CN106699855A - 一种蛋白质及其分离方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白质及其分离方法与应用，该蛋白质选自：i.由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ii.与i类蛋白同源的蛋白；iii.i类蛋白的衍生蛋白；其分离方法包括(1)芸香科植物果实总蛋白的提取；(2)总蛋白的再次提取；(3)目标蛋白的粗提取。本发明首次分离出了芸香科植物中能够引起人体“上火”等炎症的蛋白质；该分离方法得到的最终精提取物，纯度高，利用该精提取物可以准确得出引起炎症的蛋白的氨基酸序列；另外，利用本方法中的精提取物或者中间粗提取物能够对芸香科植物果实是否具有引起炎症的效果进行定量判断，实用性好。

Description

一种蛋白质及其分离方法与应用

技术领域

本发明属于植物蛋白分离技术领域，更具体地，涉及一种蛋白质及其分离方法与应用，该蛋白质(即Citsh1蛋白)分离提取自温州蜜柑，是能够诱导人体“上火”等炎症反应的蛋白质。本发明利用葡聚糖凝胶和反向色谱分离的方法分离温州蜜柑果肉中的总蛋白，通过不同提取物对巨噬细胞系RAW 264.7的处理，确定最终炎症因子环氧合酶2的转录水平变化，从而对分离后的产物进行筛选和功能验证。

背景技术

温州蜜柑(C.unshiu Marcov.satsuma)原产中国浙江温州，具有“色艳、形美、果大、皮薄、无核、汁多”的优点，是鲜食、加工两用的优良品种(乔勇进,王海宏et al.2007)。同时温州蜜柑广泛的栽培也是大家喜爱的水果之一(Nelson,Campbell et al.2008)。温州蜜柑的果实含有大量的营养，尽管如此食用过量的温州蜜柑会导致“上火”现象，如食欲不振、舌炎、牙周炎、咽喉炎等导致机体紊乱。粉刺、小脓包、痔疮还有流鼻血都被认为与过度消费“上火”食物有关(Koo 1984)。曾有报道指出7个经常喝大量橘汁的人容易口腔溃疡(Hicks 1950)。

可以说“上火”没有一个特异性的生理指标，应属于一种失去体内内环境稳定状态的身心疲劳综合症，并且“上火”与机体神经-内分泌-免疫系统有关系(何蓉蓉与栗原博2008)。根据中国传统的阴阳学说，人身体的健康被认为是阴阳的平衡，表现在“上火”和“降火”食物之间的平衡(Ludman and Newman 1984)。“火”者，其性“炎”上(苗连绪与潘静2009)。通过这样可以将传统的中医“上火”概念和西方医学中炎症的概念联系在一起。所谓的炎症就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于外界刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛、功能障碍等应激反应。任何能够引起组织损伤的因素都可成为引发炎症的原因，即致炎因子，而致炎因子的发生又会导致炎症因子的上调表达。因此检测炎症发生的效果便可以通过检测炎症因子含量的变化来判断。习惯上我们将一些含有热量高，糖分高的水果称为热性水果，这些热性水果的粗提物来研究其可能的抗炎和引起炎症的效果(Huang and Wu 2002)。

尽管现有技术中已有对易引起人体上火反应的植物及其提取物的相关研究，但这些提取方法得到的提取物纯度不高，人们无法利用这些提取物得到准确的具体蛋白序列；另一方面，这些提取方法能够针对的植物也较为有限，以芸香科植物为例，芸香科植物的果实是国内消费普遍的水果之一，但芸香科植物由于其自身的特点，如果肉细胞中存在大量次生代谢物、糖、蛋白酶等物质，蛋白质相对含量较低。这些不利的因素都会导致蛋白质的提取效率较低。此外，由于不同的芸香科植物(如橘、柑、柚、橙、柠檬等)其引起炎症的效果不同，目前除了根据经验定性判断外，缺乏科学定量判断其引起炎症效果的手段。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种蛋白质及其分离方法与应用，其中通过对蛋白质分离方法中的手段及使用的参量(如使用的各种试剂的配比、含量，分离过程的操作等)进行改进，与现有技术相比，首次分离出了芸香科植物中能够引起人体“上火”等炎症的蛋白质；并且，该分离方法得到的最终精提取物，纯度高，利用该精提取物可以准确得出引起炎症的蛋白的氨基酸序列；另外，利用本方法中的精提取物或者中间粗提取物能够对芸香科植物果实是否具有引起炎症的效果进行定量判断，实用性好。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自：

