CN111378621A

CN111378621A - Eb病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的b淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用

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Publication number: CN111378621A
Application number: CN201811618943.5A
Authority: CN
Inventors: 孙明姝; 张令歌; 罗兵; 刘雯
Original assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Current assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN111378621B

Abstract

本发明提供了一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的方法以及通过该方法获得的稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的B淋巴瘤细胞株。本发明通过设计特异性的引物序列，并通过大量实验确定了最优的转染方法和转染条件，从而比脂质体转染更高效地获得阳性细胞。本发明的方法和细胞株可以为研究EB病毒LMP1致病机制提供有力的方法和工具，也可用于抗体制备、药物研发以及基因治疗中。

Description

EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地涉及一种EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用。

背景技术

Epstein-Barr(EB)病毒是一种嗜B淋巴细胞的DNA病毒，越来越多的研究证实EB病毒感染与肿瘤及免疫系统疾病相关。EB病毒潜伏期膜蛋白(LMP)1主要表达于EB病毒Ⅱ型和Ⅲ型潜伏期感染，是维持其在人体潜伏感染状态的重要片段。

研究发现，LMP1也是EB病毒致瘤性的关键分子，与系统性红斑狼疮(Systemiclupus erythematosus,SLE)、霍奇金淋巴瘤(HL)、移植后淋巴组织增殖疾病(PTLD)相关，机制涉及CD40、核转录因子NF-kB和干扰素通路的活化，以及一些细胞因子如白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子受体相关因子1(TRAF1)的调控等。其对体外培养的淋巴与血液细胞的影响和机制仍待进一步探究。

LMP1基因作为一种病毒基因兼致癌基因，采用病毒包装载体具有较大危险性，因此非病毒载体系统具有低毒性的优点，但与此同时，与LMP1相关的自身免疫性疾病与血液系统疾病所涉及的多为悬浮细胞，质粒转染难度较大且转染效率低下。

Ramos细胞来源于人Burkitt’s淋巴瘤患者B淋巴瘤细胞，为一种EB病毒阴性细胞，表达IL-4受体与低亲和性IgE受体(CD23)，可分泌IgM，表达膜型和分泌型的免疫球蛋白。该细胞株广泛用于多个领域的B细胞信号通路及功能研究。因此，在Ramos细胞株中建立稳定表达LMP1的方法以及稳定表达LMP1的Ramos细胞株，可进行细胞功能学检测以及细胞通路研究，为研究LMP1致病机制提供工具与方法，也可进一步单克隆化为抗体制备、药物研发以及基因治疗提供支持。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明设计了特定的引物序列，利用真核表达载体通过带G418抗性的重组质粒结合电穿孔条件的优化，从而获得了一种EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株。

在第一个方面，本发明提供了一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1(下文中简称为“LMP1”)的方法(在下文中有时简称为“本发明的方法”)，该方法包括以下步骤：

1)将含有EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的重组质粒通过电穿孔法转染至B淋巴瘤细胞中；

2)利用G418筛选步骤1)中所获得的细胞克隆，从而获得LMP1稳定高表达(或过表达)的细胞株；

其中所述EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体实施方案中，步骤1)中的重组质粒是利用质粒载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP构建的，所述重组质粒包含CMV启动子、pcDNA3.1序列、G148抗性基因、EGFP示踪基因以及目的基因(即，EB病毒潜伏期膜蛋白1基因序列，序列如SEQ ID NO:1所示)。

在一个具体实施方案中，步骤1)包括以下步骤：

A.设计引物：参考PubMed中EBV LMP1基因编码区(CDS区)序列共1215个碱基(如SEQ ID NO:1所示)，利用primer5软件设计引物，并加上pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP中的AgeⅠ与ClaⅠ酶切序列；

B.用上述引物将合成至puc57克隆载体的LMP1片段PCR扩增，回收纯化目的片段；

C.用ClaⅠ与AgeⅠ内切酶线性化载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP，切胶回收；

D.将目的片段无缝连接(可以采用本领域中熟知的各种市售无缝克隆试剂盒，例如，HB-infusion^TM无缝克隆试剂盒)至pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP载体获得重组质粒；

