CN111718886A - 一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用 - Google Patents

一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用，所述方法包括：选取绿萼梅枝条，剥皮后完全浸入酶解液中，在27～28℃温度酶解40～50min；酶解液包括：1.5～2.0％纤维素酶R‑10、0.75～1.0％离析酶R‑10、0.5M甘露醇、10mM KCl、20mM CaCl2、10mM MES、0.1％BSA和0.3％PVP，pH值为5.7～5.8。本发明将绿萼梅茎段木质部通过酶解进行原生质体分离，制备的原生质体产量大，活性高，产量最高为2.3×107个/g，活性达到93％以上。本发明制备得到的绿萼梅原生质体转化效率较高，在绿萼梅遗传转化和基因功能验证方面具备较大的应用价值。

Description

一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物育种领域，尤其涉及一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用。
背景技术
梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)隶属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)，具观赏价值和经济价值(陈俊愉.中国梅花品种图志[M].中国林业出版社,2010)。梅花品种丰富，色、香、味、型品种齐全，其中，绿萼梅因萼绿花白、小枝青绿而得名。它属于梅花品种分类系统中的真梅系直枝梅类绿萼型，是梅花品系中的佼佼者，在园林造景中具有重要的地位。随着梅花全基因组、重测序研究的完成(Zhang,et al.The genome of Prunus mume[J].Nature Communications,3:1318.；Zhang,et al.The genetic architecture offloral traits in the woody plant Prunus mume[J].Nature Communications,9(1):1702.)，转基因技术为梅花品种遗传改良提供了一条新途径。然而，梅花在遗传转化困难，转化周期长，极大限制了梅花分子生物学和功能基因组学的研究进展。原生质体是组成细胞的一个形态结构单位。原生质体由于没有细胞壁且具有细胞全能性，当其经过外源刺激可相对容易摄取外源物质，是进行遗传转化、细胞壁再生、膜透性和信号转导等研究的理想受体。
自Vardi等从木本植物——柑橘珠心中分离出原生质体以来(Vardi etal.Citrus cell culture:Isolation of protoplasts,plating densities,effect ofmutagens and regeneration of embryos[J].Plant Science Letters,1975,4(4):231-236.)，利用幼嫩叶片、花瓣、根系、胚轴、愈伤组织和悬浮细胞等外植体，已有多种木本植物的原生质体分离的报道，但绝大多数尚未建立系统、完整、成熟的原生质体分离及纯化技术体系。
梅花属于蔷薇科李属植物，在现有技术中，由于李属植物世代周期长、雌蕊败育率高、杂合性高及易受病毒侵染等特点，使得梅花新品种的选育困难重重，且长期的筛选导致栽培品种集中于少数几种基因型，种质资源有限已成为梅花发展的制约因素。现有技术应用于李属植物遗传转化的方法常见为农杆菌介导法、基因枪法，目前农杆菌介导法在李属植物遗传转化工作中仍存在转化率低，转化基因植株再生率低等问题，尚无法获得足量材料用于梅花基因功能验证。
发明内容
为了解决现有技术至少存在的一种问题，本发明提供一种绿萼梅原生质体分离的方法及其应用，通过直接酶解绿萼梅枝条的方法直接制备绿萼梅原生质体，产量大，活性高，满足后续绿萼梅原生质体转化及基因功能验证。
第一方面，本发明提供一种绿萼梅原生质体分离的方法，包括：
选取绿萼梅枝条，剥皮后完全浸入酶解液中，在27～28℃温度下酶解40～50min；
所述酶解液包括如下组分：
