JPH03262426A - ベントグラスのプロトプラストを利用する植物体再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ベントグラスのプロトプラストを利用するベ
ントグラス植物体の再生方法に関するものであり、詳し
く言えば、ベントグラスの種子又は幼苗細胞からカルス
を作り、カルスから培養細胞を作り、これら細胞からプ
ロトプラストを作威し、プロトプラストからカルスを再
形成し、再形成されたカルスを再分化してベントグラス
植物体を効率よく再生する方法に関する。

〈従来の技術〉 ベントグラスは、イネ科アグロスティス属豆肛鯉且紅に
属する芝草であり、大量に庭園、ゴルフ場、等に植えら
れている。イネ科植物のプロトプラストを利用するイネ
科の植物体の再生技術はイネ、トウモロコシなどの穀物
および牧草において知られている。

たとえば、特開平２−５８５７号公報には、イチゴツナ
ギ亜科７のイネ科植物のプロトプラストを利用してカル
スを形成し、そのカルスから、植物体に再生する方法が
記載され、具体例として牧草の１種であるカモガヤ（劫
述■カロ出１弘妙虹り、）についてプロトプラストを経
由した植物体の再生の実施例が示されている。この公報
には、該公報記載の発明方法がイチゴツナギ亜科のアグ
ロスティス凰肛世旦鉦属に含まれるベントグラスにも適
用しうると示唆する記載がなされている。しかし、該公
報はベントグラスのプロトプラストを作成すること、こ
のプロトプラストからカルスを形成すること、カルスか
ら植物体の再生を行う具体的な方法について説明がなく
、実施例の記載もない。

他方、ベントグラス植物体の細胞をカルス化し、そのカ
ルスから植物体を再生する技術については、いくつかの
文献に報告がされている。

例えばそれら文献として「クロップ・サイエンスＪ（Ｃ
ｒｏｐ　Ｓｃｉ、）第２６巻第１２４５−１２４９頁（
１９８６）　；同第２２巻第１１９３−１１９７頁（１
９８２）　ｉ及び「育種学雑誌」第３９巻（別冊２）第
９８−９９貞（１９８９）が挙げられる。しかし、これ
ら文献には、ベントグラスのプロトプラストを利用して
ベントグラス植物体を再生させた実施例の報告はない。

さらに、植物細胞のプロトプラストの培養方法について
は、液体培地中でプロトプラストを培養する方法（特開
昭６２−２３２３８２号公報）が知られており、また、
植物細胞の培養に一旦用いられた古い培養液を回収し、
これを再使用して新しい培地に添加して調製される培地
（所謂、コンディショニングした培地）中でプロトプラ
ストを培養する方法などがプロトプラストの細胞分裂率
や方法の再現性を高めるため、いろいろ開発されてきた
。

しかし、これらの公知のプロ、ドプラスト培養技術は事
実上は、すべての種類の植物のプロトプラストに広く一
般的に利用できるものではなく、対象とする植物の種類
や、使用培地の組成などの相違により、該公知技術はそ
れの適用の可能性が限定されるものであった。

〈発明が解決しようとする課題〉 前述のとおり、これまで、ベントグラスのプロトプラス
トを用い、ベントグラスの植物体を再生したという事例
の報告がなく、またプロトプラストを経由してベントグ
ラスの植物体を再生することを可能にする具体的な方法
は未だ知られていない 本発明は、ベントグラス植物の細胞をカルス化し、その
カルスを培養して得られる植物体再生能を保有した多数
個の培養細胞をプロトプラスト化し、得られた多数個の
プロトプラストを植物体再生能を低下させることなく、
高頻度で分裂増殖させて得られた普通細胞の塊りからな
るカルスを再形成し、その再形成されたカルス細胞から
再分化により植物体のベントグラス（クローン）を効率
よく再生させる方法を提供することを目的とするもので
ある６前記のように多数個のプロトプラストを用い、こ
れらプロトプラストを高頻度で分裂増殖できると、植物
体に再分化できるカルスを多数再形成して収得すること
ができ、それらの多数のカルスから多個数のベントグラ
ス植物体を再生できるので、ベントグラス植物体の個数
を１個数のベントグラス種子又は幼苗から一挙に増大で
きる目的が達成される。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者は、種々研究の結果として、ベントグラスのカ
ルスから得られて植物体再生能を保有した培養細胞をプ
ロトプラスト化し、単離した多数個のプロトプラストを
、所定量のグルコースとマニトールの両者を植物組織培
養用基本液体培地に配合して威る改良液体培地中で培養
するか、若しくはすでに培養細胞の増殖に一旦用いられ
た古い培養液を新鮮な但し同系の基本液体培地と混合し
その混合物に所定量のグルコースとマニトールの両者を
配合して威る組成に相当する組成を有する改良液体培地
中でプロトプラストを培養することにより、これら多数
個のプロトプラストを、細胞壁を再生された普通の細胞
の生成を伴いながら分裂及び増殖させて多数のカルスを
再形成させることができることを見出し、また再形成さ
れた多数のカルスを再生用培地に移植して再分化させる
ことにより、多個数の植物体（クローン）を再生させる
ことのできることを見いだした。

