CN113637701B - 一种菰米遗传转化体系建立的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域。受限于菰米胚性愈伤的培养以及再生效率的低下，菰米的遗传转化体系迟迟未能建立。本发明一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。

Description

一种菰米遗传转化体系建立的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种菰米遗传转化体系建立的方法。
背景技术
中国菰(Zizania latifolia)起源于中国，分布于日本、韩国、印度和东南亚中南半岛国家。除西藏外，中国各地尤其是长江流域的河流、湖泊、沟渠、池塘、稻田周围中都有中国菰的分布。菰米(wild rice)是中国菰的颖果，它在我国作为粮食食用已经有3 000多年的历史，在古代是供帝王食用的重要的“六谷”(稻、黍、稷、粱、麦、菰)之一。唐代之后，随着人口数量的大幅度增长、围湖造田等各种农事活动增多，以及水稻种植技术的推广，再加上菰米采收和脱壳较为困难，菰米渐渐淡出人们的视线。随后，菰米逐渐作为中药材使用，明代李时珍《本草纲目》等著作有将菰米用于治疗消渴症(糖尿病)和胃肠疾病的记载。菰米由于较高的营养价值以及独特的风味，开始广泛出现在餐桌、商店里，受到越来越多人的欢迎。
目前，中国菰的生物活性和保健作用已被中国和韩国等东亚科学家广泛关注。菰米已经证实的生物活性和保健价值包括抗氧化活性、改善胰岛素抵抗、改善脂质毒性以及预防心血管疾病等。菰属植物营养成分的研究主要集中在其种子即菰米当中，菰米不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，而且含有大量的抗性淀粉、膳食纤维、植物甾醇、花青素和原花青素等生物活性物质。与北美菰米相比，中国菰米的长度和直径更小。与大米相比，菰米是一种高蛋白、低脂的健康食品。
菰米自身也有一些局限性，比如含有落粒基因，导致成熟的种子容易落粒等特征，不适用于大规模生产应用。因此，对于菰米相关基因的功能研究显得尤其重要，对于菰米的基因工程相关的技术和研究急待突破。然而，一直受限于菰米胚性愈伤的培养以及再生效率的低下，菰米的遗传转化体系迟迟未能建立。
发明内容
针对目前农杆菌介导的菰米遗传转化体系尚未建立的上述问题，本发明提供一种菰米遗传转化体系建立的方法。本发明中，一方面通过优化菰米胚性愈伤的培养条件和培养方式以及优化愈伤再生的培养基，极大程度地提高菰米愈伤的再生效率，为农杆菌侵染提供优质的胚性愈伤受体材料，为转化奠定坚实的基础；另一方面通过实验探究优化转化过程中的处理方式和培养条件，得到转化阳性株系，顺利建立稳定的农杆菌介导的菰米遗传转化体系。
本发明是这样实现的，菰米遗传转化体系建立的方法，包括以下步骤：
1)诱导培养：将成熟菰米种子在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在愈伤诱导培养基上继代培养，挑选状态良好的愈伤组织转至愈伤诱导培养基上预培养；
2)农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，用重悬液重悬稀释农杆菌获得OD660值0.2-0.4的农杆菌菌液；
3)农杆菌菌液的侵染：将步骤1)中经过预培养的愈伤组织浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染15-25min；
4)愈伤组织的恢复培养和筛选：将步骤3)中侵染后的愈伤颗粒进行共培养，共培养的条件：一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入终浓度为15-25mg/L的乙酰丁香酮的农杆菌重悬液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的农杆菌菌液后均匀分散在共培养介质上，20-28℃黑暗培养2-4d；共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地散布于恢复培养基中，25-35℃光照培养3-6d，光照周期为16h光照/8h黑暗；恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，培养条件为：25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；
5)愈伤组织再生：将4)所得愈伤颗粒在培养基上筛选3-4周之后，转至再生培养基上，25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；苗生长至长度2-5cm，移至生根培养基上，25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
