CN111918866A - 杂环化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有促进心肌细胞成熟的活性的杂环化合物。式(I)所示的化合物[其中，每个符号如说明书中所定义]或其盐具有促进心肌细胞成熟的活性，因此可用作心肌细胞成熟促进剂。

Description

杂环化合物
技术领域
本发明涉及杂环化合物，特别是具有促进心肌细胞成熟的活性的杂环化合物，以及成熟心肌细胞的制备方法。
背景技术
心脏病为世界主要的死亡原因。心脏移植目前是严重心力衰竭患者的唯一治疗选择，但遭受供体不足的问题。替代心脏移植的潜在治疗选择是衍生自多能干细胞(例如iPS细胞(诱导的多能干细胞)、ES细胞(胚胎干细胞)等)的心肌细胞的移植。希望迅速开发出替代选择。此外，还需要源自多能干细胞(例如，iPS细胞、ES细胞等)的心肌细胞作为用于药物毒性测试和心脏病模型研究的细胞。
提高效率和安全性对于将iPS细胞衍生的成熟心肌细胞应用于再生医学是必不可少的。关于效率，存在低成本效率的问题，因为能够诱导成熟的心肌细胞的数量少，并且培养基中诸如生长因子的蛋白质非常昂贵。关于安全性，存在心肌细胞纯度低的问题，并且心肌细胞以外的增殖细胞可能被污染，使得有癌变的风险。
此外，对于使用心肌细胞的药物毒性试验和心脏病模型研究，有必要收集大量充分模拟活体中心肌细胞的成熟心肌细胞。心肌细胞在出生的同时失去其分裂潜能，而这些细胞的再生非常困难。由于这样的特性，为了获得大量的心肌细胞，进行了许多将多能干细胞分化诱导为心肌细胞的研究(专利文献1、专利文献2、非专利文献1、非专利文献2和非专利文献3)。
但是，一般说来，源自人多能干细胞的心肌细胞处于与胎儿心肌细胞类似的未成熟阶段，与成年心肌细胞相比，其离子通道功能不足。因此，为了筛选与离子通道有关的药物毒性和治疗剂，需要使用成熟的心肌细胞。
因此，需要成熟的心肌细胞及其制备方法作为用于心肌细胞移植以及用于筛选药物毒性和治疗药物的细胞。
专利文献3报道了下式表示的化合物：
Figure BDA0002705049570000021
其中，每个符号如上定义，
其作为可用于治疗心脏病、肺部疾病或中枢神经系统障碍(例如阿尔茨海默氏病、缺血性疾病)的苯并咪唑衍生物。
通过长期(例如，一年或更长)培养未成熟的心肌细胞，可以获得成熟的心肌细胞。然而，作为成熟心肌细胞的商业制备方法，这种方法花费太多时间并且需要昂贵的培养基和培养基添加剂。
因此，仍然需要开发具有促进心肌细胞成熟的活性的低分子化合物，其可以在短时间内以低成本高效率地制备具有高纯度的成熟心肌细胞。
文献列表
专利文献
[专利文献1]WO2007/002136
[专利文献2]WO2009/118928
[专利文献3]DE4212748
非专利文献
[非专利文献1]Yan P等人,Biochem Biophys Res Commun.379:115-20(2009)
[非专利文献2]Laflamme MA等人,Nat Biotechnol,25:1015-1024(2007)
[非专利文献3]Yang L等人,Nature,453:524-528(2008)
发明内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供具有促进心肌细胞成熟的活性的低分子化合物，该化合物可以在短时间内以低成本有效地制备高纯度的成熟心肌细胞。
解决问题的手段
本发明的发明人已发现以下式(I)所示的化合物或其盐(在本说明书中，有时称为化合物(I))具有促进心肌细胞成熟的活性。作为进一步研究的结果，他们已完成本发明。
因此，本发明如下。
[1]一种式(I)所示的化合物或其盐(下文中称为化合物(I))，
Figure BDA0002705049570000031
其中，
环A和环B各自独立地为任选进一步取代的苯环，环C为任选被一个或多个C1-6烷基进一步取代的咪唑环，所述C1-6烷基任选被1至3个选自以下的取代基取代：
(1)卤素原子，
(2)硝基，
(3)氰基，
(4)氨基，
(5)羟基，和
(6)任选卤代的C1-6烷氧基，
L为键或任选取代的亚甲基，
R1为氢原子或取代基，且
环D为任选进一步取代的环。
[2]根据上述[1]所述的化合物或其盐，其中，在所述式(I)中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为被一个或多个C1-6烷基进一步取代的咪唑环；
L为键或亚甲基；
R1为
(1)氢原子，
(2)卤素原子，
(3)单-或二-C1-6烷基氨基，
(4)5至14元芳族杂环基，或
(5)任选被1至3个C1-6烷基取代的3至14元非芳族杂环基；且
环D为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子，
(b)羟基，
(c)任选被1至3个C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，
(d)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基：
(i)羧基，
(ii)C1-6烷氧基-羰基，
(iii)C7-16芳烷基氧基-羰基，
(iv)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基：
(A)C3-10环烷基，
(B)C6-14芳基，
(C)任选被1至3个卤素原子取代的C6-14芳基氨基，
(D)5至14元芳族杂环基，
(E)3至14元非芳族杂环基，和
(F)任选被选自C1-6烷基和C7-16芳烷基的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基，
(II)任选被1至3个C6-14芳基取代的C2-6烯基，
(III)任选被1至3个C1-6烷基取代的C3-10环烷基，
(IV)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C6-14芳基：
(A)卤素原子，和
(B)C1-6烷基，
(V)C7-16芳烷基，
(VI)5至14元芳族杂环基，和
(VII)3至14元非芳族杂环基，和
(v)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至14元非芳族杂环羰基：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基，和
(e)C7-16芳烷基氧基，
(2)环己烷环，
(3)吡啶环，
(4)异噁唑环，
(5)噻吩环，
(6)任选被1至3个C1-6烷氧基-羰基进一步取代的哌啶环，或
(7)四氢吡喃环。
[3]N-(1,1-二氧化-2,3-二氢-1-苯并噻吩-5-基)-2-(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酰胺或其盐。
[4]2-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(吗啉-4-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
[5]5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-3-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
[6]5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
[7]2-(2-(4-羟基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
[8]一种心肌细胞成熟促进剂，其包含根据上述[1]所述的化合物或盐。
[9]一种制备成熟心肌细胞的方法，其包括在根据上述[1]所述的化合物或盐的存在下培养未成熟心肌细胞的步骤。
[10]一种成熟心肌细胞，其通过根据上述[9]所述的方法获得。
本发明的效果
因为上述化合物(I)具有使心肌细胞成熟的作用，因此其可用作心肌细胞成熟促进剂。使用上述化合物促进心肌细胞成熟的方法相较于将未成熟心肌细胞进行长时间培养的方法而言，在短时间内以低成本使未成熟心肌细胞成熟。
附图说明
[图1]
图1示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(对照(无添加))的结果。
[图2]
图2示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(对照(添加DMSO))的结果。
[图3]
图3示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(添加实施例8的化合物)的结果。
[图4]
图4示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(添加实施例46的化合物)的结果。
[图5]
图5示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(添加实施例45的化合物)的结果。
[图6]
图6示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(添加实施例4的化合物)的结果。
[图7]
图7示出在实验例2中通过流式细胞术的mCherry表达分析(添加实施例17的化合物)的结果。
[图8]
图8示出在实验例3中通过流式细胞术的mCherry表达分析的结果。这些图从上依序示出在对照(无添加)、对照(添加DMSO)、添加实施例8的化合物和化合物A(实施例8：8-9天，化合物A：10-15天)、添加实施例8的化合物和化合物A(实施例8：8-15天，化合物A：10-15天)的情况下的结果。
具体实施方式
以下详述了本说明书中所使用的每个取代基的定义。除非另有说明，否则每个取代基具有以下定义。
在本说明书中，“卤素原子”的实例包括氟、氯、溴和碘。
在本说明书中，“C1-6烷基”的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基和2-乙基丁基。
在本说明书中，“任选卤代的C1-6烷基”的实例包括任选具有1至7个、优选为1至5个卤素原子的C1-6烷基。其具体实例包括甲基、氯甲基、二氟甲基、三氯甲基、三氟甲基、乙基、2-溴乙基、2,2,2-三氟乙基、四氟乙基、五氟乙基、丙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、异丙基、丁基、4,4,4-三氟丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、5,5,5-三氟戊基、己基和6,6,6-三氟己基。
在本说明书中，“C2-6烯基”的实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基和5-己烯基。
在本说明书中，“C2-6炔基”的实例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基和4-甲基-2-戊炔基。
在本说明书中，“C3-10环烷基”的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.2.1]辛基和金刚烷基。
在本说明书中，“任选卤代的C3-10环烷基”的实例包括任选具有1至7个、优选为1至5个卤素原子的C3-10环烷基。其具体实例包括环丙基、2,2-二氟环丙基、2,3-二氟环丙基、环丁基、二氟环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
在本说明书中，“C3-10环烯基”的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基。
在本说明书中，“C6-14芳基”的实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基和9-蒽基。
在本说明书中，“C7-16芳烷基”的实例包括苯甲基、苯乙基、萘甲基和苯丙基。
在本说明书中，“C1-6烷氧基”的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
在本说明书中，“任选卤代的C1-6烷氧基”的实例包括任选具有1至7个、优选为1至5个卤素原子的C1-6烷氧基。其具体实例包括甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、4,4,4-三氟丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、戊氧基和己氧基。
在本说明书中，“C3-10环烷氧基”的实例包括环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基、环庚氧基和环辛氧基。
在本说明书中，“C1-6烷基硫基”的实例包括甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、异丙基硫基、丁基硫基、仲丁基硫基、叔丁基硫基、戊基硫基和己基硫基。
在本说明书中，“任选卤代的C1-6烷基硫基”的实例包括任选具有1至7个、优选为1至5个卤素原子的C1-6烷基硫基。其具体实例包括甲基硫基、二氟甲基硫基、三氟甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、异丙基硫基、丁基硫基、4,4,4-三氟丁基硫基、戊基硫基和己基硫基。
在本说明书中，“C1-6烷基-羰基”的实例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、2-甲基丙酰基、戊酰基、3-甲基丁酰基、2-甲基丁酰基、2,2-二甲基丙酰基、己酰基和庚酰基。
在本说明书中，“任选卤代的C1-6烷基-羰基”的实例包括任选具有1至7个、优选为1至5个卤素原子的C1-6烷基-羰基。其具体实例包括乙酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和己酰基。
在本说明书中，“C1-6烷氧基-羰基”的实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、戊氧基羰基和己氧基羰基。
在本说明书中，“C6-14芳基-羰基”的实例包括苯甲酰基、1-萘甲酰基和2-萘甲酰基。
在本说明书中，“C7-16芳烷基-羰基”的实例包括苯基乙酰基和苯基丙酰基。
在本说明书中，“5至14元芳族杂环羰基”的实例包括烟酰基、异烟酰基、噻吩甲酰基和呋喃甲酰基。
在本说明书中，“3至14元非芳族杂环羰基”的实例包括吗啉基羰基、哌啶基羰基和吡咯烷基羰基。
在本说明书中，“单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基”的实例包括甲基氨基甲酰基、乙基氨基甲酰基、二甲基氨基甲酰基、二乙基氨基甲酰基和N-乙基-N-甲基氨基甲酰基。
在本说明书中，“单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基”的实例包括苯甲基氨基甲酰基和苯乙基氨基甲酰基。
在本说明书中，“C1-6烷基磺酰基”的实例包括甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基、仲丁基磺酰基和叔丁基磺酰基。
在本说明书中，“任选卤代的C1-6烷基磺酰基”的实例包括任选具有1至7个、优选为1至5个卤素原子的C1-6烷基磺酰基。其具体实例包括甲基磺酰基、二氟甲基磺酰基、三氟甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、异丙基磺酰基、丁基磺酰基、4,4,4-三氟丁基磺酰基、戊基磺酰基和己基磺酰基。
在本说明书中，“C6-14芳基磺酰基”的实例包括苯基磺酰基、1-萘基磺酰基和2-萘基磺酰基。
在本说明书中，“取代基”的实例包括卤素原子、氰基、硝基、任选取代的烃基、任选取代的杂环基、酰基、任选取代的氨基、任选取代的氨基甲酰基、任选取代的硫代氨基甲酰基、任选取代的氨磺酰基、任选取代的羟基、任选取代的硫烷基(SH)和任选取代的甲硅烷基。
在本说明书中，“烃基”(包含“任选取代的烃基”中的“烃基”)的实例包括C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C3-10环烯基、C6-14芳基和C7-16芳烷基。
在本说明书中，“任选取代的烃基”的实例包括任选具有一个或多个选自以下取代基组A的取代基的烃基。
[取代基组A]
(1)卤素原子，
(2)硝基，
(3)氰基，
(4)氧代，
(5)羟基，
(6)任选卤代的C1-6烷氧基，
(7)C6-14芳基氧基(例如苯氧基、萘氧基)，
(8)C7-16芳烷基氧基(例如苯甲基氧基)，
(9)5至14元芳族杂环氧基(例如吡啶基氧基)，
(10)3至14元非芳族杂环氧基(例如吗啉基氧基、哌啶基氧基)，
(11)C1-6烷基-羰基氧基(例如乙酰氧基、丙酰基氧基)，
(12)C6-14芳基-羰基氧基(例如苯甲酰基氧基、1-萘甲酰基氧基、2-萘甲酰基氧基)，
(13)C1-6烷氧基-羰基氧基(例如甲氧基羰基氧基、乙氧基羰基氧基、丙氧基羰基氧基、丁氧基羰基氧基)，
(14)单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基氧基(例如甲基氨基甲酰基氧基、乙基氨基甲酰基氧基、二甲基氨基甲酰基氧基、二乙基氨基甲酰基氧基)，
(15)C6-14芳基-氨基甲酰基氧基(例如苯基氨基甲酰基氧基、萘基氨基甲酰基氧基)，
(16)5至14元芳族杂环羰基氧基(例如烟酰基氧基)，
(17)3至14元非芳族杂环羰基氧基(例如吗啉基羰基氧基、哌啶基羰基氧基)，
(18)任选卤代的C1-6烷基磺酰基氧基(例如甲基磺酰基氧基、三氟甲基磺酰基氧基)，
(19)任选被C1-6烷基取代的C6-14芳基磺酰基氧基(例如苯基磺酰基氧基、甲苯磺酰基氧基)，
(20)任选卤代的C1-6烷基硫基，
(21)5至14元芳族杂环基，
(22)3至14元非芳族杂环基，
(23)甲酰基，
(24)羧基，
(25)任选卤代的C1-6烷基-羰基，
(26)C6-14芳基-羰基，
(27)5至14元芳族杂环羰基，
(28)3至14元非芳族杂环羰基，
(29)C1-6烷氧基-羰基，
(30)C6-14芳基氧基-羰基(例如苯基氧基羰基、1-萘基氧基羰基、2-萘基氧基羰基)，
(31)C7-16芳烷基氧基-羰基(例如苯甲基氧基羰基、苯乙基氧基羰基)，
(32)氨基甲酰基，
(33)硫代氨基甲酰基，
(34)单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基，
(35)C6-14芳基-氨基甲酰基(例如苯基氨基甲酰基)，
(36)5至14元芳族杂环氨基甲酰基(例如吡啶基氨基甲酰基、噻吩基氨基甲酰基)，
(37)3至14元非芳族杂环氨基甲酰基(例如吗啉基氨基甲酰基、哌啶基氨基甲酰基)，
(38)任选卤代的C1-6烷基磺酰基，
(39)C6-14芳基磺酰基，
(40)5至14元芳族杂环磺酰基(例如吡啶基磺酰基、噻吩基磺酰基)，
(41)任选卤代的C1-6烷基亚磺酰基，
(42)C6-14芳基亚磺酰基(例如苯基亚磺酰基、1-萘基亚磺酰基、2-萘基亚磺酰基)，
(43)5至14元芳族杂环亚磺酰基(例如吡啶基亚磺酰基、噻吩基亚磺酰基)，
(44)氨基，
(45)单-或二-C1-6烷基氨基(例如甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、异丙基氨基、丁基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基、N-乙基-N-甲基氨基)，
(46)单-或二-C6-14芳基氨基(例如苯基氨基)，
(47)5至14元芳族杂环氨基(例如吡啶基氨基)，
(48)C7-16芳烷基氨基(例如苯甲基氨基)，
(49)甲酰基氨基，
(50)C1-6烷基-羰基氨基(例如乙酰基氨基、丙酰基氨基、丁酰基氨基)，
(51)(C1-6烷基)(C1-6烷基-羰基)氨基(例如N-乙酰基-N-甲基氨基)，
(52)C6-14芳基-羰基氨基(例如苯基羰基氨基、萘基羰基氨基)，
(53)C1-6烷氧基-羰基氨基(例如甲氧基羰基氨基、乙氧基羰基氨基、丙氧基羰基氨基、丁氧基羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基)，
(54)C7-16芳烷基氧基-羰基氨基(例如苯甲基氧基羰基氨基)，
(55)C1-6烷基磺酰基氨基(例如甲基磺酰基氨基、乙基磺酰基氨基)，
(56)任选被C1-6烷基取代的C6-14芳基磺酰基氨基(例如苯基磺酰基氨基、甲苯磺酰基氨基)，
(57)任选卤代的C1-6烷基，
(58)C2-6烯基，
(59)C2-6炔基，
(60)C3-10环烷基，
(61)C3-10环烯基，和
(62)C6-14芳基。
“任选取代的烃基”中的上述取代基的数量例如为1至5个，优选1至3个。当取代基数量为2个或更多时，各个取代基可相同或不同。
在本说明书中，“杂环基”(包括“任选取代的杂环基”中的“杂环基”)的实例包括除了碳原子以外，各自含有1至4个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子作为环构成原子的(i)芳族杂环基、(ii)非芳族杂环基和(iii)7至10元桥联杂环基。