従って、本発明によれば、下記に示す諸工程の組合せか
らなる、ベントグラスのプロトプラストを利用するベン
トグラス植物体の再生方法が提供される。

すなわち、本発明によれば、 ■　ベントグラスの種子又は幼苗基部の細胞からカルス
を形成させる工程と、 ■　そのカルスを液体培地中で培養してカルスの細胞を
増殖させ、懸濁した状態の培養細胞及び／又は細胞塊を
生成させてこれを採取する工程と、 ■　採取された培養細胞及び／又はその細胞塊からプロ
トプラストを作成する工程と、■　プロトプラストをカ
ルス再形成用の液体培地中で培養し、プロトプラストの
分裂とそれで生じた普通細胞の増殖とによりカルスを再
び形成させる工程と、 ■　再び形成させたカルスを植物体再生用培地に移植し
、そこで再分化することにより、ベントグラスの植物体
を再生させる工程とからなることを特徴とする、ベント
グラスのプロトプラストを利用する植物体再生方法が提
供される。

本発明の方法に適用できるベントグラスとは、アグロス
ティス凰肛７属に含まれる各種の芝草を指すものであり
、その代表的な芝草の名称は、次のとおりである。

コロニアルベントグラス　（ｈ皿旦ｎｔｅｎｕｉｓ）ク
リーピングベントグラス（Ａ、　　ｎｈｌに亘）但し、
特に、これらのベントグラスは品種に限定されることは
ない。

なお、本発明の方法の工程で得たベントグラスのプロト
プラストは体細胞突然変異、細胞融合および遺伝子組換
えなどのバイオ技術の方法によりベントグラスの新品種
の開発に利用され得るものである。

本発明による、ベントグラスの植物体再生方法の第１工
程から第５工程は次の要領により実施される。なお各工
程は無菌条件下で行われることが必要である。

（Ａ）第１工程（植物体からカルスの形成）まず最初の
工程として、ベントグラス植物の細胞から植物体再生能
の高いカルスを形成させる必要がある。その細胞（Ａ料
としては、ベントグラスの種子、又は幼苗基部の細胞が
利用できる。消毒及び殺菌のため種子は通常、７０％の
エチルアルコール水溶液や７％〜ｌＯ％の次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液に２０〜６０分間浸漬して殺菌される０
次いで、その殺菌された種子をとり出し、無菌水で３回
洗浄した。ベントグラスの幼苗基部の細胞は、上記の方
法により殺菌した種子を、植物組織培養基本培地、例え
ばＭＳ培地などの培地上に播種し、無菌的に２５℃で７
日間栽培して幼苗としたのち、この幼苗の生長点近傍を
約５閣の長さ（生長点を含んだ状Ｘ！４）に切断して生
長点切片の細胞として得られる。上記により得た幼苗基
部の切片、又は種子をカルス形成用培地に置床する。こ
れに用いられるカルス形成用培地は、ＭＳ培地、Ｂ５培
地などの植物組織培養基本培地に植物生長ホルモンとし
て、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下、ｒ２，４
−Ｄ）という）、４−アミノ−３，５゜６−ドリクロル
ー２−ピリジンカルボン酸カリウム塩（以下、「ビクロ
ラム」という）、２〜メトキシ−３，６−ジクロル安息
香酸ジメチルアミン（以下、「ジカンバ」という）など
のオーキシン類、好ましくは２．４−Ｄを１〜５ＷＩｇ
／ｌ、好ましくは３■／Ｉ！の量で、また炭素源として
、ショ糖を２０〜４０ｇ／ｌ−５好ましくは３０ｇ／Ｉ
ｌの量で、寒天を１０ｇ／ｌの量でそれぞれ添加してな
るカルス形成用固体培地（ｐｌ＋　５．８）であること
ができる。

