CN106701776B - 芸香科植物引起人体上火的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个芸香科植物引起人体上火的基因及其在芸香科植物遗传改良育种中的应用，其中芸香科植物引起人体上火的基因具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，或者由于增加、缺失或替换一个或多个核苷酸导致的与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列同源性不小于80％、且功能相同的衍生核苷酸序列，同时其对应的氨基酸序列也被公开。本发明通过对芸香科植物(例如柑橘)诱导人体上火的关键基因Citsh1进行分离克隆，并利用该基因构建基因沉默载体，通过农杆菌转化对芸香科植物进行遗传育种改良，从而培育出不引起人体上火的芸香科植物。

Description

芸香科植物引起人体上火的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程与人体医学交叉领域，更具体地，涉及一种芸香科植物引起人体上火的基因片段及其在芸香科植物遗传改良育种中的应用。

背景技术

2011年中国柑橘产量以300万吨稳居世界第一位，中国第二位。占柑橘比重较大的温州蜜柑富含预防骨质疏松、抗癌、预防心脑血管疾病等功效的功能性成分[2,6]，但消费者过多食用后，会出现皮肤发痒、口腔溃疡、喉咙干疼等“上火”症状，使人易感烦躁、失眠，影响人们日常生活，从而影响柑橘等水果的保健功效和种植效益。“上火”是中医概念，其症状除了皮肤不明显反应外，和国际上研究的Allergy(过敏)反应类似。柑橘被国际上列为过敏食品之一，意大利食用橙子引起过敏的达到17％[1]，芬兰3岁幼童过敏率为3％[4]。

已有技术中，对芸香科植物(如温州蜜柑)诱导“上火”的具体成分尚不清楚，国内也无报道。吃柑橘引起人体上火在日常生活中是一个比较常见的现象，也逐渐引起人们的重视。泰茂林等认为血液内源自蛋白质的降解产物和肽类激素等中分子增多，是上火症的主要因素之一[12]。从粗提物水平研究园艺植物“上火”已有少量报道，利用巨噬细胞株RAW264.7发现，“上火”水果荔枝、龙眼粗提物显著提高前列腺素E2的合成以及上调COX-2的表达[8]。目前，这类上火物质研究还处于粗体物阶段，具体功能成分及其结构尚不清楚。

柑橘是世界消费量最大的水果，但“多吃橘子会上火”的认识常常造成人们对柑橘的评价降低，影响柑橘消费，降低了人们对柑橘的喜爱。因此，发掘柑橘中“上火”基因，并利用其对芸香科植株进行遗传改良，对提高食品安全具有重要的意义。

参考文献：

[1]Adler,B.R.,T.Assadullahi,et al.1991.Evaluation of a multiple foodspecific IgE antibody test compared to parental perception,allergy skin testsand RAST.Clinical and experimental allergy:journal of the British Society forAllergy and Clinical Immunology,21(6):683-688.

[2]Lian,F.,K.-Q.Hu,et al.2006.beta-Cryptoxanthin suppresses thegrowth of immortalized human bronchial epithelial cells and non-small-celllung cancer cells and up-regulates retinoic acid receptor betaexpression.International Journal of Cancer,119(9):2084-2089.

[3]Livak,T.D.S.K.J.(2008)."Analyzing real-time PCR data by thecomparative CT method."Nature Protocols 3:1101-1108.

[4]Ma,D.,Y.Li,et al.2011.Purification and characterization of two newallergens from the salivary glands of the horsefly,Tabanusyao.Allergy,66(1):101-109.

[5]Saarinen,U.M.and M.Kajosaari.1980.Does dietary elimination ininfancy prevent or only postpone a food allergy？A study of fish and citrusallergy in 375children.Lancet,1(8161):166-167.

[6]Suzuki,M.,H.Fujii,et al.2010.Lipocalin-type prostaglandin Dsynthase and egg white cystatin react with IgE antibodies from children withegg allergy.Allergology International,59:175-183.

[7]Uchiyama,S.and M.Yamaguchi.2008.Anabolic effect of beta-cryptoxanthin in osteoblastic MC3T3-E1 cells is enhanced with 17 beta-estradiol,genistein,or zinc sulfate in vitro:the unique effect with zinc onRunx2 and alpha 1(I)collagen mRNA expressions.Molecular and CellularBiochemistry,307(1-2):209-219.

[8]Warner,T.D.and J.A.Mitchell.2008.COX-2 selectivity alone does notdefine the cardiovascular risks associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs.The Lancet,371(9608):270-273.

[9]Wu,M.-C.2002.Differential effects of foods traditionally regardedas‘heating’and‘cooling’on prostaglandin E2 production by a macrophage cellline.Journal of biomedical science,9(6):596-606.

[10]程运江,伊华林,et al.2001.几种木本果树DNA的有效提取.华中农业大学学报,20(5):481-483.

[11]刘永忠,刘庆,et al.2006.一种适合于成熟脐橙果皮和果肉的RNA提取方法华中农业大学学报,25(3):300-304.