在本说明书中，“芳族杂环基”(包括“5至14元芳族杂环基”)，的实例包括除了碳原子以外，含有1至4个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子作为环构成原子的5至14元(优选5至10元)芳族杂环基。
“芳族杂环基”的优选实例包括5至6元单环芳族杂环基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基等；和8至14元稠合多环(优选双环或三环)芳族杂环基，例如苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、噁唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三嗪基、萘并[2,3-b]噻吩基、吩噁噻基、吲哚基、异吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹噁啉基、喹唑啉基、噌啉基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基等。
在本说明书中，“非芳族杂环基”(包含“3至14元非芳族杂环基”)的实例包括除了碳原子以外，含有1至4个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子作为环构成原子的3至14元(优选为4至10元)非芳族杂环基。
“非芳族杂环基”的优选实例包括3至8元单环非芳族杂环基，例如吖丙啶基、环氧乙烷基、硫杂环丙基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、四氢噻吩基、四氢呋喃、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、四氢异噻唑基、四氢噁唑基、四氢异噁唑基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、二氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢哒嗪基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、硫吗啉基、氮杂环庚基、二氮杂环庚基、氮杂环庚烯基、氧杂环庚基、氮杂环辛基、二氮杂环辛基等；和9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基，例如二氢苯并呋喃基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并噁唑基、二氢苯并噻唑基、二氢苯并异噻唑基、二氢萘并[2,3-b]噻吩基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、4H-喹嗪基、吲哚啉基、异吲哚啉基、四氢噻吩并[2,3-c]吡啶基、四氢苯并氮杂环庚烯基、四氢喹噁啉基、四氢菲啶基、六氢吩噻嗪基、六氢吩噁嗪基、四氢酞嗪基、四氢萘啶基、四氢喹唑啉基、四氢噌啉基、四氢咔唑基、四氢-β-咔啉基、四氢吖啶基、四氢吩嗪基、四氢硫杂蒽基、八氢异喹啉基等。
在本说明书中，“7至10元桥联杂环基”的优选实例包括奎宁环基和7-氮杂双环[2.2.1]庚基。
在本说明书中，“含氮杂环基”的实例包括含有至少一个氮原子作为环构成原子的“杂环基”。
在本说明书中，“任选取代的杂环基”的实例包括可具有一个或多个选自上述取代基组A的取代基的杂环基。
“任选取代的杂环基”中的取代基的数量例如为1至3个。当取代基数量为2个或更多时，各取代基可相同或不同。
在本说明书中，“酰基”的实例包括甲酰基、羧基、氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、亚磺酰基、磺酰基、氨磺酰基、膦酰基，各自任选具有1或2个选自C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C3-10环烯基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、5至14元芳族杂环基和3至14元非芳族杂环基的取代基，这些取代基各自任选具有1至3个选自卤素原子、任选卤代的C1-6烷氧基、羟基、硝基、氰基、氨基和氨基甲酰基的取代基。
此外，“酰基”的实例还包括烃-磺酰基、杂环磺酰基、烃-亚磺酰基、杂环亚磺酰基。
在此，烃-磺酰基是指与烃基键合的磺酰基，杂环磺酰基是指与杂环基键合的磺酰基，烃-亚磺酰基是指与烃基键合的亚磺酰基，杂环亚磺酰基是指与杂环基键合的亚磺酰基。
“酰基”的优选实例包括甲酰基、羧基、C1-6烷基-羰基、C2-6烯基-羰基(例如巴豆酰基)、C3-10环烷基-羰基(例如环丁烷羰基、环戊烷羰基、环己烷羰基、环庚烷羰基)、C3-10环烯基-羰基(例如2-环己烯羰基)、C6-14芳基-羰基、C7-16芳烷基-羰基、5至14元芳族杂环羰基、3至14元非芳族杂环羰基、C1-6烷氧基-羰基、C6-14芳基氧基-羰基(例如苯基氧基羰基、萘基氧基羰基)、C7-16芳烷基氧基-羰基(例如苯甲基氧基羰基、苯乙基氧基羰基)、氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基、单-或二-C2-6烯基-氨基甲酰基(例如二烯丙基氨基甲酰基)、单-或二-C3-10环烷基-氨基甲酰基(例如环丙基氨基甲酰基)、单-或二-C6-14芳基-氨基甲酰基(例如苯基氨基甲酰基)、单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基、5至14元芳族杂环氨基甲酰基(例如吡啶基氨基甲酰基)、硫代氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-硫代氨基甲酰基(例如甲基硫代氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C2-6烯基-硫代氨基甲酰基(例如二烯丙基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C3-10环烷基-硫代氨基甲酰基(例如环丙基硫代氨基甲酰基、环己基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C6-14芳基-硫代氨基甲酰基(例如苯基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C7-16芳烷基-硫代氨基甲酰基(例如苯甲基硫代氨基甲酰基、苯乙基硫代氨基甲酰基)、5至14元芳族杂环硫代氨基甲酰基(例如吡啶基硫代氨基甲酰基)、亚磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基(例如甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基)、磺酰基、C1-6烷基磺酰基、C6-14芳基磺酰基、膦酰基和单-或二-C1-6烷基膦酰基(例如二甲基膦酰基、二乙基膦酰基、二异丙基膦酰基、二丁基膦酰基)。
在本说明书中，“任选取代的氨基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、C1-6烷基-羰基、C6-14芳基-羰基、C7-16芳烷基-羰基、5至14元芳族杂环羰基、3至14元非芳族杂环羰基、C1-6烷氧基-羰基、5至14元芳族杂环基、氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基、单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-14芳基磺酰基的1或2个取代基”的氨基。
任选取代的氨基的优选实例包括氨基、单-或二-(任选卤代的C1-6烷基)氨基(例如甲基氨基、三氟甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、丙基氨基、二丁基氨基)、单-或二-C2-6烯基氨基(例如二烯丙基氨基)、单-或二-C3-10环烷基氨基(例如环丙基氨基、环己基氨基)、单-或二-C6-14芳基氨基(例如苯基氨基)、单-或二-C7-16芳烷基氨基(例如苯甲基氨基、二苯甲基氨基)、单-或二-(任选卤代的C1-6烷基)-羰基氨基(例如乙酰基氨基、丙酰基氨基)、单-或二-C6-14芳基-羰基氨基(例如苯甲酰基氨基)、单-或二-C7-16芳烷基-羰基氨基(例如苯甲基羰基氨基)、单-或二-5至14元芳族杂环羰基氨基(例如烟酰基氨基、异烟酰基氨基)、单-或二-3至14元非芳族杂环羰基氨基(例如哌啶基羰基氨基)、单-或二-C1-6烷氧基-羰基氨基(例如叔丁氧基羰基氨基)、5至14元芳族杂环氨基(例如吡啶基氨基)、氨基甲酰基氨基、(单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基)氨基(例如甲基氨基甲酰基氨基)、(单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基)氨基(例如苯甲基氨基甲酰基氨基)、C1-6烷基磺酰基氨基(例如甲基磺酰基氨基、乙基磺酰基氨基)、C6-14芳基磺酰基氨基(例如苯基磺酰基氨基)、(C1-6烷基)(C1-6烷基-羰基)氨基(例如N-乙酰基-N-甲基氨基)和(C1-6烷基)(C6-14芳基-羰基)氨基(例如N-苯甲酰基-N-甲基氨基)。
在本说明书中，“任选取代的氨基甲酰基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、C1-6烷基-羰基、C6-14芳基-羰基、C7-16芳烷基-羰基、5至14元芳族杂环羰基、3至14元非芳族杂环羰基、C1-6烷氧基-羰基、5至14元芳族杂环基、氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基和单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基的1或2个取代基”的氨基甲酰基。
“任选取代的氨基甲酰基”的优选实例包括氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基、单-或二-C2-6烯基-氨基甲酰基(例如二烯丙基氨基甲酰基)、单-或二-C3-10环烷基-氨基甲酰基(例如环丙基氨基甲酰基、环己基氨基甲酰基)、单-或二-C6-14芳基-氨基甲酰基(例如苯基氨基甲酰基)、单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-羰基-氨基甲酰基(例如乙酰基氨基甲酰基、丙酰基氨基甲酰基)、单-或二-C6-14芳基-羰基-氨基甲酰基(例如苯甲酰基氨基甲酰基)、5至14元芳族杂环氨基甲酰基(例如吡啶基氨基甲酰基)。
在本说明书中，“任选取代的硫代氨基甲酰基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、C1-6烷基-羰基、C6-14芳基-羰基、C7-16芳烷基-羰基、5至14元芳族杂环羰基、3至14元非芳族杂环羰基、C1-6烷氧基-羰基、5至14元芳族杂环基、氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基和单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基的1或2个取代基”的硫代氨基甲酰基。
任选取代的硫代氨基甲酰基的优选实例包括硫代氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-硫代氨基甲酰基(例如甲基硫代氨基甲酰基、乙基硫代氨基甲酰基、二甲基硫代氨基甲酰基、二乙基硫代氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C2-6烯基-硫代氨基甲酰基(例如二烯丙基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C3-10环烷基-硫代氨基甲酰基(例如环丙基硫代氨基甲酰基、环己基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C6-14芳基-硫代氨基甲酰基(例如苯基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C7-16芳烷基-硫代氨基甲酰基(例如苯甲基硫代氨基甲酰基、苯乙基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C1-6烷基-羰基-硫代氨基甲酰基(例如乙酰基硫代氨基甲酰基、丙酰基硫代氨基甲酰基)、单-或二-C6-14芳基-羰基-硫代氨基甲酰基(例如苯甲酰基硫代氨基甲酰基)和5至14元芳族杂环硫代氨基甲酰基(例如吡啶基硫代氨基甲酰基)。
在本说明书中，“任选取代的氨磺酰基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、C1-6烷基-羰基、C6-14芳基-羰基、C7-16芳烷基-羰基、5至14元芳族杂环羰基、3至14元非芳族杂环羰基、C1-6烷氧基-羰基、5至14元芳族杂环基、氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基和单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基的1或2个取代基”的氨磺酰基。
任选取代的氨磺酰基的优选实例包括氨磺酰基、单-或二-C1-6烷基-氨磺酰基(例如甲基氨磺酰基、乙基氨磺酰基、二甲基氨磺酰基、二乙基氨磺酰基、N-乙基-N-甲基氨磺酰基)、单-或二-C2-6烯基-氨磺酰基(例如二烯丙基氨磺酰基)、单-或二-C3-10环烷基-氨磺酰基(例如环丙基氨磺酰基、环己基氨磺酰基)、单-或二-C6-14芳基-氨磺酰基(例如苯基氨磺酰基)、单-或二-C7-16芳烷基-氨磺酰基(例如苯甲基氨磺酰基、苯乙基氨磺酰基)、单-或二-C1-6烷基-羰基-氨磺酰基(例如乙酰基氨磺酰基、丙酰基氨磺酰基)、单-或二-C6-14芳基-羰基-氨磺酰基(例如苯甲酰基氨磺酰基)和5至14元芳族杂环氨磺酰基(例如吡啶基氨磺酰基)。
在本说明书中，“任选取代的羟基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、C1-6烷基-羰基、C6-14芳基-羰基、C7-16芳烷基-羰基、5至14元芳族杂环羰基、3至14元非芳族杂环羰基、C1-6烷氧基-羰基、5至14元芳族杂环基、氨基甲酰基、单-或二-C1-6烷基-氨基甲酰基、单-或二-C7-16芳烷基-氨基甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-14芳基磺酰基的取代基”的羟基。
任选取代的羟基的优选实例包括羟基、C1-6烷氧基、C2-6烯基氧基(例如烯丙基氧基、2-丁烯基氧基、2-戊烯基氧基、3-己烯基氧基)、C3-10环烷基氧基(例如环己基氧基)、C6-14芳基氧基(例如苯氧基、萘基氧基)、C7-16芳烷基氧基(例如苯甲基氧基、苯乙基氧基)、C1-6烷基-羰基氧基(例如乙酰基氧基、丙酰基氧基、丁酰基氧基、异丁酰基氧基、新戊酰基氧基)、C6-14芳基-羰基氧基(例如苯甲酰基氧基)、C7-16芳烷基-羰基氧基(例如苯甲基羰基氧基)、5至14元芳族杂环羰基氧基(例如烟酰基氧基)、3至14元非芳族杂环羰基氧基(例如哌啶基羰基氧基)、C1-6烷氧基-羰基氧基(例如叔丁氧基羰基氧基)、5至14元芳族杂环氧基(例如吡啶基氧基)、氨基甲酰基氧基、C1-6烷基-氨基甲酰基氧基(例如甲基氨基甲酰基氧基)、C7-16芳烷基-氨基甲酰基氧基(例如苯甲基氨基甲酰基氧基)、C1-6烷基磺酰基氧基(例如甲基磺酰基氧基、乙基磺酰基氧基)、C6-14芳基磺酰基氧基(例如苯基磺酰基氧基)。
在本说明书中，“任选取代的硫烷基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-16芳烷基、C1-6烷基-羰基、C6-14芳基-羰基和5至14元芳族杂环基的取代基”的硫烷基和卤化的硫烷基。
任选取代的硫烷基的优选实例包括硫烷基(-SH)、C1-6烷基硫基、C2-6烯基硫基(例如烯丙基硫基、2-丁烯基硫基、2-戊烯基硫基、3-己烯基硫基)、C3-10环烷基硫基(例如环己基硫基)、C6-14芳基硫基(例如苯基硫基、萘基硫基)、C7-16芳烷基硫基(例如苯甲基硫基、苯乙基硫基)、C1-6烷基-羰基硫基(例如乙酰基硫基、丙酰基硫基、丁酰基硫基、异丁酰基硫基、新戊酰基硫基)、C6-14芳基-羰基硫基(例如苯甲酰基硫基)、5至14元芳族杂环硫基(例如吡啶基硫基)、卤化硫基(例如五氟硫基)。
在本说明书中，“任选取代的甲硅烷基”的实例包括任选具有“选自各自任选具有选自取代基组A的1至3个取代基的C1-6烷基、C2-6烯基、C3-10环烷基、C6-14芳基和C7-16芳烷基的1至3个取代基”的甲硅烷基。
任选取代的甲硅烷基的优选实例包括三-C1-6烷基甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、叔丁基(二甲基)甲硅烷基)。
在本说明书中，“烃环”的实例包括C6-14芳族烃环、C3-10环烷烃和C3-10环烯烃。
在本说明书中，“C6-14芳族烃环”的实例包括苯和萘。
在本说明书中，“C3-10环烷”的实例包括环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷。
在本说明书中，“C3-10环烯烃”的实例包括环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯和环辛烯。
在本说明书中，“杂环”的实例包括除了碳原子以外，各自含有1至4个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子作为环构成原子的芳族杂环和非芳族杂环。
在本说明书中，“芳族杂环”的实例包括除了碳原子以外，含有1至4个选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子作为环构成原子的5至14元(优选为5至10元)芳族杂环。“芳族杂环”的优选实例包括5至6元单环芳族杂环，例如噻吩、呋喃、吡咯、咪唑、吡唑、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、1,2,4-噁二唑、1,3,4-噁二唑、1,2,4-噻二唑、1,3,4-噻二唑、三唑、四唑、三嗪等；和8至14元稠合多环(优选为2或3环)芳族杂环，例如苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并三唑、咪唑并吡啶、噻吩并吡啶、呋喃并吡啶、吡咯并吡啶、吡唑并吡啶、噁唑并吡啶、噻唑并吡啶、咪唑并吡嗪、咪唑并嘧啶、噻吩并嘧啶、呋喃并嘧啶、吡咯并嘧啶、吡唑并嘧啶、噁唑并嘧啶、噻唑并嘧啶、吡唑并嘧啶、吡唑并三嗪、萘并[2,3-b]噻吩、吩噁噻、吲哚、异吲哚、1H-吲唑、嘌呤、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹噁啉、喹唑啉、噌啉、咔唑、β-咔啉、菲啶、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪等。
在本说明书中，“非芳族杂环”的实例包括除了碳原子以外，含有1至4个含有选自氮原子、硫原子和氧原子的杂原子作为环构成原子的3至14元(优选为4至10元)非芳族杂环。“非芳族杂环”的优选实例包括3至8元单环非芳族杂环，例如氮杂环丙烷、环氧乙烷基、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、咪唑啉、咪唑烷、噁唑啉、噁唑烷、吡唑啉、吡唑烷、噻唑啉、噻唑烷、四氢异噻唑、四氢噁唑、四氢异噁唑、哌啶、哌嗪、四氢吡啶、二氢吡啶、二氢噻喃、四氢嘧啶、四氢哒嗪、二氢吡喃、四氢吡喃、四氢噻喃、吗啉、硫吗啉、氮杂环庚烷、二氮杂环庚烷、氮杂环庚烯、氮杂环辛烷、二氮杂环辛烷、氧杂环庚烷等；和9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环，例如二氢苯并呋喃、二氢苯并咪唑、二氢苯并噁唑、二氢苯并噻唑、二氢苯并异噻唑、二氢萘并[2,3-b]噻吩、四氢异喹啉、四氢喹啉、4H-喹嗪、吲哚啉、异吲哚啉、四氢噻吩并[2,3-c]吡啶、四氢苯并氮杂环庚烯、四氢喹噁啉、四氢菲啶、六氢吩噻喹、六氢吩噁喹、四氢酞嗪、四氢萘啶、四氢喹唑啉、四氢噌啉、四氢咔唑、四氢-β-咔啉、四氢吖啶、四氢吩嗪、四氢硫杂蒽、八氢异喹啉等。
在本说明书中，“含氮杂环”的实例包括“杂环”中含有至少一个氮原子作为环构成原子的杂环。
在本说明书中，“环”的实例包括“烃环”和杂环”。
在本说明书中，“5至6元单环芳族环状氨基”的实例包括“5至6元单环芳族杂环基”中，含有至少一个氮原子作为环构成原子并且在氮原子上具有键的5至6元单环芳族杂环基。其具体实例包括1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基、1-三唑基、1-四唑基等。
在本说明书中，“3至8元单环非芳族环状氨基”的实例包括“3至8元单环非芳族杂环基”中含有至少一个氮原子作为环构成原子并且在氮原子上具有键的3至8元单环非芳族杂环基。其具体实例包括1-吖丙啶基、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯啉基、1-咪唑烷基、1-吡唑烷基、3-噁唑烷基、3-噻唑烷基、3-四氢异噁唑基、3-四氢异噻唑基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基、4-硫吗啉基等。
