CN111411075A

CN111411075A - 一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法

Info

Publication number: CN111411075A
Application number: CN202010160710.6A
Authority: CN
Inventors: 林彬; 高强; 庄建; 岑坚正; 麦锦连; 周丽诗
Original assignee: Guangdong Yuanxin Regenerative Medicine Co ltd
Current assignee: Guangdong Yuanxin Regenerative Medicine Co ltd
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-07-14

Abstract

本发明公开了一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法。发明人在研究过程中意外发现，一定浓度之上的血管紧张素Ⅱ处理hiPSC‑CM一定时间后，可以有效诱导hiPSC‑CM凋亡。本发明一些实例，使用血管紧张素Ⅱ诱导人心肌细胞的凋亡，构建与人体更加接近的心肌细胞凋亡模型，为后续的药理实验提供有力的工具和方法。

Description

一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞模型的构建方法，特别涉及一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法。

背景技术

心力衰竭是在老年人中非常流行的慢性病，且它的患病率和发病率正逐年上涨。全球接近2600万人次正在遭受心力衰竭的痛苦，5年内的存活率少于53％。每年全球因慢性心力衰竭治疗而造成的经济负担超过1080亿美元。心力衰竭是很多心血管疾病的末期表现，例如，缺血性心脏病，风湿性心脏病。由于个体差异，使得心力衰竭的治疗难以达到满意的效果。十分迫切建立评估不同药物对每个心力衰竭病人的效果的方法。

随着iPS(诱导多能干细胞)技术的发展、心肌细胞分化及纯化方法的建立，使得我们可以在体外制备来自患者的心肌细胞。这些心肌细胞已经协助我们研究心血管疾病，(如：长QT间期综合征，心律不齐，肥厚型心肌病，扩张型心肌病，线粒体心肌病，等)以及进行治疗心血管疾病药物的药理实验和心脏毒性试验(如：醛固酮拮抗剂，血管紧张素转化酶抑制剂，血管紧张素II受体阻断剂，β受体阻滞剂，血管紧张素脑啡肽酶受体抑制剂，等)。

建立人心肌细胞凋亡模型的方法对后续的研究十分重要，现有技术一般使用双氧水(过氧化氢)诱导细胞的凋亡。而过氧化氢并不是正常情况下导致人心力衰竭的原因,应用范围及其有限。

作为RAS系统(肾素-血管紧张素系统，能调节心血管疾病的病理过程，例如心力衰竭和高血压)的主要效应因子，血管紧张素II(Angiotensin II)通过激活血管紧张素II受体引起细胞凋亡，细胞肥大和心肌重构。因此，由血管紧张素II诱导的心肌细胞凋亡更加贴合和反映真实情况下的心力衰竭，在心力衰竭的病例机制中扮演着决定性角色。有研究显示，血管紧张素II可诱导hiPSC(人诱导多能干细胞)和hESC(人胚胎干细胞)来源的心肌细胞肥大，也有报道显示血管紧张素II的处理组和未处理组的细胞死亡和存活率无显著性差异。然而，没有研究表明血管紧张素II可以引起hiPSC-CM(人诱导多能干细胞分化的心肌细胞)凋亡。血管紧张素II受体有两种类型：AT1和AT2。一般认为，AT1参与血管紧张素II的主要作用，如增殖、肥大和纤维化，而血管紧张素II通过与AT2结合而引起细胞凋亡和心脏重构。对hiPSC-CM的基因表达分析，显示hiPSC-CM的AT2表达缺失，这可能是导致以前报道的血管紧张素II未能引起hiPSC-CM细胞凋亡的原因。

构建一种能更为有效反应真实心血管的hiPSC-CM细胞凋亡模型，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种构建可以更为有效反应真实心血管的hiPSC-CM细胞凋亡模型的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

血管紧张素Ⅱ在制备hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡诱导剂中的应用。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为150μM～1mM。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间不少于6天。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间为6～10天。

血管紧张素Ⅱ的使用终浓度大于100μM时，诱导培养超过6天即可有效诱导hiPSC-CM凋亡。

本发明的第二个方面，提供：

血管紧张素Ⅱ在构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型中的应用。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为150μM～1mM。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间不少于6天。

在一些实例中，血管紧张素Ⅱ的诱导时间为6～10天。

本发明的第三个方面，提供：

一种构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型的方法，包括在hiPSC分化而来的心肌细胞的培养液中添加终浓度为100μM～1mM的血管紧张素Ⅱ，继续培养得到获得凋亡的hiPSC-CM。