i.由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

ii.与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；

iii.SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。

作为本发明的进一步优选，该蛋白质提取自芸香科植物，并且会导致上火。

按照本发明的另一方面，提供了一种蛋白质的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)芸香科植物果实预处理：

首先将芸香科植物果实榨汁，将得到的果汁用纱布过滤得到滤液；然后，将所述滤液冷冻干燥得到固体粉末；

(2)将所述步骤(1)得到的固体粉末通过酚提取法再次提取总蛋白得到蛋白粉末；接着，利用凝胶色谱柱法分离所述蛋白粉末得到目标蛋白的粗提取粉末，其中粗提取得到的目标蛋白粉末是收集第114分钟～第147分钟凝胶色谱柱分离液得到的。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)具体包括以下步骤：

(2-1)总蛋白的再次提取：在0℃下向5～7mL的酚提取缓冲液中加入5g所述步骤(1)中得到的固体粉末，配制所述酚提取缓冲液的原料包括蔗糖、EDTA、PMSF、DTT、Triton X-100和pH值为7.5的Tris-HCl，该酚提取缓冲液中Tris的浓度为20mmol/L，蔗糖的浓度为250mmol/L，EDTA的浓度为10mmol/L，PMSF的浓度为1mmol/L，DTT的浓度为1mmol/L，Triton X-100的质量百分浓度为1％；接着再向其中加入5mL饱和酚溶液，混合后离心处理，得到水相上层、白色杂质中间层以及酚层下层；然后，回收该酚层下层作为收集液，接着向该收集液中加入4倍～5倍体积醋酸胺浓度为0.1mol/L的甲醇溶液，并在-20℃下静置12h，得到蛋白沉淀；然后将该沉淀用丙酮清洗后干燥得到蛋白粉末；

(2-2)目标蛋白的粗提取：将所述步骤(2-1)中的蛋白粉末配制成浓度为5mg/mL的蛋白水溶液，取8mL所述蛋白水溶液作为试样；接着，利用凝胶色谱柱分离该蛋白水溶液试样，控制流速为1mL/min，然后按时间依次收集100管层析液，每管收集3min，其中第38管～第49管层析液冷冻干燥即得到目标蛋白的粗提取粉末。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)还包括步骤(2-3)目标蛋白的精提取：

将所述步骤(2-2)得到的目标蛋白粗提取粉末配制成100μL浓度为10mg/mL的上样液；然后，通过高效液相色谱法利用流动相分离该上样液并按时间依次收集分离液，所述流动相是由浓度为0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液和浓度为0.1％的三氟乙酸的水溶液按体积比10:90配制而成；具体是将所述上样液溶解在所述流动相中，并通过半制备型COSMOIL C18的柱子，该柱子的温度为30℃；接着，将其中第4.5分钟～第5.0分钟收集到的所述分离液透析去除其中的流动相和无机盐，然后冷冻干燥浓缩即得到目标蛋白的精提取粉末。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中芸香科植物果实为果肉，该果肉是将所述芸香科植物果实去皮，并剥掉果肉外的白皮层得到的。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2-2)中的凝胶色谱柱填料采用Sephadex G-200。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2-3)中的所述三氟乙酸的乙腈溶液和所述三氟乙酸的水溶液均经过0.22μm滤膜过滤除菌。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2-2)得到的目标蛋白的粗提取粉末或所述步骤(2-3)得到的目标蛋白的精提取粉末包含有如权利要求1或2所述的蛋白质。

按照本发明的另一方面，提供了一种上述蛋白质分离方法在上火鉴定的应用，其特征在于，根据所述蛋白质分离方法得到的目标蛋白的粗提取粉末或者精提取粉末判断所述芸香科植物果实是否具有引起上火的蛋白质。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比具有以下有益效果：

