición de (1) 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF y (2) Compuesto A (40 nM, la estructura se muestra a continuación), o una mezcla del compuesto del Ejemplo 8 (3 pM) y Compuesto A (40 nM), o DMSO (adición de 0,1 % con respecto al volumen del medio) a 2 ml de StemPro-34 S<f>M (ThermoFisher), y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 6 días, en condiciones generales de oxígeno. El día 13, el medio se reemplazó con un medio en las mismas condiciones.
El día 16, después de fotografiar los cuerpos embrioides en cada condición con un microscopio de fluorescencia, se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos, y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se agregaron 2 ml de PBS a cada pocillo y, como anteriormente, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el PBS para no succionar los cuerpos embrioides. A cada pocillo se le añadió una disolución preparada mediante la adición de DNasa 10 pg/ml y Liberasa 100 pg/ml a 3 ml de IMDM, y la placa se dejó reposar a 37 °C durante 1 hora, en condiciones generales de oxígeno. Después de 1 hora, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se agregaron 2 ml de PBS a cada pocillo y, como anteriormente, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el PBS para no succionar los cuerpos embrioides. Se añadió a cada pocillo una disolución preparada mediante la adición de DNasa 10 pg/ml a 2 ml de TrypLE select y se dejó la placa en reposo a 37 °C durante 10 minutos, en condiciones generales de oxígeno. Luego, un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 5 ng/ml de VEGF y DNasa 10 pg/ml a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo, y los cuerpos embrioides se disociaron en células individuales mediante pipeteo y luego se sometieron a centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante, las células se suspendieron en 1 a 2 ml de FBS/PBS al 2 % y se analizó la expresión de mCherry en células TNNI1 mediante citometría de flujo (clasificador de células BD FACSAria Fusion). Los resultados se muestran en la tabla 4 y en la figura 8.
Tabla 4
Ejemplo experimental 4
Para el análisis de la función electrofisiológica de los cardiomiocitos, se usaron las líneas celulares iPS humanas 409B2 (preparadas a partir del vector episomal (pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL) utilizando HDF1388 adquirido a Cell Applications, Inc (bibliografía de referencia; Okitaet al.,Nat Methods. 8(5):409-12(2011))).
El cultivo de mantenimiento de las líneas celulares iPS mencionadas anteriormente se llevó a cabo mediante un método convencional (Takahashi K, etal.Cell. 131: 861-72, 2007 y Nakagawa M, etal.Nat Biotechnol. 26: 101-6, 2008).
Para la inducción de la diferenciación en cardiomiocitos, las líneas celulares iPS se trataron con disolución CTK (ReproCELL) durante 2 minutos, la disolución se retiró y luego las líneas celulares iPS se trataron con Accumax (Innovative Cell Technologies) durante 5 minutos y las células se disociaron en células individuales mediante pipeteo. Las células se recolectaron por centrifugación (1000 rpm, 5 min), y se sembraron en placa de 96 pocillos de baja adherencia (Corning) en 5000 células/70 pL/pocillo, y se cultivaron en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 pM de inhibidor Rock (Y-27632), 2 ng/ml de BMP4 (R&D) y 0,5 % de Matrigel (Factor de crecimiento reducido) para StemPro-34 SFM (ThermoFisher) a 37 °C, en condiciones de oxígeno al 5 % para formar cuerpos embrioides (día 0).
Al día siguiente (1er día), se añadió un medio (70 pL) preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 12 ng/ml de activina A, 10 ng/ml de bFGF y 18 ng/ml de BMP4 a StemPro-34 SFM (ThermoFisher) a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía los cuerpos embrioides para ajustar el volumen combinado con el medio de 0 días a los 140 pL finales, y los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 2 días adicionales, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Luego (3er día), se recolectaron los cuerpos embrioides obtenidos, se retiró el medio por centrifugación (1000 rpm, 3 min), y se le añadió Accumax (tecnologías celulares innovadoras). Después de 5 minutos, los cuerpos embrioides se disociaron en las células individuales mediante pipeteo, se añadió IMDm (5 ml, Invitrogen) y el medio se retiró por centrifugación (1000 rpm, 5 min). Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos de baja fijación (Corning) con 10000 células/100 pL/pocillo y se cultivaron en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 10 ng/ml de VEGF y 1 pM de IWP-3 a StemPro-34 SFM (ThermoFisher) a 37 °C durante 3 días, en condiciones de oxígeno al 5 %.