置床後に、１５〜３０℃、好ましくは２５゛ｃで４０〜
６０日間、好ましくは５０日間培養すると、植物体再生
能の高いカルスを形成できる。

（Ｂ）第２工程（液体培地中のカルスのＰ！濁培養法に
よる細胞の増殖） 第１工程で得られたカルス自体から直接にプロトプラス
トを作成することは困難である。またこれらのカルス内
の細胞を、植物体再生能を低下させることなく、かつプ
ロトプラストの作成に適した状態になるように培養して
細胞を増殖させる必要がある。そのために、前記の種子
、又は幼苗基部から得られたカルスを液体培地中に移植
し、振とう下に培養してカルスから増殖、分離した多数
の細胞が多数の微細な細胞塊の形で液体培地中に懸濁し
ている状態を保ちながら懸濁培養を続ける。

この第２工程で用いる液体培地は第１工程で用いた固体
培地と同濃度の植物生長ホルモンとショ糖炭素源を含み
、さらにカゼイン加水分解物の０．０１％〜５％、好ま
しくは０．２％を添加されたＭＳ液体培地（ｐｉ　５．
８）又はＢ５液体培地（ｐＨ５，８）であることができ
る、第２工程での培養は、第１工程のカルス形成工程と
同様の培養温度で工４日間、約１２Ｏｒ、ｐ、ｍ、で回
転振とう培養するのがよい。さらに１週間ごとに、前記
と同じ組成をもつ新鮮な液体培地に対して、これの１０
０　ｍｌ当りに５〜７ｇの量の培養細胞を古い液体培地
（培養液）から移植し、継代培養を行うのがよい。この
際、留意する点は、液体培地で懸濁培養された培養細胞
が、直径０．５〜１■程度の微細な細胞塊りの形を保ち
なから継代培養を続けることにある。このようにして得
た培養細胞は、予備試験として、第５工程に用いるべき
植物体再生用培地中に直接に移植して培養すると、良く
再分化して植物体を再生して高い植物体再生能を示した
。

なお、第２工程で一回使用済みの培養液、すなわち培養
細胞を分取した後の古い培養濾液は、後に説明する「コ
ンディシジニング培地」を調製するために回収して再利
用されるから、保存する。

（Ｃ）第３工程（プロトプラストの作成）第２工程で得
た培養細胞をプロトプラスト化するには、培養細胞の細
胞壁溶解のために通常酵素で処理する。使用する酵素は
、ペクチン分解酵素および細胞壁分解酵素である。その
ペクチン分解酵素としては、ペクトリアーゼＹ−２３、
マセロザイムＲ−１０などの組織分解を行うマセレーシ
ョン酵素が用いられ、また細胞壁分解酵素としては、セ
ルラーゼオノズカＲＳ、セルラーゼオノズ力Ｒ−１０、
ドリセラーゼ、メイセラーゼ、セルラーゼＶＣなどの酵
素、好ましくはセルラーゼオノズ力Ｒ５が用いられる。

第２工程の液体培地中より取り出した継代培養４〜６日
、好ましくは５日目の培養細胞（１〜２ｇ）を、酵素溶
液、すなわち酵素類として、ペクトリアーゼＹ−２３を
０．０１％〜０．５％、好ましくはｏ、ｉ％含み、マセ
ロザイムＲ−１０を０．０１％〜０．５％、好ましくは
０．３％含み、セルラーゼオノズカＲ５を１％〜４％、
好ましくは２％含み且つ浸透圧調節剤として、シ！ｌｌ
Ｎ０．３モル〜０．５モル、好ましくは０．４モルを含
み、さらに、必要により、塩化カルシウムを５ミリモル
〜２０ミリモル、好ましくは１０ミリモルを含む酵素溶
液（ｐＨ５，８）　１０ｄにシャーレ（直径９ｃ＠）中
で加える。２５〜３０’Ｃの暗所で１〜３時間、好まし
くは２時間静置して酵素処理すると、多量のプロトプラ
ストが作成される。