所述步骤1)愈伤组织诱导培养的条件优选为：光培养，光强4000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，温度25-35℃，培养3周后，得胚性愈伤组织。
诱导培养基的2,4-D的终浓度为2mg/L。
农杆菌菌种优选为EHA105；优选28℃黑暗培养24h进行第一次活化，然后将活化的农杆菌接种至新鲜的农杆菌活化培养基上，28℃黑暗培养过夜进行二次活化。优选每升接种培养基中加入1毫升终浓度20mg/mL的乙酰丁香酮储存液，分装于50mL灭菌离心管中，每管25mL作为重悬液。
所述侵染时农杆菌菌液的OD660值最优为0.3，愈伤颗粒侵染时间最优为20min。OD660为0.3的菌液浓度适合后续转化子的筛选，抗性愈伤率更高，且少褐化。过高或过低浓度的菌液都不利于后续转化子的筛选，浓度过低会导致转化效率的降低，而浓度过高则会引起农杆菌过度生长，导致愈伤褐化。
共培养的培养基含终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮，23℃黑暗共培养3d。共培养过程的干燥处理，可以降低共培养过程中的水分含量，起到增加细胞接触和抑制细菌生长的效果，但是又不能太过于干燥，将抑制愈伤的生长。
恢复培养的条件优选：30℃光照培养5d，光照周期为16h光照/8h黑暗。
筛选培养的条件优选：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
再生培养的条件优选：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
生根培养的条件优选：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
愈伤诱导培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4-D终浓度1mg/mL，2mL；蔗糖30g；植物凝胶3g。
YP:乙酰丁香酮农杆菌活化培养基的配方为：酵母提取物10g；蛋白胨10g；NaCl50g；卡那霉素终浓度50mg/mL，1mL；利福平终浓度10mg/mL，1.5mL；乙酰丁香酮终浓度20mg/mL，1mL；琼脂12g。
农杆菌重悬液的配方为：每升含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.5g；2,4-D，1mg/mL 2mL；蔗糖20g；葡萄糖10g；乙酰丁香酮终浓度20mg/mL，1mL。
恢复培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4-D终浓度1mg/mL，2mL；羧苄青霉素终浓度250mg/mL，1mL；蔗糖30g；植物凝胶3g。
筛选培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；蔗糖30g；2,4-D终浓度1mg/mL，2mL；羧苄青霉素终浓度250mg/mL，1mL；Hyg-B终浓度50mg/mL，1.4mL；植物凝胶3g。
分化培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；维生素B5，100X10mL；铁盐100X10mL；CuSO4，5mg/mL，0.5mL；MES 0.5g；水解酪蛋白1g；蔗糖30g；山梨醇30g；羧苄青霉素终浓度250mg/mL，0.5mL；Hyg-B终浓度50mg/mL，0.4mL；NAA终浓度1mg/mL，0.5mL；6-BA终浓度1mg/mL，0.5mL；TDZ终浓度1mg/mL，1mL；氨基酸10X100mL；植物凝胶2.8g。
生根培养基的配方为：每升培养基含MS盐2.165g；维生素B5，100X10mL；蔗糖20g；羧苄青霉素终浓度250mg/mL，0.5mL；NAA终浓度1mg/mL，0.4mL；植物凝胶3.5g。
以提取转化植株叶片DNA样品作为模板，以筛选标记HPT基因为引物进行PCR扩增，将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，确定转化阳性植株，将其产物测序对比。
本发明具有以下有益效果：
愈伤组织的结构和状态对转化效率至关重要，本发明合理控制愈伤生长的条件，16h光/8h暗培养有利于维管组织的形成，而维管组织有利于养分的输导，从而使愈伤的状态更加饱满，此外，本发明在愈伤培养过程中1-2次的继代培养有利于愈伤的生长和增殖；本发明优化了愈伤再生培养基，提高了愈伤的再生效率，为转化打下坚实的基础；农杆菌的数量和状态是影响转化的重要因素，本发明采用OD660为0.3的菌液浓度，利于转化的进行；本发明采用一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入含乙酰丁香酮的农杆菌重悬培养基对侵染后的愈伤颗粒进行共培养有效提高了转化频率；本发明中所用的外植体取材方便，保存的成熟种子，随时取用，不受季节限制。
