CN116023459A - 闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。通过根癌农杆菌介导法转化烟草，获得过表达烟草植株。并对其进行分子检测，对基因过表达的烟草进行花青素提取和PbbHLH30基因的表达分析，结果表明PbbHLH30过表达烟草中花青素含量显著高于对照烟草叶片花青素含量。

Description

闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用。

背景技术

闽楠(Phoebe bournei)属樟科(Lauraceae)楠属植物，是中国的一种本土珍稀阔叶树种，为“金丝楠木”原种植物之一，由于其叶色多样性和直立树干，具有很高观赏价值。闽楠还具有极高的商业价值，其木材因其著名的耐腐性和美丽纹理而被用于制作高贵的建筑、家具和雕塑，其提取物含有多种活性物质，例如花青素和木脂素等。

有研究表明，花青素不仅为植物提供丰富多样的颜色，还可以减少植物受到昆虫、病原体、紫外线(UV)辐射和非生物胁迫的伤害。还有证据表明，植物中提取的花青素有益于人体健康，作为抗癌剂和抗氧化剂，具有很强的抗氧化、抗癌能力、保护神经、降血脂和降血糖、预防多种慢性疾病并用于治疗相关疾病。

花青素的抗癌作用已被科研工作者进行广泛研究，花青素通过调节细胞的碳水化合物、脂质和蛋白质代谢及炎症、氧化应激和凋亡信号通路等起到抗癌作用。例如，葡萄中花青素通过抑制IκBɑ磷酸化而阻止肿瘤坏死因子ɑ诱导NF-κB被激活，以计量依赖的方式抵抗人结肠癌细胞的侵袭。花青素可以清除活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，如超氧阴离子(O₂ ^-)、过氧化物自由基(RCOO)、过氧化氢、羟基自由基(OH)和过氧亚硝酸阴离子(ONOO^-)等。例如从越橘中分离得到的花青素具有很强的清除超氧阴离子和过氧亚硝酸阴离子的能力。患有代谢综合症的人每天摄入320mg花青素能够显著抑制人体中NF-κB通路相关促炎症因子基因的表达和增强PPAR-γ基因表达降低患炎症风险。树莓中提取的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷可以抑制脂多糖诱导小鼠骨髓巨噬细胞的促炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1B、MCP-1和Inos的产生。还有研究表明，摄取花青素能保护中枢神经系统，花青素能够跨过血脑屏障到达脑部多个功能区，降低大脑功能紊乱风险，预防脑缺血和阿尔兹海默症、帕金森等神经退行疾病。花青素提取物还可以降低血清和尿液中的糖含量，并且能够防止氧自由基的产生和降低脂质氧化。

花青素是常见的黄酮类化合物，而花青素生物合成调控的核心转录因子之一是bHLH蛋白，可通过激活花青素生物合成通路中酶基因的表达。例如，黑果枸杞中一个bHLH基因高表达，可能通过上调类黄酮-花青素生物合成途径，导致黑果枸杞中花青素积累。此外，WD40与MYB和bHLH相互作用，以增强杨梅中花青素积累。在拟南芥中，bHLH113过表达植物的花青素含量显著高于野生型，在开花时茎和分支中尤为明显。我们前期在闽楠红色叶片中发现了丰富花青素，可能与高表达的PbbHLH30基因有关，我们首次在烟草中过表达PbbHLH30基因，验证其在花青素积累中的生物学功能，为人为调控花青素含量提供基因资源。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了闽楠PbbHLH30基因，其编码的蛋白和应用。

首先，本发明提供闽楠PbbHLH30蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的闽楠PbbHLH30蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在提高植物积累花青素含量中的用途。

在本发明一个具体实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提高植物积累花青素。

本发明还提供一种提高植物积累花青素的方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因的载体转化到植物基因组中，获得转基因植株。其中，所述的转基因植株过表达所述基因。所述的转基因烟草叶片与对照叶片相比，积累更高含量的花青素。

本发明克隆了闽楠PbbHLH30基因，并通过根癌农杆菌介导法转化烟草，获得基因过表达的烟草，并对其进行分子检测，对过表达烟草进行PbbHLH30的表达分析，结果表明PbbHLH30在转基因烟草中显著高表达。进一步提取对照烟草和过表达烟草的花青素，应用紫外可见分光光度计检测花青素绝对含量。结果显示，过表达(OE)烟草中检测到花青素含量显著高于野生型(WT)和空载(EV)烟草中花青素含量，含量分别为0.156ng/g，0.031ng/g和0.029ng/g；总之，我们首次在烟草中过表达闽楠PbbHLH30基因，获得了较高浓度的花青素，即人为调控植物体内花青素合成是可行的，具有较大的运用前景和经济效益。