下面详细解释式(I)中每个符号的定义。
环A和环B各自独立地为任选进一步取代的苯环。
环A所表示的“任选进一步取代的苯环”除了式(I)中的R1以外，任选进一步具有一个或多个取代基。该一个或多个取代基的实例包括选自取代基组A的取代基。这些取代基的数量为1至3个，优选为1或2个。当取代基数量为2个或更多时以上的情况，各取代基可相同或不同。
环A优选为苯环。
环B所表示的“任选进一步取代的苯环”，除了式(I)中的
Figure BDA0002705049570000201
以外，可进一步具有一个或多个取代基。该一个或多个取代基的实例包括选自取代基组A的取代基。这些取代基的数量为1至3个，优选为1或2个。当取代基数量为2个或更多时，各取代基可相同或不同。
环B优选为苯环。
环C为除了式(I)中的-L-环D以外，任选被一个或多个C1-6烷基进一步取代的咪唑环，该一个或多个C1-6烷基任选被1至3个选自以下的取代基取代：
(1)卤素原子，
(2)硝基，
(3)氰基，
(4)氨基，
(5)羟基，和
(6)任选卤代的C1-6烷氧基。
环C优选为任选被一个或多个C1-6烷基(例如甲基)进一步取代的咪唑环。
环C更优选为咪唑环。
在式(I)中，式
Figure BDA0002705049570000202
所示的部分结构为
Figure BDA0002705049570000203
所示的部分结构，
其中
R2为
(1)氢原子，或
(2)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基：
(a)卤素原子，
(b)硝基，
(c)氰基，
(d)氨基，
(e)羟基，和
(f)任选卤代的C1-6烷氧基。
L为键或任选取代的亚甲基。
L所表示的“任选取代的亚甲基”的取代基的实例包括选自取代基组A的一个或多个取代基。这些取代基的数量为1或2个，优选为1个。当取代基数量为2个时，各取代基可相同或不同。
L优选为键或亚甲基。
L更优选为键。
R1为氢原子或取代基。
R1优选为
(1)氢原子，
(2)卤素原子(例如溴原子)，
(3)任选取代的氨基(优选为单-或二-C1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基))，
(4)任选取代的5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基，更优选为5至6元单环芳族环状氨基(例如1-吡咯基))，或
(5)任选取代的3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基，更优选为3至8元单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基))。
上述“任选取代的5至14元芳族杂环基”和“任选取代的3至14元非芳族杂环基”的取代基的实例包括选自上述取代基组A的一个或多个取代基。这些取代基的数量优选为1至3个。当取代基数量为2个或更多时，各取代基可相同或不同。
R1更优选为
(1)氢原子，
(2)卤素原子(例如溴原子)，
(3)单-或二-C1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基)，
(4)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基，更优选为5至6元单环芳族环状氨基(例如1-吡咯基))，或
(5)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族杂环基，更优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基))。
R1进一步更优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族杂环基(优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、4-吗啉基))。
R1再更优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、4-吗啉基)。
R1特别优选为6元单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、4-吗啉基)。
环D为任选进一步取代的环。
环D所表示的“任选进一步取代的环”的环”优选为C6-14芳族烃环(例如苯)、C3-10环烷(优选为C3-8环烷(例如环己烷))、5至14元芳族杂环(优选为5至6元单环芳族杂环(例如吡啶、异噁唑、噻吩))或3至14元非芳族杂环(优选为3至8元单环非芳族杂环(例如哌啶、四氢吡喃))，更优选为苯环、环己烷环、吡啶环、异噁唑环、噻吩环、哌啶环或四氢吡喃环，特别优选为苯环。
环D优选为
(1)任选进一步取代的C6-14芳族烃环(例如苯)，
(2)任选进一步取代的C3-10环烷(优选为C3-8环烷(例如环己烷))，
(3)任选进一步取代的5至14元芳族杂环(优选为5至6元单环芳族杂环(例如吡啶、异噁唑、噻吩))，或
(4)任选进一步取代的3至14元非芳族杂环(优选为3至8元单环非芳族杂环(例如哌啶、四氢吡喃))。
上述“任选进一步取代的C6-14芳族烃环”、“任选进一步取代的C3-10环烷”、“任选进一步取代的5至14元芳族杂环”和“任选进一步取代的3至14元非芳族杂环”，除了式(I)中的-L-环C/环B以外，各自任选进一步具有一个或多个取代基。该取代基的实例包括上述“取代基”。这些取代基的数量优选为1至3个。当取代基数量为2个或更多时，各取代基可相同或不同。
环D更优选为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的C6-14芳族烃环(例如苯)：
(a)卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子)，
(b)羟基，
(c)任选被1至3个C1-6烷氧基(例如甲氧基)取代的C1-6烷基(例如甲基)，
(d)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、己氧基)：
(i)羧基，
(ii)C1-6烷氧基-羰基(例如甲氧基羰基)，
(iii)C7-16芳烷基氧基-羰基(例如苯甲基氧基羰基)，
(iv)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基)：
(A)C3-10环烷基(例如环丙基)，
(B)C6-14芳基(例如苯基)，
(C)任选被1至3个卤素原子(例如氟原子)取代的C6-14芳基氨基(例如苯基氨基)，
(D)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，
(E)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基))，和
(F)任选被一个或多个选自C1-6烷基(例如甲基)和C7-16芳烷基(例如2-苯基乙基)的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基，
(II)任选被1至3个C6-14芳基(例如苯基)取代的C2-6烯基(例如戊-2-基)，
(III)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的C3-10环烷基(例如环丙基)，
(IV)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C6-14芳基(例如苯基)：
(A)卤素原子(例如氟原子、氯原子)，和
(B)C1-6烷基(例如甲基)，
(V)C7-16芳烷基(例如苯甲基)，
(VI)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，和
(VII)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基)、9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基))，以及
(v)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至14元非芳族杂环羰基(优选为3至8元单环非芳族杂环羰基(例如吡咯烷基羰基、哌啶基羰基、吗啉基羰基、1,1-二氧化噻唑烷基羰基))：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基(例如甲基)，以及
(e)C7-16芳烷基氧基(例如苯甲基氧基)，
(2)C3-10环烷烃(优选为C3-8环烷烃(例如环己烷))，
(3)5至14元芳族杂环(优选为5至6元单环芳族杂环(例如吡啶、异噁唑、噻吩))，或
(4)任选被1至3个C1-6烷氧基-羰基(例如叔丁氧基羰基)进一步取代的3至14元非芳族杂环(优选为3至8元单环非芳族杂环(例如哌啶、四氢吡喃))。
环D进一步更优选为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子)，
(b)羟基，
(c)任选被1至3个C1-6烷氧基(例如甲氧基)取代的C1-6烷基(例如甲基)，
(d)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、己氧基)：
(i)羧基，
(ii)C1-6烷氧基-羰基(例如甲氧基羰基)，
(iii)C7-16芳烷基氧基-羰基(例如苯甲基氧基羰基)，
(iv)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基)：
(A)C3-10环烷基(例如环丙基)，
(B)C6-14芳基(例如苯基)，
(C)任选被1至3个卤素原子(例如氟原子)取代的C6-14芳基氨基(例如苯基氨基)，
(D)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，
(E)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基))，和
(F)任选被一个或多个选自C1-6烷基(例如甲基)和C7-16芳烷基(例如2-苯基乙基)的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基，
(II)任选被1至3个C6-14芳基(例如苯基)取代的C2-6烯基(例如戊-2-基)，
(III)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的C3-10环烷基(例如环丙基)，
(IV)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C6-14芳基(例如苯基)：
(A)卤素原子(例如氟原子、氯原子)，和
(B)C1-6烷基(例如甲基)，
(V)C7-16芳烷基(例如苯甲基)，
(VI)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，和
(VII)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基)、9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基))，以及
(v)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至14元非芳族杂环羰基(优选为3至8元单环非芳族杂环羰基(例如吡咯烷基羰基、哌啶基羰基、吗啉基羰基、1,1-二氧化噻唑烷基羰基))：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基(例如甲基)，以及
(e)C7-16芳烷基氧基(例如苯甲基氧基)，
(2)环己烷环，
(3)吡啶环，
(4)异噁唑环，
(5)噻吩环，
(6)任选被1至3个C1-6烷氧基-羰基(例如叔丁氧基羰基)进一步取代的哌啶环，或
(7)四氢吡喃环。
环D再更优选为任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如溴原子)，和
(b)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基)：
(i)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个C3-6环烷基(例如环丙基)取代的C1-6烷基(例如甲基、异丁基)，和
(II)3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基)，以及
(ii)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至8元单环非芳族杂环羰基(例如哌啶基羰基)：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基(例如甲基)。
作为另一实施方案，环D再更优选为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如溴原子)，
(b)羟基，和
(c)任选被一个或多个氨基甲酰基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基)，该一个或多个氨基甲酰基任选被一个或多个9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基)单-或二-取代，或
(2)吡啶环。
在该实施方案中，环D特别优选为被1个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如溴原子)，和
(b)被一个或多个氨基甲酰基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基)，该一个或多个氨基甲酰基被9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基)单-取代。
化合物(I)的优选实例包括以下化合物。
[化合物A]
化合物(I)，其中，
环A为任选进一步取代的苯环；
环B为任选进一步取代的苯环；
环C为任选被一个或多个C1-6烷基进一步取代的咪唑环，该一个或多个C1-6烷基任选被1至3个选自以下的取代基取代：
(1)卤素原子，
(2)硝基，
(3)氰基，
(4)氨基，
(5)羟基，和
(6)任选卤代的C1-6烷氧基；
L为键或任选取代的亚甲基；
R1为
(1)氢原子，
(2)卤素原子(例如溴原子)，
(3)任选取代的氨基(优选为单-或二-C1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基))，
(4)任选取代的5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基，更优选为5至6元单环芳族环状氨基(例如1-吡咯基))，或
(5)任选取代的3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基，更优选为3至8元单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基))；且
环D为
(1)任选进一步取代的C6-14芳族烃环(例如苯)，
(2)任选进一步取代的C3-10环烷(优选为C3-8环烷(例如环己烷))，
(3)任选进一步取代的5至14元芳族杂环(优选为5至6元单环芳族杂环(例如吡啶、异噁唑、噻吩))，或
(4)任选进一步取代的3至14元非芳族杂环(优选为3至8元单环非芳族杂环(例如哌啶、四氢吡喃))。
[化合物B]
化合物(I)，其中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为任选被C1-6烷基(例如甲基)进一步取代的咪唑环；
L为键或亚甲基；
R1为
(1)氢原子，
(2)卤素原子(例如溴原子)，
(3)单-或二-C1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基)，
(4)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基，更优选为5至6元单环芳族环状氨基(例如1-吡咯基))，或
(5)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族杂环基，更优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基))；且
环D为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的C6-14芳族烃环(例如苯)：
(a)卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子)，
(b)羟基，
(c)任选被1至3个C1-6烷氧基(例如甲氧基)取代的C1-6烷基(例如甲基)，
(d)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、己氧基)：
(i)羧基，
(ii)C1-6烷氧基-羰基(例如甲氧基羰基)，
(iii)C7-16芳烷基氧基-羰基(例如苯甲基氧基羰基)，
(iv)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基)：
(A)C3-10环烷基(例如环丙基)，
(B)C6-14芳基(例如苯基)，
(C)任选被1至3个卤素原子(例如氟原子)取代的C6-14芳基氨基(例如苯基氨基)，
(D)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，
(E)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基))，和
(F)任选被一个或多个选自C1-6烷基(例如甲基)和C7-16芳烷基(例如2-苯基乙基)的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基，
(II)任选被1至3个C6-14芳基(例如苯基)取代的C2-6烯基(例如戊-2-基)，
(III)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的C3-10环烷基(例如环丙基)，
(IV)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C6-14芳基(例如苯基)：
(A)卤素原子(例如氟原子、氯原子)，和
(B)C1-6烷基(例如甲基)，
(V)C7-16芳烷基(例如苯甲基)，
(VI)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，和
(VII)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基)、9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基))，以及
(v)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至14元非芳族杂环羰基(优选为3至8元单环非芳族杂环羰基(例如吡咯烷基羰基、哌啶基羰基、吗啉基羰基、1,1-二氧化噻唑烷基羰基))：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基(例如甲基)，以及
(e)C7-16芳烷基氧基(例如苯甲基氧基)，
(2)C3-10环烷(优选为C3-8环烷(例如环己烷))，
(3)5至14元芳族杂环(优选为5至6元单环芳族杂环(例如吡啶、异噁唑、噻吩))，或
(4)任选被1至3个C1-6烷氧基-羰基(例如叔丁氧基羰基)进一步取代的3至14元非芳族杂环(优选为3至8元单环非芳族杂环(例如哌啶、四氢吡喃))。
[化合物C]
化合物(I)，其中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为任选被C1-6烷基(例如甲基)进一步取代的咪唑环；
L为键或亚甲基；
R1为
(1)氢原子，
(2)卤素原子(例如溴原子)，
(3)单-或二-C1-6烷基氨基(例如二甲基氨基、二乙基氨基)，
(4)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基，更优选为5至6元单环芳族环状氨基(例如1-吡咯基))，或
(5)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族杂环基，更优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基))；且
环D为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子)，
(b)羟基，(c)任选被1至3个C1-6烷氧基(例如甲氧基)取代的C1-6烷基(例如甲基)，
(d)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、己氧基)：
(i)羧基，
(ii)C1-6烷氧基-羰基(例如甲氧基羰基)，
(iii)C7-16芳烷基氧基-羰基(例如苯甲基氧基羰基)，