附图说明
图1为实施例不同2,4-D浓度下愈伤的状态图；
图2为实施例菰米愈伤组织恢复图；
图3为实施例菰米愈伤增殖图；
图4为实施例菰米愈伤分化长芽图；
图5为实施例菰米愈伤颗粒在不同激素组合下愈伤分化芽生长状态图；
图6为实施例菰米生根壮苗效果图；
图7为实施例菰米再生植株的PCR产物凝胶电泳图，M-D2000Marker；1-质粒；2-12-转化后再生单株；13-ddH2O；
图8为实施例菰米PCR产物测序结果比对分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10-30℃，最好是15-25℃。
本发明披露了一种菰米遗传转化体系建立的方法及应用，选用成熟的菰米种子作为组培外植体，选用浓度为2mg/L的2,4-D的NBCIM诱导培养基诱导愈伤组织，然后通过继代培养基对愈伤进行继代增殖，再经愈伤组织预培养，以状态良好的、分裂旺盛的愈伤小颗粒为受体，采用农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因植株。具体如下实施例所示。
实施例
1、愈伤组织诱导及增殖
选择干净无霉点的成熟菰米种子，先用75％的乙醇消毒90s，然后用0.1％的汞溶液消毒15min，期间置于恒温震荡培养箱，30℃，180r/min震荡培养，消毒处理结束后，用无菌水将种子冲洗10遍以上，直至澄清，浸泡过夜；
将消毒处理的种子用解剖刀将胚剥下，接种于浓度为2mg/L的2,4-D，pH5.8诱导培养基NBCIM上，培养条件为温度(28±2℃)，光照强度1500—2000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，40d可获得愈伤组织；
将所得愈伤与胚芽分离，去掉多余的胚乳，于新鲜的愈伤诱导培养基上继代培养，培养条件：温度30℃，光照周期为16h光照/8h黑暗。
挑选状态良好的愈伤组织转至NBCIM培养基上预培养3-5d后，将状态良好的、分裂旺盛的小颗粒用小勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染，每10mL愈伤组织，共培养两皿。
表1 2,4-D浓度对愈伤出愈率及愈伤状态的影响
Figure BDA0003256768910000051
2、外植体的遗传转化
将带有植物表达载体PHUN411-sg2.0-BADH2的农杆菌EHA105接种于YP:乙酰丁香酮培养基上，28℃黑暗培养24h，再接种至新鲜的YP:乙酰丁香酮培养基上，28℃黑暗培养过夜；用接种环将农杆菌刮下，用重悬液[每升接种培养基中加入1毫升乙酰丁香酮储存液(20mg/mL)]，分装于50mL灭菌离心管中，每管25mL作为重悬液重悬农杆菌，OD660值分别为0.1、0.3、0.5，侵染步骤1处理的愈伤组织20min，期间不时轻轻晃动。
倒掉重悬液，置于无菌滤纸上至愈伤组织表面无多余菌液，然后进行共培养。设置三种共培养条件，一是普通培养基；二是在90×25mm的一次性培养皿垫上三张无菌滤纸；三是在90×25mm的一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入2.5mL接种培养基(含终浓度为20mg/L的乙酰丁香酮)；将OD值为0.3的侵染后愈伤，吸干后均匀分散在三种不同的共培养介质上，23℃黑暗培养3d后观察农杆菌的弥散程度，结果表明，共培养过程的干燥处理，可以降低共培养过程中的水分含量，起到增加细胞接触和抑制细菌生长的效果，但是又不能太过于干燥，抑制愈伤的生长，因此，加乙酰丁香酮润湿的滤纸对侵染后的愈伤颗粒进行共培养最合适；之后，用一小勺将经共培养的愈伤组织均匀散布于恢复培养基中(每皿至少分成两皿于恢复培养基)，培养条件为温度(28±2℃)，光照强度1500—2000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，5d后，将愈伤组织转至筛选培养基上(从原来的愈伤组织生长脱落下的愈伤组织视为独立的转化体)，每个培养皿接25粒愈伤组织，一轮筛选后视情况挑选状态好的愈伤继续二轮、三轮筛选，每个筛选周期14d-20d，培养条件为30℃光照培养，光周期16h光照/8h黑暗，14d后统计抗性愈伤率，结果表明，过高或过低浓度的菌液都不利于后续转化子的筛选，浓度过低会导致转化效率的降低，而浓度过高则会引起农杆菌过度生长，导致愈伤褐化，因此，OD660为0.3的菌液浓度比较适合后续转化子的筛选，抗性愈伤率更高，且少褐化。
表2不同共培养条件对转化的影响
Figure BDA0003256768910000061
表3菌液浓度对转化子筛选的影响
Figure BDA0003256768910000062
3、转基因植株的再生移栽