1.本发明首次分离出了芸香科植物中能够引起人体“上火”等炎症的蛋白质，其氨基酸序列包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示序列，以及由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2序列组成蛋白质的同源蛋白质以及衍生蛋白质。芸香科植物的上火鉴别一直困扰着芸香科植物的食用，传统方法往往是通过人为经验进行判定，并未准确得出与芸香科植物相关上火性状对应的具体蛋白序列。本发明中，利用该蛋白质(即炎症蛋白Citsh1)，人们可进一步开发针对该蛋白质的分子标记或检测试剂盒，对待检测物体内是否含有该蛋白质进行检测，从而能够为例如敏感人群提供过敏源警示提醒。

2.本发明中上述蛋白的分离方法，是采用酚提法总蛋白质提取、自制凝胶色谱分离和液相色谱分离对芸香科植物果实中的蛋白进行分离纯化，成功获得了在芸香科植物中诱发人体“上火”反应的蛋白。本发明通过对该分离方法步骤中的使用各种试剂的配比、浓度以及含量，分离过程的操作细节等进行改进(例如，在总蛋白的提取过程中采用透析的方法消除柑橘汁中多余糖分的影响)，有效的确保了分离得到产物的纯度。目标蛋白的精提取物经质谱鉴定确定为芸香科植物中能够诱导炎症的蛋白Citsh1(能够引起例如人体的上火反应)，并确定了该蛋白Citsh1的氨基酸序列。

另外，本发明的分离方法优选采用的最初级原料为芸香科植物的果实，这主要是由于在日常生活中人们往往食用果实部位，果实部位该Citsh1蛋白的含量对是否诱导人体的炎症更具实际应用意义。由于橘瓤上面的白色网状丝络(称作“橘络”)，具有通络、化痰、降火、消滞等功效且含有一定量的维生素P，会为“上火”目标蛋白的提取造成干扰，因此本发明的柑橘果实预处理中将白皮层首先去除。

3.本发明中上述蛋白的分离方法，能够得到目标蛋白的粗提取物或者精提取物，尤其是针对芸香科植物，既保证了分离操作的效率，又确保了提取物(尤其是精提取物)的纯度。本发明中的粗提取物除了包含有目标蛋白(即炎症蛋白Citsh1)外，还有其他蛋白，基于该粗提取物就能快速判断待检测物中是否含有目标蛋白，从而对芸香科植物果实是否具有引起炎症的效果进行定性或初步定量判断；本发明中的精提取物主要成分就是Citsh1目标蛋白，利用该精提取物就可对芸香科植物果实是否具有引起炎症的效果进行定量判断；基于该目标蛋白的精提取物，就可得到Citsh1蛋白的氨基酸序列。

附图说明

图1是本发明分离提取温州柑橘果肉中总蛋白流程图；

图2是自制凝胶色谱柱图，该凝胶色谱采用填料是葡聚糖SephadexG-200、取2.6×100cm的层析柱一根，最后层析柱装柱的体积为(2.6×80cm)。上样样品是温州蜜柑总蛋白，浓度为5mg/mL，体积是8mL；流速是1mL/min，每管收集3min，共收集100管。测定每一管在280nm下的吸光度值(即OD值)，并将OD值连接做成曲线。样品在管2-7，38-49，64-67有较强的吸收值，对应收集管中的液体并分别命名为C1、C2和C3；

图3是收集C2，浓缩并采用HPLC进一步分离的结果；HPLC液相色谱的条件如下：流动相为0.05％三氟乙酸的乙腈溶液：0.1％三氟乙酸的水溶液按体积比10:90混合配制而成，柱温箱温度是30℃，检测波长是215nm(采用DAD检测器)，半制备型C18柱子(COSMOSIL PACKED COLUMN5C18-MS SIZE 10I D×250mm)，样品上样量是100μL，样品浓度是10mg/mL。C2通过液相色谱的分离后在215nm下共得到4个吸光峰值，共对应的分离液分别命名为C2.1、C2.2、C2.3和C2.4；