Luego (6° día), se recogieron los cuerpos embrioides (EB) obtenidos y se colocaron en una placa de 6 pocillos de baja fijación para no exceder los 60 EB por pocillo. Se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego los cuerpos embrioides se cultivaron a 37 °C durante 4 días, en condiciones de oxígeno al 5 %. El octavo día, el medio se reemplazó con un medio en las mismas condiciones.
Después (día 10), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a cada pocillo de la placa de 6 pocillos, y luego se cultivaron los cuerpos embrioides a 37 °C durante 10 días, en condiciones generales de oxígeno. Durante el cultivo, el medio se reemplazó con un medio en las mismas condiciones cada 2 a 3 días.
Después (día 20), se inclinó la placa de 6 pocillos que contenía los cuerpos embrioides y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se agregaron 2 ml de PBS a cada pocillo y, como anteriormente, se inclinó la placa y entonces se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el PBS para no succionar los cuerpos embrioides. Se añadió a cada pocillo una disolución preparada mediante la adición de DNasa 10 pg/ml y Liberasa 100 pg/ml a 3 ml de IMDM, y luego los cuerpos embrioides se dejaron reposar a 37 °C durante 1 hora, en condiciones generales de oxígeno. Después de 1 hora, se inclinó la placa y luego se dejó reposar durante 1 a 2 minutos hasta que los cuerpos embrioides precipitaron en los bordes de los pocillos y se aspiró el sobrenadante para no succionar los cuerpos embrioides. Luego, se agregaron 2 ml de PBS a cada pocillo y, como anteriormente, se inclinó la placa y entonces se dejó reposar durante 1 a 2 minutos, y se aspiró el PBS para no succionar los cuerpos embrioides. Se añadió a cada pocillo una disolución preparada mediante la adición de DNasa 10 pg / ml a 2 ml de TrypLE select, y luego los cuerpos embrioides se dejaron reposar a 37 °C durante 10 minutos, en condiciones generales de oxígeno. Después, un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M, 5 ng/ml de VEGF y DNasa 10 pg/ml a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se agregó a cada pocillo, y los cuerpos embrioides se disociaron en células individuales mediante pipeteo. Las células se sometieron a centrifugación (1000 rpm, 5 min). Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y las células se suspendieron en 1 a 2 ml de FBS/PBS al 2 % y se tiñeron con SIRPa y anticuerpos Lineage (CD31, CD49a, CD90, CD140b) y el grupo de células SIRPa+Lin se recogió mediante citometría de flujo (clasificador de células BD FACSAria Fusión) (véase, Dubois NC,et al.Nat Biotechnol. 29: 1011-8, 2011). Las células recolectadas se sometieron a centrifugación (1000 rpm, 5 min), se suspendieron en un medio preparado mediante la adición de L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10-4 M y 5 ng/ml de VEGF a StemPro-34 SFM (ThermoFisher), y se sembraron en una placa con fondo de vidrio pre-recubierto con fibronectina con 5x104 células/5 pL, y la placa se dejó reposar durante 2 a 3 horas a 37 °C, en condiciones generales de oxígeno. Luego, un medio preparado agregando 1 % de L-glutamina, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a 2 ml de StemPro-34 SFM (ThermoFisher) se añadió a la placa, y las células se cultivaron a 37 °C durante 5 días, en condiciones generales de oxígeno. Durante el cultivo, el medio se reemplazó con un medio en las mismas condiciones cada 2 a 3 días.
El día 25, el medio se retiró de la placa y se reemplazó con un medio que contenía el compuesto de prueba I (el compuesto del Ejemplo 8, 30 pM), el compuesto de prueba II (una mezcla del compuesto del Ejemplo 8 (30 pM) y Compuesto A (40 nM)) o DMSO (concentración final 0,1 %) como control (el medio se preparó agregando L-glutamina al 1 %, transferrina 150 pg/ml, ácido ascórbico 50 pg/ml (Sigma), monotioglicerol 4*10'4 M y 5 ng/ml de VEGF a StemPro-34 SFM (ThermoFisher)). Las células se cultivaron a 37 °C durante 4 días, en condiciones generales de oxígeno y, el día 28 las células se sometieron a análisis de potencial de membrana.