在培养基上筛选3-4周之后，每个独立转化体挑选3-5颗生长状态良好、新鲜的抗性愈伤小颗粒，转至再生培养基上(每培养皿接8个独立转化体)，培养条件为30℃光照培养，光周期16h光照/8h黑暗；直至苗生长长度2-5cm左右时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(丢弃已取过苗的愈伤组织，并在培养皿的底部做标记，以防止与未分化或未取苗的其他独立来源的愈伤组织混淆)。每个生根指管接一个苗。30℃光照培养，光周期16h光照/8h黑暗。
表4不同激素配比的再生培养基对愈伤分化的影响
Figure BDA0003256768910000071
4、转基因植株的DNA提取、筛选标记基因PCR扩增及产物测序
将生根获得的11株苗，取适量菰米叶片置于2mL离心管中，加入1粒5mm研磨钢珠，将样品放入高通量组织研磨仪中，做好固定之后即可开始研磨，研磨时长设定为2min，转速1500rpm。将研磨好的样品取出加入800μL CTAB抽提液，颠倒混匀后置于65℃水浴锅中温浴45min，期间每隔15分钟轻轻摇动一次离心管。冷却后加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀后，平放在摇床上摇动5min(频率以抽提液与氯仿完全混合为度)，12000rpm，20℃离心10min。吸取上清于另一干净的1.5mL离心管中，加入与上清液等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，放-20℃冰箱冷冻30min。12000rpm，20℃离心10min，用移液器吸去上清液。用75％乙醇漂洗沉淀两次，每次停留5min；用移液器尽量除去乙醇，将离心管倒置于吸水纸上干燥至沉淀刚出现半透明。用100μL无菌水溶解沉淀。取2μL DNA电泳检查DNA的质量，于-20℃保存。
以获得的11个独立单株的DNA样品作为模板，以筛选标记HPT基因的引物进行PCR扩增，扩增体系如下：
表5 PCR扩增体系
Figure BDA0003256768910000072
扩增引物：HPT-F:CGCCGATGGTTTCTACAA(SEQ NO:1)
HPT-R:GGCGTCGGTTTCCACTAT(SEQ NO:2)
扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，32-33循环，72℃终延伸7min。
目标片段：839BP。
将PCR产物(SEQ NO:3)跑琼脂糖凝胶电泳，电泳胶图见图7。由电泳胶图可以看出，单株2为转化阳性单株，转化阳性率1/11。
PCR产物测序结果比对分析见图8，由图可以看出，PCR产物的测序结果与hyg基因序列完全匹配。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院烟草研究所
合肥戬谷生物科技有限公司
<120> 一种菰米遗传转化体系的建立方法
<141> 2021-09-10
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgccgatggt ttctacaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggcgtcggtt tccactat 18
<210> 3
<211> 815
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gggtttcatc gggcactttg catcggccgc gctccgattc cggaagtgct tgacattggg 60
gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtt cacagggtgt cacgttgcaa 120
gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg 180
atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 240
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gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt 780
gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgcca 815

Claims (3)

1.一种菰米遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)诱导培养：将成熟菰米种子在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，在愈伤诱导培养基上继代培养，挑选状态良好的愈伤组织转至愈伤诱导培养基上预培养；愈伤组织诱导培养的条件为：光培养，光强4000Lux，光周期16h光照/8h黑暗，温度25-35，℃培养3周后，得胚性愈伤组织；