E.重组质粒转化于感受态，行菌液PCR验证及测序验证。

在一个优选实施方案中，步骤1)中所述的构建EB病毒潜伏期膜蛋白(LMP1)重组质粒的步骤中所采用的引物如下：

上游引物：

5’-TGTGACCGGCGCCTACGAATTCGCCACCATGGAACGCGACCTTGA-3’(SEQ ID NO:2)；

下游引物：

5’-ATCGATGGACCGGTCGGGATCCGTCATAGTAGCTTAGCTGAA-3’(SEQ ID NO:3)。

在一个优选实施方案中，步骤B中所采用的PCR扩增程序是：95℃5min；94℃20s,55℃20s,72℃60s，27个循环；72℃10min。

在一个优选实施方案中，步骤B中所采用的PCR扩增反应体系如下：buffer forKOD plus 5μl，MgSO₄(25mM)2μl，dNTPs(2mM)5μl，上下游引物各1μl，KOD plus DNA聚合酶1μl,puc57-LMP1质粒(质粒模板，合成于上海汉恒生物科技公司)1μl，超纯水34μl。

在一个实施方案中，步骤1)的转染步骤包括：用无血清培养基制备B淋巴瘤细胞悬液，对混合了重组质粒的细胞悬液进行电击，电击条件为：电容为1000μF、细胞密度为5×10⁶～5×10⁷个/ml，电压140V，其中细胞悬液与重组质粒的混合比例为200μl细胞悬液：5μg重组质粒。

在一个优选实施方案中，步骤2)的筛选步骤包括：在电击后去除死亡细胞，将剩余细胞转移到细胞培养板中进行单孔培养。

在一个优选实施方案中，本发明的方法还包括：

3)纯化步骤，所述纯化步骤包括下列步骤：将培养了48～72小时，优选64小时后的单孔细胞传代于5孔中，使用含G418的培养基继续培养至少20天，优选至少30天。

在一个优选实施方案中，步骤2)中所使用的G418浓度为600μg/ml。

在一个优选实施方案中，在纯化步骤中，在继续培养中G418浓度为300～600μg/ml。

在第二个方面，本发明提供了一种稳定表达LMP1的B淋巴瘤细胞株(下文中有时简称为“本发明的细胞株”)，所述细胞株是通过本发明的方法获得的。

在第三个方面，本发明提供了本发明的细胞株在制备用于治疗EB病毒相关疾病的药物中的用途。

在本发明中，B淋巴瘤细胞可以是提取自任何哺乳动物或人的B淋巴瘤细胞或建系细胞，优选是人的B淋巴瘤细胞或建系细胞。在一个优选实施方案中，B淋巴瘤细胞是RAMOS细胞系(该细胞系是一种在体外稳定增殖传代的EB病毒阴性人B淋巴瘤细胞系)。

在本发明中，哺乳动物包括但不限于，牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物，优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物，更优选牛、马、犬、山羊、绵羊、猪、骆驼、大鼠、小鼠和猴。

在本发明中，EB病毒相关疾病包括EB病毒感染性疾病和与EB病毒密切相关的疾病，例如，但不限于，系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)、霍奇金淋巴瘤(HL)、移植后淋巴组织增殖疾病(PTLD)、鼻咽癌等。用于治疗EB病毒相关疾病的药物包括但不限于抗体、化学药物、基因工程药物、蛋白质药物、疫苗等。EB病毒相关疾病的基因治疗包括本领域中熟知的各种基因治疗方法，包括但不限于，基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、自杀基因、免疫基因治疗、耐药基因等治疗方式。

本发明的有益效果：

1.本发明参考PubMed中EBV LMP1基因编码区(CDS区)序列共1215个碱基，利用primer6软件进行设计，并于正反引物5’端分别加上pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP中的AgeⅠ，ClaⅠ酶切位点序列，从而设计出了特定引物序列，该引物能够扩增出特异性目的LMP1基因全长且其两端与载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP具有同源性；能够简便通过无缝克隆与载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP进行连接。

2.本发明采用的非病毒载体系统与病毒载体相比具有低毒性的特点。

3.本发明通过大量实验确定了最优转染方法和转染条件：本发明利用电穿孔法，依照本发明所确定的转染条件以及优化的筛选步骤和条件，可以获得比脂质体转染更高效地获得阳性细胞。