图4是不同处理下环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)转录水平的表达；图中所致的不同处理分别是正常对照、脂多糖(LPS)阳性对照、以及C2.1、C2.2、C2.3和C2.4四个分离液处理巨噬细胞RAW 264.7细胞系，从而比较炎症因子COX-2的表达；

图5为收集的C2.3分离液进行HPLC纯度的检测，其中图5A在相同液相色谱的参数条件下得到色谱图，保留时间4.730min，选择峰上的3个不同的区域(即波峰以及1/2波峰区域)，利用DAD检测器对进行全波长(190-400nm)的扫描，结果如图5B所示；图5B中上述不同区域得到的吸收波长相重合，表明该物质的单一；

图6是利用MALDI-TOF/TOF检测C2.3的肽段的流程图，以及Cs8g14040.3及Cs8g14040.3的基因结构和结构域模型；

图7是温州蜜柑和甜橙基因的核苷酸和蛋白质差异(分别为图7A和图7B)，其中温州蜜柑中诱发“上火”的蛋白即Citsh1。温州蜜柑和甜橙差异的3个碱基分别是22(G/A)、60(C/A)和94(G/A)，3个氨基酸序列分别是8(A/T)、20(S/R)和32(V/I)，其他位置(用*标注)均为一致的序列。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1分离纯化温州蜜柑中诱导“上火”物质

1.提取温州蜜柑果肉中的总蛋白

如图1所示，采摘新鲜的温州蜜柑果实，人工去皮后剥掉果肉外的白皮层。匀浆机将果肉榨汁，采用4层纱布过滤以除去汁胞等脂溶性部分和其他杂质，收集滤液并离心(5000rpm、15min、4℃)除去残留的滤渣。收集后的上清液放于冷冻干燥机中，冷冻干燥得到固体粉末，在超低温冰箱中长期保存。

称取5g粉末样品，加入5mL～7mL的蛋白提取缓冲液(其中含有250mM蔗糖、20mM Tris、10mM EGTA、1mM PMSF、1mM DTT、1％的TritonX-100和pH＝7.5的Tris-HCl)冰上震荡摇匀10min，充分振荡20min使其混合均匀，整个过程在冰上操作。后离心(5000rpm、20min、4℃)，上层为水相、中间的白色物质是杂质、下层是酚层(蛋白质溶解在其中)。回收酚层，再加入4倍～5倍所述酚相体积的甲醇溶液(该甲醇溶液含有0.1mol/L醋酸胺)于-20℃过夜使蛋白沉淀。预冷的丙酮洗2次于4℃下干燥保存。

2.自制凝胶色谱柱分离果肉总蛋白

取Sephadex G-20025g，加500mL蒸馏水后在沸水浴中溶胀5h。待溶胀完全后，倾去上层细颗粒，然后再加入蒸馏水进行微微搅拌防止葡聚糖颗粒结构破碎，静置使凝胶颗粒沉于烧杯底部，再倾去溶液上方细小颗粒，重复数次至无细颗粒为止，即可用来装层析柱。

取2.6×100cm层析柱一根，保持底部密封。将层析柱垂直至于稳定铁架上保持固定，然后通过玻璃棒引流在柱中加水冲稀检查是否有堵塞。确定好后加入洗脱液(50mM Tris PH＝7.9,0.5mM EDTA,50mM NaCl)。洗脱液配制方法：称取6.057gTris碱，加800ml纯水，在称取0.186g EDTA，2.922NaCl溶解后，用浓盐酸调节pH值到7.9，然后再定容到1L。将层析柱的下方出口关闭。待洗脱液的体积达到柱体积的1/3时，把已经溶胀好的葡聚糖凝胶搅拌均匀，在通过玻璃棒引流从烧杯中倒入柱内，胶粒逐渐扩散下沉，连续加入。确定层析柱粗细必须均匀，没有气泡没有明显分层。不停敲击层析柱以确定填料其均匀一致。当沉积的凝胶物质达到约70cm高时，打开柱的出口，并注意控制压力以均匀不变的流速直到胶装完为止。层析柱装好后，在层析柱中填料的上面放置一张略小于柱内径的滤纸以防止样品中一些不溶物质污染凝胶。再加入洗脱液平衡柱层，直至层析的胶床高不变为止。