[12]庞然,张淑玲,et al.2009.草木犀正丁醇提取物对小鼠巨噬细胞促炎介质的影响.中国现代医学杂志,20(19):2893-2896.

[13]泰茂林,肖莉,et al.1990.“上火”证与中分子物质关系初步探讨.广东医学,11(6):31-32.

发明内容

针对“吃柑橘上火现象”对柑橘消费和人体健康的负面影响，本发明的目的在于提供了一种芸香科植物引起人体上火的基因及其应用，通过基因沉默技术获得了能够进一步改良芸香科植物(如温州蜜柑国庆一号、尤力克柠檬)是否引起人体上火反应这一性状的miRNA基因序列及利用该miRNA基因序列得到的miRNA构建的沉默载体，对具有引起人体上火反应能力的这两种和其它芸香科植物的遗传育种改良有重要意义。

为实现上述目的，本发明的一个方面，提供了一种芸香科植物引起人体上火的基因全长，其特征在于，具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，或者由于增加、缺失或替换一个或多个核苷酸导致的与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列同源性不小于80％、且功能相同的衍生核苷酸序列。

本发明的又一方面，本发明提供了基于上述芸香科植物引起人体上火基因片段的编码序列，其特征在于，该编码序列具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，或者由于增加、缺失或替换一个或多个核苷酸导致的与SEQ ID No.9所示的核苷酸序列同源性不小于80％、且功能相同的衍生核苷酸序列。

本发明的又一方面，本发明提供了一种芸香科植物引起人体上火的蛋白质，其特征在于，该蛋白质是由SEQ ID No.10所示的核苷酸序列直接编码的蛋白质，或者是与由SEQID No.10所示的核苷酸序列直接编码的蛋白质同源性在80％至100％、且功能相同的蛋白质。

本发明的又一方面，本发明提供了一种用于沉默上述芸香科植物引起人体上火基因片段的miRNA基因序列，其特征在于，该miRNA基因序列具有如SEQ ID No.11或SEQ IDNo.12所示的核苷酸序列，用于获得miRNA。

本发明的又一方面，本发明提供了一种利用上述miRNA基因序列获得的miRNA构建的沉默载体。

本发明的另一方面，本发明提供了上述沉默载体在芸香科植物育种改良中的应用。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于准确分离出了芸香科植物中引起人体上火的天然蛋白质对应的基因片段(即具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列或相应的衍生核苷酸序列，该基因片段存在于具有引起人体上火这一性状的天然芸香科植物中，是芸香科植物诱发人体上火的主要原因之一)，进一步细化了具有引起人体上火反应这一性状的芸香科植物其遗传基因上的特点，找出了部分芸香科植物具有能够引起人体上火这一性状的根本原因，对改良具有引起人体上火反应这一性状的芸香科植物具有重要意义，人们可以利用上述基因片段对芸香科植物的进行遗传转化，沉默引起人体上火的基因Citsh1的表达，从而利用生物技术育出不引起人体上火反应的芸香科植物。

本发明中用于沉默芸香科植物引起人体上火基因片段(如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列)的miRNA基因序列(由于该miRNA是人造miRNA，因此也可称为amiRNA)，是基于WebMicroRNA Designer网站设计的两个用于沉默Citsh1基因的small RNAs(例如与SEQ IDNo.11或SEQ ID No.12对应)，该small RNAs用于构建Artificial microRNAs(amiRNAs)载体沉默Citsh1基因，分别为pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2。本发明所采用的amiRNA技术方法相对于其他的基因沉默方法具有高效、精确和可控等特点，可以有效的沉默芸香科植物中Citsh1基因，对芸香科植物遗传改良具有重要意义。

本发明中的沉默载体是利用上述miRNA基因序列对应获得的miRNA构建而成，例如，可以是利用在线软件WMD3-Web MicroRNA Designer设计靶向柑橘Citsh1基因的两个amiRNA，以及用于over-lapping PCR的引物I,II,III,IV。该沉默载体可用于沉默如SEQ IDNo.6所示的芸香科植物引起人体上火的基因片段，从而对芸香科植物育种进行改良。例如，该沉默载体可遗传转化尤力克柠檬(上胚轴法)，对其潜在的引起人体上火功能进行遗传改良，所采用的方法及其所获得的改良植株；或将该沉默载体用于遗传转化温州蜜柑愈伤组织并诱导获得再生植株，对其引起人体上火功能进行遗传改良，获得改良植株；愈伤组织可以通过根癌农杆菌介导遗传转化得出，然后诱导抗性愈伤生胚，生芽，生根，进而可以获得完整植株。

综上，本发明通过对芸香科植物诱导人体上火的关键基因Citsh1进行分离克隆，并针对该基因构建基因沉默载体，通过例如农杆菌转化对芸香科植物进行遗传育种改良，获得不引起人体上火的芸香科植物。