このようにして培養細胞を酵素処理した消化反応液は、
２０〜４０μｍの孔のナイロンメッシェで濾過し、未消
化の培養細胞を除去した後、プロトプラストを含む濾液
を５００〜６００ｒ、ρ１．で５〜１０分間遠心分離す
るとプロトプラストの沈澱を得られた。この沈澱は染色
法によりプロトプラストであることをｒ１ｆｉ認できる
。このようにして得たプロトプラストの沈澱物を０．４
Ｍマニトール水溶液１０ｍに再び懸濁し、上記と同様に
遠心分離して洗浄されたプロトプラストの沈澱を得る。

この洗浄操作は合計３回行うのがよい、このプロトプラ
スト化法によれば、第２工程で採取できた培養細胞１ｇ
当り約５Ｘ１０’個〜１０７個の収率で、プロトプラス
トを取得することができる。

（Ｄ）第４工程（プロトプラストからのカルスの再形成
） 第３工程で得られたプロトプラストを、これからカルス
を再形成する目的でシャーレに入れたカルス再形成用液
体培地（後記に詳しく説明する）に移植してプロトプラ
ストを培養する。移植されるプロトプラストの個数はカ
ルス再形成用の液体培地のＬｄ当りにｉｏ’個／ｄ〜１
０’個／−１好ましくは１０６個／ｄとなるようにトー
マ血球計算盤を用いてカウントして行う、移植後には、
２５°Ｃ１暗所で液体培養するのがよい。

このカルス再形成用液体培地中で培養されるプロトプラ
スト細胞は夫々が分裂し、分裂と共に細胞壁を再生され
た普通の細胞として増殖して多数のカルスを再形成する
。この分裂に際して生じた１つの普通細胞から、増殖に
より１個のカルスが形成される。

プロトプラストの培養中、すなわちプロトプラストから
のカルスの再形成の過程中で、このプロトプラストを培
養しているカルス再形成中の培養液は必要成分の補足の
ために、培養１４日後と培養２１日後に、現に使用中の
カルス再形成用液体培地の調製に当り用いたと同系の基
本培地に同一種類の植物ホルモンを配合してなる新鮮な
培地（浸透圧調節剤を含まない）で２倍に希釈される。

プロトプラストの培養開始後、３〜４週間で、１つのプ
ロトプラストから直径０．５〜ＩＤＩ程度のカルス１個
が形成される割合になる。

このようにカルス再形成培地中でプロトプラストから得
られた直径０．５〜１＋ｗ程度の再形成カルスは、これ
を培地から分は取って、第１工程で用いたカルス形成用
固体培地と同し組成の培地を含むシャーレ中に移植し、
２５°Ｃの暗所で更に７〜１４日間培養を続けると、直
径２〜５閣の大きさのカルスに生長することができる。

前記のように末法の第４工程に用いられるプロトプラス
トからカルス再形成用の液体培地は、植物ホルモンとし
て２．４−Ｄ、ビクロラム、ジカンバなどのオーキシン
類、好ましくは２．４−Ｄを０．１〜５■／ｌ、好まし
くは０．５■／Ｉｌの量で、並びに炭素源を兼ねる浸透
圧調節剤として作用するマニトールとグルコースとの両
者をそれぞれ５〜９％、好ましくはそれぞれ７％の量で
植物組織培養基本液体培地、例えばＭＳ液体培地（ｐＨ
５，８）又はＢ５液体培地（ｐＨ５，８）に配合して威
る改良液体培地（イ）であることができる。

また、上記のカルス再形成用液体培地は、前記の改良液
体培地（イ）に対して、後述するコンディショニングを
予め行った培地（コンディショニング培地）を混合して
なる改良液体培地（０であることができる。