整个过程中应保持整个装置的稳定性。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距层析柱表面1～2mm时，关闭出口，用滴管将温州蜜柑总蛋白溶液(浓度为5mg/mL)慢慢地加至填料表面，打开出口加入8mL后完全进入凝胶中时关闭出口，同时沿着层析柱内壁加入少量洗脱液，再打开柱的出口。这时样品已加好，在床的表面再小心地加洗脱液，使高出床表面3～5cm，接上恒流泵和确定充足的洗脱液开始进行凝胶色谱分离。待层析开始，在柱的出口处以试管分管收集流出液，共收集100管，流速是1mL/min，每管收集3min，测定收集液在分光光度计280nm处其OD值，如图2所示。2-7，38-49，64-67有较强的吸收值，分别命名为C1、C2和C3，其中第38管至第49管即对应第114分钟～第147分钟得到的分离液。

3.HPLC(高效液相色谱法)进一步分离C2并鉴定

冷冻干燥收集的C2后溶于水，配制成100μL浓度为10mg/mL的上样液。分别配置0.05％三氟乙酸的乙腈溶液和0.1％三氟乙酸的水溶液，并利用0.22μm滤膜过滤除菌。液相色谱的条件如下：流动相是0.05％三氟乙酸的乙腈溶液和0.1％三氟乙酸的水溶液按体积比10:90混合配制而成；将样品溶解在流动相溶液中，DAD检测器检测波长215nm；样品的进样体积是100μL，柱温为30℃，柱子类型是半制备型COSMOIL C18。通过分离得到4种分离液，分别命名为C2.1、C2.2、C2.3和C2.4，如图3所示。

实施例2确定分离物质是否引发炎症现象

透析除去无机盐后，将4种分离液于冷冻干燥机浓缩得到固体粉末。将粉末溶解于不含血清的DMEM培养基(Hyclone)中处理巨噬细胞系RAW264.7。将细胞传代于24孔板上，待贴壁生长1天后，加入不同的处理，这些处理分别是空白对照组，即含有血清的培养基DMEM；阳性对照，即1μg/mL的LPS处理组；然后是10mg/mL的C2.1、C2.2、C2.3和C2.4。保持生长约18h后，采用Trizol试剂提取处理后细胞的RNA。通过real-timePCR方法检测炎症因子环氧合酶-2转录水平的上调表达，脂多糖LPS能够显著诱发COX-2的表达。C2.1、C2.2、C2.3和C2.4导致细胞产生COX-2的表达量分别是正常处理的12.27倍、4.05倍、42.05倍和20.27倍。通过相对定量的数据，C2.3是主要诱发炎症发生的蛋白质，用来进一步鉴定。

使用引物列举如下：

COX-2 F(5′-GAAGTCTTTGGTCTGGTGCCTG-3′)

COX-2 R(5′-GTCTGCTGGTTTGGAATAGTTGC-3′)；

β-actin F(5′-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3′)

β-actin R(5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′)。

关于巨噬细胞和环氧合酶2与炎症的关系，已有现有技术对其进行了阐述。巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用，它通过激活机体的免疫系统，释放细胞因子具有生物活性的脂介质及活性氧等一系列炎症介质参与炎症反应。因此选用RAW 264.7细胞系，此细胞株是来源于小鼠腹腔中经永生化的巨噬细胞株，可以进行稳定的传代培养，是小鼠巨噬细胞培养的良好模型。环氧合酶2(COX-2)是诱导型氧化酶，在生理正常状况下，绝大部分组织细胞中不表达，但可为多种刺激所诱导，是PGE₂的重要关键酶(Huang and Wu 2002)。COX-2作为诱导酶，与人类许多疾病的病理过程相联系，也是许多新型非甾体抗炎药物的主要作用靶点。一些“上火”水果如荔枝和龙眼的提取物都可以在RAW 264.7细胞系中提高环氧合酶2蛋白质的表达(Huang and Wu 2002)。而“降火”食物的提取物又可以在同样的细胞系中降低环氧合酶2的含量(Ho and Tsai 2004)。本实施例也是通过提取温州蜜柑果实物质对巨噬细胞系的不同处理来检测环氧合酶2的变化从而验证能够诱发“上火”的物质。