附图说明

图1是本发明克隆Citsh1基因、Citsh1基因沉默载体构建和其在芸香科植物遗传改良育种中的应用技术流程图；

图2 Citsh1基因全长克隆琼脂糖凝胶电泳图。Citsh1基因全长约1000bp。

图3 Citsh1基因编码区序列(coding sequence，CDS，编码序列)克隆琼脂糖凝胶电泳图。图中J代表本地早，G代表温州蜜柑，C代表红夏橙，Y代表高斑柚。Citsh1基因CDS长度约300～400bp之间。

图4 Citsh1基因沉默载体构建琼脂糖凝胶电泳图。经过四轮PCR反应，通过overlaping技术合成的两个Artificial microRNA琼脂糖凝胶电泳图。

图5 Artificial microRNAs(amiRNAs)法设计Citsh1基因沉默片段。图表示合成的Artificial microRNAs示意图，虚线区域是人工设计的microRNA。

图6 Artificial microRNAs(amiRNAs)法构建Citsh1基因沉默载体。所构建沉默载体结构图。

图7多种柑橘果实Citsh1基因相对表达量分析。取温州蜜柑(国庆1号)、红橘、甜橙(红夏橙)、高斑柚、尤力克柠檬五种柑橘果实果肉，分别对其Citsh1基因进行相对表达量分析。

图8遗传转化改良柠檬过程。图8A为侵染后上胚轴培养，图8B为生芽培养基培养，图8C为伸长培养基培养，图8D为抗性芽切下后转入生根培养集中生根，8E为生根成功后的阳性苗，图8F为阳性苗进行为其30d的炼苗。

图9转基因植株Citsh1基因沉默效果分析。分别取转基因前后柠檬叶片，分析其Citsh1基因沉默效果。

图10遗传转化温州蜜柑愈伤组织筛选示意图。图10A为生长良好的温州蜜柑愈伤组织，用于转基因；图10B为农杆菌侵染后，对愈伤组织进行抗性筛选；图10C为挑出繁殖的抗性愈伤进行继代培养。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

图1描绘了通过柑橘提取物单一成分蛋白质谱分析、分离克隆Citsh1基因、Artificial microRNAs(amiRNAs)法构建Citsh1基因沉默载体以及其在芸香科植物遗传改良育种中的应用的流程。其中，目标的柑橘提取物单一成分蛋白质(即能够引起人体上火反应的天然Citsh1蛋白)质谱信息通过以下方法步骤获得：

(1)芸香科植物果实预处理：

首先将芸香科植物果实榨汁，将得到的果汁用纱布过滤得到滤液；然后，将所述滤液冷冻干燥得到固体粉末；

(2)将所述步骤(1)得到的固体粉末通过酚提取法再次提取总蛋白得到蛋白粉末；接着，利用凝胶色谱柱法分离所述蛋白粉末得到目标蛋白的粗提取粉末，其中粗提取得到的目标蛋白粉末是收集第114分钟～第147分钟凝胶色谱柱分离液得到的；

其中，所述总蛋白的再次提取包括：在0℃下向5～7mL的酚提取缓冲液中加入5g所述步骤(1)中得到的固体粉末，配制所述酚提取缓冲液的原料包括蔗糖、EDTA、PMSF、DTT、Triton X-100和pH值为7.5的Tris-HCl，该酚提取缓冲液中Tris的浓度为20mmol/L，蔗糖的浓度为250mmol/L，EDTA的浓度为10mmol/L，PMSF的浓度为1mmol/L，DTT的浓度为1mmol/L，Triton X-100的质量百分浓度为1％；接着再向其中加入5mL饱和酚溶液，混合后离心处理，得到水相上层、白色杂质中间层以及酚层下层；然后，回收该酚层下层作为收集液，接着向该收集液中加入4倍～5倍体积醋酸胺浓度为0.1mol/L的甲醇溶液，并在-20℃下静置12h，得到蛋白沉淀；然后将该沉淀用丙酮清洗后干燥得到蛋白粉末；

所述目标蛋白的粗提取包括：将所述蛋白粉末配制成浓度为5mg/mL的蛋白水溶液，取8mL所述蛋白水溶液作为试样；接着，利用凝胶色谱柱分离该蛋白水溶液试样，控制流速为1mL/min，然后按时间依次收集100管层析液，每管收集3min，其中第38管～第49管层析液冷冻干燥即得到目标蛋白的粗提取粉末；

接着，再将得到的目标蛋白粗提取粉末配制成100μL浓度为10mg/mL的上样液；然后，通过高效液相色谱法利用流动相分离该上样液并按时间依次收集分离液，所述流动相是由浓度为0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液和浓度为0.1％的三氟乙酸的水溶液按体积比10:90配制而成；具体是将所述上样液溶解在所述流动相中，并通过半制备型COSMOIL C18的柱子，该柱子的温度为30℃；接着，将其中第4.5分钟～第5.0分钟收集到的所述分离液透析去除其中的流动相和无机盐，然后冷冻干燥浓缩即得到目标蛋白的精提取粉末。

