CN108094206A

CN108094206A - 一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法

Info

Publication number: CN108094206A
Application number: CN201711421443.8A
Authority: CN
Inventors: 胡进耀; 别鹏飞; 向莉; 余凌帆; 王虹; 马月琴
Original assignee: MIANYANG TEACHERS COLLEGE
Current assignee: MIANYANG TEACHERS COLLEGE
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2018-06-01

Abstract

本发明属于光叶蕨培养技术领域，公开了一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，使用浓度为3～5g/mL的洗衣粉浸泡，使用75％乙醇和0.01％升汞处理，消毒方便，对芽的伤害低。本发明采用pH值为5.8～6.0的培养基，在2000～2100lx下对芽进行初代培养，促使芽快速的萌发为GGB，GGB可以用于继代接种、繁殖。本发明在保证具有最大增殖效率的前提下，促进芽萌发的茎段的生长，提升光叶蕨苗的成活率。本发明壮苗培养基和增殖培养基的组分相比，增加了赤霉素，调整其中各组分配比，使壮苗效果达到最大化。采用本发明的方法进行炼苗，可使光叶蕨苗的成活率达到80％以上。

Description

一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法

技术领域

本发明属于光叶蕨培养技术领域，尤其涉及一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法。

背景技术

光叶蕨主要分布在四川西部二朗山山地长绿落叶阔叶混交林下，为蹄盖蕨科中等大的林下阴地常绿植物。根状茎短横卧，叶近生，基部褐色，稍膨大，叶片狭披针形，羽片近对生，平展，无柄。孢子囊群圆形，囊群盖卵圆形，薄膜质，灰绿色，孢子圆肾形，深褐色，不透明，表面具较密的棘状突起。是中国国务院1999年8月4日批准国家Ⅰ级重点保护野生植物中国濒危物种。目前该物种已成为极小种群物种，需要短时间生产大量种苗以保护该物种。但由于该物种知名度低，目前很少有人研究，仅有原叶体阶段的培育技术(孢子)和分株培育技术，还没有成熟的快速育苗技术。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有人工繁殖光叶蕨分株培育方法，培育速度慢；组培育苗只能培育出原叶体，还未有人研究过如何培育出孢子体，因此目前还没有培育出孢子体的技术方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法。

本发明是这样实现的，一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，所述光叶蕨孢子体繁殖的培养方法包括以下步骤：

步骤一，采集光叶蕨地下茎；

步骤二，将光叶蕨地下茎置于浓度为3～5g/mL的洗衣粉溶液中浸泡1～3min，切割修整，剩0.3～0.5cm的芽端，用75％乙醇浸泡10～30s，再用0.01％升汞溶液浸泡1～3min；

步骤三，向1/2MS培养基中加入NAA、6-BA，蔗糖浓度为20g/L，调节培养基pH值为5.8～6.0；120～125℃灭菌20～25min，冷却至室温，备用；将消毒后的芽接种至培养基中，24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d；NAA加入量为0～0.1mg/L、6-BA加入量为0.05～0.15mg/L；

步骤四，所得产物接种至含有NAA、6-BA的1/2MS培养基中，24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，增殖培养，得到光叶蕨苗；其中，1/2MS培养基中NAA加入量为0.5～1.5mg/L、6-BA加入量为0.5～1.5mg/L、GA₃加入量为1.5～2.5mg/L；

步骤五，用含有NAA、6-BA、GA₃的1/2MS培养基，24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，培育所得光叶蕨苗；其中，NAA加入量为0.5～1.5mg/L、6-BA加入量为0.2～0.8mg/L、GA₃加入量为0.5～1.5mg/L；

步骤六，选取生长状态良好的光叶蕨苗，采用含有NAA的1/2MS培养基，于24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，培养至生根；NAA的加入量为0～0.5mg/L；

步骤七，在生根培养40d后，对光叶蕨苗进行闭罐炼苗15～20d，遮阴度为50％，再开罐炼苗3～7d；将光叶蕨苗移出，消毒灭菌，移栽至经消毒处理的基质中，浇足定根水，每5d喷施一次营养液；其中，基质为草炭、珍珠岩和蛭石的混合物，草炭、珍珠岩和蛭石重量比为1～2:0.5～1:0.5～1。

