CN110982775A - 一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法 - Google Patents

一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，属于原生质体制备领域，该方法包括以下步骤：(1)取匍匐翦股颖无菌苗，剪取其幼嫩的叶片和叶鞘组织，用双面刀将其切成不超过1mm的小段，及时将小段放置于0.6M的甘露醇溶液中，获得匍匐翦股颖样品；(2)将匍匐翦股颖样品加入到酶解液中，先真空30min，然后取出在室温条件下酶解3‑4h；(3)酶解完成后，离心过滤重悬洗涤，即获得匍匐翦股颖原生质体。本发明提供的制备方法能够获得大量形态正常，杂质少，无破损的匍匐翦股颖原生质体，能够满足后续的实验要求。

Description

一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法
技术领域
本发明涉及原生质体制备领域，特别是涉及一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法。
背景技术
匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)是一种常见的冷季型草坪草，它属于禾本科翦股颖属。它具有良好的质地，发达的匍匐茎，耐低修剪，能够形成低矮致密的草坪，特别适合用于建植足球场，草地网球场等高质量草坪。此外，匍匐翦股颖耐盐性极强，对重金属也有良好的吸收作用，因此，也可以作为盐碱地修复，矿山恢复的生态草种。
植物原生质体是指脱去植物细胞壁仅由质膜包裹的能够正常进行生命活动裸露的细胞。原生质体作为优良的受体材料，在体细胞杂交、分子遗传育种，分子作物改良等应用科学领域得到了广泛的应用。同时，由于原生质体没有细胞壁的保护，能够较容易地摄取外源DNA等遗传物质，是进行细胞遗传转化的理想受体，是进行基因改良的理想材料，是进行细胞生物学等基础理论研究的优良实验体系。目前，在植物原生质体的分离和应用主要集中在粮食作物如水稻,小麦，玉米，谷子，高粱中，而在草坪草匍匐翦股颖中，尚未见到相关的应用报道。并且，参考拟南芥，水稻，玉米等植物原生质体提取方法得到的匍匐翦股颖原生质体数量少，易破碎，无法满足后续的遗传转化，亚细胞定位等研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，以解决上述现有技术存在的问题，提高匍匐翦股颖原生质体的制备率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，包括以下步骤：
(1)取匍匐翦股颖无菌苗，剪取其幼嫩的叶片和叶鞘组织，用双面刀将其切成不超过1mm的小段，及时将小段放置于0.6M的甘露醇溶液中，获得匍匐翦股颖样品；
(2)将匍匐翦股颖样品加入到酶解液中，先真空30min，然后取出在室温条件下酶解3-4h；
(3)酶解完成后，将酶解液用Miracloth过滤，滤液离心，去除上清；
(4)滤渣用预冷的W5溶液浸泡，缓慢震荡，用Miracloth过滤，滤液离心，去除上清；
(5)滤渣用预冷的W5溶液洗涤，去除上清，再用预冷的W5溶液重悬原生质体，即获得匍匐翦股颖原生质体。
进一步地，所述匍匐翦股颖无菌苗通过以下方法获得：
(1)将匍匐翦股颖种子置于84消毒液中消毒30min，无菌水清洗5遍，接种至培养瓶中；
(2)将培养瓶置于无菌组织培养室，培养至幼苗长至10cm即可取样。
进一步地，所述培养瓶中为MS培养基，所述MS培养基的组分为：MS基础培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，pH5.7，植物凝胶3g/L。
进一步地，步骤(2)中，培养条件为白天：23℃/14h，光照强度6000lux；夜晚：18℃/10h，光照0lux。
进一步地，所述酶解液的成分为：1.5％(1.5g/100mL)的纤维素酶，0.75％(0.75g/100mL)的离析酶，甘露醇0.6M，10mM MES(pH5.7)，1g/L的BSA，头孢噻肟250mg/L，3.4mM的CaCl2，0.1％(v/v)的β-巯基乙醇，溶剂为无菌水。
进一步地，所述酶解液的配制方法包括以下步骤：
(1)称取纤维素酶、离析酶、甘露醇，加入1mL 100mM的MES(pH5.7)，加入7mL的无菌水；
(2)涡旋搅拌至完全溶解，65℃水浴10min；
(3)加入0.01g BSA，250mg/mL的头孢噻肟10μL，1M CaCl2 34μL，β-巯基乙醇10μL，补充无菌水至10mL即可。
进一步地，所述缓慢震荡的转速为30r/min。
进一步地，步骤(2)中，所述酶解在避光条件下进行，温度23℃。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明提供了一套能够高效获取匍匐翦股颖原生质体的方法，从而为进行匍匐翦股颖亚细胞定位，双荧光互补，体细胞杂交，遗传转化等基础研究和应用研究提供了重要的技术支持，以促进匍匐翦股颖遗传育种和产业发展。
2.本发明提供的制备方法能够获得大量形态正常，杂质少，无破损的匍匐翦股颖原生质体，能够满足后续的实验要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的匍匐翦股颖原生质体的显微镜图片。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