El medio se retiró de la placa que contenía las células el día 28 y se añadió gota a gota a la parte de vidrio de la placa una disolución preparada mediante la adición de 0,2 pL de colorante de potencial de membrana FluoVolt™ (Invitrogen, F10488) a 200 pL de disolución de sal equilibrada de Gay (Sigma), y las células se incubaron a 37 °C durante 15 min, en condiciones generales de oxígeno. Después de la incubación, se retiró la disolución que contenía el colorante de potencial de membrana, se agregó 1 ml de disolución salina equilibrada de Gay a la placa y las células se incubaron en una incubadora en una platina de microscopio (37 °C, oxígeno en general) durante 1 hora. Después de la incubación, las células se sometieron a una reacción de fluorescencia durante 30 segundos cada 5,9 milisegundos con luz de excitación de 490 nm utilizando AquaCosmos 2.6 (Hamamatsu Photonics K.K). El intervalo de medición (ROI) se estableció en 512x64 píxeles y se midieron tres ROI por placa. Los resultados se muestran en la tabla 5.
Tabla 5
pulsaciones por minuto (cada grupo n=3, media ± desviación estándar)
Aplicabilidad industrial
Dado que el compuesto (I) tiene una actividad para promover la maduración de un cardiomiocito, es útil como promotor de la maduración de un cardiomiocito.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto representado por la fórmula (I):
    en donde el anillo A es un anillo benceno; el anillo B es un anillo benceno; el anillo C es un anillo imidazol opcionalmente además sustituido con grupo(s) alquilo de C<1>-<6>; L es un enlace o un grupo metileno, R1 es (1) un átomo de hidrógeno, (2) un átomo de halógeno, (3) un grupo mono- o di-alquilamino de C<1>-<6>, (4) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros, o (5) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de C<1>-e; y el anillo D es (1) un anillo de benceno además opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (a) un átomo de halógeno, (b) un grupo hidroxilo, (c) un grupo alquilo de C<1-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi de C<1>-<6>, (d) un grupo alcoxi de C<1-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (i) un grupo carboxilo, (ii) un grupo alcoxi de C<1>-<6>-carbonilo, (iii) un grupo aralquiloxi de C7-16-carbonilo, (iv) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyente(s) seleccionado de (I) grupo alquilo de C<1-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (A) un grupo cicloalquilo de C<3>-<10>, (B) un grupo arilo de C<6>-<14>, (C) un grupo arilamino de C<6-14>opcionalmente sustituido con 1 a 3 átomos de halógeno, (D) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros, (E) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros, y (F) un grupo carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido con sustituyentes seleccionados de un grupo alquilo de C<1-6>y un grupo aralquilo de C<7>-<16>, (II) un grupo alquenilo de C<2-6>opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos arilo de C<6>-<14>, (III) un grupo cicloalquilo de C<3-10>opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alquilo de C<1>-<6>, (IV) un grupo arilo de C<6-14>opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (A) un átomo de halógeno, y (B) un grupo alquilo de C<1>-<6>, (V) un grupo aralquilo de C7-16, (VI) un grupo heterocíclico aromático de 5 a 14 miembros, y (VII) un grupo heterocíclico no aromático de 3 a 14 miembros, y (v) un grupo heterociclilcarbonilo no aromático de 3 a 14 miembros opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de (I) un grupo hidroxilo, y (II) un grupo alquilo de C<1>-<6>, y (e) un grupo aralquiloxi de C<7>-<16>, (2) un anillo ciclohexano, (3) un anillo piridina, (4) un anillo isoxazol, (5) un anillo tiofeno, (6) un anillo de piperidina además opcionalmente sustituido con 1 a 3 grupos alcoxi de C<1>-<6>-carbonilo, o (7) un anillo tetrahidropirano, o una de sus sales.