进一步，所述步骤三1/2MS培养基中NAA加入量为0.05mg/L、6-BA加入量为0.1mg/L。

进一步，所述步骤四1/2MS培养基中NAA加入量为1.0mg/L、6-BA加入量为1.0mg/L、GA₃加入量为2.0mg/L。

进一步，所述步骤五用于壮苗培育的1/2MS培养基中NAA加入量为1.0mg/L、6-BA加入量为0.5mg/L、GA₃加入量为1.0mg/L。

进一步，所述步骤六用于生根培育的1/2MS培养基中NAA的加入量为0.1mg/L。

进一步，所述步骤七基质中草炭、珍珠岩和蛭石的体积比为2:1:1(体积比)。

进一步，所述步骤七基质的消毒过程如下：将基质置于0.1MPa的灭菌锅中，保持20～30min；或者采用5％的福尔马林或0.3％的硫酸铜溶液淋透基质，塑料布覆盖7d。

进一步，所述步骤七光叶蕨苗的消毒过程如下：采用500倍多灵菌溶液清洗光叶蕨苗2～3次。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法培养的光叶蕨。

本发明的优点及积极效果为：光叶蕨是孢子体发达、配子体退化的植物。通过孢子繁殖只能获得退化的配子体，配子体生存能力很弱，获得孢子体需要通过受精过程才能获得孢子体，比较困难，且培养周期长。本发明以孢子体地下茎为外植体，直接培养出孢子体，生存适应能力强。

1、光叶蕨是孢子体发达、配子体退化的植物。通过孢子繁殖只能获得退化的配子体，配子体生存能力很弱，获得孢子体需要通过受精过程才能获得孢子体，比较困难，且培养周期长。本发明以孢子体地下茎为外植体，直接培养出孢子体，生存适应能力强，成活率高。

2.地下茎和芽外面存在有很厚毛或鳞片保护，采用常规方法对地下茎进行消毒时，存在消毒不彻底，导致组培过程中染菌的问题，所以目前还没有其他人利用光叶蕨地下茎芽来进行光叶蕨的组培繁殖。本发明在对芽进行消毒除菌时，先使用浓度为3～5g/mL的洗衣粉浸泡，除去芽上的泥土等杂质后、软化毛，切割剥除鳞片、毛后，再使用75％乙醇和0.01％升汞处理，消毒方便，对芽的伤害低。污染率可降低到10％，死亡率可降低到10％。

3、本发明采用pH值为5.8～6.0的培养基，在2000～2100lx下对芽进行初代培养，促使芽快速的萌发为GGB，GGB可以用于继代接种、繁殖。平均GGB1.7个。

3、本发明根据芽初代培养所用的培养基组分及配比，在芽具有最大萌发效率和萌发量的前提下(新增芽平均个数3.6个)，增殖培养基与其相比在组分上和配比上进行了调整，在保证具有最大增殖效率的前提下，促进芽萌发的茎段的生长，提升光叶蕨苗的成活率。

4、本发明通过增殖培养基培养，初步得到光叶蕨苗；在选用壮苗培养基组分时，以增殖培养基的组分为参考，壮苗培养基和增殖培养基的组分相比，增加了赤霉素，调整其中各组分配比，使壮苗效果达到最大化。

5、采用本发明过程中提及的方法进行炼苗，可使光叶蕨苗的成活率达到80％以上。

本发明以地下茎芽为外植体，建立了完整的光叶蕨组培快速繁殖体系，有效解决了在消毒、增殖、生根、炼苗过程中存在的问题，可在短期内培育大量的光叶蕨苗，并且，炼苗技术成熟，成活率可达80％以上。

附图说明

图1是本发明实施例提供的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明以地下茎芽为外植体，有效解决了在消毒、增殖、生根、炼苗过程中存在的问题，可在短期内培育大量的光叶蕨苗，并且，炼苗技术成熟，成活率可达80％以上。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法包括以下步骤：

S101：采集光叶蕨地下茎；

S102：将光叶蕨地下茎置于浓度为3～5g/mL的洗衣粉溶液中浸泡1～3min，切割修整，使其仅剩0.3～0.5cm的芽端，用75％乙醇浸泡10～30s，再用0.01％升汞溶液浸泡1～3min；

S103：向1/2MS培养基中加入NAA、6-BA，蔗糖浓度为20g/L，调节培养基pH值为5.8～6.0(灭菌前)，于120～125℃灭菌20～25min，冷却至室温，备用；然后将步骤(2)中消毒后的芽接种至培养基中，于24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，大约10d后，即可观察到外植体逐渐产生单个的绿色瘤状物，称为绿色球状体(GGB)；以后GGB不断增大或多个密集在一起，新的GGB不断产生；50d后，GGB诱导率基本上达到最大值。其中，NAA加入量为0～0.1mg/L、6-BA加入量为0.05～0.15mg/L；

S104：将所得产物接种至含有NAA、6-BA的1/2MS培养基中，于24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，增殖培养，得到光叶蕨苗；其中，1/2MS培养基中NAA加入量为0.5～1.5mg/L、6-BA加入量为0.5～1.5mg/L、GA₃加入量为1.5～2.5mg/L；