1.5～2.0％纤维素酶R-10、0.5～1.0％离析酶R-10、0.4～0.5M甘露醇、10mM KCl、20mM CaCl2、10mM MES、0.1％BSA和0.1～0.3％PVP，pH值为5.7～5.8。
进一步地，所述酶解液包括如下组分：
1.5～2.0％纤维素酶R-10、0.75～1.0％离析酶R-10、0.5M甘露醇、10mM KCl、20mMCaCl2、10mM MES、0.1％BSA和0.3％PVP，pH值为5.7～5.8。
目前，由于梅花遗传转化困难，关于梅花遗传转化的文献报道较少，应用于基因功能验证的转基因梅花更少。本发明在梅花遗传转化中进行大量研究和探索后发现梅花茎木质部原生质体遗传转化可能成为梅花基因功能验证的可行方案之一，但是制备得到梅花的原生质体呈现细胞破碎的状态，无法进一步应用于遗传转化和功能验证等过程。经过进一步的研究，本发明发现这是由于梅花的原生质体在分离后，酚类化合物和多酚氧化酶接触后迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与其他蛋白质聚合，引起其他酶系统的失活，致使原生质体失活。据此，本发明在酶解液中加入抑制褐变的试剂并进行酶解条件的优化，最终得到了高活力的梅花原生质体。
进一步地，所述选取绿萼梅枝条为选取室外生长的的绿萼梅‘飞绿萼’当年生长2.5～3个月枝条，所述枝条的直径为0.4～0.6cm。
枝条的长短可根据实际情况进行调整，例如8～10cm方便在离心管内浸泡。
本发明经过研究对比发现利用绿萼梅‘飞绿萼’制备得到的原生质体活力较高。
进一步地，在所述酶解后还包括：
将所述枝条转移至洗涤液中震荡使原生质体脱落后得到含有原生质体的洗涤液；
过滤后离心，去上清得到绿萼梅原生质体。
进一步地，所述洗涤液包括如下组分：
150～160mM NaCl、120～130mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES、5～6mM Glucose，pH值为5.7～5.8。
优选为154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES、5mM Glucose，pH值为5.7～5.8。
进一步地，所述过滤为通过180～200目的纱网。
进一步地，所述离心的条件为：
在200～220g的速度下离心8～10min。
作为一种优选的实施方式，本发明提供一种绿萼梅原生质体分离方法，包括：
1)选取生长3个月大的绿萼梅枝条，将茎段切成8～10cm长的茎段，剥去树皮后完全浸入到含有25-30mL酶解液的50mL离心管中，一个管中可以放置6～8根茎段；
2)轻轻旋上管盖，27～28℃水浴酶解40～50min，期间避免晃动；
3)用镊子将茎干轻轻的转移到含有30mL洗涤液50mL离心管中，上下剧烈震荡25～30s，弃掉茎干；
4)利用180～200目的纱网，过滤上一步中的洗涤液，转移至新的50mL离心管中；
5)利用离心机16℃，200～220g/min水平离心8～10min，轻轻吸除上清；
6)用5mL重悬液重悬管底的原生质体，得到绿萼梅未分化木质部原生质体。
进一步地，所述重悬液的配方为：0.5M甘露醇、15mM MgCl2、4mM MES，pH 5.7～5.8。
本发明进一步提供所述绿萼梅原生质体分离的方法在转基因绿萼梅制备中的应用。
本发明进一步提供所述绿萼梅原生质体分离的方法在绿萼梅新品种选育中的应用。
本发明进一步提供所述绿萼梅原生质体分离的方法在绿萼梅内源基因功能验证中的应用。
本发明具备如下有益效果：
(1)本发明以室外生长的绿萼梅枝条制备原生质体，无需对外植体材料消毒而且材料容易获得。
(2)本发明在绿萼梅原生质体分离的酶解液中加入抑制褐变的试剂，并结合酶解条件的优化成功制备出高活力(93％以上)的绿萼梅原生质体，同时产量较高，达到2.3×107个/g以上。
(3)本发明制备得到的原生质体可以进一步用于原生质体遗传转化及梅花内源基因功能验证，为其他李属植物原生质体分离提供了理论参考，在李属植物遗传转化和内源基因功能验证方面具有较大的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的梅花茎段去皮后浸入酶解液中处理示意图；