在一些实例中，所述培养液中hiPSC-CM的浓度为(2～10)×10⁴/mL。

在一些实例中，所述继续培养的时间不少于6天。

在一些实例中，所述继续培养的时间为6～10天。

在一些实例中，所述培养液中血管紧张素Ⅱ的终浓度为150μM～1mM。

实验结果表明，更高浓度(1mM)的血管紧张素Ⅱ诱导，细胞凋亡的比例更高。可以根据需要调节血管紧张素Ⅱ的使用浓度。

本发明的有益效果是：

发明人在研究过程中意外发现，一定浓度之上的血管紧张素Ⅱ处理hiPSC-CM一定时间后，可以有效诱导hiPSC-CM凋亡。

本发明一些实例，使用血管紧张素Ⅱ诱导人心肌细胞的凋亡，构建与人体更加接近的心肌细胞凋亡模型，为后续的药理实验提供有力的工具和方法。

附图说明

图1是不同浓度AngⅡ短期处理对hiPSC-CM活力的影响；

图2是不同浓度AngⅡ长期处理对hiPSC-CM活力的影响；

图3是不同浓度AngⅡ处理2天对hiPSC-CM各基因表达的影响；

图4是不同浓度AngⅡ处理10天对hiPSC-CM各基因表达的影响；

图5是不同浓度AngⅡ处理10天的流式细胞分析结果。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

1、按常规的，公认的方法获得iPS细胞。

2、按常规的，公认的方法将iPS细胞分化成心肌细胞并进行纯化。

或具体的，可参照如下方法获得纯化的hiPSC-CM。

hiPSC-CM的获得

1.1hiPSC细胞的培养：将人诱导多能干细胞DYR0100(ATCC)接种于Matrigel基质(康宁，354277)包被的平板上，然后用Stemflex培养基(Gibco，A3349401)进行培养。StemFlex培养基每两天更换一次。iPSC每隔3天传代一次，或在细胞培养达到80-90％汇合度时传代。传代过程中用1×DPBS(Gibco，14040133)冲洗1次，然后在室温下用使用1×DPBS(Gibco，14190144)稀释的0.5mM EDTA(Invitgen，15575020)在中处理10min。传代比为1：3-1：6。

1.2hiPSC细胞的分化：在RPMI-BSA培养基[RPMI1640培养基(HyClone，SH30027.01)+213μg/mL AA2P(l-抗坏血酸2-磷酸镁)(A8960，Sigma)和0.1％牛血清白蛋白(A1470，Sigma)]中，加入CHIR99021(Tcriis4423，终浓度为10mmol M)处理iPSC 24小时，然后换RPMI-BSA培养基静止培养。在分化第4天，在RPMI-BSA培养基中加入IWP2(Tcriis3533，终浓度5μM)处理细胞。48h后换用RPMI-BSA培养基。在随后的实验中，用RPMI1640培养基加3％的血清替代物(Gibco，10828-028)培养心肌细胞。

1.3hiPSC-CM细胞的纯化：使用代谢选择方法纯化hiPSC-CM。代谢选择培养基为添加0.1％牛血清白蛋白(SIGMA，A1470)和1×亚油酸-油酸-白蛋白(SIGMA，L9655)的DMEM培养基(无葡萄糖)(Gibco，11966-025)。用代谢选择培养基处理细胞3～6d。培养基每2天更换一次。心肌细胞纯度可高达99％。

血管紧张素Ⅱ诱导hiPSC-CM凋亡

2.1血管紧张素Ⅱ诱导hiPSC-CM细胞凋亡：

纯化后用添加不同量(1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,100μM,1mM)血管紧张素Ⅱ的心肌细胞培养液(MedChemExpress，HY-13948)进行血管紧张素Ⅱ处理，每隔2天更换一次血管紧张素Ⅱ培养液。

2.2hiPSC-CM凋亡验证：

2.2.1不同浓度和不同培养时间AngⅡ处理对hiPSC-CM的活性影响

按说明书用PrestoBlue细胞活性检测试剂(Invitgen，A13261)检测心肌细胞活性，结果如图1和图2所示。

2.2.2AngⅡ对hiPSC-CM细胞凋亡和增殖相关基因表达水平的影响

用UNLQ-10柱Trizol总RNA分离试剂盒(Sangon Biotech，B511321-0100)提取总RNA，然后用DNase I(Sangon Biotech，B618252)处理30min。mRNA使用iScript ReverseTranscription Supermix(Bio-Rad，1708841)进行逆转录。使用PikoReal-time PCRsystem(Thermo Fisher)和Sso Advanced^TMUniversal