4.本发明的方法以及通过本发明的方法所获得的稳定表达LMP1的B淋巴瘤细胞株为研究EB病毒LMP1致病机制、抗体制备、药物研发以及基因治疗提供有力的方法和工具。

附图说明

下面结合附图描述本发明的优选实施方案，本领域技术人员要理解的是下面结合附图所述的实施方案或实施例仅用于说明实现本发明的最佳实施方式，而非将本发明的范围限于这些实施方案。

图1是正常RAMOS细胞的光镜(10×)下形态。

图2是实施例1中的pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP载体的图谱。

图3是在实施例5中所述的最佳转染条件下转染48小时转染细胞的荧光表达情况(光镜10×)。

图4是实施例6中获得的纯化细胞第20天，其中图4A是在白光镜下所观察到的纯化细胞(10×)，图4B是在荧光显微镜下所观察到的纯化细胞(10×)。

图5是实施例6中获得的纯化细胞继续培养45天，其中图5A是在白光镜下所观察到的纯化细胞(10×)，图5B是在荧光显微镜下所观察到的纯化细胞(10×)。

图6图示了验证纯化细胞株能够扩增出LMP1的片段。

图7图示了转化感受态能够扩增出LMP1全长。

图8是实施例7中LMP1过表达载体的测序结果，其中上面灰色区域部分为目的序列，下面灰色部分是3flag序列。

图9是实施例7中LMP1测序结果比对，在图中灰色区域为与目的序列匹配部分。

具体实施方式

下面借助于实施例对本发明进行解释和说明，要理解的是本发明可以在下述实施例的基础上作出各种改进和变化，这些改进和变化都包括在本发明的范围之内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1细胞培养

选定能够在体外稳定增殖传代的Epstein-Barr(EB)病毒阴性人类B林巴瘤细胞RAMOS细胞系，购买冻存的RAMOS细胞株自北京北纳生物公司，复苏后培养扩增。

复苏与培养过程如下：从干冰中取出冻存管，放入37摄氏度水浴1分钟左右使冻存液快速溶解，酒精擦拭消毒冻存管后打开，吸取细胞悬液放入离心管中，补加10ml培养液，1000转5分钟低速离心，去除上清，补加培养液吹打均匀后移入培养瓶中，置于温箱培养，次日更换培养基后继续培养。此种细胞的培养需要RPMI1640培养基添加10％的胎牛血清，将半量换液法与离心换液法进行结合使用。半量换液法即将整瓶细胞瓶树立放置半小时，吸掉竖立放置的培养瓶中的上半部分培养液，留下细胞沉淀传代，重新加入部分新的培养液。

离心换液法即将培养瓶中的细胞吹打均匀加入离心管中，离心倒掉液体，在细胞沉淀中加入新的培养液，吹打均匀，吸入培养瓶中。

正常的RAMOS细胞株传代培养第二日状态见图1，从图1中可见正常RAMOS细胞呈悬浮圆球形或椭圆球形(10倍光镜)。

实施例2 EB病毒潜伏期膜蛋白(LMP1)重组质粒的构建

2.1实验试剂

2.2载体及目的基因信息

pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP载体图谱参见图2，其包含CMV启动子、pcDNA3.1序列、G148抗性基因和EGFP示踪基因。

2.3 LMP1基因序列信息：参见序列表中的SEQ ID NO:1。

2.4引物设计

参考PubMed中EBV LMP1基因编码区(CDS区)序列共1215个碱基(参见SEQ ID NO:1)，利用primer6软件进行设计，并于正反引物5’端分别加上pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP中的AgeⅠ，ClaⅠ酶切位点序列。

设计的引物序列如下：

上游引物：

PC-LMP1-E/B-F

TGTGACCGGCGCCTACGAATTCGCCACCATGGAACGCGACCTTGA(SEQ ID NO:2)

下游引物：

PC-LMP1-E/B-R ATCGATggACCGGTcgGGATCCGTCATAGTAGCTTAGCTGAA

(SEQ ID NO:3)

2.5载体酶切

40μl酶切体系

pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP(购自上海汉恒生物公司)(400ng/μl)2μl

claⅠ酶1μl

AgeⅠ 1μl

cutsmart buffer4μl

H₂O 32μl

37℃2小时

2.6载体酶切完成后胶回收(常规DNA凝胶回收与纯化离心柱式试剂盒)