(iv)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基)：
(A)C3-10环烷基(例如环丙基)，
(B)C6-14芳基(例如苯基)，
(C)任选被1至3个卤素原子(例如氟原子)取代的C6-14芳基氨基(例如苯基氨基)，
(D)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基-(例如吡啶基))，
(E)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基))，和
(F)任选被一个或多个选自C1-6烷基(例如甲基)和C7-16芳烷基(例如2-苯基乙基)的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基，
(II)任选被1至3个C6-14芳基(例如苯基)取代的C2-6烯基(例如戊-2-基)，
(III)任选被1至3个C1-6烷基(例如甲基)取代的C3-10环烷基(例如环丙基)，
(IV)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C6-14芳基(例如苯基)：
(A)卤素原子(例如氟原子、氯原子)，和
(B)C1-6烷基(例如甲基)，
(V)C7-16芳烷基(例如苯甲基)，
(VI)5至14元芳族杂环基(优选为5至6元单环芳族杂环基(例如吡啶基))，和
(VII)3至14元非芳族杂环基(优选为3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基)、9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基))，以及
(v)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至14元非芳族杂环羰基(优选为3至8元单环非芳族杂环羰基(例如吡咯烷基羰基、哌啶基羰基、吗啉基羰基、1,1-二氧化噻唑烷基羰基))：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基(例如甲基)，以及
(e)C7-16芳烷基氧基(例如苯甲基氧基)，
(2)环己烷环，
(3)吡啶环，
(4)异噁唑环，
(5)噻吩环，
(6)任选被1至3个C1-6烷氧基-羰基(例如叔丁氧基羰基)进一步取代的哌啶环，或
(7)四氢吡喃环。
[化合物D]
化合物(I)，其中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为咪唑环；
L为键；
R1为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族杂环基(优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、4-吗啉基))；且
环D为任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如溴原子)，和
(b)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基)：
(i)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个C3-6环烷基(例如环丙基)取代的C1-6烷基(例如甲基、异丁基)，和
(II)3至8元单环非芳族杂环基(例如四氢吡喃基)，以及
(ii)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至8元单环非芳族杂环羰基(例如哌啶基羰基)：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基(例如甲基)。
[化合物E]
化合物(I)，其中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为咪唑环；
L为键；
R1为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族杂环基(优选为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、4-吗啉基))；且
环D为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如溴原子)，
(b)羟基，和
(c)任选被一个或多个氨基甲酰基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基)，该一个或多个氨基甲酰基任选被9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基)单-或二-取代，或
(2)吡啶环。
[化合物F]
化合物(I)，其中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为咪唑环；
L为键；
R1为3至8元(优选为5至6元)单环非芳族环状氨基(例如1-哌啶基、4-吗啉基)；且
环D为被1个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子(例如溴原子)，和
(b)被一个或多个氨基甲酰基取代的C1-6烷氧基(例如甲氧基)，该一个或多个氨基甲酰基被9至14元稠合多环(优选为2或3环)非芳族杂环基(例如1,1-二氧化二氢苯并噻吩基)单-取代。
[化合物G]
N-(1,1-二氧化-2,3-二氢-1-苯并噻吩-5-基)-2-(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酰胺，或其盐(实施例17)。
2-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(吗啉-4-基)异吲哚啉-1-酮，或其盐(实施例8)。
5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-3-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮，或其盐(实施例46)。
5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮，或其盐(实施例45)。
2-(2-(4-羟基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮，或其盐(实施例4)。
化合物(I)的具体实例包括下述实施例1至73的化合物。
作为式(I)所示的化合物的盐，药理学上可接受的盐是优选的，且此种盐的实例包括与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。
与无机碱的盐的优选实例包括碱金属盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属盐例如钙盐、镁盐等；铝盐；铵盐等。
与有机碱的盐的优选实例包括与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇[三(羟基甲基)甲基胺]、叔丁基胺、环己基胺、苯甲基胺、二环己基胺、N,N-二苯甲基乙二胺等的盐。
与无机酸的盐的优选实例包括与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。
与有机酸的盐的优选实例包括与甲酸、乙酸、三氟乙酸、酞酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。
与碱性氨基酸的盐的优选实例包括与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐。
与酸性氨基酸的盐的优选实例包括与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
下面说明化合物(I)的制备方法。
以下制备方法中的每个步骤中所使用的原料化合物或试剂以及所获得的化合物各自可呈盐的形式，此种盐的实例包括与式(I)所示的化合物等的盐类似的那些。
当每个步骤中所获得的化合物为游离形式时，可以将其通过本身已知的方法转换成目标的盐。当每个步骤中所获得的化合物为盐时，可以将其通过本身已知的方法转换成目标游离形式或其他盐。
每个步骤中所获得的化合物可以作为反应溶液直接使用，或作为粗产物用于下一反应。或者，可将每个步骤中所获得的化合物根据本身已知的方法，例如浓缩、结晶、再结晶、蒸馏、溶剂萃取、分馏、柱色谱等分离手段从反应混合物中分离和纯化。
当每个步骤的原料化合物或试剂是可商购时，该可商购产品也可以直接使用。
在每个步骤的反应中，虽然反应时间根据有待使用的试剂和溶剂的种类而变化，除非另有说明，其通常为1分钟-48小时，优选为10分钟-8小时。
在每个步骤的反应中，虽然反应温度根据有待使用的试剂和溶剂的种类而变化，除非另有说明，其通常为-78℃-300℃，优选为-78℃-150℃。
在每个步骤的反应中，虽然压力根据有待使用的试剂和溶剂的种类而变化，除非另有说明，其通常为1atm-20atm，优选为1atm-3atm。
微波合成器例如Biotage公司制造的Initiator等可用于每个步骤的反应中。虽然反应温度根据有待使用的试剂和溶剂的种类而变化，除非另有说明，其通常为室温-300℃，优选为50℃-250℃。虽然反应时间根据有待使用的试剂和溶剂的种类而变化，除非另有说明，其通常为1分钟-48小时，优选为1分钟-8小时。
在每个步骤的反应中，除非另有说明，试剂相对于基质而言的使用量为0.5当量-20当量，优选为0.8当量-5当量。当试剂用作催化剂时，试剂相对于基质而言的使用量为0.001当量-1当量，优选为0.01当量-0.2当量。当试剂用作反应溶剂时，试剂以溶剂量使用。
除非另有说明，每个步骤中的反应在无溶剂的情况下进行，或者通过将原料化合物溶解或悬浮在合适的溶剂中进行。溶剂的实例包括实施例所述的溶剂和以下溶剂。
醇：甲醇、乙醇、叔丁醇、2-甲氧基乙醇等；
醚：乙醚、二苯基醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷等；
芳族烃：氯苯、甲苯、二甲苯等；
饱和烃：环己烷、己烷等；
酰胺：N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；
卤化烃：二氯甲烷、四氯化碳等；
腈：乙腈等；
亚砜：二甲基亚砜等；
芳族有机碱：吡啶等；
酸酐：乙酸酐等；
有机酸：甲酸、乙酸、三氟乙酸等；
无机酸：盐酸、硫酸等；
酯：乙酸乙酯等；
酮：丙酮、甲基乙基酮等；
水。
上述溶剂可以以适当的比率使用其中的两种或更多的混合物。
当将碱用于每个步骤中的反应时，其实例包括实施例所述的那些和以下碱。
无机碱：氢氧化钠、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸钙、碳酸氢钠等；
有机碱：三乙基胺、二乙基胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N,N-二甲基苯胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯、咪唑、哌啶等；金属醇盐：乙醇钠、叔丁醇钾等；
碱金属氢化物：氢化钠等；
金属氨化物：氨基钠、二异丙基氨基锂、六甲基二硅氮烷锂盐等；
有机锂：正丁基锂等。
当将酸或酸催化剂用于每个步骤中的反应时，其实例包括实施例中所述的那些以及以下的酸和酸催化剂。
无机酸：盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、磷酸等；
有机酸：乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、10-樟脑磺酸等；
路易斯酸：三氟化硼乙醚络合物、碘化锌、无水氯化铝、无水氯化锌、无水氯化铁等。
除非另有说明，每个步骤中的反应根据本身已知的方法，例如Jikken KagakuKouza,第5版,第13-19卷(the Chemical Society of Japan编辑)；Shin Jikken KagakuKouza,第14-15卷the Chemical Society of Japan编辑)；Fine Organic Chemistry,修订第2版(L.F.Tietze,Th.Eicher,Nankodo)；Organic Name Reactions,the ReactionMechanism and Essence,修订版(Hideo Togo,Kodansha)；ORGANIC SYNTHESESCollective第I-VII卷(John Wiley&Sons Inc.)；Modern Organic Synthesis in theLaboratory A Collection of Standard Experimental Procedures(Jie Jack Li,OXFORD UNIVERSITY)；Comprehensive Heterocyclic Chemistry III,第1-14卷(ElsevierJapan)；Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis(translated by Kiyoshi Tomioka,Kagakudojin)；Comprehensive OrganicTransformations(VCH Publishers Inc.),1989等中所述的方法或实施例中所述的方法进行。
在每个步骤中，官能基团的保护或脱保护反应根据本身已知的方法，例如“Protective Groups in Organic Synthesis,第4版”,Wiley-Interscience,Inc.,2007(Theodora W.Greene,Peter G.M.Wuts)；“Protecting Groups第3版”Thieme,2004(P.J.Kocienski)等中所述的方法，或者实施例中所述的方法进行。
醇等的羟基以及酚羟基的保护基团的实例包括醚型保护基团，例如甲氧基甲基醚、苯甲基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚、四氢吡喃基醚等；羧酸酯型保护基团，例如乙酸酯等；磺酸酯型保护基团，例如甲磺酸酯等；碳酸酯型保护基团，例如碳酸叔丁酯等，诸如此类。
醛的羰基的保护基团的实例包括缩醛型保护基团，例如二甲基缩醛等；环状缩醛型保护基团，例如1,3-二噁烷等，诸如此类。
酮的羰基的保护基团的实例包括缩酮型保护基团，例如二甲基缩酮等；环状缩酮型保护基团，例如1,3-二噁烷等；肟型保护基团，例如O-甲基肟等；腙型保护基团，例如N,N-二甲基腙等，诸如此类。
羧基的保护基团的实例包括酯型保护基团，例如甲基酯等；酰胺型保护基团，例如N,N-二甲基酰胺等，诸如此类。
硫醇基的保护基团的实例包括醚型保护基团，例如苯甲基硫醚等；酯型保护基团，例如硫代乙酸酯、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯等，诸如此类。
氨基或咪唑、吡咯、吲哚等芳族杂环的保护基团的实例包括氨基甲酸酯型保护基团，例如氨基甲酸苯甲酯等；酰胺型保护基团，例如乙酰胺等；烷基胺型保护基团，例如N-三苯基甲基胺等；磺酰胺型保护基团，例如甲磺酰胺等，诸如此类。
保护基团可根据本身已知的方法去除，例如通过使用采用酸、碱、紫外线、肼、苯肼、N-甲基二硫代氨基甲酸钠、四丁基氟化铵、乙酸钯、三烷基甲硅烷基卤化物(例如三甲基甲硅烷基碘化物、三甲基甲硅烷基溴化物)等的方法、还原方法等去除。
当在每个步骤中进行还原反应时，有待使用的还原剂的实例包括金属氢化物，例如氢化铝锂、三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝(DIBAL-H)、硼氢化钠、四甲基三乙酰氧硼氢化铵等；硼烷，例如硼烷四氢呋喃络合物等；阮内镍；阮内钴；氢；甲酸；三乙基硅烷等。当将碳-碳双键或者三键还原时，可以采用使用催化剂例如与钯-碳、林德拉(Lindlar)催化剂等的方法。
当在每个步骤中进行氧化反应时，有待使用的氧化剂的实例包括过氧化物，例如间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、过氧化氢、叔丁基氢过氧化物等；高氯酸盐，例如四丁基高氯酸铵等；氯酸盐，例如氯酸钠等；亚氯酸盐，例如亚氯酸钠等；高碘酸盐，例如高碘酸钠等；高价碘试剂，例如亚碘酰苯等；含锰的试剂，例如二氧化锰、高锰酸钾等；铅，例如四乙酸铅等；含铬的试剂，例如氯铬酸吡啶鎓(PCC)、重铬酸吡啶鎓(PDC)、Jones试剂等；卤素化合物，例如N-溴琥珀酰亚胺(NBS)等；氧；臭氧；三氧化硫-吡啶络合物；四氧化锇；二氧化硒；2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)等。
当在每个步骤中进行自由基环化反应时，有待使用的自由基引发剂的实例包括偶氮化合物，例如偶氮双异丁腈(AIBN)等；水溶性自由基引发剂，例如4,4’-偶氮双-4-氰基戊酸(ACPA)等；在空气或氧存在下的三乙基硼；过氧化苯甲酰基等。有待使用的自由基反应试剂的实例包括三丁基锡烷、三三甲基甲硅烷基硅烷、1,1,2,2-四苯基二硅烷、二苯基硅烷、碘化钐等。
当在每个步骤中进行Wittig反应时，有待使用的Wittig试剂的实例包括亚烷基膦烷等。亚烷基膦烷可通过本身已知的方法，例如使鏻盐与强碱进行反应来制备。
当在每个步骤中进行Horner-Emmons反应时，有待使用的试剂的实例包括膦酰基乙酸酯，例如二甲基膦酰基乙酸甲酯、二乙基膦酰基乙酸乙酯等；碱，例如碱金属氢化物、有机锂等。
当在每个步骤中进行Friedel-Crafts反应时，使用路易斯酸与酰氯的组合，或路易斯酸与烷基化剂(例如卤化烷、醇、烯烃等)的组合作为试剂。或者，也可使用有机酸或无机酸代替路易斯酸，也可使用酸酐例如乙酸酐等代替酰氯。
当在每个步骤中进行芳族亲核取代反应时，使用亲核剂(例如胺、咪唑等)和碱(例如有机碱等)作为试剂。
当在每个步骤中进行碳阴离子的亲核加成反应、碳阴离子的亲核1,4-加成反应(Michael加成反应)或碳阴离子的亲核取代反应时，用于产生碳阴离子的碱的实例包括有机锂、金属烷醇盐、无机碱、有机碱等。
当在每个步骤中进行Grignard反应时，有待使用Grignard试剂的实例包括芳基镁卤化物，例如苯基镁溴化物等；和烷基镁卤化物，例如甲基镁溴化物等。Grignard试剂可通过本身已知的方法，例如通过在醚或四氢呋喃作为溶剂的情况下，使烷基卤或芳基卤与金属镁进行反应来制备。
当在每个步骤中进行Knoevenagel缩合反应的情况，使用具有两个吸电子基团的活性亚甲基化合物(例如丙二酸、丙二酸二乙酯、丙二腈等)和碱(例如有机碱、金属醇盐、无机碱)作为试剂。
当在每个步骤中进行Vilsmeier-Haack反应的情况，使用磷酰氯和酰胺衍生物(例如N,N-二甲基甲酰胺等)作为试剂。
当在每个步骤中进行醇、烷基卤化物、磺酸酯的叠氮化反应时，有待使用的叠氮化剂的实例包括二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、三甲基甲硅烷基叠氮化物、叠氮化钠等。例如，对于醇的叠氮化反应，采用使用二苯基磷酰基叠氮化物和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)的方法或使用三甲基甲硅烷基叠氮化物和路易斯酸的方法等。
当在每个步骤中进行还原性氨基化反应时，有待使用的还原剂的实例包括三乙酰氧基硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢、甲酸等。当基质为胺化合物时，有待使用的羰基化合物的实例包括多聚甲醛，醛，例如乙醛等和酮，例如环己酮等。当基质为羰基化合物时，有待使用的胺的实例包括氨，伯胺，例如甲胺等；仲胺，例如二甲胺等，诸如此类。
当在每个步骤中进行光延反应的情况，使用偶氮二羧酸酯(例如偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)等)和膦(例如三苯基膦、三丁基膦)作为试剂。
当在每个步骤中进行酯化反应、酰胺化反应或脲形成反应时，有待使用的试剂的实例包括酰基卤，例如酰氯、酰溴等；活化的羧酸，例如酸酐、活化的酯、硫酸酯等。羧酸的活化剂的实例包括碳二亚胺缩合剂，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSCD)等；三嗪缩合剂，例如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物-n-水合物(DMT-MM)等；碳酸酯缩合剂，例如1,1-羰基二咪唑(CDI)等；二苯基磷酸叠氮化物(DPPA)；苯并三唑-1-基氧基-三二甲基氨基鏻盐(BOP试剂)；2-氯-1-甲基-吡啶鎓碘化物(向山试剂)；亚硫酰氯；卤甲酸低级烷基酯，例如氯甲酸乙酯等；O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)；硫酸；其组合等等。当使用碳二亚胺缩合剂时，可将添加剂，例如1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基琥珀酸酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)等进一步加至反应体系中。