该目标蛋白的精提取粉末即柑橘提取物Citsh1蛋白固体粉末，将此粉末送往上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱shotgun分析。

实施例1：柑橘“上火”单一物质Cs8g14040蛋白质谱分析及其生物信息分析

1.质谱分析柑橘“上火”单一物质

质谱技术(MS)是目前最重要的蛋白质组学鉴定技术。其基本原理是将样品分子离子化后，根据不同的离子质荷比(m/z)的差异来分离并确定分子量。现今的生物质谱有多钟方法，其中以基质辅助激光解吸电离(MALDI)/飞行时间质谱测量法(TOF)和电子喷雾电离质谱测量法(ESI)为主。

本实验将柑橘提取物单一成分蛋白质(即引起人体上火的天然Citsh1蛋白)处理后做基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测(由上海中科新生命生物科技有限公司做质谱检测)、鉴定蛋白质，然后用质谱测定肽片段的精确质量，将实验获得的肽质量指纹谱数据和甜橙全基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/gb2/gbrowse/orange/)中蛋白质进行序列比对，所检索的蛋白质按其匹配的优劣进行排序(见表1)，其中以检索分数较高者作为最终鉴定的蛋白，同时得到匹配基因注册号为Cs8g14040.3。

表1柑橘单一成分质谱及蛋白鉴定

表2为柑橘单一成分质谱及蛋白鉴定。根据基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的肽质量指纹谱与柑橘全基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)比较知，Protein Score最高的是Cs8g14040.3，较高的得分的是Cs8g14040.2、Cs8g14040.1，由此可知该基因的注册号是Cs8g14040(如序列表SEQ ID NO.1所示)，Cs8g14040.1(如序列表SEQ ID NO.2所示)、Cs8g14040.2(如序列表SEQ ID NO.3所示)、Cs8g14040.3(如序列表SEQ ID NO.4所示)是Cs8g14040基因的三个转录本，且Cs8g14040.3是对应匹配的转录本。

2.利用生物信息学方法确定Cs8g14040.3基因结构

对照比较Cs8g14040的基因组序列和编码序列(CDS,coding sequence)，Cs8g14040基因全长972bp，由2个外显子组成。Cs8g14040基因编码三个转录本，分别为Cs8g14040.1、Cs8g14040.2、Cs8g14040.3。鉴于Cs8g14040.3是后续研究的基因，因此分析其序列发现，Cs8g14040.3的两个外显子分别位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的178-440、586-688bp处；其编码序列位于第一个外显子及第二外显子中，分别位于序列表SEQ IDNO.1所示序列的178-440bp、586-688bp处。Cs8g14040.3基因的5’非翻译区(untranslatedregion,5’-UTR)长177bp，位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的1-177bp处；Cs8g14040.3基因的内含子(intron)长145bp，位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的441-585bp处；Cs8g14040.3基因的3’非翻译区(3’-UTR)长284bp，位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的689-972bp处。Cs8g14040.3基因编码一个由121个氨基酸组成未注释功能的蛋白(如SEQ IDNO.5所示)。

实施例2：克隆Citsh1基因全长及其编码序列(Coding sequence,CDS)

关于基因命名的说明，本发明中克隆温州蜜柑中Cs8g14040同源基因命名为Citsh1，且Cs8g14040.1对应Citsh1.1、Cs8g14040.2对应Citsh1.2、Cs8g14040.3对应Citsh1.3。由于Citsh1编码三个转录本，而第三个转录本Citsh1.3是蛋白质谱鉴定的目的基因序列，因此本发明后续研究中使用的Citsh1若无特别说明指代的是Citsh1.3，便于统一名称。

实施例2主要有以下几个步骤：

1.克隆Citsh1基因全长

1.1国庆一号温州蜜柑DNA的提取

选择温州蜜柑嫩叶，采自华中农业大学国家柑橘育种中心资源圃的成年母树，置于-4℃冰箱存放。DNA提取方法参照程运江的方法(参考文献10)。

⑴.液氮充分研磨样品后，取0.1g样品于1.5ml离心管中；⑵.将600μl CTAB提取液(含15g/L CTAB和1.5％体积的巯基乙醇)，预热至90℃左右加入事先研磨好的样品中。将离心管放入65℃水浴锅中水浴60-90min，每隔30min取出上下轻轻混匀几次；⑶.水浴完成后，加入700μl氯仿/异戊醇(24/1)溶液，上下混匀10min，11000g离心15min，吸取上清液至另一新的离心管中后再重复一次该步骤；⑷.加入60μl NaCl(5M)和1ml-20℃冰冻无水乙醇，轻轻颠倒数次，混匀后-20℃冰冻30min沉淀DNA；⑸.11000g离心5min，弃上清液，加入1ml70％乙醇浸泡约10h(中途更换2-3次70％乙醇)；⑹.弃70％乙醇，并适当风干沉淀，每管加入50μl TE和5μl 20μg/ml RNaseA，37℃ 6h或过夜；⑺.检测DNA质量和浓度，-20℃保存备用。