  2. 2. El compuesto o la sal según la reivindicación 1, que es N-(1,1-dióxido-2,3-dihidro-1-benzotiofen-5-il)-2-(4-(5-(1-oxo-5-(piperidin-1-il)-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-1H-bencimidazol-2-il)fenoxi)acetamida, o una sal del mismo.
  3. 3. El compuesto o la sal según la reivindicación 1, que es 2-(2-(4-bromofenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(morfolin-4-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
  4. 4. El compuesto o la sal según la reivindicación 1, que es 5-(piperidin-1 -il)-2-(2-(piridin-3-il)-1 H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
  5. 5. El compuesto o la sal según la reivindicación 1, que es 5-(piperidin-1 -il)-2-(2-(piridin-4-il)-1 H-bencimidazol-5-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
  6. 6. El compuesto o la sal según la reivindicación 1, que es 2-(2-(4-Hidroxifenil)-1H-bencimidazol-5-il)-5-(piperidin-1-il)isoindolin-1-ona, o una sal del mismo.
  7. 7. Un promotor de maduración de cardiomiocitos que comprende el compuesto o sal según la reivindicación 1.
  8. 8. Un método para preparar un cardiomiocito maduro, que comprende un paso de cultivar un cardiomiocito inmaduro en presencia del compuesto o sal según la reivindicación 1.
ES19774392T 2018-03-30 2019-03-28 Compuesto heterocíclico Active ES2966207T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018069872 2018-03-30
PCT/JP2019/013529 WO2019189553A1 (ja) 2018-03-30 2019-03-28 複素環化合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2966207T3 true ES2966207T3 (es) 2024-04-18

Family

ID=68059192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19774392T Active ES2966207T3 (es) 2018-03-30 2019-03-28 Compuesto heterocíclico

Country Status (15)

Country Link
US (1) US11401264B2 (es)
EP (1) EP3778587B1 (es)
JP (1) JP7257698B2 (es)
KR (1) KR20200139210A (es)
CN (1) CN111918866B (es)
AU (1) AU2019241702B2 (es)
BR (1) BR112020019579A8 (es)
CA (1) CA3095717A1 (es)
CO (1) CO2020012101A2 (es)
ES (1) ES2966207T3 (es)
IL (1) IL277340B1 (es)
MX (1) MX2020010184A (es)
SG (1) SG11202009314XA (es)
TW (1) TWI820104B (es)
WO (1) WO2019189553A1 (es)

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI9210098B (sl) * 1991-02-06 2000-06-30 Dr. Karl Thomae Benzimidazoli, zdravila, ki te spojine vsebujejo, in postopek za njihovo pripravo
US5591762A (en) * 1991-02-06 1997-01-07 Dr. Karl Thomae Gmbh Benzimidazoles useful as angiotensin-11 antagonists
US5594003A (en) 1991-02-06 1997-01-14 Dr. Karl Thomae Gmbh Tetrahydroimidazo[1,2-a]pyridin-2-yl-(benzimidazol-1-yl)-methyl-biphenyls useful as angiotensin-II antagonists
US5602127A (en) 1991-02-06 1997-02-11 Karl Thomae Gmbh (Alkanesultam-1-yl)-benzimidazol-1-yl)-1yl)-methyl-biphenyls useful as angiotensin-II antagonists
DE4212748A1 (de) 1992-04-16 1993-10-21 Thomae Gmbh Dr K Benzimidazole, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
BRPI0414961A (pt) 2003-10-03 2006-11-07 Keiichi Fukuda processo de indução da diferenciação de células tronco em células do miocárdio
CN1960657B (zh) 2004-04-10 2010-12-29 汉高两合股份公司 卷发筒
GB2441718B (en) 2005-06-22 2010-10-06 Geron Corp Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocyte-lineage cells
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
MX2008007654A (es) 2005-12-13 2008-09-26 Univ Kyoto Factor de reprogramacion nuclear.