附图说明

图1为本发明的闽楠叶的总RNA。

图2为PCR扩增闽楠PbbHLH30基因。

图3为闽楠PbbHLH30基因的过表达植株中PCR检测。

图4为鉴定阳性株系中PbbHLH30表达水平分析(荧光定量PCR)。

图5为PbbHLH30的过表达烟草中叶片的花青素含量分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1 材料

1.1 实验材料

闽楠材料取自浙江省丽水市庆元县实验林场。

烟草使用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)野生型，培养于浙江农林大学智能实验楼生长室，生长条件为25℃光照16h/d。

1.2实验试剂与仪器

高保真DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Marker、DNA胶回收试剂盒均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及大肠杆菌感受态购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)股份有限公司；PCR仪为美国PE9700 PCR仪；超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。

1.3引物合成及测序

引物合成及测序均由浙江有康生物科技有限公司完成。

2方法

2.1闽楠总RNA的提取

采用M5 Plant RNeasy Complex Mini Kit提取闽楠总RNA，步骤如下：

(1)取1ml裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65℃水浴重新溶解)，在裂解液CLB中加入5％β-巯基乙醇(1ml CLB加50μlβ-巯基乙醇)。颠倒混匀后65℃水浴中预热；

(2)取0.1g左右的样品，放入液氮预冷的研钵中，液氮研磨至细粉状；

(3)转移100-200mg细粉加至预热的裂解液CLB(已加有β-巯基乙醇)离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果；

(4)短时放回65℃水浴中(5-10min)，中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解；

(5)将裂解物13,000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片；

(6)取裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

(7)立刻接操作步骤的步骤3；

(8)将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，13,000rpm离心2分钟，弃掉废液；

(9)将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内，在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT Plus，13,000rpm离心30秒，收集滤液，用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去)，加入0.5倍体积的无水乙醇，立即吹打混匀，不要离心；

(10)立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，弃掉废液；

(11)加700μl去蛋白液RW1，室温放置1分钟，13,000rpm离心30秒，弃掉废液；

(12)加入500μl漂洗液RW，13,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍；

(13)将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液；

(14)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-Free H2O(事先在70℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟；

(15)如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase-Free H2O重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍。

2.2逆转录cDNA第一链的合成

闽楠RNA(Total RNA)参照PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)的说明书进行反转录cDNA第一链的合成。

(1)配置以下混合液进行去除基因组反应：

反应程序为：42℃，2min；4℃，hold。

(2)配置以下混合液进行反转录反应：

反应程序为：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，hold。

2.3目的基因克隆

2.3.1基因克隆

设计PbbHLH30的特异性引物(表1)，扩增体系和程序见表2。

表1PbbHLH30的克隆引物

表2克隆体系

反应程序：98℃，30sec，52℃，5sec，72℃，1min，循环35次；72℃，1min；16℃，hold。

2.3.2目的片段回收

配制1％的琼脂糖凝胶，利用琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物，若条带正确参照MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit(Takara，大连)说明书对目的片段进行切胶回收。

(1)准备已灭菌的2mL离心管，称重空管质量。

(2)用干净的手术刀在紫外灯下切出含有目的片段的胶块，切碎胶块再放入2mL离心管中，称重计算胶块体积(以1mg＝1μL为标准)。

(3)向胶块中加入3倍凝胶体积的Buffer GM，室温溶解胶块，间断震荡混合。

(3)当凝胶完全溶解后加入终浓度为20％的异丙醇。

(4)将上一步溶液加入Spin Column吸附柱中，置于Collection Tube上，12000rpm离心1min，弃废液。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液Buffer WB，室温12000rpm，1min，弃废液；

(6)重复步骤(5)。

(6)空离12000rpm，1min。

(7)将吸附柱置于已灭菌的1.5mL离心管中，向吸附膜中加入30μL灭菌水(预先加热至65℃)，室温静置1min，12000rpm离心1min，将收集液置于-20℃保存。

