JPH07170870A - トルコぎきょうの種苗の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 同一形質を有するトルコぎきょうの種苗を不
定胚を用いて効率的に生産する方法を提供する。 【構成】 トルコぎきょうの組織片を暗黒下、植物ホル
モンとしてナフタレン酢酸を含む固体培地で培養してカ
ルスを形成させるカルス形成工程（Ａ）、該カルスを光
照射下、０．５〜１．５％ゲル化剤を含み、かつ植物ホ
ルモンフリーの固体培地で培養して不定胚を形成させ、
該不定胚から植物体を再生させる植物体形成工程（Ｂ）
によってトルコぎきょうの種苗を生産する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、トルコぎきょうの組織
片を培養し、植物体を再生して種苗とするトルコぎきょ
うの種苗の生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一つの植物体の細胞または組織片を培養
し、これより植物体の種苗を再生・育成することによ
り、単一の遺伝形質を有する植物体を短期間で多数得る
ことができるため、品種改良に有利である他、種苗の市
場安定供給が可能であるという利点を有している。この
ような植物体の細胞培養から種苗を得る方法としては、
植物体から得られた植物細胞、組織片から不定芽を形成
させ、この不定芽から再生植物体を生産する方法、およ
び植物細胞、組織片からエンブリオジェニックカルスを
経由して不定胚を得、この不定胚から再生植物体を生産
する方法が知られている。

【０００３】従来、トルコぎきょうでは、組織片から植
物体の種苗を再生・生産するために前者の方法が採用さ
れており、例えば、トルコぎきょうの葉片、茎、根など
の組織片をベンジルアデニンを含む培地で培養して不定
芽を形成させ、その不定芽を植物ホルモンフリーの培地
で発根させることにより苗を得る方法〔植物組織培養、
第５巻９６頁〜９７頁（１９８７年）：プラント セル
ティシュー アンドオルガン カルチャー（Plant Ce
ll Tissue and Organ Culture ）が知られている。

【０００４】しかしながら、従来では、トルコぎきょう
の植物組織から不定胚を得、この不定胚から植物体を再
生させる後者の方法で種苗を効率よく生産する方法につ
いては知られていなかった。

【０００５】他の植物体では、不定胚を用いて植物体の
種苗を生産する方法の適用例が知られており、例えば、
ワサビ大根の茎、葉から切り取った組織片を滅菌してベ
ンジルアデニンと2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（以下
「2,4-ＰＡ」という）を含むＭＳ固形培地に置床してカ
ルスを誘導し、得られたカルスをベンジルアデニンと2,
4-ＰＡを含むＭＳ液体培地で遊離させて懸濁細胞とした
後、この懸濁細胞を濾別して粒径を揃えて分取し、次い
で分取植物細胞を植物ホルモンフリーのＭＳ液体培地で
培養して均一な不定胚を得、この不定胚から植物体の再
生を目的とする方法（特開平２−１８２１２４号公報）
などが知られている。

【０００６】また、アスパラガス植物の外殖片を、オー
キシンとサイトカイニンを含む液体培地にて、光照射下
で培養してカルスを形成させ、これを植物ホルモンフリ
ーの液体培地で培養して不定胚を形成させた後、得られ
た不定胚を、液体培地に１０重量％以下のゲル化剤を添
加することによって浮遊・分散させ、これを固体培地上
に放出し、培養して植物体を得る方法（特開平４−２２
８０１６号公報）も知られている。

【０００７】しかしながら、このような他の植物体の組
織片から不定胚を経由して再生植物体を得る方法は、こ
れをそのままトルコぎきょうの種苗生産に適用しても、
不定胚から植物体が全く再生しないか、あるいは再生率
が極端に低く、実用的ではないという問題があった。

【０００８】

【発明の目的】本発明は、このような従来技術の問題点
を解決しようとするものであり、トルコぎきょうから、
不定胚を経由して植物体を再生させることにより、同一
の形質を持つトルコぎきょうの種苗を効率的に大量生産
できる方法を提供することを目的としている。

【０００９】

【発明の概要】本発明に係るトルコぎきょうの種苗の生
産方法は、トルコぎきょうの組織片を、ナフタレン酢酸
を含む固体培地上にて、暗黒下で培養してカルスを形成
させるカルス形成工程（Ａ）、および前記カルスを、
０．５〜１．５％のゲル化剤を含み、かつ植物ホルモン
フリーの固体培地上にて、光照射下で培養して不定胚を
形成させ、該不定胚から幼植物体を再生させる植物体再
生工程（Ｂ）を含むことを特徴としている。