1.DNA电泳后用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段。仔细将胶块中无DNA部分去除掉。

2.含DNA的琼脂糖胶块装入1.5ml离心管，估算其体积。加入500μl(<150μl凝胶)或3～4倍(>150μl凝胶)凝胶体积的Buffer PS(溶胶结合液)。

3.离心管置于50～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混悬震荡10sec，至琼脂糖凝胶完全溶解，室温放置5min冷却。

4.将少于700μl融化胶液转移至插入套管的离心柱内，于台式离心机上高速离心1min，弃去套管内废液，再将离心柱插入套管。

5.多于700μl的剩余融化胶液，加入同一离心柱内，重复步骤4。

6.向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)700μl，高速离心1min，弃去废液,，将离心柱插入套管。

7.向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)200μl，高速离心1～2min。

8.高速离心1～2min后，小心取出离心柱，弃去套管。

9.将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer(洗脱液)，室温放置2～5min，高速离心1min，即得纯化的DNA溶液。

10.获得的DNA溶液保存于-20℃备用。

2.7片段PCR回收

PCR扩增序列，体系(50μl)为：

1.95℃ 5min

2.94℃ 20s

3.55℃ 20s

4.72℃ 60s

5.72℃ 10min

6.4℃

2.3.4步设27个循环

注：puc57-LMP1质粒模板合成于上海汉恒生物科技公司

将目的片段纯化(常规DNA离心柱型纯化试剂盒)

1.DNA溶液中加入3～4倍体积的Buffer PSB(结合液)，颠倒或混悬震荡混匀。

2.将少于700μl的溶液转移至插入套管的离心柱内，于台式离心机上高速离心1min,弃去套管内废液，再将离心柱插入套管。

3.多于700μl的剩余溶液，加入同一离心柱内，重复步骤2。

4.向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)700μl，高速离心1min，弃去套管内废液,，将离心柱插入套管。

5.高速离心1～2min后，取出离心柱，弃去套管。

7.将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer(洗脱液)；室温放置2～5min，高速离心1min,离心管中即得纯化的DNA溶液。

8.获得的DNA溶液存于-20℃备用。

2.8目的片段与载体连接

50℃20min

实施例3感受态转化

1.从-70℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

2.加入连接好的质粒DNA溶液(含量不超过1μg，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。

3.42℃热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4.向管中加入0.5ml LB液体培养基(不含抗生素)，吸打混匀后于37℃，220rpm摇床振荡培养1小时。

5.将上述菌液摇匀后，离心，去除大部分上清，余下培养基与菌体沉淀吸打混匀后涂布于含氨苄抗生素的筛选平板上。

6.平板正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。长上菌落的平板可置于4℃保存。

7.注意菌种的冻存，甘油与LB培养基1:4加入菌体沉淀吹打混匀，冻存于-20℃。

实施例4菌落PCR鉴定

取得50ml试管，装50mlLB培养基，添加50μl氨苄霉素工作液(50ng/ml)，将配置的液体分装于9个15ml离心管，每管4ml，向每管中分别添加挑取的9个单克隆菌落。将试管盖子松松盖上，胶带固定盖子防止脱落，将试管置摇床中过夜，160rmp以下，140rmp以上，37℃。

将每管菌液取1μl菌液稀释10倍，进行PCR。

用于扩增LMP-1的引物如下：

正向引物：TGTGACCGGCGCCTACGAATTCGCCACCATGGAACGCGACCTTGA

(SEQ ID NO:4)

反向引物：ATCGATGGACCGGTCGGGATCCGTCATAGTAGCTTAGCTGAA

(SEQ ID NO:5)

1.95℃10min

2.95℃20s

3.55℃45s

4.72℃1min

5.72℃10min

6.4℃

2.3.4步设置27个循环

实施例5质粒的提取

摇菌过程同实施例4，收集菌液用于质粒提取。

提取质粒的步骤如下：

新的试剂盒使用时，先在buffer p1中加入RNase A混匀，在4度冰箱保存，每次使用时平衡至室温。其他成分在室温保存。新的试剂盒还需在buffer pw中加入无水乙醇，并准备好异丙醇。