2.3.3目的片段连接及转化

(1)连接：使用pEASY Blunt Zero载体(Transgene，

-Blunt ZeroCloning Kit)与目的基因进行连接，混合下列溶液，轻轻混匀，短暂离心。PCR：25℃，30min。

(2)转化：取Trans T1(Transgene，北京)大肠杆菌感受态，冰浴融化后，加入2μL上述连接产物，冰浴放置30min，42℃水浴热激30s，然后快速平稳地将离心管转移到冰浴中2min，加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃摇床200rpm培养1h。4000rpm 2min，去部分上清，留100μL菌液，重新将菌体吹打混匀，涂板于固体LB培养基(含50mg/L Kana)，37℃倒置培养12h。

(3)菌检：在板上挑取白色单菌落，加入500μL液体LB培养基(含50mg/L Kana)，37℃摇床200rpm培养3-5h。取1μL菌液作为模板进行PCR检测，引物为基因克隆引物，体系和程序如下。

反应程序为：94℃，5min；94℃，30sec，52℃，30sec，72℃，1min，循环35次；72℃，5min；16℃，hold。

(4)琼脂糖凝胶电泳检测菌液PCR产物，选取阳性克隆送往浙江有康生物科技有限公司测序。

(5)待SnapGene比对测序结果正确后，使用Transgene EasyPure PlasmidMiniPrep Kit提取质粒，利用得到的阳性质粒构建PbbHLH30基因的过表达载体。

2.4利用同源重组法构建过表达载体

根据

II One Step Cloning Kit进行同源重组法构建过表达载体。

(1)首先在目的基因特异性引物基础上加上含有pK2W7-eYGFPuv-3xFLAG接头序列，利用上步得到的阳性质粒为模板配制下列PCR体系(20μL)：

反应程序：98℃，30sec，54℃，5sec，72℃，1min，循环35次；72℃，5min；16℃，hold。

(2)保证产物为单一条带后，参照MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(Takara，大连)说明书对目的片段进行切胶回收。

(3)对过表达载体pK2W7-eYGFPuv-3xFLAG进行双酶切线性化，利用pK2W7-eYGFPuv-3xFLAG质粒为模板配置下列PCR体系：

反应程序：37℃，2h；16℃，hold。

(4)参照MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(Takara，大连)说明书对目的片段进行切胶回收。

(5)遗传转化过表达载体选用的是pK2W7-eYGFPuv-3xFLAG，构建PbbHLH30基因的过表达载体。配制下列混合溶液，25℃，过夜。

最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03 pmol)最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06 pmol)

反应程序：37℃，30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

(2)取2μL用于转化Trans T1(Transgene，北京)大肠杆菌感受态，然后挑单克隆用于菌液PCR检测，引物为基因克隆引物，PCR体系如下：

反应程序为：94℃，5min；94℃，30sec，52℃，30sec，72℃，1min，循环35次；72℃，5min；16℃，hold。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，转化至Trans T1(Transgene，北京)大肠杆菌感受态后选取阳性克隆送往浙江有康生物科技有限公司测序。提取测序结果正确的菌株质粒，待用。