当在每个步骤中进行偶合反应时，有待使用的金属催化剂的实例包括钯化合物，例如乙酸钯(II)、四(三苯基膦)钯(0)、二氯双(三苯基膦)钯(II)、二氯双(三乙基膦)钯(II)、三(二亚苯甲基丙酮)二钯(0)、1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁氯化钯(II)等；镍化合物，例如四(三苯基膦)镍(0)等；铑化合物，例如三(三苯基膦)氯化铑(III)等；钴化合物；铜化合物，例如氧化铜、碘化亚铜(I)等；铂化合物等。此外，可向反应体系中加入碱，其实例包括无机碱等。
当在每个步骤中进行硫羰基化反应时，通常使用五硫化二磷作为硫羰基化剂。或者，可使用具有1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷-2,4-二硫化物结构(例如，2,4-双(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷-2,4-二硫化物(Lawesson试剂)等)的试剂代替五硫化二磷。
当在每个步骤中进行Wohl-Ziegler反应时，有待使用的卤化剂的实例包括N-碘代琥珀酸酰亚胺、N-溴代琥珀酸酰亚胺(NBS)、N-氯代琥珀酸酰亚胺(NCS)、溴、硫酰氯等。另外，可通过使自由基引发剂，例如热、光、过氧化苯甲酰基、偶氮双异丁腈等经受反应体系反应而使反应加速。
当在每个步骤中进行羟基的卤化反应时，有待使用的卤化剂的实例包括氢卤酸和无机酸的酰卤，具体而言，用于氯化的盐酸、亚硫酰氯、氧氯化磷等，用于溴化的48％氢溴酸等。此外，可使用通过使醇与三苯基膦和四氯化碳或四溴化碳等反应来产生卤代烷的方法。或者，也可使用经由将醇转换成相应的磺酸酯，然后使磺酸酯与溴化锂、氯化锂或碘化钠进行反应的两步骤来产生卤代烷的方法。
当在每个步骤中进行Arbuzov反应时，有待使用的试剂的实例包括卤代烷，例如溴乙酸乙酯等；亚磷酸酯，例如亚磷酸三乙酯、亚磷酸三(异丙基)酯等。
当在每个步骤中进行磺酸酯化反应时，有待使用的磺化剂的实例包括甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯、甲磺酸酐、对甲苯磺酸酐等。
当在每个步骤中进行水解反应时，使用酸或碱作为试剂。对于叔丁酯的酸水解反应，可加入甲酸、三乙基硅烷等用于还原性地捕捉作为副产物的叔丁基阳离子。
当在每个步骤中进行脱水反应时，有待使用的脱水剂的实例包括硫酸、五氧化二磷、氧氯化磷、N,N’-二环己基碳二亚胺、氧化铝、多磷酸等。
化合物(I)可根据以下方法从化合物(II)制备。
Figure BDA0002705049570000411
其中，每个符号如上文所定义。
化合物(II)可根据本身已知的方法或与其类似的方法制备。
化合物(III)可通过使化合物(II)进行酰胺化反应来制备。
化合物(IV)可通过使化合物(III)进行光延反应来制备。
化合物(V)可通过使化合物(IV)进行还原反应来制备。
化合物(I)可通过使化合物(V)进行环化反应来制备。反应剂的实例包括对应于-L-环D的醛、酰氯等。可将亚硫酸氢钠、三乙基胺等加入到反应体系中。
在如此获得的化合物(I)中，分子内的官能基团也可通过将本身已知的化学反应的组合而转换成目标官能基团。化学反应的实例包括氧化反应、还原反应、烷基化反应、酰基化反应、脲化反应、水解反应、氨基化反应、酯化反应、芳基偶合反应、脱保护反应等。
在上述制备方法中，当起始化合物具有氨基、羧基、羟基、羰基或巯基作为取代基时，可将肽化学中通常使用的保护基团引入这些基团中，可通过在反应后视需要去除保护基团而获得目标化合物。
通过上述制备方法获得的化合物(I)可通过已知的手段，例如溶剂萃取、液体转化、相转移、结晶、再结晶、色谱等进行分离和纯化。
当化合物(I)含有旋光异构体、立体异构体、位置异构体和旋转异构体的情况，这些化合物也包括在化合物(I)中，且各自可通过本身已知的合成方法或分离方法以单一产物获得。例如，当化合物(I)中存在旋光异构体时，从该化合物中拆分出的光学异构体也包括在化合物(I)中。
在此，光学异构体可通过本身已知的方法来制备。
化合物(I)可为晶体。
化合物(I)的晶体(以下有时简称为本发明的晶体)可通过应用本身已知的结晶方法使化合物(I)结晶来制备。
在本说明书中，熔点是指例如通过微量熔点测定仪(Yanaco，MP-500D型，或Buchi，B-545型)或DSC(差示扫描量热分析)装置(SEIKO，EXSTAR6000)等测量的熔点。
通常，熔点有时取决于测量装置、测量条件等而变化。本说明书中的晶体可为显示出与本说明书中所述的值不同的熔点的晶体，只要差值在一般误差范围内。
上述化合物可为水合物、非水合物、溶剂合物、非溶剂合物。
此外，上述化合物可为用同位素(例如2H、3H、11C、14C、18F、35S、125I等)等标记或取代的化合物。
上述化合物还包括氘转化，其中将1H转化成2H(D)。
上述化合物还包括互变异构体。
上述化合物可为药学上可接受的共晶体或共晶体盐。共晶体或共晶体盐是指各自具有不同的物理特性(例如结构、熔点、熔解热、吸湿性、溶解性和稳定性等)，在室温由两种或更多特殊固体所构成的结晶物质。共晶体或共晶体盐可通过本身已知的共结晶方法制备。
本发明的心肌细胞成熟促进剂可以按原样，或者与药理学上可接受的载体混合并将混合物根据本身已知的方法配制而使用。
由于化合物(I)具有优异的促进心肌细胞成熟的活性，因此它可用作心肌细胞成熟促进剂。因此，通过将未成熟心肌细胞在化合物(I)或其盐的存在下进行培养，可在相较于当仅在培养基成分中进行培养时更短的时间内制备成熟心肌细胞。
在本说明书中，术语“多能性(pluripotency)”是指分化成具有不同的形态和/或功能的组织或细胞，以及分化成三个胚层的任何系列的细胞的能力。“多能性”不能分化成胚盘。因此，“多能性”不同于术语“全能性(totipotency)”，在于它没有形成个体的能力，“全能性”可分化成包括胚盘的生物体的所有组织。
在本说明书中，“多潜能性(multipotency)”是指分化成多个有限数量的系列的细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞为多潜能的，而不是多能的。
在本说明书中，“干细胞”的实例包括多能干细胞。
施用化合物(I)的“心肌细胞”没有特别限制，它们优选源自哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猪、猴、人类)，更优选源自人类。
可通过化合物(I)促进成熟的心肌细胞没有特别限制，只要可基于下述的标记表达水平、形态或结构(例如肌节、线粒体)、性质(例如搏动性、电生理学成熟度)等确定它们处于未成熟期。
可通过化合物(I)促进成熟的心肌细胞也可是通过从多能干细胞分化诱导而制备的细胞，或者从活体分离的未成熟心肌细胞(例如，源自小鼠或大鼠的胎儿或新生儿的心肌细胞)。
多能干细胞的实例包括但不限于，胚胎干(ES)细胞、生殖系干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导的多能干(iPS)细胞、源自通过核移植所获得的克隆胚胎的胚胎干(ntES)细胞等。多能干细胞优选为ES细胞、iPS细胞和ntES细胞。
(A)胚胎干细胞
ES细胞是从哺乳动物例如人类或小鼠等的早期胚胎(例如囊胚)的内部细胞团建立的干细胞，这些干细胞具有多能性和通过自我更新的生长能力。
ES细胞是源自囊胚的内细胞团的胚胎干细胞，囊胚是受精卵的8细胞期和桑椹期之后形成的胚胎。ES细胞具有分化为构成成人的任何细胞的能力，即所谓的分化多能性，以及通过自我更新的生长能力。ES细胞于1981年在小鼠中发现(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981),Nature 292:154-156)，这之后建立了灵长类如人类、猴等的ES细胞系(J.A.Thomson等人(1998),Science 282:1145-1147；J.A.Thomson等人(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848；J.A.Thomson等人(1996),Biol.Reprod.,55:254-259；J.A.Thomson和V.S.Marshall(1998),Curr.Top.Dev.Biol.,38:133-165)。
ES细胞可通过从受试动物的受精卵的囊胚中移出内部细胞团，接着将内部细胞团在饲养层成纤维细胞上进行培养而建立。可使用补充有一种或多种物质如白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等的培养基进行继代培养来维持细胞。建立和维持人类和猴ES细胞的方法描述于例如US 5,843,780B；Thomson JA等人(1995),ProcNatl.Acad.Sci.USA.92:7844-7848；Thomson JA等人(1998),Science.282:1145-1147；H.Suemori等人(2006),Biochem.Biophys.Res.Commun.,345:926-932；M.Ueno等人(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:9554-9559；H.Suemori等人(2001),Dev.Dyn.,222:273-279；H.Kawasaki等人(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1580-1585；和Klimanskaya I等人(2006),Nature.444:481-485。
关于用于制备ES细胞的培养基，可例如使用补充有0.1mM 2-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸、20％KSR和4ng/mL bFGF的DMEM/F-12培养基在37℃在2％CO2/98％空气的潮湿气氛下维持人类ES细胞(O.Fumitaka等人(2008),Nat.Biotechnol.,26:215-224)。ES细胞必须每3至4天进行继代培养，并且该继代培养可使用例如在含有1mMCaCl2和20％KSR的PBS中的0.25％胰蛋白酶和0.1mg/ml胶原蛋白酶IV进行。
ES细胞的选择通常可通过使用基因标记如碱性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等的表达作为指标的实时PCR法进行。特别地，为了选择人类ES细胞，可将基因标记如OCT-3/4，NANOG，ECAD等的表达用作指标(E.Kroon等人(2008),Nat.Biotechnol.,26:443-452)。
关于ES细胞，作为小鼠ES细胞，由inGenious targeting laboratory、Riken(Institute of Physical and Chemical Research)等建立的各种小鼠ES细胞系是可用的，作为人类ES细胞，由NIH、Riken、京都大学(Kyoto University)、Cellartis等建立的各种人类ES细胞系是可用的。例如，人类ES细胞系的实例包括NIH的CHB-1–CHB-12系、RUES1系、RUES2系、HUES1-HUES28系等，WisCell Research的H1系和H9系，以及Riken的KhES-1系、KhES-2系、KhES-3系、KhES-4系、KhES-5系、SSES1系、SSES2系、SSES3系等。或者，可使用临床等级的细胞系以及使用这些细胞系制备的研究或临床细胞系等。
(B)生殖系干细胞
生殖系干细胞为源自睾丸的多能干细胞，并起着精子发生来源的作用。与ES细胞相似，这些细胞可被诱导分化为各种系列的细胞，并且例如具有通过将细胞移植到小鼠囊胚中实现制备嵌合小鼠的性质(M.Kanatsu-Shinohara等人(2003)Biol.Reprod.,69:612-616；K.Shinohara等人(2004),Cell,119:1001-1012)。生殖系干细胞能够在含有神经胶质细胞系神经营养因子(GDNF)的培养基中自我更新，并且通过在与ES细胞相同的培养条件下重复其继代培养，可以获得生殖系干细胞(Masanori Takehashi等人(2008),ExperimentalMedicine,26(5)(附加版):41-46,Yodosha(日本东京))。
(C)胚胎生殖细胞
胚胎生殖细胞是从胎儿原始生殖细胞建立的，具有与ES细胞相似的多能性。它们可以通过在诸如LIF、bFGF、干细胞因子等物质的存在下培养原始生殖细胞来建立(Matsui等人(1992),Cell,70:841-847；J.L.Resnick等人(1992),Nature,359:550-551)。
(D)诱导的多能干细胞
“诱导的多能干细胞(iPSC)”是指通过将某种因子(核重编程因子)引入哺乳动物体细胞或未分化干细胞中进行重编程而获得的细胞。目前，存在各种各样的“诱导的多能干细胞”，并且也可以使用的那些如下：Yamanaka等人通过将四个因子Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入小鼠成纤维细胞中而建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)；以及通过将相同的四个因子引入人类成纤维细胞中而建立的源自人类细胞的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,等人Cell,(2007)131:861-872.)；通过引入上述四个因子，然后以Nanog的表达为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；用不包括c-Myc的方法制备的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,等人Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)；以及通过无病毒方法引入六个因子而建立的iPS细胞(Okita K等人Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K等人Stem Cells.31(3):458-66)。另外，也可使用由Thomson等人制备的诱导的多能干细胞是通过引入四种因子OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28建立的(Yu J.,Thomson JA.等人,Science(2007)318:1917-1920.)，一种由Daley等人制备的诱导的多能干细胞(ParkIH,Daley GQ.等人,Nature(2007)451:141-146)，以及由Sakurada等人制备的诱导的多能干细胞(日本专利申请特开号2008-307007)等。
此外，可使用所有已公开的论文(例如，Shi Y.,Ding S.,等人,Cell Stem Cell,(2008)Vol 3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,等人,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,等人,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)，或专利(例如，日本专利申请特开号2008-307007，日本专利申请特开号2008-283972，US2008-2336610，US 2009-047263，WO2007-069666，WO 2008-118220，WO 2008-124133，WO2008-151058，WO2009-006930，WO 2009-006997，WO 2009-007852)中所述的本领域已知的任何诱导的多能干细胞。
作为诱导的多能细胞系，由NIH、Riken、京都大学等建立的各种iPSC系是可用的。例如，人类iPSC系的实例包括Riken的HiPS-RIKEN-1A系、HiPS-RIKEN-2A系、HiPS-RIKEN-12A系、Nips-B2系，京都大学的253G1系、201B7系、409B2系、454E2系、606A1系、610B1系和648A1系等。或者，也可使用由京都大学、Cellular Dynamics International等提供的临床等级的细胞系以及使用这些细胞系制备的研究或临床细胞系等。
本说明书中所使用的术语“体细胞”是指除了生殖系细胞和全能细胞，例如卵子、卵母细胞、ES细胞等之外的所有动物细胞(优选为包括人类的哺乳动物细胞)。体细胞的实例包括但不限于任何胎儿体细胞，新生儿体细胞和成熟、健康或患病的体细胞，以及任何原代培养细胞、继代培养细胞和已建立的细胞系。体细胞的具体实例包括：(1)组织干细胞(体干细胞)，例如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等；(2)组织祖细胞；(3)分化细胞，例如淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞、脂肪细胞等。
在本发明中，从其收集体细胞的哺乳动物个体不受限制，优选人类。在将获得的iPS细胞用于人类再生医学的情况下，特别优选的是，考虑到预防排斥反应，从患者本人或具有相同或基本相同的人类白细胞抗原(HLA)类型的其他人收集体细胞。在此，“实质上相同”的HLA类型是指，当从源自体细胞的iPS细胞进行分化诱导得到的细胞被移植至患者时，通过使用一种或多种免疫抑制剂等使HLA类型匹配至允许移植细胞存活的程度。例如，这意味着该人具有与患者相同的主要HLA(例如，在三个基因座HLA-A、HLA-B和HLA-DR)(以下相同)。另一方面，例如，在不对人施用(移植)细胞的情况下，在用于测试候选药物对心肌细胞的毒性的方法中，用作iPS细胞来源的体细胞来源细胞不受限制。在将iPS细胞用作筛选细胞来源以评估患者的药物敏感性或副作用的情况下，优选从患者本人或具有与药物敏感性或副作用有关的一种或多种相同遗传多态性的另一个人收集体细胞。
(E)源自通过核移植获得的克隆胚胎的ES细胞
ntES细胞是源自通过核移植技术制备的克隆胚胎的ES细胞，并且具有与源自受精卵的ES细胞几乎相同的特性(T.Wakayama等人(2001),Science,292:740-743；S.Wakayama等人(2005),Biol.Reprod.,72:932-936；J.Byrne等人(2007),Nature,450:497-502)。即，ntES(核转移ES)细胞是由囊胚的内部细胞团建立的ES细胞，所述囊胚源自通过用体细胞核替换未受精卵的核而获得的克隆胚胎。为了制备ntES细胞，采用了核移植技术(J.B.Cibelli等人(1998),Nature Biotechnol.,16:642-646)和ES细胞制备技术(上述)的组合(Sayaka Wakayama等人(2008),Experimental Medicine 26(5)(附加版),pp.47-52。在核移植中，可通过将体细胞核注入哺乳动物去核的未受精卵中并将其培养数小时来实现重编程。
如本文所用，术语“心肌细胞”是指表达选自心肌肌钙蛋白(cTNT)、αMHC(α肌球蛋白重链，MYH6)和βMHC(MYH7)的至少一种标记基因的细胞。cTNT的实例包括在人类的情况下的NCBI登录号NM_000364和在小鼠的情况下的NM_001130176。αMHC的实例包括在人类的情况下的NCBI登录号NM_002471和在小鼠的情况下的NM_001164171。βMHC的实例包括在人类的情况下NCBI登录号NM_000257和在小鼠的情况下的NM_080728。
已知随着心肌细胞成熟，发生其中肌钙蛋白I1(TNNI1)的表达降低，肌钙蛋白I3(TNNI3)的表达升高的同工型转换(Fikru B.Bedada,(2014)3(4):594–605.)。如本文所用，“心肌细胞是成熟的(成熟)”是指至少TNNI3表达增加。
关于诱导的多能干细胞分化为未成熟心肌细胞的方法，可以通过例如LaflammeMA等人报道的方法由多能干细胞制备心肌细胞(Laflamme MA&Murry CE,Nature 2011,Review)。
该方法的其他实例包括但不限于通过诱导的多能干细胞的悬浮培养通过形成细胞团(胚状体)来制备心肌细胞的方法，在存在抑制骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的物质存在下制备心肌细胞的方法(WO 2005/033298)，通过依次添加激活素A和BMP制备心肌细胞的方法(WO 2007/002136)，在存在促进经典Wnt信号通路激活的物质的情况下制备心肌细胞的方法(WO2007/126077)，从诱导的多能干细胞中分离Flk/KDR阳性细胞，然后在环孢菌素A存在下制备心肌细胞(WO 2009/118928)的方法，等等。
此外，还提出了利用细胞因子通过胚状体形成诱导分化为心肌细胞的方法(YangL等人，Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population.,Nature.,2008May22；453(7194):524-8)，在无细胞因子的条件下通过粘附培养诱导分化为心肌细胞的方法(Lian X等人，Robust cardiomyocytedifferentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation ofcanonical Wnt signaling.,Proc Natl Acad Sci U S A.,2012July 3；109(27):E1848-57)，在无细胞因子条件下通过粘附培养和悬浮培养组合使用而诱导分化为心肌细胞的方法(Minami I等人，A small molecule that promotes cardiac differentiation ofhuman pluripotent stem cells under defined,cytokine-and xeno-freeconditions.,Cell Rep.,2012Nov 29；2(5):1448-60)等。