【００１０】本発明に係るトルコぎきょうの種苗の生産
方法によれば、トルコぎきょうの組織をナフタレン酢酸
を含有する固体培地にて、暗黒下で培養してカルスを形
成させ、次いでこのカルスを、０．５〜１．５重量％の
ゲル化剤を含み、かつ植物ホルモンフリーの固体培地に
て、光照射下で培養した不定胚から植物体を再生させて
いるため、均一な形質を有する植物体を効率よく得るこ
とができる。

【００１１】

【発明の具体的説明】次に本発明の方法について説明す
る。以下、本発明に係るトルコぎきょうの種苗生産方法
を、さらに具体的に説明する。

【００１２】本発明に係るトルコぎきょうの種苗の生産
方法は、トルコぎきょうから組織片を得、次いでこの組
織片から特定条件にてカルスを形成させるカルス形成工
程（Ａ）と、得られたカルスを、特定の固定培地上に
て、特定条件下で培養して形成させた不定胚から植物体
を再生させる植物体再生工程（Ｂ）とを含んでいる。

【００１３】以下、これら工程（Ａ）および（Ｂ）を詳
細に説明する。カルス形成工程（Ａ ） 本発明のカルス形成工程（Ａ）では、トルコぎきょうか
ら得た組織切片を原料とし、この細胞または組織切片か
ら特定条件でカルスを形成させている。

【００１４】トルコぎきょうは、ユーストマ（Eustoma
）属の植物であり、本発明では、ユーストマ（Eustoma
）属に属するあらゆる品種を用いて原料を調製するこ
とができる。

【００１５】このようなトルコぎきょうから得られる原
料としての組織片は、例えば植物体の葉身、葉柄、茎
頂、塊茎、葯基部、根、花茎などから分離・収集するこ
とができ、好ましくは葉身から分離・収集される。

【００１６】本発明の原料である組織片は、これら葉身
などの植物体の一部を切出し、常法により殺菌した後、
無菌条件で所望の大きさの小片に切断することにより、
調製することができる。

【００１７】植物体から得た組織片の殺菌処理として
は、例えば、薬剤殺菌を挙げることができ、この際、７
０％エタノールの他、適当な濃度の過酸化水素溶液、次
亜塩素酸ナトリウム溶液および次亜塩素酸カルシウム溶
液などを、単独、あるいは組み合わせて用いて行うこと
ができる。さらに具体的には、植物体から得た組織切片
は、例えば、これらを７０％エタノール溶液に１分間、
次いで有効塩素濃度約１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液
に２０分間浸漬して殺菌処理することができる。

【００１８】このようにして殺菌処理された組織は、滅
菌水で洗浄した後に適当な固体培地上に移植されるが、
組織片が大きい場合には、必要に応じて、無菌条件下で
適当な大きさの切片、通常１ｃｍ角程度の切片に切断し
て用いてもよい。

【００１９】本発明のカルス形成工程（Ａ）では、この
ようにして得られる組織片を、特定植物ホルモンを含有
する固体培地上にて、暗黒下で培養してカルスを形成さ
せる。

【００２０】このような固体培地は、液体培地に、炭素
源と、植物ホルモンとを加え、ｐＨを調製し、さらにゲ
ル化剤を加えて固化することによって調製することがで
きる。

【００２１】固体培地の調製に用いられる液体培地は、
植物の育成に必要な窒素、リン、カリウム、マグネシウ
ム、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛、ホウ素、モリブ
デンおよび鉄などの元素を含む無機塩が含まれた水溶液
であり、従来より植物体の培養に広く用いられた何れで
あってもよい。具体的には、例えば、ムラシゲ・スクー
グ培地（以下「ＭＳ培地」という）、ガンボルグのＢ５
培地、ホワイト培地、ニッチ−ニッチ培地、Ｎ６培地な
どが挙げられる。これら培地は、これをそのまま用いて
も、水を加えて１／３〜１／２に希釈したものを用いて
もよい。この内、特にＭＳ培地が好ましい。