1.取2ml的过夜培养菌液，加入2ml离心管中，13000rmp离心10min，轻柔吸尽全部上清，取得细菌沉淀。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer p1(事先加入RNase)。充分吹打均匀。不用于提取质粒的甘油菌沉淀加入配好的甘油冻存液，吹打均匀，放于-20℃冰箱。

3.向管中加入250μl buffer p2，温和上下颠倒混匀10次，室温放置5分钟。直到液体清亮粘稠。

4.向管中加入250μl buffer p3，立即上下颠倒混匀10次，直到出现白色絮状沉淀，室温下放置5分钟。13000rmp离心5分钟，吸取上清加到过滤柱FM中。13000rmp离心1分钟过滤，滤液收集于1.5ml离心管。

5.向滤液中加入225μl异丙醇，上下颠倒混匀。

6.柱平衡：向已经装入收集管的吸附柱DM中加200μl buffer ps，13000转离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.将步骤5的液体转移到步骤6已平衡且放回收集管的吸附柱中。

8.13000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9.向吸附柱中加750μl的buffer pw(事先已加入无水乙醇)，13000rmp离心1分钟。倒掉收集管中的废液。

10.将吸附柱重新放回收集管中13000rmp离心1分钟，去除残留乙醇。

11.将吸附柱置于新的收集管中，向吸附膜的中间部位加入25μl buffer EB,室温放置2分钟。13000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。-20度冰箱保存。

实施例6转染条件的确定

悬浮细胞存在转染效率低下的问题，不适合脂质体转染法，因此采取电穿孔法将外源基因转入RAMOS细胞株中。

5.1设备：BIO-RAD电穿孔仪器(gene pluser Xcell)：2mm规格电击杯，电容设置为1000μF，细胞密度调整至5×10⁶至1×10⁷/ml，以电压140V，100μl细胞悬液与5μg质粒混合体系为基准进行上下调整，探索最佳转染条件。每一次电击后的细胞转移到24孔板中，补加0.5ml完全培养基，48小时后观察细胞生长情况。

1000μF,140V，0.2mm电击杯；设置电压梯度

1000μF，200μl，0.2mm电击杯；设置体系体积梯度

因此以电容设置为1000μF，细胞密度调整至5×10⁶至1×10⁷个/ml，电压140V，200μl细胞悬液与5μg质粒混合体系为转染条件。

实施例7 LMP-1相对稳定过表达细胞的纯化筛选

因构建的重组质粒带G418抗性，因此基因组与质粒重组成功的细胞能够在含G418的培养液中存活，而未转染成功的细胞则不能代谢G418，最终会因蛋白质合成受抑制而死亡。

通过12孔板接种未加任何干预的RAMOS细胞，用含不同浓度的含G418培养基培养细胞，最终确立一个能够在10天左右杀死全部细胞的浓度用于后续实验，此浓度为G418能够杀死未转染成功的细胞的同时，不对能够相对稳定表达目的基因和G418抗性基因以及GFP基因的细胞造成过度代谢负担。

按照kill curve法，调整细胞浓度为1000个/毫升，接种至12孔板，各孔G418浓度梯度分别为0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1200μg/ml，至10天时G418为600μg/ml的孔中细胞完全死亡。因此以此浓度进行后续实验。

将混合质粒的细胞悬液加入到电击杯中，电击后小心拨去上层的白色死亡细胞层，将剩余不到200微升的细胞转移到12孔板其中一孔中，补加2毫升培养基。

培养48到72小时之间时，G418抗性得以足量表达，此时将细胞传代于12孔板的5个孔中，补加培养基，并添加G418使每孔G418浓度为600μg/ml，连续培养9天以上。

依据多次试验结果，若按照脂质体法转染后的以1000个/毫升的密度接种筛选细胞，将无法得到阳性的克隆细胞团，推测为：电转造成的细胞损伤较大，若细胞密度低，即使质粒重组成功，细胞也难以像正常情况下一样进行分裂。因此适当增加细胞接种密度，在转染后64小时仅将一孔细胞传代于12孔板的5个孔中，尽管细胞密度增加将使细胞耐药性增加，造成筛选周期增长，但能够保证阳性克隆细胞团的增殖。筛选期间依据细胞生长情况进行换液与传代，但始终保持培养液中G418浓度为600μg/ml。