从多能干细胞获得未成熟的心肌细胞的培养基没有特别限制，可以使用本身已知的培养基。其实例包括IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle最低基础培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer培养基、Neurobasal培养基(Life Technologies)、StemPro34(Invitrogen)，从StemFit AK02除去溶液C后的培养基(AJINOMOTO AK02，400mL溶液A和100mL B溶液，总计500mL)、Essential 6培养基(Thermo Fischer Scientific)及其混合培养基等。
本身已知的添加剂可以根据细胞和培养条件添加到这些培养基中。例如，培养基可以包含血清，或者可以是无血清的。如果需要，培养基可以包含一种或多种血清替代品，例如白蛋白、转铁蛋白、Knockout血清替代品(KSR)(ES细胞培养过程中FBS的血清替代品)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、1-巯基甘油等，并且还可以包含一种或多种物质，例如脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子量化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。其中，优选的培养基是StemPro34或从StemFitAK02中除去溶液C后的培养基，每种培养基都含有转铁蛋白、1-巯基甘油、L-谷氨酰胺和抗坏血酸，或含有B27补充剂的RPMI1640。
激活素A、BMP4和bFGF或CHIR99021的组合用作用于使用上述培养基诱导分化为心肌细胞的初始添加剂。
在激活素A、BMP4和bFGF的组合的情况下，这些添加剂的使用浓度为：对于激活素A优选为1ng/mL至100ng/mL，对于BMP4为1ng/mL至100ng/mL，对于bFGF为1ng/mL至100ng/mL，更优选对于激活素A为6ng/mL，对于BMP4为10ng/mL，对于bFGF为5ng/mL。
在CHIR99021的情况下，使用浓度优选为100nM至100μM，更优选为4至6μM。
在添加上述添加剂之后，通过向培养基中添加血管内皮生长因子(VEGF)和Wnt抑制剂，多能干细胞可分化为心肌细胞。
有待使用的VEGF的浓度优选为1至100ng/mL，更优选为10ng/mL。
Wnt抑制剂的实例包括DKK1蛋白(例如，在人类的情况下NCBI登录号：NM_012242)、硬化蛋白(例如在人类的情况下NCBI登录号：NM_025237)、IWR-1(Merck Millipore)、IWP-2(Sigma-Aldrich)，IWP-3(Sigma-Aldrich)、IWP-4(Sigma-Aldrich)、PNU-74654(Sigma-Aldrich)，XAV939(Sigma-Aldrich)及其衍生物等。其中，优选使用IWP-3、IWP-4和IWR-1。
有待使用的Wnt抑制剂的浓度只要能够抑制Wnt，就没有特别限制，优选为1nM-50μM，特别优选为1-2μM。
由多能干细胞制备未成熟心肌细胞的培养时间为例如5至365天，优选5至100天，更优选5至60天，进一步更优选5至40天，还更优选5至30天。
用作本发明的心肌细胞成熟促进剂的化合物的量没有特别限制，其例如为每1×104至1×107个未成熟心肌细胞，0.01至100μM，优选0.1至30μM，更优选1至10μM。
本发明的心肌细胞成熟促进剂可以单独或以一种或多种的组合包含本文所述的特定化合物。或者，本发明的心肌细胞成熟促进剂可包含一种或多种本文所述的特定化合物与一种或多种具有促进心肌细胞成熟的活性的化合物的组合，所述化合物不同于本文所述的那些(例如，根据在此实验例中所述的方法，被证实具有促进心肌细胞成熟的活性的化合物，例如2-甲氧基-5-((Z)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯酚、(2-(2-甲氧基-4-甲基苯基)-4-甲基-1,3-噻唑-5-基)氨基甲酸(1-乙基-1H-苯并三唑-5-基)甲酯、(2'β)-22-氧代长春花碱、2-(2-(4-氯苯基)乙基)-6-(2-呋喃基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶、4,5-脱水-1,2-二脱氧-4-甲基-2-((N-(吗啉-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-O-甲基-L-酪氨酰基)氨基)-1-苯基-L-苏-戊-3-酮糖、3-(3-甲氧基苯基)-N7,N7-二甲基异喹啉-1,7-二胺、4-(2-苯甲基苯甲酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸甲酯、2'-(4-氨基苯基)-1H,1'H-2,5'-联苯并咪唑-5-胺，以及其盐)。
作为心肌细胞成熟的指标，可以使用心肌细胞成熟的标记的表达水平、形态和结构(例如，肌节、线粒体)、性质(例如，搏动性、电生理学成熟度)等。这些指标可以通过本身已知的方法来确认。
例如，用于心肌细胞成熟的标记的表达水平可以通过以下方法进行分析：使用PCR测量标记基因的表达水平进行分析；使用蛋白质印迹法等通过标记蛋白的表达水平进行分析；或使用显微镜或流式细胞仪通过荧光标记进行分析。可以使用膜片钳技术等通过静息膜电位的深度来分析电生理学成熟度指标。肌节微观结构或线粒体的指标可通过电子显微镜观察；使用显微镜或流式细胞仪通过荧光标记进行分析；或通过细胞外通量分析仪等进行功能分析。
在一个实施方案中，通过使用本发明的化合物(I)获得的成熟心肌细胞可以用于心脏再生医学。例如，可以将包含通过本发明的方法制备的心肌细胞的细胞团的组合物施用于患有心脏病的患者的心脏。具体地，通过本发明的方法获得的心肌细胞可以以细胞悬液的形式或以心肌细胞片(单层或多层)的形式直接移植到患有心脏病的患者的心脏中。例如，关于心肌细胞片的制备方法，参见WO 2012/133945、WO 2013/137491、WO 2014/192909和WO 2016/076368。
在另一个实施方案中，通过使用本发明的化合物(I)获得的心肌细胞还可以用于药物筛选或药物心脏毒性评估以治疗心脏病，以，因为心肌细胞是均匀成熟的。例如，通过对通过本发明的方法获得的心肌细胞施用测试药物，然后测量心肌细胞的反应，可以评估测试药物的效果和毒性。
在另一个实施方案中，通过使用本发明的化合物(I)获得的具有降低的自律性的心肌细胞可以用于心脏再生医学。
实施例
本发明进一步通过以下实施例和实验例进行详细说明。然而，这些实施例并未对本发明进行限定，且这些实施例可在本发明范围的范围内进行修改。
以下实施例中的“室温”通常为约10℃至约35℃。除非另有说明，混合溶剂的比率是体积混合比率，除非另有说明，％是指wt％。
除非另有说明，实施例中的柱色谱中的洗脱在通过TLC(薄层色谱)的观测下进行。在通过TLC的观测中，使用Merck公司制造的60F254作为TLC板，使用柱色谱中用作洗脱溶剂的溶剂作为洗脱液，使用UV检测器用于检测。在硅胶柱色谱中，NH的指示是指使用氨基丙基硅烷键合的硅胶，Diol的指示是指使用3-(2,3-二羟基丙氧基)丙基硅烷键合的硅胶。在制备型HPLC(高效液相色谱)中，C18的指示是指使用十八基键合的硅胶。除非另有说明，洗脱溶剂的比率为体积混合比率。
1H NMR通过傅里叶变换NMR测量。对于1H NMR的分析，使用ACD/SpecManager(商品名)软件等。有时未描述具有非常平缓的质子峰的羟基、氨基等的峰。
MS通过LC/MS测量。作为离子化方法，使用ESI方法或APCI方法。数据表示实测值(found)。虽然通常观测到分子离子峰，但有时观测到碎片离子。在盐的情况，通常观测到游离形式的分子离子峰或碎片离子峰。
针对旋光度([α]D)的样品浓度(c)的单位为g/100mL。
元素分析值(Anal.)描述为计算值(Calcd)和实测值(Found)。
实施例中通过粉末X射线衍射的峰是指在室温通过使用Ultima IV(日本RigakuCorporation)用Cu Kα辐射作为辐射源测得的峰。测量条件如下。
电压/电流：40kV/50mA
扫描速度：6度/分钟
2θ扫描范围：2-35度
实施例中通过粉末X射线衍射的结晶度通过Hermans方法计算。
在以下实施例中，使用以下缩写。
mp：熔点
MS：质谱
M：摩尔浓度
N：当量浓度
CDCl3：氘代氯仿
DMSO-d6：氘代二甲基亚砜
1H NMR：质子核磁共振
LC/MS：液相色谱质谱仪
ESI：电喷雾离子化
APCI：大气压化学离子化
THF：四氢呋喃
MeOH：甲醇
EtOH：乙醇
TEA：三乙基胺
DEAD：(E)-二氮烯-1,2-二甲酸二乙酯
实施例1
2-(2-苯基-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
A)5-(哌啶-1-基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮
在室温向5-溴-2-苯并呋喃-1(3H)-酮(25.0g)、哌啶(13.92mL)和甲苯(250mL)的混合物中加入乙酸钯(2.63g)、2,2’-双(二苯基膦)-1,1’-联萘(10.96g)和碳酸铯(26.78g)。将混合物在100℃搅拌12小时。向混合物中加入二氯甲烷，通过Celite过滤除去杂质，在减压下浓缩滤液。将残余物通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)进行纯化，获得标题化合物(13.0g)。
MS：[M+H]+218。
B)N-(4-氨基-3-硝基苯基)-2-(羟基甲基)-4-(哌啶-1-基)苯甲酰胺
在0℃向2-硝基苯-1,4-二胺(9.17g)和THF(200mL)的混合物中滴加2M三甲基铝甲苯溶液(65.89mL)，将混合物在室温搅拌1小时。在室温向反应混合物中加入5-(哌啶-1-基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮(13.0g)和THF(100mL)的混合物，将反应混合物在室温搅拌48小时。在0℃向混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，通过Celite过滤除去杂质，将滤液用乙酸乙酯进行萃取。将有机层分离，用饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱(MeOH/二氯甲烷)进行纯化，获得标题化合物(3.35mg)。
MS[M+H]+371。
C)2-(4-氨基-3-硝基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
在室温向N-(4-氨基-3-硝基苯基)-2-(羟基甲基)-4-(哌啶-1-基)苯甲酰胺(3.35g)、三丁基膦(2.9mL)和THF(130mL)的混合物中加入DEAD(5.12mL)。将混合物在室温搅拌16小时后，将反应溶液进行浓缩。向所获得的残余物中加入水和乙酸乙酯，将所产生的固体进行过滤，用乙酸乙酯洗涤，干燥，获得标题化合物(1.68g)。
MS[M+H]+353。
D)2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
在室温向2-(4-氨基-3-硝基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(1.68g)和EtOH(80mL)的混合物中加入10％钯碳(1.68g)。将混合物在3.4atm的氢气环境下，在室温搅拌12小时。通过过滤除去催化剂，将滤液在减压下进行浓缩而获得标题化合物(1.0g)。
MS[M+H]+323。
E)2-(2-苯基-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
在0℃向2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.075g)和THF(2mL)的混合物中加入TEA(0.035mL)以及苯甲酰氯(0.027mL)和THF(1mL)的混合物。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌1小时，将反应溶液进行浓缩。将所获得的残余物分配在乙酸乙酯-THF-水中，将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠进行干燥，在减压下进行浓缩。向所获得的残余物中加入MeOH(5mL)和浓盐酸(0.3mL)，将混合物回流12小时，将反应溶液进行浓缩。向所获得的残余物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，通过过滤收集所产生的固体，用乙酸乙酯洗涤，干燥，获得标题化合物(0.037g)。
实施例2
2-(2-苯甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
在0℃向苯基乙醛(0.046g)和EtOH(2mL)的混合物中加入亚硫酸氢钠(0.181mg)和2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.125mg)。在室温搅拌16小时，将反应溶液进行浓缩。向所获得的残余物中加入水，将所产生的固体通过过滤收集，用水洗涤。将残余物通过HPLC(L-Column 2ODS，流动相：水/乙腈(含有0.1％甲酸))进行纯化，获得标题化合物(0.024mg)。
实施例3
2-(2-(4-(苯甲基氧基)苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
在0℃向4-(苯甲基氧基)苯甲醛(0.082g)和EtOH(2mL)的混合物中加入亚硫酸氢钠(0.181g)和2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.125g)。在室温搅拌18小时，将反应溶液进行浓缩。向残余物中加入水，将所产生的固体通过过滤收集，用水洗涤，干燥。将残余物通过HPLC(L-Column2ODS，流动相：水/乙腈(含有10mM乙酸铵))进行纯化，获得标题化合物(0.030g)。
实施例4
2-(2-(4-羟基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮
在室温向2-(2-(4-(苯甲基氧基)苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.150g)和MeOH(6mL)和THF(3mL)的混合物中加入10％钯碳(0.1g)。将混合物在常压的氢气环境下，在室温搅拌16小时。通过过滤除去催化剂，将滤液在减压下进行浓缩。将残余物用乙醚和MeOH洗涤，干燥，获得标题化合物(0.070g)。
实施例5
(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酸甲酯
在0℃向(4-甲酰基苯氧基)乙酸甲酯(0.120g)和EtOH(3mL)的混合物中加入亚硫酸氢钠(0.290g)和2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.2g)。在室温搅拌16小时，将反应溶液进行浓缩。在所获得的残余物中加入水，将所产生的固体通过过滤收集，用水洗涤，干燥。将所获得的固体通过硅胶柱色谱(MeOH/二氯甲烷)进行纯化，获得标题化合物(0.120g)。
实施例6
(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酸
在室温向(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酸甲酯(1.3g)、THF(13mL)和水(13mL)的混合物中加入氢氧化锂(0.330g)。在室温搅拌16小时，向反应溶液中加入水。将混合物分配在乙酸乙酯-水中，将水层用1N盐酸(pH<4)酸化。将所产生的固体通过过滤收集，用水和MeOH洗涤，干燥，获得标题化合物(0.710g)。
实施例8
2-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(吗啉-4-基)异吲哚啉-1-酮
A)5-(4-吗啉基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮
将乙酸钯(0.948g)、2,2’-双(二苯基膦)-1,1’-联萘(3.95g)和碳酸铯(9.64g)和甲苯(70mL)的混合物在氮气环境下搅拌5分钟。向此混合物中加入5-溴-2-苯并呋喃-1(3H)-酮(9.0g)和吗啉(4.4mL)，将该混合物在氮气环境下于100℃搅拌4小时。将混合物冷却，在减压下进行浓缩。向残余物中加入氯仿，通过Celite过滤除去不溶物，在减压下浓缩滤液。向残余物中加入乙酸乙酯，通过过滤收集所产生的固体，获得粗产物。使粗产物从THF和乙酸乙酯中进行结晶，获得标题化合物(6.39g)。
1H NMR(200MHz,CDCl3)δ3.31-3.36(4H,m),3.85-3.90(4H,m),5.22(2H,s),6.82(1H,d,J＝1.6Hz),7.00(1H,dd,J＝8.8,2.2Hz),7.77(1H,d,J＝8.8Hz)。
B)2-(4-溴苯基)-5-硝基-1H-苯并咪唑
在0℃向4-硝基苯-1,2-二胺(5.0g)、三乙基胺(5.0mL)和THF(80mL)的混合物中滴加4-溴苯甲酰氯(7.17g)和THF(20mL)的混合物，将该混合物搅拌30分钟，然后在室温搅拌1小时。将混合物在减压下进行浓缩，向其中加入饱和碳酸氢钠水溶液，通过过滤收集所产生的固体，用水洗涤，获得粗产物。向此粗产物和甲醇(100mL)的混合物中加入浓盐酸(10mL)，将混合物在80℃搅拌22小时，在减压下进行浓缩。向残余物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，通过过滤收集所产生的固体，用水和乙酸乙酯依次洗涤，获得标题化合物(8.84g)。
1H NMR(200MHz,DMSO-d6)δ7.71(2H,d,J＝8.8Hz),7.81(1H,dd,J＝9.0,0.6Hz),8.17(1H,dd,J＝8.9,2.3Hz),8.28(2H,d,J＝8.8Hz),8.50(1H,d,J＝2.0Hz)。
C)2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-胺
将2-(4-溴苯基)-5-硝基-1H-苯并咪唑(7.68g)、氯化锡(II)二水合物(27.2g)和乙醇(300mL)的混合物在65℃搅拌3小时。将混合物冷却至室温，通过饱和碳酸氢钠水溶液调节至pH＝8，在减压下进行浓缩。向残余物中加入乙酸乙酯和水，通过Celite过滤除去不溶物，将水层分离，用乙酸乙酯进行萃取。将有机层合并，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠进行干燥，在减压下进行浓缩。将残余物用乙酸乙酯洗涤，获得标题化合物(5.61g)。
1H NMR(200MHz,DMSO-d6)δ4.96(2H,br),6.54(1H,dd,J＝8.7,2.1Hz),6.67(1H,s),7.29(1H,d,J＝8.4Hz),7.70(2H,d,J＝8.6Hz),8.00(2H,d,J＝8.4Hz),12.18(1H,brs)。
D)N-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-2-(羟基甲基)-4-(4-吗啉基)苯并酰胺
向2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-胺(1.0g)和THF(100mL)的混合物中滴加二甲基铝氯化物的1M己烷溶液(13.9mL)，将混合物搅拌5分钟。向其中加入5-(4-吗啉基)-2-苯并呋喃-1(3H)-酮(760.9mg)，将混合物搅拌4天。向其中分批加入0.005N盐酸，通过过滤收集所产生的固体，用0.005N盐酸、水、饱和碳酸氢钠水溶液和水依次洗涤，获得粗产物。使产物从THF-甲醇中进行结晶，获得标题化合物(1.033g)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ3.22(4H,m),3.77(4H,m),4.69(2H,d,J＝4.3Hz),5.43(1H,t,J＝4.8Hz),6.93(1H,dd,J＝8.7,2.5Hz),7.16(1H,d,J＝2.4Hz),7.44(1H,s),7.57(2H,d,J＝8.5Hz),7.77(2H,m),8.09(2H,d,J＝8.5Hz),8.20(1H,s),10.33(1H,s),12.92(1H,s)。