S105：用含有NAA、6-BA、GA₃的1/2MS培养基，于24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，培育所得光叶蕨苗；其中，NAA加入量为0.5～1.5mg/L、6-BA加入量为0.2～0.8mg/L、GA₃加入量为0.5～1.5mg/L；

S106：选取生长状态良好的光叶蕨苗，采用含有NAA的1/2MS培养基，于24±1℃、2000～2100lx条件下，光照8～10h/d，培养至生根；NAA的加入量为0～0.5mg/L；

S107：在生根培养40d后，对光叶蕨苗进行闭罐炼苗15～20d，遮阴度为50％，再开罐炼苗3～7d，然后将光叶蕨苗移出，消毒灭菌，移栽至经消毒处理的基质中，浇足定根水，每5d喷施一次营养液；其中，基质为草炭、珍珠岩和蛭石的混合物，草炭、珍珠岩和蛭石重量比为1～2:0.5～1:0.5～1。

在本发明的优选实施例中：1/2MS培养基中NAA加入量为0.05mg/L、6-BA加入量为0.1mg/L。

在本发明的优选实施例中：1/2MS培养基中NAA加入量为1.0mg/L、6-BA加入量为1.0mg/L、GA₃加入量为2.0mg/L。

在本发明的优选实施例中：用于壮苗培育的1/2MS培养基中NAA加入量为1.0mg/L、6-BA加入量为0.5mg/L、GA₃加入量为1.0mg/L。

在本发明的优选实施例中：用于生根培育的1/2MS培养基中NAA的加入量为0.1mg/L。

在本发明的优选实施例中：基质中草炭、珍珠岩和蛭石的体积比为2:1:1。

在本发明的优选实施例中：基质的消毒过程如下：将基质置于0.1MPa的灭菌锅中，保持20～30min；或者采用5％的福尔马林或0.3％的硫酸铜溶液淋透基质，再以塑料布覆盖7d。

在本发明的优选实施例中：光叶蕨苗的消毒过程如下：采用500倍多灵菌溶液清洗光叶蕨苗2～3次。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：

本发明实施例提供的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法包括以下步骤：

(1)采集光叶蕨地下茎芽为外植体材料；

(2)消毒灭菌

将野外采集的光叶蕨地下茎芽在浓度为3～5g/mL的洗衣粉溶液中浸泡2min，用软毛笔轻轻的将芽鳞清洗干净，用流水冲洗2h，在超净工作台上用0.1％升汞溶液浸泡芽2-3min后，用无菌水冲洗5次以上，洗净后用灭菌滤纸吸干外植体表面水分，用镊子剥去芽全部鳞片和毛，得到芽体，再采用75％乙醇+升汞对其进行处理，具体过程如下：

75％乙醇+0.01％升汞配合消毒灭菌(见表1)

剪掉芽体上附着物，使其仅剩0.5cm的芽端，用75％乙醇表面消毒10～30s，取出芽体，然后用无菌水冲洗2～5，再用0.01％升汞溶液浸泡芽体1～3min，用灭菌滤纸吸干芽体上水分，消毒处理结果见表2；

表1 75％乙醇+0.01％升汞配合消毒灭菌

表2采用表1消毒方式处理后的结果

根据消毒处理结果，可看出污染率与死亡率成反比，可能由于不同消毒处理对细胞的杀伤程度不同：消毒时间越短，对细胞的杀伤程度越小，因此它对应的污染率较高，致死率较低；消毒时间越长，对细胞的杀伤越大，相应的污染率低，致死率却很高。由此可以得知表1中的消毒方式②是最好的，即先用75％酒精浸泡20S，然后再用0.01％升汞浸泡2min这种方式是芽消毒处理的最佳条件。

(3)初代培养

设立11组含有不同NAA和6-BA含量的1/2MS培养基，每组1/2MS培养基中均添加1.5g/L的AC，调节培养基pH值为5.8～6.0，于121℃高压灭菌20min，冷却至室温；然后将步骤(2)中消毒后的芽分别接种至1、4、5、6、7、8、9、10、11号培养基中，每种培养基接种10罐，每罐3个外植体，重复三次，接种后置于培养室内，于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，培养至芽萌发为带芽茎段，50d后统计芽萌发率，结果见表4；

表3用于初代培养的培养基

表4初代培养基GGB诱导情况

根据培养结果，5号培养基的GGB启动时间最短，个数最多，与其它培养基的启动时间和GGB个数差异达到极显著水平(p<0.01)，50d左右自动分化出芽，能为进一步增殖提供材料。所以最佳培养基为：NAA0.05mg/L+6-BA0.1mg/L。