1.2采用TA克隆法克隆Citsh1基因全长

1.2.1 PCR

扩增基因Citsh1引物对如表2所示。20μl的反应体系中包括：1μl cDNA，2μl缓冲液，1.2μl MgCl₂，0.4μl dNTP，0.4μl Taq聚合酶(前述缓冲液和Taq聚合酶购自Fermentas公司,Lithuania)加0.5μl上述引物(如表3所示)。PCR反应在ABI 9700(AppliedBiosystem)扩增仪上按以下程序完成：94℃，5分钟，94℃变性30秒，60℃退火50秒，72℃延伸60秒，35个循环；循环完成后72℃延伸10分钟(如表4所示)。

表2 Citsh1基因引物序列

表3克隆Citsh1基因全长PCR反应体系

表4克隆Citsh1基因全长PCR反应条件

1.2.2 PCR产物的回收与纯化

产生的PCR产物，经1.2％的琼脂糖凝胶电泳后，用洁净的刀片在紫外灯下将片段小心切下放入2.0ml离心管，操作按上海生物工程技术有限公司凝胶回收试剂盒说明书进行：⑴.按500μl/100mg琼脂糖凝胶的比例加入Binding Buffer，置于55℃水浴中，加热溶胶，每2min混匀一次，直至胶彻底融化；⑵.将含有目的片段的Binding Buffer转移至放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2-3min，12000g/min离心0.5min；⑶.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500μl的Wash buffer，室温12000g/min离心0.5min；⑷.重复步骤3次；⑸.取下UNIQ-10柱，再次将UNIQ-10柱放入收集管中，室温12000g/min离心2-3min；⑹.将UNIQ-10柱放入一个1.5ml的无菌的离心管中，在柱子膜中央加25μl的无菌水，55℃水浴放置5min；⑺.室温12000g/min离心2-3min，1.5ml离心管中收集的液体即为回收的DNA片段。

1.2.3感受态细胞的制备

感受态大肠杆菌细胞制备：⑴.挑取DH5α大肠杆菌原种菌，用接种环在LB琼脂板上划线培养，挑取白色饱满的新鲜单菌落，接种到100ml LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养至OD600达到0.4-0.5；⑵.将摇浑浊的菌液转移至一预冷的无菌50ml离心管，冰浴10min，4℃4500g/min离心10min，倒掉上清以回收沉淀；⑶.加入10ml预冷的0.l mol/L CaCl₂悬浮细菌沉淀，冰浴30min，4℃4500g/min离心10min，倒掉上清再次回收细菌沉淀；⑷.加入3ml0.1mol/LCaCl₂溶液重新悬浮细菌沉淀；⑸.加甘油至终浓度15％-20％，混匀分装成每管100μl，冻存于-80℃。

1.2.4目的产物的克隆

将纯化的产物与pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司)进行连接反应，按说明书操作，连接反应体系中插入Citsh1基因与pMD18-T载体的摩尔比为3:1连接反应总体积是10μl，其中包括5μl的Solution I，4μl纯化的PCR产物，1μl pMD18-T载体，16℃连接过夜。

之后：⑴.取出大肠杆菌的感受态，放置冰上冻融，加入10μl连接产物，用移液枪轻轻吸打混匀，在冰上放置30min；⑵.热激：将离心管在42℃下水浴90s；⑶.冰镇：快速将离心管转移至冰浴，2-3min；⑷.复苏：每管加450μl液体LB培养基，在37℃摇床200转/min摇动1h；⑸.铺皿：取100μl菌液均匀涂布于已制备好的LB平板上；⑹.培养：37℃下倒置培养16h左右；⑺阳性克隆的鉴定：用灭菌200μl枪头挑选白色单菌落，放入盛有5ml液体LB培养基(50μg/ml氨苄青霉素)的10ml灭菌离心管中，约20管，在37℃摇床上培养过夜(12-16h)。

菌液PCR检测体系：20μl的反应体系中包括1μl菌液，2μl缓冲液，1.2μl MgCl₂，0.4μl dNTP，0.4μl Taq聚合酶(前述缓冲液和Taq聚合酶购自Fermentas公司,Lithuania)加0.5μl上述引物(如表5所示)。PCR反应在ABI 9700(Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成：94℃，5分钟，94℃变性30秒，60℃退火50秒，72℃延伸60秒，35个循环；循环完成后72℃延伸15分钟(如表6所示)。产生的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，凝胶电泳检测(图2)。