E)2-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(吗啉-4-基)异吲哚啉-1-酮
向N-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-2-(羟基甲基)-4-(4-吗啉基)苯并酰胺(0.95g)和N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的混合物中加入三丁基膦(1.75mL)后，向其中滴加DEAD(1.36mL)。将混合物搅拌1小时后，将反应溶液进行浓缩。向所获得的残余物中加入乙酸乙酯和少量的水，将混合物在回流下加热3分钟。将混合物冷却后，将所产生的固体通过过滤收集，用乙酸乙酯洗涤，干燥，获得标题化合物(807mg)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ3.29(4H,t,J＝4.7Hz),3.77(4H,t,J＝4.3Hz),4.99(2H,s),7.11(2H,m),7.72(5H,m),8.14(3H,m),13.00(1H,s)。
实施例17
N-(1,1-二氧化-2,3-二氢-1-苯并噻吩-5-基)-2-(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酰胺
在室温向(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酸(15mg)、N,N-二异丙基乙基胺(0.027mL)和N,N-二甲基乙酰胺(1mL)的混合物中加入氯-N,N,N’,N’-双(四亚甲基)甲脒鎓六氟磷酸盐(16mg)，在室温搅拌0.5小时。在室温向混合物中加入5-氨基-2,3-二氢苯并[b]噻吩1,1-二氧化物(11.4mg)，将混合物搅拌3天。将混合物进行过滤，将残余物通过HPLC(YMCTriartC18，流动相：水/乙腈(含有10mM碳酸氢铵))进行纯化，获得标题化合物(8.7mg)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ1.57-1.67(6H,m),3.36-3.39(6H,m),3.53-3.61(2H,m),4.87(2H,s),4.95(2H,s),7.01-7.13(2H,m),7.14-7.22(2H,m),7.49-7.79(5H,m),7.91(1H,s),7.98-8.28(3H,m),10.57(1H,brs),12.78(1H,brs)。
实施例9-16和18-28
在室温向(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酸(0.029mg，0.06mL)、氯-N,N,N’,N’-双(四亚甲基)甲脒鎓六氟磷酸盐(0.030mg)和N,N-二甲基乙酰胺(1mL)的混合物中滴加N,N-二异丙基乙基胺(0.052mL)，将混合物在室温搅拌0.5小时。在室温向混合物中加入对应的胺(0.12mL)，将混合物搅拌2小时。向混合物中加入水(0.5mL)，将混合物在60℃进行浓缩。将残余物通过HPLC(YMCTriartC18，流动相：水/乙腈(含有10mM碳酸氢铵))进行纯化，获得实施例9-16和18-28的化合物。
实施例29-38
将对应的胺(0.16mL)、2-(4-(5-(5-吗啉基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚啉-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酸(0.039mg，0.08mL)(根据实施例1的步骤A-C和实施例5-6的方法除了使用吗啉代替哌啶而合成)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(0.037mg)、N,N-二异丙基乙基胺(0.056mL)和N,N-二甲基甲酰胺(1mL)的混合物在室温搅拌16小时，将混合物在60℃进行浓缩。将残余物通过HPLC(YMCTriartC18，流动相：水/乙腈(含有10mM碳酸氢铵))进行纯化，获得实施例29-38的化合物。
实施例45
5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮
在0℃向2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.125mg)和THF(3mL)的混合物中加入TEA(0.119mL)以及异烟酰氯盐酸盐(0.069mg)和THF(2mL)的混合物。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌16小时，将反应溶液进行浓缩。将所获得的残余物分配在乙酸乙酯-THF-水中，将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠进行干燥，在减压下进行浓缩。向所获得的残余物中加入MeOH(10mL)和浓盐酸(0.6mL)，将混合物在70℃回流16小时，将反应溶液进行浓缩。向所获得的残余物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，通过过滤收集所产生的固体，获得粗产物。将此粗产物通过HPLC(L-Column 2ODS，流动相：水/乙腈(含有10mM碳酸氢铵))进行纯化，获得标题化合物(32mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.62(6H,brs),3.37(4H,brs),4.96(2H,s),7.07-7.10(2H,m),7.57(1H,d,J＝8.2Hz),7.69(2H,q,J＝8.7Hz),8.09(2H,d,J＝4.6Hz),8.19(1H,s),8.74(2H,d,J＝4.9Hz)。
实施例46
5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-3-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮
在0℃向烟碱醛和EtOH的混合物中加入亚硫酸氢钠(0.290mg)和2-(3,4-二氨基苯基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮(0.200mg)。将混合物在室温搅拌16小时，将反应溶液进行浓缩。向所获得的残余物中加入水，通过过滤收集所生成的固体，用水洗涤，干燥，获得粗产物。将此粗产物通过HPLC(L-Column2ODS，流动相：水/乙腈(含有10mM碳酸氢铵))进行纯化，获得标题化合物(48mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.62(6H,brs),3.37(4H,brs),4.96(2H,d,J＝7.0Hz),7.07-7.10(2H,m),7.56-7.60(3H,m),7.72(0.6H,d,J＝8.5Hz),7.88(0.4H,d,J＝8.5Hz),8.09(0.4H,brs),8.29(0.6H,brs),8.47-8.51(1H,m),8.67-8.68(1H,m),9.34-9.36(1H,m),13.10(1H,brs)。
将实施例化合物示于以下表中。表中的MS是指实测值。以下表中的实施例7、39至44和47至73的化合物是根据上述实施例所示的方法或与其类似的方法合成的。
[表1-1]
Figure BDA0002705049570000591
[表1-2]
Figure BDA0002705049570000592
Figure BDA0002705049570000601
[表1-3]
Figure BDA0002705049570000602
[表1-4]
Figure BDA0002705049570000603
Figure BDA0002705049570000611
[表1-5]
Figure BDA0002705049570000612
[表1-6]
Figure BDA0002705049570000621
[表1-7]
Figure BDA0002705049570000622
Figure BDA0002705049570000631
[表1-8]
Figure BDA0002705049570000632
[表1-9]
Figure BDA0002705049570000633
Figure BDA0002705049570000641
[表1-10]
Figure BDA0002705049570000642
[表1-11]
Figure BDA0002705049570000651
[表1-12]
Figure BDA0002705049570000652
Figure BDA0002705049570000661
[表1-13]
Figure BDA0002705049570000662
[表1-14]
Figure BDA0002705049570000663
Figure BDA0002705049570000671
[表1-15]
Figure BDA0002705049570000672
[表1-16]
Figure BDA0002705049570000673
Figure BDA0002705049570000681
[表1-17]
Figure BDA0002705049570000682
[表1-18]
Figure BDA0002705049570000691
[表1-19]
Figure BDA0002705049570000692
[表1-20]
Figure BDA0002705049570000701
[表1-21]
Figure BDA0002705049570000702
[表1-22]
Figure BDA0002705049570000711
[表1-23]
Figure BDA0002705049570000712
[表1-24]
Figure BDA0002705049570000721
[表1-25]
Figure BDA0002705049570000722
实验例1
为了检测心肌细胞的成熟化，制备了双敲入型(double knock-in)人类iPS细胞系，其中在TNNI1和TNNI3的基因座中分别插入报导子蛋白质序列EmGFP(序列编号1)和mCherry(序列编号2)(人类iPS细胞使用购自CTL公司的PBMC(LP_167，样品ID：20130318)从游离型载体(负载基因；OCT3/4、KLF4、SOX2、L-MYC、LIN28、小鼠p53DD)制备(参考文献；Okita K,等人Stem Cells.2012Nov 29.doi：10.1002/stem.1293))。
上述报导子iPS细胞系的维持培养通过常规方法进行(Okita K等人，StemCells.2012Nov 29.doi:10.1002/stem.1293)。
对于诱导分化为心肌细胞，将报导子iPS细胞系用0.5×TrypLE select(LifeTechnologies，用0.5mM EDTA/PBS稀释1/2)处理4至5分钟，用细胞刮刀(IWAKI)将细胞剥离，然后通过吸量管吸移解离成单一细胞。通过离心分离(1,000rpm，5min)去除培养基，将所获得的细胞以每30mL生物反应器(ABLE)1×107个细胞接种到生物反应器(ABLE)上，然后在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μM Rock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％基质胶(低生长因子)添加至从StemFit AK02除去C液后的培养基(AJINOMOTO AK02，400mL溶液A和100mL B溶液，共计500mL)中而制备的培养基中，在37℃，5％氧气条件下进行培养(55rpm，搅拌悬浮培养法)，以形成胚状体(第0天)。
翌日(第1天)，将10μg/mL的活化素A 9μL(最终浓度3ng/mL)、10μg/mL的bFGF 15μL(最终浓度5ng/mL)和10μg/mL的BMP4 24μL(最终浓度10ng/mL)添加至生物反应器中，将细胞在37℃，5％氧气条件下再培养2天。
接着(第3天)，将所获得的胚状体收集在50mL离心管中，然后进行离心分离(200mg，1min)。去除培养基，将胚状体在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6μM Dorsomorphin和5.4μM SB431542添加至从StemFit AK02除去C液后的培养基(AJINOMOTO AK02，400mL溶液A和100mL B溶液，共计500mL)中而制备的培养基中，在37℃，5％氧气条件下(55rpm，搅拌悬浮培养法)培养3天。
接着(第6天)，将生物反应器静置而使胚状体沉淀，并去除80至90％的培养基。将通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至从StemFit AK02除去C液后的培养基(AJINOMOTO AK02，400mL溶液A和100mL B溶液，共计500mL)中而制备的培养基添加至生物反应器中，使得总体积变为30mL，将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养8天(55rpm，搅拌悬浮培养法)。在培养期间，每2至3天将培养基替换为在相同条件下的培养基。
自分化诱导开始起第14天，将胚状体用2mg/mL I型胶原蛋白酶(Sigma)处理2小时，用0.25％胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen)处理10分钟。向其中添加50％FBS/IMDM(ThermoFisher Science)，并通过吸量管吸移使胚状体解离成单一细胞，然后进行离心分离(1,000rpm，5分钟)。离心分离后，去除上清液，将细胞再悬浮于100mL的基于StemFit AK02培养基的心肌细胞分化AK02培养基(通过将抗坏血酸50μg/mL、L-谷氨酰胺2mM、转铁蛋白150mg/mL、单硫代甘油4×10-4M、VEGF 5ng/mL添加至AJINOMOTO AK02(400mL溶液A和100mL B溶液，共计500mL中)而制备)中。将再悬浮的细胞以1.0×104个细胞/孔接种于预先用iMatrix-511(购自Nippi公司)涂覆的CellCarrier-384Ultra Microplate(PerkinElmer/6057300)上，并在基于StemFit AK02培养基的心肌细胞分化AK02培养基(通过将抗坏血酸50μg/mL、L-谷氨酰胺2mM、转铁蛋白150mg/mL、单硫代甘油4×10-4M混合至AJINOMOTO AK02(400mL溶液A和100mL B溶液，共计500mL)中而制备)中进行培养，70μL/孔。
在培养第3天和第6天将测试化合物(1或30μM，每孔一种化合物)以50μL/孔添加到孔中。在培养第8天，将细胞用多聚甲醛(Wako Pure Chemical Corporation,163-20145)进行固定，进行使用大鼠抗mCherry(Invitrogen，M11217)作为一次抗体，使用山羊抗大鼠IgGAlexa 647(Invitrogen，A-21247)作为二次抗体的免疫染色。通过HCS(高内涵筛选)系统(Perkin Elmer/OperaPhenix高内涵成像系统)(拍摄模式；非共焦，物镜10×air NA0.3)测定Alexa 647的表达水平。
由测得的荧光强度计算，对照孔(没有添加测试化合物)的平均荧光强度(n＝60的平均值)为797。将结果示于表2(n＝3的平均值(实施例1至7、9至59、61至71)或n＝6的平均值(实施例8、60、72和73))。另外，表2中的符号“-”是指因细胞减少而无法评估平均荧光强度。
表2-1
Figure BDA0002705049570000741
Figure BDA0002705049570000751
表2-2
实施例编号 平均荧光强度(在1μM处) 平均荧光强度(在30μM处)
30 1005 876
31 736 888
32 1312 1937
33 1568 3010
34 1540 -
35 1536 1204
36 1006 1743
37 1696 1290
38 1633 -
39 1042 1026
40 1089 1327
41 1107 1571
42 980 1041
43 1087 1153
44 1071 1141
45 1130 814
46 1142 1616
47 1115 1348
48 1182 1408
49 1382 890
50 1126 1717
51 963 1279
52 937 973
53 880 2812
54 838 -
55 1092 -
56 1185 897
57 778 1666
58 994 819
表2-3
实施例编号 平均荧光强度(在1μM处) 平均荧光强度(在30μM处)
59 803 1301
60 770 868
61 1150 -
62 1004 -
63 1194 -
64 1328 -
65 1245 836
66 1338 1358
67 1367 1188
68 1301 -
69 1222 1942
70 998 4335
71 923 -
72 1370 948
73 1231 922
实验例2
为了检测心肌细胞的成熟化，制备了双敲入型人类iPS细胞系，其中在TNNI1和TNNI3的基因座中分别插入报导子蛋白质序列EmGFP(序列编号1)和mCherry(序列编号2)(人类iPS细胞系使用购自CTL公司的PBMC(LP_167，样品ID：20130318)从游离型载体(负载基因；OCT3/4、KLF4、SOX2、L-MYC、LIN28、小鼠p53DD)制备(参考文献；Okita K,等人StemCells.2012Nov 29.doi：10.1002/stem.1293))。
上述报导子iPS细胞系的维持培养通过常规方法进行(Okita K等人，StemCells.2012Nov 29.doi:10.1002/stem.1293)。
对于诱导分化为心肌细胞，将报导子iPS细胞系用0.5×TrypLE select(LifeTechnologies，用0.5mM EDTA/PBS稀释1/2)处理4至5分钟，用细胞刮刀(IWAKI)将细胞剥离，然后通过吸量管吸移解离成单一细胞。通过离心分离(1,000rpm，5min)去除培养基，将所获得的细胞在6孔板中以2x106个细胞/1.5mL/孔，悬浮在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μM Rock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％基质胶(低生长因子)添加至StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基中，然后在37℃，5％氧气条件下静置培养，以形成胚状体(第0天)。
翌日(第1天)，向含有胚状体的6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μg/mL的活化素A 1.8μL(浓度12ng/mL)、10μg/mL的bFGF 15μL(浓度10ng/mL)和10μg/mL的BMP4 2.7μL(浓度18ng/mL)添加至1.5mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，以调节与第0天的培养基组合的体积为最终3mL(活化素A：6ng/mL，bFGF：5ng/mL，BMP4：10ng/mL)，将胚状体在37℃，5％氧气条件下再培养2天。
接着(第3天)，将含有胚状体的6孔板倾斜，然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中添加IMDM(ThermoFisher)培养基，同上，将板倾斜并然后静置1至2分钟，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6μM Dorsomorphin和5.4μM SB431542添加至3mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养3天。
接着(第6天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至2mL的StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养2天。
接着(第8天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将(1)1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF，以及(2)表3所示的测试化合物(各3μM)或DMSO(相对于培养基容积的0.1％添加)添加至2mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养2天。
接着(第10天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将(1)1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF，以及(2)表3所示的测试化合物(各3μM)或DMSO(相对于培养基容积的0.1％添加)添加至3mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，一般氧气条件下培养6天。在第13天，将培养基替换为在相同条件下的培养基。