(4)增殖培养

将步骤(3)所得产物分别接种至下表中的培养基中，接种后置于培养室内，于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，诱导产生丛生芽，增殖培养，得到光叶蕨苗，60d后统计生长结果；

表5不同激素组合对光叶蕨芽直接诱导丛生芽的影响

综合比较，光叶蕨芽直接诱导丛生芽的最佳培养基为5号培养基，其具体配比为：NAA1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+GA₃2.0mg/L，在此培养基上诱导率最高为87％，产生的丛生芽最多(4.0)，且芽生长健壮。

(5)壮苗培养

用含有不同量的NAA、6-BA和GA₃的9组1/2MS培养基，每组培养基中AC的加入量为1.0g/L，分别于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，培育步骤(4)中的光叶蕨苗50d，统计平均苗高；

表6壮苗培养结果

以无根苗为材料研究了GA₃、NAA、6-BA对壮苗培养的影响，壮苗培养的适宜培养基为1/2MS+GA₃ 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L，在此培养基上培养的光叶蕨苗平均苗高可达2.12cm。

(6)生根培养

采用含有不同量的NAA浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5)的1/2MS培养基，于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，分别培养步骤(5)中生长状态良好的光叶蕨苗至生根，并对生根结果进行分析；

表7生根培养实验结果

由表中的生根率可知，光叶蕨苗进行生根培养的最佳培养基为1号培养基，生根率达到45.5％，其具体配比为：1/2MS+NAA0.1mg/L。

(7)炼苗移栽

炼苗过程包括闭罐炼苗和开罐炼苗，其具体过程如下：

闭罐炼苗：生根培养后40d，将装有光叶蕨苗的组培罐移至室外遮阴棚或温室中进行闭罐炼苗15～20d，遮阴度为50％％；

开罐炼苗：闭罐炼苗结束后，再打开组培罐盖，在自然光下进行开罐炼苗3～7d，开罐炼苗分为三个阶段，首先松开组培罐盖1～2d，然后部分开罐1～2d，最后完全开罐1～3d；在开罐炼苗过程中，光照较强时应注意采取措施，避免光叶蕨苗被灼伤；

炼苗结束后，用镊子将光叶蕨苗从组培罐中移出，洗净光叶蕨苗根部，避免根部残留的蔗糖和营养物质成为致病微生物生长的培养基，可有效防止光叶蕨苗移栽后烂根死亡；

然后直接移栽，使用500倍多灵菌溶液清洗光叶蕨苗，再用清水清洗后，再分别移栽至消毒灭菌后的基质中，浇足定根水，每5天喷施一次营养液，并注意遮阴和通风换气，以50孔育苗盘为一区，3个重复，生长60d后统计成活率和平均株高；

基质各组分体积比如下：

(1)珍珠岩+蛭石(1:1)；(2)腐殖质土；(3)泥炭+珍珠岩(1:1)；(4)草炭+珍珠岩+蛭石(2:1:1)

基质消毒灭菌过程为：

(1)于120℃将基质置于烘箱中烘烤20min，或在0.1MPa的灭菌锅中，保压20～30min；

(2)用5％的福尔马林或0.3％硫酸铜溶液淋透基质，然后覆盖塑料布，7d后揭开，并翻动基质，使气味挥发。

根据统计结果可得光叶蕨苗的最佳生长基质为草炭+珍珠岩+蛭石(2:1:1)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述光叶蕨孢子体繁殖的培养方法包括以下步骤：

步骤一，采集光叶蕨地下茎；

2.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤三1/2MS培养基中NAA加入量为0.05mg/L、6-BA加入量为0.1mg/L。

3.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤四1/2MS培养基中NAA加入量为1.0mg/L、6-BA加入量为1.0mg/L、GA₃加入量为2.0mg/L。

4.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤五用于壮苗培育的1/2MS培养基中NAA加入量为1.0mg/L、6-BA加入量为0.5mg/L、GA₃加入量为1.0mg/L。

5.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤六用于生根培育的1/2MS培养基中NAA的加入量为0.1mg/L。

6.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤七基质中草炭、珍珠岩和蛭石的体积比为2:1:1。

7.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤七基质的消毒过程如下：将基质置于0.1MPa的灭菌锅中，保持20～30min；或者采用5％的福尔马林或0.3％的硫酸铜溶液淋透基质，塑料布覆盖7d。

8.如权利要求1所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法，其特征在于，所述步骤七光叶蕨苗的消毒过程如下：采用500倍多灵菌溶液清洗光叶蕨苗2～3次。

9.一种利用如权利要求1～8任意一项所述的光叶蕨孢子体繁殖的培养方法培养的光叶蕨。