表5克隆Citsh1基因全长菌液PCR反应体系

表6克隆Citsh1基因全长菌液PCR反应条件

选出10个克隆测序(由上海生工生物股份有限公司完成)，测序结果表明，本发明克隆Citsh1基因全长为972bp(见SEQ ID NO.6所示)。

2.克隆Citsh1基因编码序列

2.1采用TRIzol法提取RNA及反转录合成cDNA

选择温州蜜柑的成熟果实，在其成熟期采自华中农业大学国家柑橘育种中心资源圃的成年母树，用液氮冷冻后，置于-80℃冰箱存放。

总RNA提取参照刘永忠的方法(参考文献11)。初提取：⑴.向10ml离心管(DEPC水浸泡后灭菌)中加入5ml抽提液；⑵.液氮研磨好样品后，称取适量(0.5-1g)温州蜜柑汁胞加入抽提液中；⑶.上下剧烈振荡混匀30s，室温静置15min；⑷.加入2-3ml氯仿，剧烈振荡15-30s后，室温静置10min；⑸4℃，11000g离心15min，取上清至另一10ml离心管中；⑹.重复步骤4和5一次；⑺.加入等体积冷冻异丙醇，混匀后静置5-10min；⑻.4℃，11000g离心20min，弃上清；⑼.沉淀用预冷的75％乙醇(灭菌DEPC水配置)漂洗，并浸泡30min；(10).10000g离心5min，弃乙醇后，稍风干后进入纯化步骤。

纯化：⑴.加入400μl TESAR，充分涡旋溶解沉淀物，涡旋时间至少3min；⑵.分别加入400μl Bu/CTAB和Aq/CTAB，涡旋3min；⑶.将混合液转移至1.5ml的离心管中(DEPC水处理后灭菌)；⑷.室温下，15000g离心10-15min；⑸.将上层溶液转移至另一个新的1.5ml离心管中；⑹.加入50μl 3M NaAc和1ml预冷无水乙醇，-80℃冰冻1h；⑺.4℃15000g离心30min，弃上清，稍风干；⑻.加30-100μl灭菌DEPC水溶解；⑼.电泳检测总RNA质量，NanoDrop1000测定总RNA浓度；RNA于-80℃保存。

2.2反转录RT-PCR

将上述总RNA用DNaseI(Invitrogen,美国)处理30分钟以去除基因组DNA污染。然后将RNA样品按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Fermentas,Lithuania)的操作方法反转录合成第一链cDNA：取1-1.5μg总RNA作为反转录模板(20μl体系)，反转录完成后加入80μl双蒸水稀释，存于-20℃冰箱备用。

2.3采用TA克隆法克隆Citsh1基因编码序列

本发明研究人员克隆Citsh1基因CDS序列参照克隆Citsh1基因DNA全长的方法(琼脂糖凝胶电泳图如图3所示)，PCR引物为Citsh1-F、Citsh1-R和Citsh1.2-F、Citsh1.2-R(如表2)。

选出20个克隆测序(由上海生工生物股份有限公司完成)，测序结果表明，本发明克隆到Citsh1.1、Citsh1.2、Citsh1.3。其中Citsh1.1编码序列(CDS，coding sequence)为381bp(见SEQ ID NO.7所示)、其中Citsh1.2编码序列(CDS，coding sequence)为339bp(见SEQ ID NO.8所示)、其中Citsh1.3编码序列(CDS，coding sequence)为366bp(见SEQ IDNO.9所示)。

实施例3利用amiRNA技术构建Citsh1基因沉默载体

1.amiRNA的分子设计及克隆

利用在线软件WMD3-Web MicroRNA Designer设计靶向柑橘Citsh1基因的amiRNA，所设计的amiRNA有两条，分别为amiRNA-1"TGTTCGTTTAAGCGTTGGCAC"(见SEQ ID NO.11所示)和amiRNA-2"TAACTTGCAATAGGGTCACCT"(见SEQ ID NO.12所示)，进而获得amiRNA*以及用于over-lapping PCR的引物I,II,III,IV(表7)。通用引物A和B分别与pRS300质粒中MIR319a外围序列配对。

表7构建沉默载体重叠PCR引物

采用Overlaping PCR的方法(表8)，将A,B,C和D反应将目的片段整合为一段全新DNA片段(表9、10、11、12)，技术路线参照WMD3-Web MicroRNA Designer提供的方法。

表8 Overlaping PCR方法

表9反应A,B和C的PCR程序

表10反应D的PCR程序

表11反应A,B和C的PCR体系(50μl)

表12反应D的PCR体系(50μl)

以获得的PCR产物为模板，attB-miRsh-F、attB-miRsh-R为引物进行PCR扩增，分别凝胶电泳后(图4)，用胶回收试剂盒(上海生物工程技术有限公司凝胶回收试剂盒)分别收片段attb-ami-citsh1-1和attb-ami-citsh1-2(图5)。

2.利用gateway重组技术构建沉默载体

Gateway克隆技术是invitrogen公司的专利，因此后续操作参照invitrogen公司提供的方法。

将回收的片段通过BP反应特异重组在pDNOR207(购自invitrogen公司)上，分别命名为pDNOR207-ami-citsh1-1和pDNOR207-ami-citsh1-2。获得pDNOR207-ami-citsh1-1和pDNOR207-ami-citsh1-2正确载体质粒后，通过LR反应特异重组，将ami-citsh1-1和ami-citsh1-2整合到pK2GW7(购自invitrogen公司)载体中，得到pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2(图6)。至此，成功获得Citsh1基因沉默载体。