图2为本发明实施例3提供的外源吸附剂对抑制原生质体褐化的影响，其中A为不加吸附剂的酶解液示意图，B为添加0.3％吸附剂PVP的酶解液示意图；
图3为本发明实施例6提供的制备得到的绿萼梅‘飞绿萼’未分化木质部原生质体图；
图4为本发明对比例1提供的制备得到的绿萼梅‘飞绿萼’未分化木质部原生质体图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 梅花原生质体的制备方法
本发明涉及一种梅花原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)选取生长3个月大的梅花枝条，将茎段切成8～10cm长的茎段，剥去树皮后完全浸入到含有25～30mL酶解液的50mL离心管中，一个管中可以放置6～8根茎段，所述酶解液为：2.0％(m/v)纤维素酶R-10、0.75％(m/v)离析酶R-10、0.5M甘露醇、20mM KCl、10mMCaCl2、20mM MES、0.1％BSA和0.3％PVP，pH值为5.7～5.8；
(2)轻轻旋上管盖，27～28℃水浴酶解40～50min，期间避免晃动；
(3)用镊子将茎干轻轻的转移到含有30mL洗涤液50mL离心管中，上下剧烈震荡25～30s，弃掉茎干；
(4)利用180～200目的纱网，过滤上一步中的洗涤液，转移至新的50mL离心管中，所述洗涤液为：154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES、5mM Glucose，pH值为5.7～5.8；
(5)利用离心机16℃，200～220g/min水平离心8～10min，轻轻的吸除上清；
(6)用5mL重悬液重悬管底的原生质体，得到绿萼梅未分化木质部原生质体，所述重悬液的配方优选为：0.5M甘露醇、15mM MgCl2、4mM MES，pH 5.7～5.8；
(7)原生质体的计数与活力检测。用重悬液稀释原生质体，在标准血球计数板上滴加10μL原生质体悬浮液，当原生质体充满计数室后，用光学显微镜计算5个大方格内的原生质体个数，重复3次，利用公式计算原生质体数，并换算为每克鲜重材料获得的原生质体产量(个/g FW)；利用质量分数为0.01％二乙酸荧光素(FDA)对原生质体进行染色，计算发出绿色荧光的原生质体数和原生质体总数，重复3次，利用公式计算原生质体活力{原生质体活力＝(发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)×100％}。
图1为本实施例提供的梅花茎段去皮后浸入酶解液中处理示意图。
实施例2 不同梅花品种对原生质体产量和活力的影响
在原生质体分离过程中，不同梅花品种对原生质体的产量和活力具有显著影响。本发明共设置了绿萼梅(‘小绿萼’、‘飞绿萼’)、宫粉梅(‘江南宫粉’、‘粉皮宫粉’)、朱砂梅(‘粉红朱砂’、‘乌羽玉’)共6个品种的处理。不同品种茎段剥皮后浸入酶解液(所述酶解液为：2.0％(m/v)纤维素酶R-10、1.0％(m/v)离析酶R-10、0.5M甘露醇、20mM KCl、10mMCaCl2、20mM MES、0.1％BSA，pH值为5.7～5.8)，在室温(25℃)酶解2h。通过测定分离出原生质体的产量和活力，确定适宜的梅花品种。结果见表1，综合比较原生质体产量和活性，生长速度快、树皮分离效果好的绿萼梅获得的原生质体产量和活性最佳，杂质较少。
表1 不同梅花品种对原生质体产量和活力的影响
梅花品种 原生质体产量(个/g) 原生质体活力(％)
‘小绿萼’ 8.8×10<sup>5</sup> 39.6
‘飞绿萼’ 8.4×10<sup>5</sup> 44.8
‘江南宫粉’ 3.6×10<sup>5</sup> 32.5
‘粉皮宫粉’ 2.5×10<sup>5</sup> 35.9
‘粉红朱砂’ 2.0×10<sup>5</sup> 29.6
‘乌羽玉’ 1.3×10<sup>5</sup> 22.8
实施例3 外源添加物对抑制原生质体褐化的影响