实施例3利用质谱确定蛋白质肽段

收集C2.3，进行鉴定。首先收集C2.3并进行HPLC纯度的检测。参数条件：流动相为0.05％三氟乙酸的乙腈溶液和0.1％三氟乙酸的水溶液按体积比10:90配制而成；柱温箱温度是30℃；C18柱子的型号是COSMOSILPACKED COLUMN 5C18-MS SIZE 10I D×250mm；仪器：dionex Ultimate3000。DAD检测器(即光电二极管矩阵检测器)全波长扫描检测纯度。最后经胶内酶解Trypsin处理20h、抽提肽段、Ziptip脱盐处理后使用MALDI-TOF/TOF质谱检测分离得到的能够引发“炎症”的物质，确定了其肽段。

使用MALDI-TOF/TOF检测鉴定分离的物质确定的肽段如下：1)

MALNLSSTSSIACSNLQFNR；2)KLNLQIKCESK；3)

MIKTAASVPCLRANSGLVKPGDVGR。根据甜橙全基因组数据库

(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/gb2/gbrowse/orange/)中寻找匹配基因为Cs8g14040.3，后设计引物序列是F(5′-ATGGCACTGAACCTCTCTT-3′)和R(5′-TTGATTCTCACAGACAACAGC-3′)扩增得到温州蜜柑中引起“上火”的物质即Citsh1。图6所示为温州蜜柑基因Citsh1的DNA结构，基因全长972bp，编码序列在183-444、606-711bp处，内含子长161bp，序列在445-605bp处；图7为甜橙与温州蜜柑中Citsh1的核酸和氨基酸序列差异图。

上述实施例1～3对应Citsh1蛋白分离、功能验证和鉴定的实验过程，本发明采用酚提法总蛋白质提取、自制凝胶色谱分离和液相色谱分离对芸香科植物果实中的蛋白进行分离纯化，成功获得了在芸香科植物中诱发人体“上火”反应的蛋白(即Citsh1)。本发明分离方法的产物(包括目标蛋白的粗提取物以及精提取物)具有良好的纯度(如图2、3所示)，该分离方法除了能够单纯的分离纯化获得Citsh1蛋白外，还可用于对其他芸香科植物进行蛋白分离，从而对这些芸香科植物是否具有引起炎症的效果进行定性或半定量判断，具有良好的应用前景。

凝胶过滤层析因其操作简便、操作条件温和，不易引起生物样品变性失活，能够保持蛋白质的活性，且分离效果好，本方法中首先使用葡聚糖凝胶G-200进行凝胶过滤层析作为粗分离的过程；反相色谱以疏水作用(主要是C18充当固定相)为基础、基于相似相溶原理色谱分离，具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点，本方法中采用RPLC对提取物进一步的细化分离，使用不同的检测器波长可以同时纯化分离蛋白质并检测蛋白质的纯度。

本发明中的芸香科植物，既包括柑橘属植物(如橘、柑、柚、橙、柠檬等)，也包括其他常见柑橘类植物(如枳、金橘等)。本发明提供的序列表中，SEQ ID NO:1为温州蜜柑中相关目标蛋白的氨基酸序列(该目标蛋白能够诱发上火反应)，SEQ ID NO:2为甜柑中相关目标蛋白的氨基酸序列(该目标蛋白不引起上火反应)；SEQ ID NO:3为温州蜜柑中相关目标蛋白对应的DNA碱基序列，SEQ ID NO:4为甜橙中相关目标蛋白对应的DNA碱基序列。本发明中的“上火”即指炎症反应，也是说，当利用本发明的蛋白质分离方法对某一芸香科植物进行目标蛋白的提取时，若分离出了本发明对应的蛋白，则该芸香科植物能够引起人体上火，即人体的炎症反应；若分离后未得到本发明对应的蛋白，则该芸香科植物不会引起人体上火。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自：