实施例4采用农杆菌介导的方法沉默尤力克柠檬Citsh1基因表达

1.多种柑橘果实Citsh1基因表达量分析

分别采集成熟时期的温州蜜柑、甜橙(红夏橙)、红橘、高斑柚、尤力克柠檬果实，将分离的果实汁胞分别用液氮冻存，随后按照实施例2中方法提取RNA，以及对提取的RNA进行反转录合成cDNA。取1-1.5μg总RNA作为反转录模板(20μl体系)，反转录完成后加入40μl灭菌双蒸水(ddH2O)稀释，存于-20℃冰箱备用。

Citsh1基因的表达分析：基因的表达分析在ABI 7500实时定量PCR仪(AppliedBiosystems,CA,USA)上完成。定量引物见表13，基因扩增体系见表14，扩增的反应程序如下：50℃2min，95℃1min；95℃15s；60℃1min(40个循环)。2×SYBR Green PCR Mix(货号4367659)购自appliedbiosystems。每个样品的cDNA扩增反应进行3次独立重复。基因的表达量采用2-△△Ct方法计算[3]。之后使用origin9.0软件对各表达量进行显著性分析(P＝0.01)。

表13 Citsh1基因定量引物序列

表14实时荧光定量PCR反应体系

分析结果发现，Citsh1在温州蜜柑(国庆1号)的果肉中表达量最高，尤力克柠檬中次之，而红橘、甜橙(红夏橙)、高斑柚中Citsh1基因表达量显著低于前两种(P<0.01)(图7)，表明除了温州蜜柑，尤力克柠檬也是能够导致人体“上火”的柑橘品种。由于日常生活中人们食用柠檬的量较小，并未引起显著的人体上火现象。在本案例中拟使用分子生物学技术干涉柠檬中Citsh1基因表达，改良其潜在的导致人体“上火”的功能，作为基于Citsh1基因在柑橘生物技术改良的第一个实施案例。

2.遗传转化

2.1农杆菌菌液制备

pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2两个Citsh1基因沉默载体转化农杆菌EHA105的方法可参考仝铸，2008年华中农业大学博士学位论文。

制备农杆菌菌液：取出含有目标质粒的菌液在固体LB平板(含有卡那霉素50mg/L)上划线，28℃暗培养2d；挑单克隆于新的固体LB平板(含有卡那霉素50mg/L)上划线，28℃暗培养2d，获得单菌落；用手术刀片刮取所有菌体于MT悬浮培养基中，180rpm，28℃振荡培养1.5-2h备用(用紫外分光光度计测定菌液浓度，调整至OD600在0.6-0.8)。

2.2柠檬上胚轴遗传转化

柑橘播种苗上胚轴的遗传转化以及材料后期培养可参考仝铸博士毕业论文(2008)的方法。具体操作步骤如下。

侵染：将外植体浸泡在预先制备好的农杆菌菌液中；侵染20min后，用无菌滤纸吸干上胚轴切断表面的菌液，转入共培养培养基中于21℃培养3d(图8A)。

筛选培养：将共培养后的茎段转入上胚轴筛选培养基，26±2℃暗培养1周后转入光/暗(16h/8h)培养(图8B，图8C)；

生根培养：将大于1cm的抗性芽切下后转入生根培养集中生根(图8D，图8E)，或用于嫁接(试管苗或大砧木)。

移栽：将生长健壮的自根苗和试管嫁接苗取出，洗净根部的培养基，转入清水中炼苗3d，移栽至盛有灭菌腐殖质土的小塑料杯中，上部加盖一个塑料杯(塑料杯轧孔)，浇透水后，转入温室中培养；1个月后，将盖子去掉，视小苗生长情况将其移栽至大盆(图8F)。

2.3.柠檬中Citsh1基因表达干涉效果检测

目前成功获得抗性植株一株(图8F)，有二十余株再生抗性芽在生根中，预期还可获得少量再生植株。采集其叶片，提取RNA，反转录合成cDNA后，通过ABI 7500实时定量PCR仪分析其叶片组织Citsh1基因表达量，结果显示改良后的柠檬植株的叶片中Citsh1基因表达量较野生型柠檬叶片表达量低(图9)。由于柠檬再生植株生长发育缓慢，获得成熟果实时间较久，因此目前没有果实相关的数据可检测，但可以预期再生柠檬的成熟果实中Citsh1基因表达量较野生型柠檬果实中表达量低。通过此方法可达到沉默柠檬中Citsh1基因表达，改良其潜在的导致人体“上火”的功能的目的。

实施例5改良温州蜜柑导致人体“上火”的功能

由于温州蜜柑是无籽品种，不能采用与改良尤力克柠檬相同方法即下胚轴遗传转化，获得改良植株，因此本实施例特设计出一种新的改良策略。具体过程是首先通过农杆菌介导转化温州蜜柑愈伤组织沉默其Citsh1基因表达，然后诱导愈伤组织长出胚状体，获得再生芽，进而再生芽诱导生根获得完整植株。