【００２２】培地に添加される炭素源としては、ショ
糖、ブドウ糖などの糖類が挙げられ、この内、ショ糖が
好ましい。これら炭素源の濃度は、糖類の種類等によっ
て適宜選択されるが、例えば、１０ｇ／リットル〜６０
ｇ／リットル、好ましくは３０ｇ／リットルの濃度で用
いるのが望ましい。

【００２３】また、カルス形成工程（Ａ）で用いられる
植物ホルモンとしては、オーキシンに属するナフタレン
酢酸（以下ＮＡＡという）が用いられる。また、ＮＡＡ
は、通常１mg／リットル〜２０mg／リットル、好ましく
は４mg／リットル〜１６mg／リットル、さらに好ましく
は６mg／リットル〜９mg／リットルの濃度で用いられる
ことが望ましい。

【００２４】また、培地を固化させるためのゲル化剤と
しては、寒天、アガロース、ゲルライト（ゲランガム）
などを挙げることができ、特にゲルライトが好ましい。
このようなゲル化剤の使用量は、ゲル化剤の種類によっ
て適宜選択され、例えば０．１〜１０ｇ／リットル、好
ましくは２〜５ｇ／リットル、特に好ましくは３ｇ／リ
ットルの量で用いられることが望ましい。

【００２５】固体培地は、上記炭素源と、植物ホルモン
とを液体培地に添加し、これを所望のｐＨ、具体的に
は、ｐＨ４〜７に調節した後、さらにゲル化剤を加えて
固化することによって調製される。

【００２６】このようにして調製される固体培地は、オ
ートクレーブ等により滅菌して用いることが望ましい。
また、固体培地には、所望により、さらに各種ビタミ
ン、アミノ酸、その他天然物などを加えてもよい。

【００２７】本発明のカルス形成工程（Ａ）では、この
ような固体培地上に、上記組織片を置床し、これを暗黒
下で培養することにより、組織片からカルスを形成す
る。なお、ここでいうカルスとは、細胞が比較的小さく
細胞質が詰まった不定胚形成能力を持つエンブリオジェ
ニック カルス（embryogenic callus）を意味する。

【００２８】このような毛状根組織片の培養は、通常１
５℃〜３０℃、好ましくは２０〜２８℃、さらに好まし
くは２５℃の温度で、通常２０〜９０日間、好ましくは
３０〜６０日間行なわれる。

【００２９】植物体再生工程（Ｂ） 本発明の植物体再生工程（Ｂ）では、上記カルス形成工
程（Ａ）で得られたカルスを、特定の固体培地上にて、
光照射下で培養して不定胚を形成させ、ついでこの不定
胚から幼植物体を再生させている。

【００３０】この植物再生工程（Ｂ）で用いられる固体
培地は、植物ホルモンフリーである他、特定量のゲル化
剤を含んでいる。ゲル化剤としては、具体的には、デン
プン、セルロース、デンプン／アクリル酸共重合体、セ
ルロース／アクリル酸共重合体、セルロース／アクリル
酸共重合体、ポリアクリル酸架橋物、寒天、アガロース
などを挙げることができる。

【００３１】本発明では、このようなゲル化剤は、固体
培地に５〜１５ｇ／リットル（０．５〜１．５％）、好
ましくは８ｇ／リットル〜１２ｇ／リットル（０．８〜
１．２％）、さらに好ましくは１０ｇ／リットル（１
％）の量で含まれている。

【００３２】このような固体培地は、炭素源と、所望に
より上記組合せの植物ホルモンとを液体培地に添加し、
所望のｐＨ、具体的には、ｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ
５．６〜６、さらに好ましくはｐＨ５．８に調節した
後、さらにゲル化剤を上記所定量となるように加えて固
化して調製される。

【００３３】なお、炭素源および液体培地としては、上
記カルス形成工程（Ａ）と同様の炭素源および液体培地
を、同様の量で用いることができる。このようにして調
製される固体培地は、オートクレーブ等により滅菌して
用いることが望ましい。また、固体培地には、所望によ
り、さらに各種ビタミン、アミノ酸、その他天然物など
を加えてもよい。

【００３４】このようにして調製した固体培地上には、
カルス形成工程（Ａ）で得たカルスが置床される。この
ようなカルスの置床は、カルスを所望の直径、通常直径
０．５〜１cmのカルス塊に分割して固体培地上に置床す
るか、あるいはメッシュを用いて所望の大きさ、通常直
径０．１〜１mm、好ましくは０．２５〜０．５mmを有す
るカルスに選別し、これを固体培地上に置床することに
より行なうことができる。