2.5液氮法转化农杆菌

(1)取出-80℃中保存的农杆菌GV1301(唯地生物)，置冰上解冻；

(2)取0.5μg表达载体质粒，加至农杆菌感受态中，轻弹混匀后，分别依次置于冰上、液氮中、37℃水浴锅中、冰水混合物中各5min；

(3)向离心管中加入700μL不含任何抗性的新鲜LB液体培养基，将菌液置于摇床中(28℃，200rpm)震荡培养4-6h；

(4)离心(6000rpm，2min)，倒掉部分上清，使管中剩余液体体积70-100μL左右，吹打均匀；

(5)将菌液均匀涂于含有抗生素(50mg/L Kana及50mg/L Rif)的LB固体培养基上，于28℃生化培养箱中倒置培养48-72h；

(6)挑取板上的单克隆进行菌液PCR检测，引物为基因克隆引物，PCR体系如下：

反应程序为：94℃，5min；94℃，30sec，46℃，30sec，72℃，20sec，循环30次；72℃，5min；16℃，hold。

(7)对检测结果阳性的单克隆菌液加入同体积的50％甘油，保存于-80℃冰箱内。

2.6农杆菌介导转化烟草

2.6.1叶盘法转化烟草

取培养瓶内健壮烟草叶片，去掉主叶脉和叶片边缘不平部分，半叶切成三、四小片，伤口朝下放置在预培养基上暗培养两天。制备实施例1制备的含闽楠PbbHLH30过表达载体的农杆菌GV3101菌液，采用叶盘法侵染烟草叶片，28℃摇床内150rpm 20min；超净台内弃液体，叶片放置到滤纸上吸干表面水分，伤口朝下放置在共培养基上暗培三天。将共培养基上的叶片，伤口朝上放置在筛选培养基上，长出愈伤后切下放置在新的筛选培养基上继续培养。待长出小苗后，从基部切下，插在生根培养基上，一周左右生根；清洗根部培养基，可移栽土培，注意保湿两周。

2.6.2荧光定量PCR鉴定

对转基因烟草叶片采用M5 Plant RNeasy Complex Mini Kit提取总RNA，再使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，大连，中国)进行反转录cDNA。

采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京，中国)进行荧光定量PCR，仪器使用Bio-Rad CFX-96，配制20μL体系混合液：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10μL、Primer-F 0.4μL、Primer-R 0.4μL、50×ROX Reference Dye 1 0.4μL、cDNA 1μL和ddH₂O7.8μL；反应程序为：95℃30s；95℃10s，60℃30s，循环40次；65℃5s，95℃5min(按仪器类型设置溶解曲线)。荧光定量PCR所用引物见表3，选择U6作为内参基因。

表3荧光定量PCR引物

2.7转基因植物的花青素含量分析

将0.5克叶片研碎放入10毫升甲醇(含1％HCL)提取物中，摇匀，盖上盖子避光，超声处理1小时。离心后(5000rpm，10分钟)，上清液用于花青素含量测定。然后，吸出2毫升上清液，分别与8毫升氯酸钾-盐酸缓冲液(pH1.0)和醋酸钠-冰醋酸缓冲液(pH4.5)混合，将混合物在40度的暗室中孵育30分钟。使用紫外可见分光光度计(Thermo Scientific Co.,Ltd,USA)在520纳米处测量混合物上清液的吸光度，测量花青素含量，在700纳米处测量校正。所有的吸光度测量是在室温下进行的，以蒸馏水作为空白对照。

获得吸光度根据公式计算花青素含量：

ΔA＝(A₅₂₀－A₇₀₀)Ph4.5－(A₅₂₀－A₇₀₀)Ph1

花青素含量(mg·100g^-1)＝ΔA·M·DF·V·100/m·ε·LM：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2g·moL^-1；

DF：稀释因子；取1ml至10ml容量瓶，DF＝10V：提取液总体积，mL；

m：重量，g；

ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900L·mol^-1·cm^-1；

L：光程，1cm。

3.实验结果

3.1闽楠的叶片总RNA提取分析

采用M5 Plant RNeasy Complex Mini Kit提取闽楠总RNA(图1)，并通过紫外分光光度计测定所提RNA的OD260/280比值均在1.8-2.1之间，说明总RNA纯度较好；琼脂糖凝胶电泳结果则显示RNA样品的18s和28s两条带非常清晰，可推断RNA没有降解，符合下步实验的要求。

3.2闽楠PbbHLH30序列的克隆及载体构建

通过高保真酶PCR扩增方法从闽楠cDNA中扩增PbbHLH30，得到一条2127bp片段(图2)，将扩增片段连接到过表达载体pK2W7-eYGFPuv-3xFLAG后转化大肠杆菌，经浙江有康生物科技有限公司测序，序列完全正确，选择其中一个克隆提取质粒后转化农杆菌，再转化烟草。

3.3烟草转基因阳性株筛选

闽楠PbbHLH30基因转化烟草后经PCR鉴定后得到转基因植株(图3)，运用荧光定量PCR检测转基因植株中PbbHLH30表达水平(图4)，表明表达量为4.32倍。

3.4转基因烟草花青素含量测定

PbbHLH30过表达植株的叶片中的花青素含量显著高于野生型和空载(图5)，暗示植物花青素生物合成途径结构基因被PbbHLH30调控，促进了烟草花青素的积累。综上所述，过表达闽楠PbbHLH30基因可显著提高烟草花青素含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.闽楠PbbHLH30蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的闽楠PbbHLH30蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在提高植物积累花青素中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提高植物积累花青素。

9.一种提高植物积累花青素的方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的转基因植株过表达所述基因。

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