5.1农杆菌介导的温州蜜柑胚性愈伤遗传转化

根癌农杆菌介导的柑橘胚性愈伤遗传转化可参照段艳欣，2006年华中农业大学博士学位论文。

外植体准备：胚性愈伤组织于MT固体基本培养基上继代培养，培养温度为25±1℃，取培养20d左右生长旺盛的愈伤组织悬浮于MT液体培养基中，于110rpm摇床上预培养4d后用于农杆菌侵染转化(图10A)。

农杆菌准备：取悬浮活化后的农杆菌单菌落接种于固体LB培养基上(含50mg/LKm)，28℃暗培养2d。刮取培养好的农杆菌于MT液体基本培养基中(不含抗生素)，180rpm悬浮培养1.5-2h。

侵染与共培养：OD600＝0.6-0.8的农杆菌浸泡愈伤组织30min后，用无菌滤纸吸干愈伤上多余的菌液。将愈伤转移至共培养培养基中，于21±1℃暗培养3d(图10B)。

筛选培养，再生与纯化：将共培养后的愈伤组织转移至筛选培养基中，26±1℃暗培养筛选。期间将生长迅速的愈伤组织转移至新的筛选培养基中。约3个月左右，抗性愈伤从已褐化的愈伤组织中长出。从每份长出的抗性愈伤团中挑取一小块愈伤组织转移至新的筛选培养基中进行纯化培养，纯化后的愈伤组织长大后再重复纯化一次(图10C)。

目前愈伤组织正在筛选中(图10C)，预期可以获得转基因沉默Citsh1基因抗性愈伤。

5.2诱导转基因沉默Citsh1基因抗性愈伤组织为再生体系

诱导转基因沉默Citsh1基因抗性温州蜜柑愈伤组织为再生体系方法参照刘歆硕士论文(2005)。

胚状体分化培养基诱导胚状体30-60d，之后用胚状体增殖培养基培养，然后使用生芽培养基培养生芽，生根培养基生根，进而获得完整植株。

此部分还未进行，但可预期获得再生植株，且该再生植株已沉默Citsh1基因表达，改良了其导致人体“上火”功能。

综上，本发明以温州蜜柑(Citrus unshiu Marc)为材料，基于蛋白质色谱分离出的上火单一成分蛋白质进行蛋白质谱shotgun分析。利用质谱得到的氨基酸序列，通过柑橘基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)海量数据进行tBLASTn，预测得到的同源片段中基因完整ORF，并通过NCBI上BLAST验证，最终鉴定芸香科植物中引起人体上火的基因Citsh1。采用TA克隆的方法，得到Citsh1基因全长及编码区(coding sequence，CDS)的准确序列。本发明利用在线软件WMD3-Web MicroRNA Designer设计了靶向Citsh1基因的两个amiRNA，并通过over-lapping PCR的方法合成了两个amiRNA的前体。之后利用gateway的方法构建了两个用于沉默Citsh1基因的载体pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2。通过Realtime-PCR分析了多种柑橘果实中的Citsh1的基因表达量，发现尤力克柠檬中Citsh1的基因表达量较高，是一种潜在的导致人体上火的芸香科植株。本发明通过遗传转化对尤力克柠檬进行改良，成功获得转基因植株一株且其叶片中Citsh1的基因表达量显著下降(柠檬自苗期到果实成熟过程需要多年生长，本发明中的沉默载体所用的启动子是35S启动子，可以预期柠檬果实中Citsh1的基因会有较好的沉默效果)。除此之外，本发明还提出一种改良温州蜜柑导致人体上火功能的策略，通过转化其愈伤组织，然后诱导其生胚，生芽，生根，进而获得改良的温州蜜柑植株。本发明通过克隆柑橘中“上火”基因，并利用其对芸香科植株进行遗传改良，对提高食品安全具有重要的意义。

本发明序列共提供12条核苷酸和氨基酸序列，其中SEQ ID No.1为Cs8g14040基因全长核苷酸序列，SEQ ID No.2～4分别对应Cs8g14040.1、Cs8g14040.2和Cs8g14040.3的核苷酸序列，SEQ ID No.5为Cs8g14040.3氨基酸序列；SEQ ID No.6为Citsh1基因全长核苷酸序列，SEQ ID No.7～9分别对应Citsh1.1、Citsh1.2和Citsh1.3的核苷酸序列，SEQ IDNo.10为Citsh1.3氨基酸序列；SEQ ID No.11～12分别为amiRNA-1和amiRNA-2的基因序列。本发明中的芸香科植物，既包括柑橘属植物(如橘、柑、柚、橙、柠檬等)，也包括其他常见柑橘类植物(如枳、金橘等)。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种芸香科植物引起人体上火的基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示。

2.如权利要求1所述基因片段在芸香科植物育种改良中的应用。

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