【００３５】植物体再生工程（Ｂ）では、固体培地上に
置床したカルスは、光照射下で培養される。光照射は、
１日に５時間〜２０時間、好ましくは１６時間、１００
０〜１００００ルックス、好ましくは４０００ルックス
で行なわれることが望ましい。

【００３６】このような光照射条件下で、通常６０日間
程培養すると、カルスから不定胚が形成され、次いで不
定胚から正常な発芽および発根がおこり、幼植物体を得
ることができる。

【００３７】このようにして得られた再生幼植物体は、
これをそのまま種苗として供給してもよいが、所望によ
り、植物体育成工程（Ｃ）により、さらに育成してもよ
い。この植物体育成工程（Ｃ）では、具体的には、幼植
物体を、土壌を詰めたポットに移植し、温室で栽培して
育成・順化させて、種苗として供給するのに適した植物
体に育成する。

【００３８】

【発明の効果】本発明に係るトルコぎきょうの種苗の生
産方法によれば、トルコぎきょうの組織をナフタレン酢
酸を含有する固体培地にて、暗黒下で培養してカルスを
形成させ、次いでこのカルスを、０．５〜１．５重量％
のゲル化剤を含み、かつ植物ホルモンフリーの固体培地
にて、光照射下で培養した不定胚から植物体を再生させ
ているため、均一な形質を有する植物体を効率よく得る
ことができる。

【００３９】以下、実施例により、本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００４０】

【実施例１】 （Ａ）カルス形成工程 トルコぎきょう（品種：紫の峰）の葉を７０％エタノー
ル溶液に１分間、次いで１％次亜塩素酸ナトリウム溶液
に２０分間浸漬した後、滅菌水で３回洗浄した。滅菌し
た葉を、メスで１cmの長さの切片に切り出し、これを組
織片とした。

【００４１】このようにして得た組織片を、シャーレ
（直径９ｃｍ）内に調製したカルス形成用固体培地〔Ｍ
Ｓ固体培地の所定濃度の無機塩、ＮＡＡ４ｍｇ／リット
ル、ショ糖３０ｇ／リットルおよびゲルライト３ｇ／リ
ットルを含有するｐＨ５．８の固体培地〕に、１シャー
レ当たり５片づつ置床した。

【００４２】カルス形成用固体培地に置床された組織片
を、２５℃で、暗黒下６０日間培養（培養開始３０日目
に固体培地を同一組成の新しい固体培地に変更して継代
培養）することにより、不定胚形成能を有する黄色のエ
ンブリオジェニックカルスが形成された。

【００４３】下記式により求められたカルス形成率
（％）を、表１に示す。

【００４４】

【数１】

【００４５】（Ｂ）植物体再生工程 工程（Ａ）で得たカルス１ｇを孔径０．５mmのステンレ
ス製ふるいにかけ、直径０．５mm以下のカルス塊を分取
した。

【００４６】得られたカルス０．５ｇを、ＭＳ培地の所
定濃度の無機塩、ショ糖３０ｇ／リットルを含む液体培
地（ｐＨ５．８）１００mlに加えて懸濁液を得た。ＭＳ
培地の所定濃度の無機塩、ショ糖３０ｇ／リットル、ゲ
ルライト１０ｇ／リットルを含有する植物体再生用固体
培地（ｐＨ５．８）をシャーレ（直径９０mm）内に調製
し、この植物体再生用固体培地に、上述のカルス懸濁液
を、シャーレ当たり１mlづつ置床した。

【００４７】置床されたカルスを、温度２５℃、１日当
たりの明期（４０００ルックス）１６時間、暗期８時間
の条件で、３０日間培養したところ、カルスから不定胚
が形成され、さらに３０日間培養すると不定胚から発
芽、発根した幼植物体が得られた。

【００４８】下記式により求められた植物体再生率
（％）を、表１に示す。

【００４９】

【数２】

【００５０】（Ｃ）幼植物体育成工程 工程（Ｂ）の再生用固体培地から得られた幼植物体計１
０本を、バーミキュライト１００mlが充填された５００
ml容量のプラスチックポット（直径６cm）に移植した。