US8293529B2 (en) 2006-04-28 2012-10-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes
US7661738B2 (en) 2006-11-28 2010-02-16 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
WO2008124133A1 (en) 2007-04-07 2008-10-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
CN101802172A (zh) 2007-05-30 2010-08-11 通用医疗公司 由体细胞产生多能细胞的方法
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US8765465B2 (en) 2008-03-26 2014-07-01 Kyoto University Efficient production and use of highly cardiogenic progenitors and cardiomyocytes from embryonic and induced pluripotent stem cells
US9499790B2 (en) 2010-08-26 2016-11-22 Kyoto University Method for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiac muscle cells
JP5930205B2 (ja) * 2010-08-26 2016-06-08 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の心筋分化促進剤
JP5840855B2 (ja) 2011-03-30 2016-01-06 学校法人東京女子医科大学 胚性幹細胞から心筋シートを製造する方法
WO2013137491A1 (ja) 2012-03-15 2013-09-19 国立大学法人京都大学 人工多能性幹細胞から心筋および血管系混合細胞群を製造する方法
US10159766B2 (en) 2013-05-31 2018-12-25 Iheart Japan Corporation Layered cell sheet incorporating hydrogel
CA3135208A1 (en) 2013-06-11 2014-12-18 Ncardia B.V. Culture medium compositions for maturating cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells
WO2015182765A1 (ja) * 2014-05-30 2015-12-03 国立大学法人京都大学 低分子化合物を用いた多能性幹細胞の心筋分化誘導法
WO2016076368A1 (ja) 2014-11-12 2016-05-19 テルモ株式会社 心筋細胞シート
JP2017060422A (ja) 2015-09-24 2017-03-30 国立大学法人 東京大学 成熟した心筋細胞を分化誘導させる方法
JP6702134B2 (ja) 2016-10-27 2020-05-27 トヨタ自動車株式会社 電動車両

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202009314XA (en) 2020-10-29
WO2019189553A1 (ja) 2019-10-03
AU2019241702A1 (en) 2020-10-08
EP3778587A1 (en) 2021-02-17
MX2020010184A (es) 2020-10-28
EP3778587A4 (en) 2021-10-06
BR112020019579A2 (pt) 2021-01-12
CO2020012101A2 (es) 2020-12-10
TWI820104B (zh) 2023-11-01
US11401264B2 (en) 2022-08-02
IL277340B1 (en) 2024-03-01
US20210024512A1 (en) 2021-01-28
KR20200139210A (ko) 2020-12-11
TW201942354A (zh) 2019-11-01
CN111918866B (zh) 2023-07-04
BR112020019579A8 (pt) 2022-10-18
EP3778587B1 (en) 2023-10-04
IL277340A (en) 2020-10-29
CA3095717A1 (en) 2019-10-03
JPWO2019189553A1 (ja) 2021-03-25
CN111918866A (zh) 2020-11-10
JP7257698B2 (ja) 2023-04-14
RU2020135574A (ru) 2022-05-04
EP3778587C0 (en) 2023-10-04
AU2019241702B2 (en) 2023-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI765908B (zh) 苯並咪唑類化合物激酶抑制劑及其製備方法和應用
AU2019335968B2 (en) Heterocyclic compound
ES2926931T3 (es) Inhibidores de caseína quinasa 1 basados en azoles 2,4,5-tri-sustituidos como inductores de la cardiomiogénesis
ES2447965T3 (es) Imidazo- y triazolopirimidinas sustituidas, imidazo- y pirazolopirazinas e imidazotriazinas como inhibidores de GSK3beta
BR122023006150B1 (pt) Compostos inibidores de hpk1, seu uso, e composição farmacêutica que os compreende
AU2015276537A1 (en) Novel compounds as dual inhibitors of histone methyltransferases and dna methyltransferases
JP6521387B2 (ja) 縮合複素環化合物
BRPI0710548B1 (pt) INIBIDORES DE c-FMS CINASE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E FORMA DE DOSAGEM FARMACÊUTICA
JPWO2018159805A1 (ja) 膵前駆細胞の製造方法
US11713311B2 (en) Heterocyclic compound
JP2006508965A (ja) 化学物質
JP5799024B2 (ja) 新規化合物
ES2966207T3 (es) Compuesto heterocíclico
RU2786587C2 (ru) Гетероциклическое соединение
JP7177042B2 (ja) 複素環化合物
KR101731624B1 (ko) 세포 리프로그래밍 유도용 조성물