前記のコンディショニング培地とは、次のように作られ
たものである。すなわち、末法の第２工程において懸濁
培養に用いた液体培地、例えばＭＳまたはＢ５培地でカ
ルス細胞−を継代培養して得られた培養細胞を含む懸濁
液、すなわち培養液から培養細胞を濾別した残りの培養
濾液に対して、上記の改良液体培地（ロ）の調製に当り
混合される改良液体培地（イ）で使用したのと同一濃度
の同種植物ホルモンと同一濃度のマニトール＋グルコー
スとを配合させて作られた液を０．２２ミクロン孔のメ
ンブレンフィルター（ミリボア社製）で濾過して除菌す
ることにより、前記のコンディショニング培地（ｐ）Ｉ
　５．８）が調製できる。前記の改良液体培地（ロ）の
調製に当り、改良液体培地（イ）に混合されるコンディ
ショニング培地の割合は得られた混合液について２５〜
５０％であり、好ましくは５０％がよい、すなわち、コ
ンディショニング培地と、これを混合される改良液体培
地（イ）との混合比は１：１乃至１：３（容量）の範囲
であるのがよい。

前記の改良液体培地（イ）においても、また前記のコン
ディショニング培地においても、これに炭素源を兼ねた
浸透圧調節剤として５〜９％のマニトールと５〜１０％
のグルコースとが必らず併用して配合されるが、これに
代えて、マニトール単独、グルコース単独、シｇ糖単独
を配合するとプロトプラストの分裂頻度は悪化する。

（Ｅ）第５工程（再形成カルスからの植物体の再生） 第４工程で得られた直径２〜５■の大きさのカルスを植
物体再生用培地に置床して、培養してカルスを再分化さ
せると、ベントグラス植物体が再生される。この再分化
用培地は植物生長ホルモンとして、ベンジルアデニン（
ＢＡ）　、カイネチン、ゼアチンなどのサイトカイニン
類、好ましくはＢＡを０．５〜１０ｍｇ／　ｆ　、好ま
しくは１〜２Ｉｎｇ／ｌの量で、並びにシラ糖を２０〜
９０ｇ／ｆ、好ましくは３０ｇ／ｌの量で植物組織培養
基本固形培地、例えばＭＳ固形培地（ρＩ＋　５．８．
寒天１％含有）またはＢ５固形培地（ｐｌ＋　５．８．
寒天１％含有）に配合してなる固形培地であることがで
きる。逼イ四→←植物体再生用培地に置床されたカルス
は、１５〜３０°Ｃ１好ましくは２５°Ｃで１０〜５０
日間、明所（例えば１０００ルツクス）にて培養すると
、個々のカルスから夫々にベントグラス植物体を再生さ
せることができる。

次に、本発明の方法の各工程で使用する各種の培地につ
いて説明する。

本発明の方法の各工程で使用する植物組織培養用培地、
すなわちカルス形成用、懸濁培養による培養細胞形成用
、プロトプラストからのカルス再形成用およびカルスか
らの植物体再生用の各培地は、原則としては、次に示す
ように植物組織培養用の基本液体又は固形培地に、植物
ホルモン（オーキシン類、サイトカイニン類）、炭素源
（シ！Ｉｌｌ、グルコース、マニトール）を配合した加
用培地である。ここに、基本培地としては、無機塩成分
、ビタミン類、アミノ酸を含むものが使用される。この
無機塩成分としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム
、塩化マグネシウム、硝酸ナトリウム、リン酸−水素カ
リウム、塩化カルシウム、リン酸三水素ナトリウム、硫
酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化
コノくルト、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化
カリウム、ホウ酸などが挙げられる。また、ビタミン類
としては、チアミン、ピリドキシン、ニコチン酸、ニコ
チン酸アミド、ビオチン、パントテン酸カルシウム、ア
スコルビン酸、リボフラビンおよびミオイノシトール等
を例示できる−０また、アミノ酸類としては、グリシン
、アスパラギン、グルタミン、アルギニンなどを例示す
ることができる。

このような各種成分を含む基本培地としては、公知の培
地、例えば、ＭＳ（ムラシゲ・スクーグ）培地〔フィシ
オル・プラント（Ｐｈｉｓｙｏｌ、　Ｐｌａｎｔ）第１
５巻、第４７３〜４７９頁（１９６２年））；Ｎ６培地
（サイエンティア・シニカ（Ｓｃｉｅｎｔｉａ　５ｃｉ
ｎｉｃａ）第１８巻、第６５９〜６６３頁（１９７５年
））；Ｂ５培地〔イクスベリメンタル・セル・リサーチ
（Ｅｘρ。

Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、）第５０巻、第１５１〜１５Ｂ頁（
１９６８年）］；Ｒ２培地〔プラント　セル　フィジイ
オール（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）第
１４巻、第１１１３〜１１２１頁（１９７３年））；Ｋ
Ｍ培地〔ブランク（Ｐｌａｎｔａ）第１２６巻、第１０
５〜１１０頁（１９７５年）〕があげられ、この中でも
特にＭＳ培地およびＢ５培地が好ましいが、これら２つ
の培地に限定されるものではない。

本発明で使用できる前記培地はｐＨ５，６〜５，８に調
整され、液体培地又は固形培地でとして使用される。

固形培地とする場合は、ゲル化剤として寒天やマガロー
スなどを通常０．２〜１％の濃度で配合される。そして
この固形培地上で培養される。

液体培地を用いる培養の場合、培養物を液体中に浮遊、
懸濁させて培養する懸濁培養が通常行なわれ、この場合
、ロータリーシェーカーを培養槽として用いることもで
きる。

次に、本発明の試験例を示して具体的に説明する。

巴」艶鮭 １、第１工程（植物体からのカルスの形成）゛のカルス コロニアルベントグラスの種子１００粒を７０％エチル
アルコール水溶液１００Ｉｄに１分間浸してから、この
種子を取り出し、さらに１０％次亜塩素酸ナトリウム水
溶液５００ｔｕｌに２０分間浸して殺菌し、無菌水で３
回洗浄した。この種子を３０ｇ／ｌ（３％）のシｇ糖、
３１℃ｇ／ｌ（３ρρｌ１ｌ）の２゜４−Ｄを含むＢ５
固形培地（ｐＨ５，８、寒天１０ｇ／　１２　）　１０
ａｆｆｉを入れた試験管（直径１．５ｃｍ、長さ１０ｃ
ｍ）に工試験管あたり１粒あて、試験管１００本に播種
した。これを２５°Ｃ，５０日間培養し、１粒当り３０
〜５０ＩＩｇのカルス１個を得た。

■−２１の　　　゛のカルス クリーピングベントグラスの種子１００粒を上記（１−
１）と同様に殺菌処理した。この種子をＭＳ基本培地（
ｐＨ５，８、寒天１％）　３０ａｄ！を入れたシャーレ
（直径９　ｃｔａ　）に１シヤーレあたり１０粒あてシ
ャー１１０個に播種した。これを２５℃で７日間栽培し
た。このようにして得た草丈２ｃｍ程度のベントグラス
の幼苗を基部から５ｍ程度の切片（生長点を含む）に切
断した。この切片を３０ｇ／ｌ（３％）　（７）　シｍ
ｌ　１ｇ、５　ｇ／　Ｒ（７）２，４Ｄを含むＢ５固形
培地（ｐｌ！　５．８、寒天１０ｇ／ｆ）３０−を入れ
たシャーレ（直径９ｃｍ）に１シャーレ当り工０切片あ
て、シャー１１０個に置床した。

これを２５°Ｃ６０日間培養すると生長点付近の細胞か
ら１切片当り３０〜５０■のカルス１個を得た。

２、第２工程（懸濁培養による培養細胞の増殖）第１工
程より得たカルスを３０ｇ／ｊ！（３％）のシｇ糖、２
■／ｌ　（２ｐｐｍ）の２．４−Ｄ、２ｇ／ｆｆｉ　（
０，２％）のカゼイン加水分解物を含むＭＳ液体培地（
ｐＨ５，８）およびＢ５液体培地（ρｌ！５．８）の各
５０ｍ１をそれぞれ入れた１００ｒＮ容量の三角フラス
コに、１フラスコあたり１個のカルス（３０〜５０ｍｇ
）の割合で移植し、２５°Ｃで１４日間振とう培養（１
２０ｒ、ρ１．）し、ｌ！！濁した状態で増殖した培養
細胞を得た。その後、培養細胞の植え継ぎは、１週間に
１回あて上記した但し新鮮な液体培地を用いて行った。