所用试剂均可在市场上购买得到，部分原料来源及规格如下：
W5溶液：154mM NaCl,125mM CaCl2,5mM KCl,2mM MES(pH 5.7)。
所用匍匐翦股颖品种为Penn A4，购自草业公司。
实施例1
1.取适量的匍匐翦股颖种子，经84消毒液消毒30min，用无菌水冲洗5遍。
2.配制MS培养基：MS基础培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，pH5.7，植物凝胶3g/L；高压蒸汽灭菌后分装至培养瓶。
3.将消毒好的匍匐翦股颖种子均匀的接种至培养基上，封好瓶口。置于无菌组培室中培养。培养条件为：白天23℃/14h，光照强度6000lux；夜晚：18℃/10h，光照0lux。
4.培养一月后，取匍匐翦股颖幼苗，用双面刀将其切成小于1mm的碎片，将碎片及时浸泡至0.6M的甘露醇溶液中，防止脱水。
5.配制酶解液：称取纤维素酶0.15g，离析酶0.075g，D-甘露醇1.09g置于50mL离心管中，加入1mL的100mM MES缓冲液(pH5.7)，加无菌水7mL，涡旋至完全溶解后放置在65℃水浴中10min；之后加入0.01g的BSA，注意BSA要直接加到溶液里；再加入10μL的250mg/mL的头孢噻肟，34μL的1M CaCl2溶液，10μL的β-巯基乙醇，配制过程中不可产生泡沫。
6.将步骤4的所有植物组织转移至酶解液中，抽真空30min后，置于23℃环境的摇床(30rpm)上避光酶解4h。
7.酶解完成后，用Miracloth进行过滤，滤液移至50mL离心管中，滤渣用15mL预冷的W5溶液浸泡，继续在23℃环境的摇床(30rpm)上震荡1h。
8.步骤7中的体系用Miracloth进行过滤，滤液转移至50mL离心管中。
9.200g离心5min，弃上清。
10.用预冷的W5溶液洗涤原生质体2次，200g离心5min，弃上清。
11.用2mL预冷的W5溶液重悬原生质体后进行镜检，使用细胞计数板统计原生质体的数量。
12.计算得出匍匐翦股颖原生质体数量为6.75×106个，原生质体大小约为14-23μm，原生质体的显微镜图片如图1所示。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取匍匐翦股颖无菌苗，剪取其幼嫩的叶片和叶鞘组织，切成小段，并及时将小段放置于甘露醇溶液中，获得匍匐翦股颖样品；
(2)将匍匐翦股颖样品加入到酶解液中，先真空30min，然后取出在室温条件下酶解3-4h；
(3)酶解完成后，将酶解液用Miracloth过滤，滤液离心，去除上清；
(4)滤渣用预冷的W5溶液浸泡，缓慢震荡，用Miracloth过滤，滤液离心，去除上清；
(5)滤渣用预冷的W5溶液洗涤，去除上清，再用预冷的W5溶液重悬原生质体，即获得匍匐翦股颖原生质体。
2.根据权利要求1所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，所述匍匐翦股颖无菌苗通过以下方法获得：
(1)将匍匐翦股颖种子置于84消毒液中消毒30min，无菌水清洗5遍，接种至培养瓶中；
(2)将培养瓶置于无菌组织培养室，培养至幼苗长至10cm即可取样。
3.根据权利要求2所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，所述培养瓶为MS培养基，所述MS培养基的组分为：MS基础培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，pH5.7，植物凝胶3g/L。
4.根据权利要求2所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，步骤(2)中，培养条件为白天：23℃/14h，光照强度6000lux；夜晚：18℃/10h，光照0lux。
5.根据权利要求1所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，所述酶解液的成分为：1.5％的纤维素酶，0.75％的离析酶，甘露醇0.6M，10mM MES(pH5.7)，1g/L的BSA，头孢噻肟250mg/L，3.4mM的CaCl2，0.1％(v/v)的β-巯基乙醇，溶剂为无菌水。
6.根据权利要求5所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，所述酶解液的配制方法包括以下步骤：
(1)称取纤维素酶、离析酶、甘露醇，加入1mL 100mM pH5.7的MES，加入7mL的无菌水；
(2)涡旋搅拌至完全溶解，65℃水浴10min；
(3)加入0.01g BSA，250mg/mL的头孢噻肟10μL，1M CaCl2 34μL，β-巯基乙醇10μL，补充无菌水至10mL即可。
7.根据权利要求1所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，所述缓慢震荡的转速为30r/min。
8.根据权利要求1所述的一种匍匐翦股颖原生质体制备的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解在避光条件下进行，温度23℃。
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