在上述原生质体分离过程中，不同梅花品种茎段浸泡酶解过程后，分离得到的原生质体均存在褐化现象，其中绿萼梅品种获得的原生质体颜色最浅。为了探究抑制原生质体褐化方法，提高原生质体活性，本发明共设置了绿萼梅(‘小绿萼’、‘飞绿萼’)在0.1％(m/v)抗氧化剂维生素C(Vc)、0.3％(m/v)吸附剂聚乙烯吡略烷酮(PVP)及0.3％(m/v)活性碳(AC)等褐化抑制剂共6个样品的处理。将梅花茎段剥皮后浸入含有上述抑制剂的酶解液(所述酶解液为：2.0％(m/v)纤维素酶R-10、1.0％(m/v)离析酶R-10、0.5M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl2、20mM MES、0.1％BSA，pH值为5.7～5.8)，在室温(25℃)下室温酶解2h。通过测定分离出原生质体的产量和活力，确定适宜的褐化抑制剂。PVP是酚类物质的专一吸附剂，其对酚的结合强于酶蛋白的结合，因而可使酶从多酚-酶复合物中结合出来，从而使酶的抑制消除。结果见图2和表2，图2显示了未加入PVP(A)以及加入PVP(B)后酶解梅花枝条的区别；表2综合比较原生质体产量和活性，利用含有PVP抑制剂处理的酶解液获得的原生质体颜色淡、产量大、活性高。
表2 外源添加物对抑制原生质体褐化的影响
Figure BDA0002481106300000081
实施例4 酶液浓度对原生质体产量和活性的影响
酶液种类和浓度是影响原生质体产量和活性最重要的因素。在原生质体分离过程中，不同浓度的酶组合能显著提升原生质体产量和活性。本发明设置了1.0％、1.5％、2.0％(m/v)纤维素酶R-10和0.5％、0.75％、1.0％(m/v)离析酶R-10共6个不同浓度的处理。以绿萼梅‘飞绿萼’为材料，在添加0.3％吸附剂聚乙烯吡略烷酮(PVP)的基础上，在室温(25℃)下酶解2h，分离并测定原生质体产量和活性，确定最佳酶液浓度。结果如表3所示，随着酶浓度的增加，原生质体的产量和活性均增加，当纤维素酶浓度为2.0％、离析酶浓度为0.75％时，原生质体的产量和活性达到最高，之后随着离析酶浓度的增加，原生质体的产量和活性均降低，而且细胞碎片等杂质增多。
表3 酶液浓度对原生质体产量和活性的影响
Figure BDA0002481106300000082
Figure BDA0002481106300000091
实施例5 酶解时间对原生质体产量和活性的影响
酶解时间是影响原生质体产量和活性的重要因素之一。本发明设置了20min、30min、40min、50min、60min、2h共6个酶解时间。以绿萼梅‘飞绿萼’为材料，所述酶解液为2.0％(m/v)纤维素酶R-10、0.75％(m/v)离析酶R-10、0.5M甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl2、20mM MES、0.1％BSA和0.3％PVP，pH值为5.7～5.8，在室温(25℃)下进行上述6个时间段的酶解处理，通过测定原生质体产量和活性，确定最佳酶解时间。结果如表4所示，在酶解前期，原生质体的产量随着酶解时间的增加而逐渐升高，在60min达到最高；超过60min后，原生质体产量随着酶解时间的增加而降低，同时细胞碎片逐渐增多，且原生质体的活力在30min达到最高，后随酶解时间延长而降低，因此综合考虑产量和活力，40～50min为分离绿萼梅‘飞绿萼’未分化木质部原生质体的最佳时间。
表4 酶解时间对原生质体产量和活性的影响
Figure BDA0002481106300000092
Figure BDA0002481106300000101
实施例6 酶解温度对原生质体产量和活性的影响
酶解温度也是是影响原生质体产量和活性的重要因素之一。本发明设置了25℃(室温)、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃共6个酶解温度处理。以绿萼梅‘飞绿萼’为材料，所述酶解液为2.0％(m/v)纤维素酶R-10、0.75％(m/v)离析酶R-10、0.5M甘露醇、20mM KCl、10mMCaCl2、20mM MES、0.1％BSA和0.3％PVP，pH值为5.7～5.8，在上述不同温度下酶解40min，通过测定原生质体产量和活性，确定最佳酶液温度。结果如图3和表5所示，图3显示了制备得到的原生质体在显微镜下的图片，表5显示在酶解过程，原生质体的产量随着酶解温度的增加而逐渐升高，而原生质体活性随着酶解温度的增加而降低，出现较多的细胞碎片。综合考虑产量和活性，27～28℃为分离绿萼梅‘飞绿萼’未分化木质部原生质体的优选温度。
表5 酶解温度对原生质体产量和活性的影响