３、第３工程（プロトプラストの作成）第２工程におい
て植え継ぎ後５日目の培養細胞を約１ｇとりだし、これ
を４％セルラーゼオノズカＲ５，０，１％ペクトリアー
ゼＹ−２３，０，４Ｍショ糖を含む酵素溶液ＣｐＨ５，
８）　１０ＩＩ１１を入れたシャーレ（直径９ｃｍ）に
移植した。これを２８℃、２時間、暗所に静置した。こ
のようにして培養細胞を酵素処理した消化反応液を、２
０μｍの孔のナイロンメツシュで濾過し、未消化の培養
細胞を除去し、プロトプラストを含む濾液を５０Ｏｒ、
ｐ、ｍ、で５分間遠心分離してプロトプラストの沈殿を
得た。このようにして得たプロトプラストの沈殿物を０
．４Ｍマニトール水溶液１０ｄに再び懸濁し、５００ｒ
、ｐ、、ｍ。

で５分間遠心分離をおこない、プロトプラストの沈殿物
を得た。このような洗浄の操作を合計３回くりかえして
プロトプラストを収得し、次の工程に供した。

４、第４工程（プロトプラストからのカルスの再形成） （ａ）　　プロトプラストからカルスの再形成用に用い
る培地は次の通り調製した。すなわち０．５■／２の２
．４−Ｄと所定量のグルコース及びマニトールとをＭＳ
液体培地（ｐＨ５，８）またはＢ５液体培地（ｐＨ５，
８）に配合して数種の改良液体培地（イー１）を調製し
た。

次に、既に本試験例の第２工程でＭＳ培地またはＢ５培
地を用いてカルスからの培養細胞を継代培養して得られ
た１００日目細胞懸濁液（培養液）を濾紙にて濾過して
細胞を採取した残りの培養濾液を用意した。各濾液に、
上記の改良液体培地（イー１）に用いたと同じ２．４−
Ｄ、グルコース、マニトールを改良液体培地（イー１）
におけるのと同一の濃度となるように添加した。このよ
うに２．４−Ｄ、グルコース及びマニトールを添加され
た培養濾液を０．２２μｒｒｔ孔のメンブレンフィルタ
ー（ミリボア社製）で濾過して除菌し、これにより、コ
ンディショニングされたＭＳ液体培地（ｐＨ５，８）ま
たはコンディショニングされたＢ５液体培地（ａｌｌ　
５．８）を「コンディショニング培地」として得た。こ
のように、コンディショニングされたＭＳ液体培地（Ｍ
Ｓ系コンディショニング培地）またはコンディショニン
グされたＢ５液体培地（Ｂ５系コンディショニング培地
）を調製した。

更に、ＭＳ液体培地を用いて調製された改良液体培地（
イー１）には、ＭＳ系コンディショニング培地を混合し
てカルス再形成用液体培地を作り、またＢ５液体培地を
用いて調製された改良液体培地（イー１）には、Ｂ５系
コンディショニング培地を混合してカルス再形成用液体
培地を作るが、この際、混合され合わせるＭＳ系または
Ｂ５系の改良液体培地と、ＭＳ系または１３５系のコン
ディショニング培地との組合わせは、夫々に同一の濃度
の２．４−Ｄ並びに同一の濃度のグルコースとマニトー
ルを含有するもの同志の組合わせにすることが必要であ
る。従って、ＭＳ系またはＢ５系改良液体培地（イー１
）とＭＳ系またはＢ５系コンディショニング培地とを混
合して戒るカルス再形成用液体培地は、結局は、それの
調製に用いたＭＳ系またはＢ５系改良液体培地（あるい
はＭＳ系またはＢ５系コンディショニング培地）と同一
濃度で植物生長ホルモン（具体的には２．４−Ｄ）と、
炭素源を兼ねた浸透圧調節剤（グルコース＋マニトール
）を含有することになる。本例では、改良液体培地（イ
ー１）の０．５−を「コンディショニング」培地の０．
５ｊｌｌ！とを混合し、すなわち前者と後者との混合比
を１＝１として混合して居り、こうして、後記の第１表
に示される組成を有する各種のカルス再形成用液体培地
を１−づつ調製し、次段のプロトプラストからのカルス
再形成段階に供した。

（ｂ）　　前記の（ａ）項に説明したように調製された
各種のカルス再形成用液体培地の１　ａｌｌを夫々に、
シャーレ（直径３５ａ＊）に入れた。これに第３工程で
得たプロトプラスト１０６個となるようにトーマ血球針
算盤を用いてカウントして移植し、２５°Ｃ１暗所で培
養した。培養中の培養液はグルコース、マニトールを添
加していないＭＳ液体培地またはＢ５液体培地を用いて
、同じＭＳ系またはＢ５系同志の組合せで培養１４日と
２１日後にそれぞれ２倍に希釈した。培養開始後プロト
プラストの分裂と増殖により３０日目に形成した細胞の
塊り、すなわちカルスの個数を調べ、下記の分裂頻度に
より試験結果を評価した。その結果は第１表に示すとお
りである。