所述愈伤诱导培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素，100X 10mL；铁盐100X 10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4-D，1mg/mL，2mL；蔗糖30g；植物凝胶3g；
2)农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种于农杆菌活化培养基上活化，用重悬液重悬稀释农杆菌获得OD660值0.2-0.4的农杆菌菌液；
所述农杆菌活化培养基的配方为：每升培养基含酵母提取物10g；蛋白胨10g；NaCl50g；卡那霉素，50mg/mL，1mL；利福平，10mg/mL，1.5mL；乙酰丁香酮，20mg/mL，1mL；琼脂12g；
农杆菌重悬液的配方为：每升含N6大量20X50mL；B5微量1，100X10mL；B5微量2，1000X1mL；B5维生素，100X10mL；铁盐100X10mL；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.5g；2,4-D，1mg/mL 2mL；蔗糖20g；葡萄糖10g；乙酰丁香酮终浓度20mg/mL，1mL；
3)农杆菌菌液的侵染：将步骤1)中经过预培养的愈伤组织浸泡于步骤2)获得的农杆菌菌液中进行侵染15-25min；
4)愈伤组织的恢复培养和筛选：将步骤3)中侵染后的愈伤颗粒进行共培养，共培养的条件：一次性培养皿垫上三张无菌滤纸后加入终浓度为15-25mg/L的乙酰丁香酮的农杆菌重悬液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的农杆菌菌液后均匀分散在共培养介质上，20-28℃黑暗培养2-4d；共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀且稀疏地散布于恢复培养基中，25-35℃光照培养3-6d，光照周期为16h光照/8h黑暗；恢复培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，培养条件为：25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；
所述恢复培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素100X 10mL；铁盐100X 10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；2,4-D，1mg/ml，2mL；羧苄青霉素，250mg/mL，1mL；蔗糖30g；植物凝胶3g；
所述筛选培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素100X 10mL；铁盐100X 10mL；谷氨酰胺0.5g；脯氨酸0.5g；水解酪蛋白0.3g；蔗糖30g；2,4-D，1mg/mL，2mL；羧苄青霉素，250mg/mL，1mL；Hyg-B，50mg/mL，1.4mL；植物凝胶3g；
5)愈伤组织再生：将4)所得愈伤颗粒在培养基上筛选3-4周之后，转至再生培养基上，25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；苗生长至长度2-5cm，移至生根培养基上，25-35℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗；
所述再生培养基的配方为：每升培养基含N6大量20X 50mL；B5微量1，100X 10mL；B5微量2，1000X 1mL；B5维生素100X 10mL；铁盐100X 10mL；CuSO4，5mg/mL，0.5mL；MES 0.5g；水解酪蛋白1g；蔗糖30g；山梨醇30g；羧苄青霉素，250mg/mL，0.5mL；Hyg-B，50mg/mL，0.4mL；NAA，1mg/mL，0.5mL；6-BA，1mg/mL，0.5mL；TDZ，1mg/mL，1mL；氨基酸10X 100mL；植物凝胶2.8g；
所述生根培养基的配方为：每升培养基含MS盐2.165g；B5维生素，100X10mL；蔗糖20g；羧苄青霉素终浓度250mg/mL，0.5mL；NAA终浓度1mg/mL，0.4mL；植物凝胶3.5g；
恢复培养、筛选培养、再生培养及生根培养的条件为：30℃光照培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。
2.根据权利要求1所述的一种菰米遗传转化体系建立的方法，其特征在于：所述侵染时农杆菌菌液的OD660值为0.3，愈伤颗粒侵染时间为20min。
3.根据权利要求2所述的一种菰米遗传转化体系建立的方法，其特征在于：共培养的培养基乙酰丁香酮终浓度为20mg/L，23℃黑暗培养3d。
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