酶解时间 原生质体产量(个/g) 原生质体活力(％)
25℃ 1.5×10<sup>7</sup> 94.2
26℃ 1.7×10<sup>7</sup> 94.1
27℃ 2.2×10<sup>7</sup> 93.5
28℃ 2.3×10<sup>7</sup> 93.3
29℃ 2.5×10<sup>7</sup> 79.4
30℃ 2.8×10<sup>7</sup> 71.2
对比例1
本对比例提供一种原生质体制备方法，酶解液配方为：0.4M甘露醇、20mM KCl、20mM MES-KOH、10m MCaCl2、0.1％BSA、1.0％纤维素酶-Rs、1.0％离析酶-R-10、0.5％半纤维素酶、0.3％PVP，pH值为5.7-5.8。具体步骤如下：
以绿萼梅‘飞绿萼’为材料，选择生长状况良好的一年生植株，取当年生的茎段，用流水冲洗5～20min，剥去树皮，用上述酶解液在25～27℃黑暗中置于30～50rpm/min的摇床上进行酶解2h，将处理好的茎段转移到MMG溶液中，轻摇分散原生质体，用孔径为70μm的细胞筛过滤，收集滤液，离心收集原生质体，用MMG重新悬浮，到纯化的梅花原生质体并测定原生质体产量和活性。结果如图4所示，酶解2h时，获得的原生质体溶液中存在较多的细胞碎片，原生质体产量为4.8×105个/g，活性为77.8％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种绿萼梅原生质体分离的方法，其特征在于，包括：
选取绿萼梅枝条，剥皮后完全浸入酶解液中，在27～28℃温度下酶解40～50min；
所述酶解液包括如下组分：
1.5～2.0％纤维素酶R-10、0.5～1.0％离析酶R-10、0.4～0.5M甘露醇、10mM KCl、20mMCaCl2、10mM MES、0.1％BSA和0.1～0.3％PVP，pH值为5.7～5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液包括如下组分：
1.5～2.0％纤维素酶R-10、0.75～1.0％离析酶R-10、0.5M甘露醇、10mM KCl、20mMCaCl2、10mM MES、0.1％BSA和0.3·％PVP，pH值为5.7～5.8。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述选取绿萼梅枝条为选取室外生长的的绿萼梅‘飞绿萼’当年生长2.5～3个月枝条，所述枝条的直径为0.4～0.6cm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在所述酶解后还包括：
将所述枝条转移至洗涤液中震荡使原生质体脱落后得到含有原生质体的洗涤液；
过滤后离心，去上清得到绿萼梅原生质体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗涤液包括如下组分：
150～160mM NaCl、120～130mM CaCl2、5mM KCl、2mM MES、5～6mM Glucose，pH值为5.7～5.8。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述过滤为通过180～200目的纱网。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为：
在200～220g的速度下离心8～10min。
8.一种酶解液，其特征在于，所述酶解液用于酶解绿萼梅枝条进行绿萼梅原生质体的分离，所述酶解液包括：
1.5～2.0％纤维素酶R-10、0.5～1.0％离析酶R-10、0.4～0.5M甘露醇、10mM KCl、20mMCaCl2、10mM MES、0.1％BSA和0.1～0.3％PVP，pH值为5.7～5.8。
9.权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8所述酶解液在绿萼梅遗传转化中的应用。
10.权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8所述酶解液在绿萼梅内源基因功能验证中的应用。
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