本实施例中，培养9天内细胞死亡量较少，仍得以大量扩增，9天后于荧光镜下观察，带绿色荧光蛋白的细胞数目仍然较少，于第13天至20天连续出现细胞大量死亡情况，此时每日通过离心去除死亡细胞，将培养体系不断进行缩小，第22天后绿色荧光细胞不断得以繁殖扩增，而未转染成功的细胞渐渐被噬没。

此时，可保持G418浓度为300至600μg/ml，维持培养。

本实施例的细胞株可用于进一步单克隆化。

实施例8 LMP-1相对稳定过表达人B淋巴瘤细胞株的鉴定

7.1 RNA提取

将细胞离心沉淀，用醇沉淀法进行RNA提取，步骤如下：

冰上进行，所有枪头与1.5ml离心管选用无酶产品，高压灭菌。

(1)离心去上清取得细胞沉淀，5分钟，离心两次。轻柔吸弃所有沉淀后加入1mlTrizol试剂，混匀，冰上放置20分钟。4℃离心机12000rmp离心20分钟。取上清于1.5毫升离心管。

(2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，上下混匀，静置15-20分钟。

(3)4摄氏度下12000rmp每分钟离心20分钟。取得上清液转移到新的1.5ml离心管中。宁少勿多，不要吸取中间层的蛋白。

(4)加入等500μl异丙醇，震荡混匀，-20℃冰箱里放置15分钟，4摄氏度下12000转每分钟离心20分钟。

(5)小心去除上清液，沉淀为RNA

(6)加入无水乙醇1ml，吹匀洗涤RNA沉淀，12000rmp离心20分钟。

(7)尽可能的吸取酒精上清，放于室温让乙醇自然挥发。

(8)沉淀中加入25μlDEPC水使其溶解。在分光光度仪下测出RNA浓度与OD值。

7.2逆转录反应

(1)去除基因组反应

按试剂盒说明书将下面的反应体系扩增三倍

去基因组DNA条件

42℃2min

4℃

*取1μgRNA

(2)逆转录反应

同样跟上述一样将下面的反应体系扩增三倍

逆转录条件

37℃15min；

85℃5sec

4℃

*除去步骤一反应液的剩余液体在2ml离心管中配置好，因步骤一中的体系扩增三倍，因此扩增倍数为说明书各试剂的(3×处理组数+2)倍。配好后混匀，在步骤一各管中分别加30μl。

7.3普通PCR

所使用的引物如下：

1.95℃10min

2.95℃30s

3.58℃45s

4.72℃1min30s

5.72℃10min

6.4℃

2.3.4步设置30个循环取5μl PCR产物或LMP-1重组质粒，加入1μl 6×loadingbuffer，用1％琼脂糖凝胶进行电泳

从左到右孔上样分别为Marker、纯水样本空白对照(A1)、RAMOS-LMP-1内参扩增产物(B1)、RAMOS内参扩增产物(C1)、LMP-1重组质粒内参扩增产物(D1)；水(A2)，RAMOS-LMP-1LMP-1扩增产物(B2)、RAMOS LMP-1扩增产物(C2)、LMP-1重组质粒LMP-1扩增产物(D2)。

可见筛选出的细胞能够扩增出LMP1片段，两种细胞均能扩增出内参基因，而正常Ramos细胞株不能扩增出LMP1片段，而LMP-1重组质粒作为阳性对照可扩增出LMP1片段。可见筛选出的细胞能够扩增出250bp左右的目的片段。

7.4 LMP1过表达载体测序结果：PCR结果见图7，菌落均可扩增出LMP1全长，测序结果见图8，其中上面灰色区域部分为目的序列，下面灰色部分是3flag序列。测序结果比对情况见图9。

可见插入的碱基片段序列与目的基因一致，显示过表达载体构建成功。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可以做出多种其他改变和变型。因此，在随附的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。