在第16天，通过荧光显微镜拍摄在每种条件下的胚状体后，将含有胚状体的6孔板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中加入2mL的PBS，并同上，将板倾斜并然后静置1至2分钟，抽吸出PBS以免吸出胚状体。向每个孔中添加通过将DNase 10μg/mL和Liberase 100μg/mL添加至3mL的IMDM中而制备的溶液，使板在37℃，一般氧气条件下静置1小时。1小时后，将板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中加入2mL的PBS，并同上，将板倾斜并静置1至2分钟，抽吸出PBS以免吸出胚状体。向每个孔中添加通过将DNase10μg/mL添加至2mL的TrypLE select中而制备的溶液，然后将板在37℃，一般氧气条件下静置10分钟。然后，向每个孔加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、5ng/mL VEGF和DNase 10μg/mL添加至2mL的StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，通过吸量管吸移使胚状体解离成单一细胞，然后进行离心分离(1,000rpm，5分钟)。离心分离后，去除上清液，将细胞悬浮在1至2mL的2％FBS/PBS中，通过流式细胞仪(BD FACSAria Fusion细胞分选仪)分析TNNI1+细胞中的mCherry表达。结果示于表3和图1至7中。
表3
Figure BDA0002705049570000791
Figure BDA0002705049570000801
实验例3
为了检测心肌细胞的成熟化，制备了双敲入型人类iPS细胞系，其中在TNNI1和TNNI3的基因座中分别插入报导子蛋白质序列EmGFP(序列编号1)和mCherry(序列编号2)(人类iPS细胞使用购自CTL公司的PBMC(LP_167，样品ID：20130318)从游离型载体(负载基因；OCT3/4、KLF4、SOX2、L-MYC、LIN28、小鼠p53DD)制备(参考文献；Okita K,等人StemCells.2012Nov 29.doi：10.1002/stem.1293))。
上述报导子iPS细胞系的维持培养通过常规方法进行(Okita K等人，StemCells.2012Nov 29.doi:10.1002/stem.1293)。
对于诱导分化为心肌细胞，将报导子iPS细胞系用0.5×TrypLE select(LifeTechnologies，用0.5mM EDTA/PBS稀释1/2)处理4至5分钟，用细胞刮刀(IWAKI)将细胞剥离，然后通过吸量管吸移解离成单一细胞。通过离心分离(1,000rpm，5min)去除培养基，将所获得的细胞在6孔板中以2x106个细胞/1.5mL/孔，悬浮在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μM Rock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％基质胶(低生长因子)添加至StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基中，然后在37℃，5％氧气条件下静置培养，以形成胚状体(第0天)。
翌日(第1天)，向含有胚状体的6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μg/mL的活化素A 1.8μL(浓度12ng/mL)、10μg/mL的bFGF 15μL(浓度10ng/mL)和10μg/mL的BMP4 2.7μL(浓度18ng/mL)添加至1.5mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，以调节与第0天的培养基组合的体积为最终3mL(活化素A：6ng/mL，bFGF：5ng/mL，BMP4：10ng/mL)，将胚状体在37℃，5％氧气条件下再培养2天。
接着(第3天)，将含有胚状体的6孔板倾斜，然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中添加IMDM(ThermoFisher)培养基，同上，将板倾斜并然后静置1至2分钟，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10ng/mL VEGF、1μM IWP-3、0.6μM Dorsomorphin和5.4μM SB431542添加至3mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养3天。
接着(第6天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至2mL的StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养2天。
接着(第8天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将(1)1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF，以及(2)实施例8的化合物(3μM)或DMSO(相对于培养基容积的0.1％添加)添加至2mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，5％氧气条件下培养2天。
在第10天，将培养基替换为通过将(1)1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF，以及(2)化合物A(40nM，结构如以下所示)，或实施例8的化合物(3μM)和化合物A(40nM)的混合物，或DMSO(相对于培养基容积的0.1％添加)添加至2mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，一般氧气条件下培养6天。在第13天，将培养基替换为在相同条件下的培养基。
在第16天，通过荧光显微镜拍摄在每种条件下的胚状体后，将含有胚状体的6孔板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中加入2mL的PBS，并同上，将板倾斜并然后静置1至2分钟，抽吸出PBS以免吸出胚状体。向每个孔中添加通过将DNase 10μg/mL和Liberase 100μg/mL添加至3mL的IMDM中而制备的溶液，使板在37℃，一般氧气条件下静置1小时。1小时后，将板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中加入2mL的PBS，并同上，将板倾斜并静置1至2分钟，抽吸出PBS以免吸出胚状体。向每个孔中添加通过将DNase10μg/mL添加至2mL的TrypLE select中而制备的溶液，然后将板在37℃，一般氧气条件下静置10分钟。然后，向每个孔加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、5ng/mL VEGF和DNase 10μg/mL添加至2mL的StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，通过吸量管吸移使胚状体解离成单一细胞，然后进行离心分离(1,000rpm，5分钟)。离心分离后，去除上清液，将细胞悬浮在1至2mL的2％FBS/PBS中，通过流式细胞仪(BD FACSAria Fusion细胞分选仪)分析TNNI1+细胞中的mCherry表达。结果示于表4和图8中。
Figure BDA0002705049570000821
表4
Figure BDA0002705049570000822
Figure BDA0002705049570000831
实验例4
对于分析心肌细胞的电生理学功能，使用人类iPS细胞系409B2(使用购自CellApplications公司的HDF1388由游离型载体(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL)制备的(参考文献：Okita等人，Nat Methods.8(5):409-12.(2011)))。
上述iPS细胞系的维持培养通过常规方法进行(Takahashi K等人，Cell.131:861-72,2007和Nakagawa M等人，Nat Biotechnol.26:101-6,2008)。
对于诱导分化为心肌细胞，将iPS细胞系用CTK溶液(ReproCELL)处理2分钟后，去除溶液，然后将iPS细胞系用Accumax(Innovative Cell Technologies)处理5分钟，通过吸量管吸移使细胞解离成单一细胞。通过离心分离(1,000rpm，5min)收集细胞，以5000个细胞/70μL/孔接种到低附着96孔板(Corning)，在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10μM Rock抑制剂(Y-27632)、2ng/mL BMP4(R&D)和0.5％基质胶(低生长因子)添加至StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基中，在37℃，5％氧气条件下进行培养，以形成胚状体(第0天)。
翌日(第1天)，向含有胚状体的96孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、12ng/mL活化素A、10ng/mL bFGF和18ng/mL BMP4添加至StemPro-34 SFM(ThermoFisher)而制备的培养基(70μL)，以调节与第0天的培养基组合的体积为最终140μL，将胚状体在37℃，5％氧气条件下再培养2天。
接着(第3天)，收集所获得的胚状体，通过离心分离(1,000rpm，3min)去除培养基，并向其中添加Accumax(innovative cell technologies)。5分钟后，通过吸量管吸移使胚状体解离成单一细胞，向其中加入IMDM(5ml，invitrogen)，通过离心分离(1,000rpm，5min)去除培养基。将细胞以10000个细胞/100μL/孔接种到低附着96孔板(Corning)上，在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、10ng/mL VEGF和1μM IWP-3添加至StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基中，在37℃，5％氧气条件下培养3天。
接着(第6天)，收集所获得的胚状体，并放入低附着的6孔板中以便每孔不超过60EB。将含有胚状体的6孔板倾斜并静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至2mL的StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，一般氧气条件下培养4天。在第8天，将培养基替换为在相同条件下的培养基。
接着(第10天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。向6孔板的每个孔中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至2mL的StemPro-34SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，然后将胚状体在37℃，一般氧气条件下培养10天。在培养期间，每2至3天将培养基替换为在相同条件下的培养基。
接着(第20天)，将含有胚状体的6孔板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中加入2mL的PBS，并同上，将板倾斜并然后静置1至2分钟，抽吸出PBS以免吸出胚状体。向每个孔中添加通过将DNase 10μg/mL和Liberase 100μg/mL添加至3mL的IMDM中而制备的溶液，然后使胚状体在37℃，一般氧气条件下静置1小时。1小时后，将板倾斜并然后静置1至2分钟直至胚状体在孔的边缘沉淀，抽吸出上清液以免吸出胚状体。然后，向每个孔中加入2mL的PBS，并同上，将板倾斜并静置1至2分钟，抽吸出PBS以免吸出胚状体。向每个孔中添加通过将DNase 10μg/mL添加至2mL的TrypLE select中而制备的溶液，然后将胚状体在37℃，一般氧气条件下静置10分钟。然后，向每个孔加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M、5ng/mL VEGF和DNase 10μg/mL添加至2mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，通过吸量管吸移使胚状体解离成单一细胞。将细胞进行离心分离(1,000rpm，5分钟)。离心分离后，去除上清液，将细胞悬浮在1至2mL的2％FBS/PBS中并用SIRPa和Lineage(CD31、CD49a、CD90、CD140b)抗体进行染色，通过流式细胞仪(BDFACSAri Fusion细胞分选仪)收集SIRPa+Lin-细胞组(参见Dubois NC等人，NatBiotechnol.29:1011-8,2011)。将所收集的细胞进行离心分离(1,000rpm，5分钟)，悬浮在通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基中，以5x104个细胞/5μL接种至预先用纤连蛋白涂覆的玻璃底皿，将该皿在37℃，一般氧气条件下静置2至3小时。然后，向该皿中加入通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至2mL的StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备的培养基，将细胞在37℃，一般氧气条件下培养5天。在培养期间，每2至3天将培养基替换为在相同条件下的培养基。
在第25天，从该皿中去除培养基，替换为含有测试化合物I(实施例8的化合物，30μM)、测试化合物II(实施例8的化合物(30μM)和化合物A(40nM)的混合物)或作为对照的DMSO(终浓度0.1％)的培养基(该培养基通过将1％L-谷氨酰胺、转铁蛋白150μg/mL、抗坏血酸50μg/mL(Sigma)、单硫代甘油4×10-4M和5ng/mL VEGF添加至StemPro-34 SFM(ThermoFisher)中而制备)。然后将细胞在37℃，一般氧气条件下培养4天，在第28天，将细胞进行膜电位分析。
在第28天，从含有细胞的皿中去除培养基，将通过将0.2μL的FluoVoltTM膜电位染料(Invitrogen，F10488)添加至200μL的gay平衡盐溶液(Sigma)而制备的溶液滴加至皿的玻璃部分，将细胞在37℃，一般氧气条件下孵育15分钟。在孵育后，去除包含膜电位染料的溶液，将1mL gay平衡盐溶液添加至皿中，将细胞在显微镜台上的孵育器(37℃，一般氧气)中孵育1小时。孵育后，使用AquaCosmos 2.6(Hamamatsu Photonics K.K)以490nm的激发光每5.9毫秒使细胞进行荧光反应30秒。测量范围(ROI)设定成512×64像素，每个皿测量3个ROI。结果示于表5中。
表5每分钟的拍动数(每组n＝3，平均值±标准偏差)
对照 化合物I 化合物II
拍动数(平均值) 70.7 32.0 38.0
标准偏差 2.3 0 2
工业实用性
由于化合物(I)具有促进心肌细胞的成熟的活性，其可用作心肌细胞成熟促进剂。
本申请是基于2018年3月30日在日本提交的专利申请号2018-69872，其内容全部涵盖在本申请中。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人京都大学
武田药品工业株式会社
<120> 杂环化合物
<130> 092884
<150> JP2018-069872
<151> 2018-3-30
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 翠绿色荧光蛋白 (EmGFP)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaag gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gacccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 2
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta g 711

Claims (10)

1.一种式(I)所示的化合物或其盐，
Figure FDA0002705049560000011
其中，
环A和环B各自独立地为任选进一步取代的苯环，环C为任选被一个或多个C1-6烷基进一步取代的咪唑环，所述C1-6烷基任选被1至3个选自以下的取代基取代：
(1)卤素原子，
(2)硝基，
(3)氰基，
(4)氨基，
(5)羟基，和
(6)任选卤代的C1-6烷氧基，
L为键或任选取代的亚甲基，
R1为氢原子或取代基，且
环D为任选进一步取代的环。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中，在所述式(I)中，
环A为苯环；
环B为苯环；
环C为被一个或多个C1-6烷基进一步取代的咪唑环；
L为键或亚甲基；
R1为
(1)氢原子，
(2)卤素原子，
(3)单-或二-C1-6烷基氨基，
(4)5至14元芳族杂环基，或
(5)任选被1至3个C1-6烷基取代的3至14元非芳族杂环基；且
环D为
(1)任选被1至3个选自以下的取代基进一步取代的苯环：
(a)卤素原子，
(b)羟基，
(c)任选被1至3个C1-6烷氧基取代的C1-6烷基，
(d)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷氧基：
(i)羧基，
(ii)C1-6烷氧基-羰基，
(iii)C7-16芳烷基氧基-羰基，
(iv)任选被选自以下的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基：
(I)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C1-6烷基：
(A)C3-10环烷基，
(B)C6-14芳基，
(C)任选被1至3个卤素原子取代的C6-14芳基氨基，
(D)5至14元芳族杂环基，
(E)3至14元非芳族杂环基，和
(F)任选被选自C1-6烷基和C7-16芳烷基的取代基单-或二-取代的氨基甲酰基，
(II)任选被1至3个C6-14芳基取代的C2-6烯基，
(III)任选被1至3个C1-6烷基取代的C3-10环烷基，
(IV)任选被1至3个选自以下的取代基取代的C6-14芳基：
(A)卤素原子，和
(B)C1-6烷基，
(V)C7-16芳烷基，
(VI)5至14元芳族杂环基，和
(VII)3至14元非芳族杂环基，和
(v)任选被1至3个选自以下的取代基取代的3至14元非芳族杂环羰基：
(I)羟基，和
(II)C1-6烷基，和
(e)C7-16芳烷基氧基，
(2)环己烷环，
(3)吡啶环，
(4)异噁唑环，
(5)噻吩环，
(6)任选被1至3个C1-6烷氧基-羰基进一步取代的哌啶环，或
(7)四氢吡喃环。
3.N-(1,1-二氧化-2,3-二氢-1-苯并噻吩-5-基)-2-(4-(5-(1-氧代-5-(哌啶-1-基)-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)-1H-苯并咪唑-2-基)苯氧基)乙酰胺或其盐。
4.2-(2-(4-溴苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(吗啉-4-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
5.5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-3-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
6.5-(哌啶-1-基)-2-(2-(吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
7.2-(2-(4-羟基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基)-5-(哌啶-1-基)异吲哚啉-1-酮或其盐。
8.一种心肌细胞成熟促进剂，其包含根据权利要求1所述的化合物或盐。
9.一种制备成熟心肌细胞的方法，其包括在根据权利要求1所述的化合物或盐的存在下培养未成熟心肌细胞的步骤。
10.一种成熟心肌细胞，其通过根据权利要求9所述的方法获得。
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