Green SuperMix(BioRad，1725271)进行定量聚合酶链反应。定量PCR的引物来自先前报告，具体如下(从5‘到3’)：

结果如图3和图4所示。

2.2.3长时间(6d和10d)高浓度(100μM和1mM)AngⅡ处理诱导hiPSC-CM细胞凋亡

从细胞活性检测结果看，仅长期AngⅡ处理使hiPSC-CM得活性下降。

因此，为了研究细胞凋亡率，我们对AngⅡ处理10天的hiPSC-CM细胞进行凋亡分析。

应用凋亡检测试剂盒Annexin V，Alexa Fluor^TM488conjugate(InvitgenV13201)检测AngⅡ处理和未处理心肌细胞的凋亡情况。心肌细胞用凋亡标记物Annexin V标记后，用FACSAria^TMII流式细胞分析仪(BD)进行分析。结果如图5所示，图中，经0nM(未处理)、100μM和1mM AngⅡ处理10天的hiPSC-CM用凋亡标记物Annexin V标记，使用流式细胞分析仪进行分析。未染色组用DPBS缓冲液代替Annexin V染色试剂。

实验结果：

通过测试hiPSC-CM在不同浓度和培养时间，包括8个浓度(0nM(未经处理)、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM an和1mM))和4个处理时间(24小时、48小时、6天和10天)确定血管紧张素Ⅱ的促凋亡作用。在AngⅡ短期处理(24小时和48小时)，无论浓度高低，对照组hiPSC-CM和AngⅡ处理组hiPSC-CM在细胞活性上，均无显著差异(图1)。相反的，经过6天处理AngⅡ100μM组和1mM组的hiPSC-CM细胞活性显著降低(细胞活力差异倍数，100μM对比未处理对照组为0.763；1mM比未处理对照组为0.762。p<0.001极显著差异)。经过10天处理，10μM AngⅡ甚至导致细胞活性急下降20％(细胞活力差异倍数，10μM对比未处理对照组为0.795；100μM对比未处理对照组为0.638；1mM对比未处理对照组为0.590.10μM组p<0.05有统计学差异；100μM和1mM组,p<0.001极显著差异)。其他浓度AngⅡ细胞活性似乎略有下降但无统计学意义(图2)。

在血管紧张素Ⅱ处理2天的hiPSC-CM中，1nM和1μM血管紧张素Ⅱ没有改变BCL2、TP53和GADD45A的表达水平，而1mM(1mM)血管紧张素Ⅱ使BAX表达增加1.2 5倍，BCL2表达下调。3种浓度的AngⅡ处理后，MKI67的表达均降低。1mM AngⅡ作用10天后，BAX、TP53、GADD45A和MKI67的表达明显上调(分别为2.25、1.81、1.83和2.53倍)，而BLD2的表达下降了70％。与2天处理相反，10天处理使MKI67在所有三个浓度下的表达均升高。BAX编码促凋亡蛋白，在凋亡途径中起凋亡激活剂的作用。相反，BCL2是一种抗凋亡分子，可以促进细胞存活，阻止细胞程序性死亡。TP53和GADD45A是细胞周期调控基因，也被报道介导细胞凋亡。MKI67和PCNA是细胞增殖的标志。值得注意的是，1mM AngⅡ在短期内已引起BAX表达上调，BCL2表达下调，且随着孵育时间的延长，作为细胞凋亡指标的BAX/BCL2比值急剧升高。此外，1mM AngⅡ还可增加TP53和GADD45A的表达，表明心肌细胞处于凋亡状态。

收集10天处理的hiPSC-CM，用结合了绿色荧光基团Alexa Fluor 488的Annexin V染料染色，然后用流式细胞术分析。如图5所示，未处理的hiPSC-CM组平均凋亡率为4.1％，而100μM和1mM AngⅡ处理组hiPSC-CM平均细胞凋亡率分别为12.7％和15.6％(图5)。这表明100μM AngⅡ处理组的细胞凋亡率为未处理组的3.08倍，1mM AngⅡ处理组的凋亡率为未处理组的3.74倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东源心再生医学有限公司

<120> 一种构建人心肌细胞凋亡模型的方法

<130> Ang Ⅱ

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

1.血管紧张素Ⅱ在制备hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡诱导剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。

3.血管紧张素Ⅱ在构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：血管紧张素Ⅱ的使用终浓度为100μM～1mM。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于：血管紧张素Ⅱ持续处理hiPSC分化而来的心肌细胞的时间不少于6天。

6.一种构建hiPSC分化而来的心肌细胞凋亡模型的方法，包括在hiPSC分化而来的心肌细胞的培养液中添加终浓度为100μM～1mM的血管紧张素Ⅱ，继续培养得到获得凋亡的hiPSC-CM。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述培养液中hiPSC-CM的浓度为(2～10)×10⁴/mL。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述继续培养的时间不少于6天。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述继续培养的时间为6～10天。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述培养液中血管紧张素Ⅱ的终浓度为150μM～1mM。