序列表

<110> 青岛大学附属医院

<120> EB病毒潜伏期膜蛋白1稳定转染的B淋巴瘤细胞株、其构建方法和应用

<130> 182355

<141> 2018-12-28

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1215

<212> DNA

<213> Herpesvirus papio

<400> 1

atggaacgcg accttgagag cgccccaccc agcgcgccac ggccccctct aggacccccc 60

ctctcctctt ccataggcct tgctctcctt ctcctgctct tggcgctact gttctggctg 120

tatatcgtta tgagtgactg gactggagga gcgctccttg tcctctattc ctttgctctc 180

atgcttatta ttatcattct catcatcttt atcttcagaa gagaccttct ctgtccactt 240

ggaggccttg gtctactcct actgatgatc accctcctac tcatcgctct ctggaatttg 300

cacggacagg cattgtacct tggaattgtg ctgttcatct ttggctgctt acttgtcttc 360

ggtatctgga tctacttctt ggagattctc tggcggcttg gtgccaccct ctggcagctt 420

ttggccttca tcctagcctt cttcctagcc atcatcctgc tcattattgc tctctatcta 480

caacaaaact ggtggactct attggttgat ctcctttggc tcctcctgtt tatggccatt 540

ttaatctgga tgtattatca tggaccacga cacactgatg aacaccacca cgatgactcc 600

ctcccgcacc ctcaacaagc taccgacgat tctagccatg aatctgactc taactccaac 660

gagggcagac accacctgct cgtgagtgga gccggcgacg gacccccact ctgctctcaa 720

aacctaggcg cacctggagg tggtcctgac aatggcccac aggaccctga caacactgat 780

gacaatggcc cacaggaccc tgacaacact gatgacaatg gcccacagga ccctgacaac 840

actgatgaca atggcccaca ggaccctgac aacactgatg acaatggccc acaggaccct 900

gacaacactg atgacaatgg cccacaggac cctgacaaca ctgatgacaa tggcccacag 960

gaccctgaca acactgatga caatggccca catgacccgc tgcctcatag ccctagcgac 1020

tctgctggaa atgatggagg ccctccaaat ttgacggaag aggttgcaaa caaaggaggt 1080

gaccggggcc cgccttcgat gacagacggt ggcggcggtg atccacacct tcctacgctg 1140

cttttgggta cttctggttc cggtggagat gatgacgacc cccacggccc agttcagcta 1200

agctactatg actaa 1215

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgaccggc gcctacgaat tcgccaccat ggaacgcgac cttga 45

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgatggac cggtcgggat ccgtcatagt agcttagctg aa 42

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgaccggc gcctacgaat tcgccaccat ggaacgcgac cttga 45

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcgatggac cggtcgggat ccgtcatagt agcttagctg aa 42

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatttgcacg gacaggcatt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaggccaaaa gctgccagat 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctcctacca gaagaatgg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcctacca gaagaatgg 19

Claims

1.一种在B淋巴瘤细胞中稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

3)将含有EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的重组质粒通过电穿孔法转染至B淋巴瘤细胞中；

4)利用G418筛选步骤1)中所获得的细胞克隆，从而获得LMP1稳定高表达的细胞株；

其中所述EB病毒潜伏期膜蛋白1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中的所述重组质粒是利用质粒载体pcDNA3.1-EF1a-mcs-3flag-CMV-EGFP构建的，所述重组质粒包含CMV启动子、pcDNA3.1序列、G148抗性基因、EGFP示踪基因以及EB病毒潜伏期膜蛋白1基因。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤1)的转染步骤中所使用的电击条件为：电容为1000μF、细胞密度为5×10⁶～5×10⁷个/ml，电压140V，其中B淋巴瘤细胞的细胞悬液与重组质粒的混合比例为200μl细胞悬液：5μg重组质粒。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)的筛选步骤包括在电击后去除死亡细胞，将剩余细胞转移到细胞培养板中进行单孔培养。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法还包括3)纯化步骤，所述纯化步骤包括下列步骤：将培养了48～72小时，优选64小时后的单孔细胞传代于5孔中，使用含G418的培养基继续培养至少20天。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中所使用的G418浓度为600μg/ml。

7.权利要求5所述的方法，其特征在于在继续培养中G418浓度为300～600μg/ml。

8.一种稳定表达EB病毒潜伏期膜蛋白1的B淋巴瘤细胞株，其特征在于所述细胞株是通过权利要求1-7中任一项所述的方法获得的。

9.权利要求8所述的B淋巴瘤细胞株，其特征在于所述B淋巴细胞瘤细胞是RAMOS细胞系。

10.权利要求8或9所述的B淋巴瘤细胞株在制备用于治疗EB病毒相关疾病的药物中的用途。