i.由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

ii.与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；

iii.SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质提取自芸香科植物，并且会导致上火。

3.一种蛋白质的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)芸香科植物果实预处理：

首先将芸香科植物果实榨汁，将得到的果汁用纱布过滤得到滤液；然后，将所述滤液冷冻干燥得到固体粉末；

(2)将所述步骤(1)得到的固体粉末通过酚提取法再次提取总蛋白得到蛋白粉末；接着，利用凝胶色谱柱法分离所述蛋白粉末得到目标蛋白的粗提取粉末，其中粗提取得到的目标蛋白粉末是收集第114分钟～第147分钟凝胶色谱柱分离液得到的。

4.如权利要求3所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下步骤：

(2-1)总蛋白的再次提取：在0℃下向5～7mL的酚提取缓冲液中加入5g所述步骤(1)中得到的固体粉末，配制所述酚提取缓冲液的原料包括蔗糖、EDTA、PMSF、DTT、Triton X-100和pH值为7.5的Tris-HCl，该酚提取缓冲液中Tris的浓度为20mmol/L，蔗糖的浓度为250mmol/L，EDTA的浓度为10mmol/L，PMSF的浓度为1mmol/L，DTT的浓度为1mmol/L，Triton X-100的质量百分浓度为1％；接着再向其中加入5mL饱和酚溶液，混合后离心处理，得到水相上层、白色杂质中间层以及酚层下层；然后，回收该酚层下层作为收集液，接着向该收集液中加入4倍～5倍体积醋酸胺浓度为0.1mol/L的甲醇溶液，并在-20℃下静置12h，得到蛋白沉淀；然后将该沉淀用丙酮清洗后干燥得到蛋白粉末；

(2-2)目标蛋白的粗提取：将所述步骤(2-1)中的蛋白粉末配制成浓度为5mg/mL的蛋白水溶液，取8mL所述蛋白水溶液作为试样；接着，利用凝胶色谱柱分离该蛋白水溶液试样，控制流速为1mL/min，然后按时间依次收集100管层析液，每管收集3min，其中第38管～第49管层析液冷冻干燥即得到目标蛋白的粗提取粉末。

5.如权利要求4所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括步骤(2-3)目标蛋白的精提取：

将所述步骤(2-2)得到的目标蛋白粗提取粉末配制成100μL浓度为10mg/mL的上样液；然后，通过高效液相色谱法利用流动相分离该上样液并按时间依次收集分离液，所述流动相是由浓度为0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液和浓度为0.1％的三氟乙酸的水溶液按体积比10:90配制而成；具体是将所述上样液溶解在所述流动相中，并通过半制备型COSMOIL C18的柱子，该柱子的温度为30℃；接着，将其中第4.5分钟～第5.0分钟收集到的所述分离液透析去除其中的流动相和无机盐，然后冷冻干燥浓缩即得到目标蛋白的精提取粉末。

6.如权利要求3所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中芸香科植物果实为果肉，该果肉是将所述芸香科植物果实去皮，并剥掉果肉外的白皮层得到的。

7.如权利要求3所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2-2)中的凝胶色谱柱填料采用Sephadex G-200。

8.如权利要求5-6任意一项所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2-3)中的所述三氟乙酸的乙腈溶液和所述三氟乙酸的水溶液均经过0.22μm滤膜过滤除菌。

9.如权利要求3-8任意一项所述蛋白质的分离方法，其特征在于，所述步骤(2-2)得到的目标蛋白的粗提取粉末或所述步骤(2-3)得到的目标蛋白的精提取粉末包含有如权利要求1或2所述的蛋白质。

10.如权利要求3-9任意一项所述蛋白质分离方法在上火鉴定的应用，其特征在于，根据所述蛋白质分离方法得到的目标蛋白的粗提取粉末或者精提取粉末判断所述芸香科植物果实是否具有引起上火的蛋白质。