【００５１】これを温度２５℃、湿度８０％に保った順
化室内で１０日間順化して種苗とした。工程（Ｃ）で得
られた種苗を、土壌を充填した１リットル容量のプラス
チックポット（直径１５cm）に移植し、温室内で移植４
か月間栽培したところ、正常に発育・開花した。

【００５２】

【実施例２〜３】カルス形成工程において、カルス形成
用固体培地に、各々表１で示された濃度のＮＡＡを用い
た以外は、実施例１と同様にして、カルス形成および植
物体再生を行なった。

【００５３】得られた結果を表１に示す。また、実施例
１と同様にして、得られた幼植物体を種苗とし、育成し
たところ、いずれの実施例２および３でも、正常に成育
・開花した。

【００５４】

【実施例４〜６】カルス形成工程において、トルコぎき
ょうの茎から、葉身と同様にして得られた組織片を原料
に用い、かつカルス形成用固体培地に、各々表１で示さ
れた濃度のＮＡＡを用いた以外は、実施例１と同様にし
て、カルス形成および植物体再生を行なった。

【００５５】得られた結果を表１に示す。また、実施例
１と同様にして、得られた幼植物体を種苗とし、育成し
たところ、いずれの実施例４〜６でも、正常に成育・開
花した。

【００５６】

【比較例１〜３】カルス形成用固体培地に、表１に示さ
れた植物ホルモンを、表１に示された量で用いた以外
は、実施例１と同様にして、カルス形成および植物体再
生を行なった。

【００５７】得られた結果を表１に示す。

【００５８】

【比較例４〜６】カルス形成工程において、トルコぎき
ょうの茎から、葉身と同様にして得られた組織片を原料
に用い、カルス形成用固体培地に、表１に示された植物
ホルモンを、表１に示された量で用いた以外は、実施例
１と同様にして、カルス形成および植物体再生を行なっ
た。

【００５９】得られた結果を表１に示す。

【００６０】

【比較例７〜１０】カルス形成工程において、実施例２
と同様のカルス形成用固体培地を用い、かつ植物体再生
工程において、植物体再生用固体培地に、表１に示され
た植物ホルモンを、表１に示された量で用いた以外は、
実施例１と同様にして、カルス形成および植物体再生を
行なった。

【００６１】得られた結果を表１に示す。

【００６２】

【比較例１１】カルス形成工程において、実施例２と同
様のカルス形成用固体培地を用い、植物体再生工程にお
いて、カルスの培養を１日当たり２４時間の暗期で行っ
た以外は、実施例１と同様にして、カルス形成および植
物体再生を行なった。

【００６３】得られた結果を表１に示す。

【００６４】

【比較例１２】カルス形成工程において、実施例２と同
様のカルス形成用固体培地を用い、植物体再生工程にお
いて、植物体再生用培地のゲルライト濃度を３ｇ／リッ
トル（０．３％）とした以外は、実施例と同様にして、
カルス形成および植物体再生を行なった。

【００６５】得られた結果を表１に示す。

【００６６】

【表１】

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トルコぎきょうの組織片を、ナフタレン
   酢酸を含む固体培地上にて、暗黒下で培養してカルスを
   形成させるカルス形成工程（Ａ）、および前記カルス
   を、０．５〜１．５％のゲル化剤を含み、かつ植物ホル
   モンフリーの固体培地上にて、光照射下で培養して不定
   胚を形成させ、該不定胚から幼植物体を再生させる植物
   体再生工程（Ｂ）を含むことを特徴とするトルコぎきょ
   うの種苗の生産方法。
2. 【請求項２】 前記植物体再生工程（Ｂ）で得られた幼
   植物体を育成・順化させて、種苗とする幼植物体育成工
   程（Ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載のトルコ
   ぎきょうの種苗の生産方法。
3. 【請求項３】 前記カルス形成工程（Ａ）で用いられる
   固体培地が、ナフタレン酢酸を、１mg／リットル〜２０
   mg／リットルの量で含むことを特徴とする請求項１また
   は２記載のトルコぎきょうの種苗の生産方法。
4. 【請求項４】 前記植物体再生工程（Ｂ）において、前
   記光照射が、１日あたり５時間〜２０時間、１０００〜
   １００００ルックスで行なわれることを特徴とする請求
   項１〜３のいずれか１項記載のトルコぎきょうの種苗の
   生産方法。