プロ　ブース　の　゛　　（カルス再形成の度合） 分裂しない（カルスの再形成なし）。

±：数個のカルス再形成が認められる。

＋：分裂して１０個から１００個のカルスを再形成した
。

十＋：分裂して１００個以上のカルスを再形成した。

第１表に示された本発明試験区のうち、グルコース７％
＋マニトール７％を含むカルス再形成用培地で分裂頻度
が＋＋の評価を受けた試験区で形成された複数個のカル
スを培地から取り出した。

次いで、この再形成されたカルスを、本試験例の第１工
程で用いたと同し組成のカルス形成培地に移植し、２５
°Ｃの暗所で１４日間更に培養すると、大きさが２〜５
ｍのカルスに生育したので、これを次段の第５工程に供
した。

５、第５工程（植物体の再生） 第４工程で得られたカルス（直径２〜５閣）をｇ／ｌの
シｇ糖とサイトカイニンとして、後記第２表に示された
所定量のベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチンまたは
ゼアチンとをそれぞれ含むＭＳ培地に移植し、２５℃明
所（１０００ルツクスにおいて培養した。培養開始後３
０日自己下記の基準により植物体の再生の程度を調べた
。その結果は第２表に示すとおりである。

樅忽供亘生夏五度：×　再生しない ○　再生が認められた ◎　良く再生した 〈発明の効果〉 本発明の方法によれば、ベントグラス植物から多数のプ
ロトプラストが作成でき、これを培養して多数のカルス
を高率で得ることができ、これらカルスから効率良く多
個数のベントグラス植物体を再生させることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）ベントグラスの種子又は幼苗基部の細胞から
   カルスを形成させる工程と、 （２）そのカルスを液体培地中で培養してカルスの細胞
   を増殖させ、懸濁した状態の培養 細胞及び／又は細胞塊を生成させてこれを 採取する工程と、 （３）採取された培養細胞及び／又はその細胞塊からプ
   ロトプラストを作成する工程と、 （４）プロトプラストをカルス再形成用の液体培地中で
   培養し、プロトプラストの分裂と それで生じた普通細胞の増殖とによりカル スを再び形成させる工程と、 （５）再び形成させたカルスを植物体再生用培地に移植
   し、そこで再分化することにより、ベントグラスの植物
   体を再生させる工程と からなることを特徴とする、ベントグラスのプロトプラ
   ストを利用する植物体再生方法。 ２、炭素源を兼ねる浸透圧調節剤として５〜１０％（重
   量）のグルコースと５〜９％（重量）のマニトールとを
   組合わせて植物組織培養用の基本液体培地に配合して成
   るカルス再形成用の液体培地中でプロトプラストを培養
   して本法の第４工程を行う請求項１記載の方法。 ３、本法の第２工程で液体培地中でカルス細胞を増殖さ
   せて得られた培養細胞を含む培養液から細胞を濾過によ
   り採取した後の残りの培養濾液に対して、５〜１０％（
   重量）のグルコース及び５〜９％（重量）のマニトール
   並びに０．１〜５ｍｇ／ｌの植物生長ホルモンを配合し
   てコンディショニング培地を作り、また、第２工程で用
   いた液体培地と同じ系統の植物組織培養用基本液体培地
   に対して５〜１０％（重量）のグルコース及び５〜９％
   （重量）のマニトール、並びに先と同一の種類であって
   ０．１〜５ｍｇ／ｌの量である植物生長ホルモンを配合
   して改良液体培地を作り、しかも、この際に、該改良液
   体培地中に配合されるグルコース、マニトール及び植物
   生長ホルモンの各濃度が夫々に前記のコンディショニン
   グ培地における各濃度と同一であるように調整し、更に
   、前記のコンディショニング培地を前記の改良液体培地
   に容量混合比が１：１乃至１：３の範囲で混合すること
   により調製されたカルス再形成用の液体培地中でプロト
   プラストを培養して本法の第４工程を行う請求項１記載
   の方法。