CN105660397B

CN105660397B - 一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法

Info

Publication number: CN105660397B
Application number: CN201610022606.4A
Authority: CN
Inventors: 孙英坤; 陈林敬; 樊靖; 胡玉春; 刘华红; 田伟莉; 裘雯慧; 郭娟
Original assignee: HANGZHOU LANDSCAPING Inc
Current assignee: HANGZHOU LANDSCAPING Inc
Priority date: 2016-01-13
Filing date: 2016-01-13
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2036-01-13
Also published as: CN105660397A

Abstract

本发明涉及一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法。本发明其特征在于以半木质化嫩茎的休眠腋芽为基础，主要步骤包括外植体的取材和消毒处理、诱导休眠腋芽萌发、诱导不定芽和侧芽高频发生、壮苗培养、瓶内生根培养和炼苗移栽，最终得到与亲本性状一致、品质优良、抗逆性强的再生植株。本发明能够在较短时间内得到大量规格一致、品质优良的苗木，有力地推动了灯笼树市场化的进程。

Description

一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法

一、技术领域

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法

二、背景技术

灯笼树是一种杜鹃花科、吊钟花属的落叶灌木，生长在我国中部地区，株高2-6米。每当夏日，在它的枝端两侧挂着十几朵肉红色的钟形花朵，所以又称作吊钟花。灯笼树的果实在十月里成熟，椭圆形，棕色。有趣的是，它的果梗完全向下垂着，而先端弯曲向上，因此结的果实却是直立的。远远望去，仿佛树枝上举满了一个个的小灯笼，因此而得名。灯笼树不仅花果美丽，而且叶子入秋后变为浓红，不似枫叶，胜似枫叶。

目前，国外已有少数将灯笼树做成容器苗小盆栽产品，既可用于庭院绿化，又可用作室内观赏，具有极大的市场开发价值。在国内，灯笼树以野生资源为主，且分布极具地域性，数量极为有限，更没有形成产品，市场开发一片空白。采用常规的扦插技术进行繁育，需要大量的穗条，极难生根，再生苗抗性差且无法保证能够稳定延续野生亲本的优良性状，使市场开发遇到瓶颈。

三、发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，目的在于提供一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法的技术方案，能够在较短时间内得到大量规格一致、品质优良的苗木，有力地推动了灯笼树市场化的进程。

为此，本发明采取如下技术方案：灯笼树的组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选取野生的无病虫害的灯笼树性状优良的单株于3月份开始恢复生长时，将其放到温室内养护，每隔一周叶面喷洒一次0.3％-0.5％的多菌灵溶液，直至5月份左右。待新芽抽出后，剪取其中半木质化的嫩茎作为外植体材料，将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段(每段有一个休眠腋芽)，用清水反复冲洗3-4次，备用。配制5L0.3％的新洁尔灭消毒液(加入适量洗洁精混匀)，加入超声波清洗机的清洗槽中，将冲洗过的小芽茎段均匀的分散到清洗槽中，超声波清洗1-2小时，然后无菌水冲洗干净，备用；

2)将步骤1)处理过备用的小段在超净工作台中先用70％-75％的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用1％的次氯酸钠溶液消毒5-10min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率；

3)将步骤2)消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有1个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上。培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。启动培养基为：wpm+0.001-0.005mg/L噻苯隆(TDZ)+0.005-0.01mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

4)启动培养约30d以后，休眠的腋芽萌发，抽出新的枝条，将新萌发的幼嫩枝条切成2cm左右的小芽茎段，接种到增殖培养基上。培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。增殖培养基为：wpm+0.01-0.05mg/L玉米素(ZT)+0.5-1mg/L激动素(KT)+0.005-0.01mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

5)增殖培养约10d以后，不定芽开始大量分化，约15d以后，侧芽开始萌动，约40-50d以后，得到了大量的不定芽(丛)和侧芽枝条，不定芽分化为再生小苗，但大多数小苗不够健壮，长势较弱，而侧芽枝条则比较健壮。选取其中长势较弱的小苗，将小苗基部的愈伤组织切掉，接种到壮苗培养基上，健壮的再生小苗和侧芽枝条无需进行壮苗培养，可直接进行生根培养。壮苗培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。壮苗培养基为：wpm+0.005-0.01mg/L玉米素(ZT)+0.1-0.5mg/L激动素(KT)+0.005-0.01mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

6)壮苗培养约30d以后，小苗生长旺盛，叶片数量较多，高度为5-8cm，切掉小苗基部的愈伤组织，接种到生根培养基上。培养条件为：温度28±2℃，光照时间为8h/d，光照强度为1000-1500Lx，湿度为60％-65％。生根培养基为：1/2wpm+0.5-1mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5-1mg/L萘乙酸(NAA)+0.1-0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

7)生根培养约10d以后，小苗基部开始膨大，有少量愈伤产生；生根培养约20d以后，小苗基部开始分化出根原基；25-30d以后，根原基开始分化出不定根；30-40d以后，每株小苗平均约产生4.8条不定根，均长为3.5cm，生根苗高度约为6-8cm。将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，自然环境下炼苗15-20d。移栽前3-4d，将组培瓶的瓶盖松动，但不要完全打开，移栽前1-2d，将组培瓶的瓶盖完全打开，并往组培瓶内灌入少量的无菌水。生根组培苗移栽前，先用镊子将生根苗轻轻地从培养基内夹出来，将根部所带的培养基用清水完全清洗干净，不要损伤生根苗的根部。将清洗好的生根苗轻轻插入炼苗基质(珍珠岩：泥炭＝1:1，v/v，移栽前1周左右，用0.8％高锰酸钾溶液消毒处理)中，生根苗不宜种的过深，尽量使根部舒展地分布于基质中，不要使其弯曲。最后，用0.3％多菌灵溶液对移栽的生根苗和基质表面进行均匀喷施，以基质完全浸湿为宜，然后用塑料薄膜做成封闭的小拱棚，进行保温保湿40d左右。待生根小苗长出新的须状根并恢复健壮生长后，将小拱棚的两端打开，缓慢放风，约1周后，将小拱棚完全打开，使其在自然条件下生长。

以上所述的1/2wpm培养基均是指在wpm培养基的基础上，大量元素减半，其他元素不变。

本发明的有益效果在于：与传统的繁育技术和常规的组培技术相比，本发明中的增殖培养基配方能够同时诱导得到大量不定芽和侧芽，其中不定芽增殖系数高达7.8，侧芽增殖系数高达5.6。瓶内生根率高达90％，炼苗移栽成活率可达到85％以上，整个快繁周期缩短到只有4个月左右，大大提高了生产效率，并且获得的再生苗能够稳定的延续野生资源的优良性状。

四、具体实施方式

实施案例1

2013年5月28日上午，温室内选取生长旺盛，无病虫害，性状表现优良的灯笼树野生单株，剪取当年新抽的枝条(极幼嫩茎段和半木质化茎段)，用剪刀将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，用清水反复冲洗3-4次，备用。配制5L0.3％的新洁尔灭消毒液(加入适量洗洁精混匀)，加入超声波清洗机的清洗槽中，将冲洗过的小芽茎段均匀的分散到清洗槽中，超声波清洗1小时，然后无菌水冲洗干净，超净工作台中备用。超净工作台上，将上述处理过备用的小段先用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，挑选其中极幼嫩茎段用70％-75％的酒精溶液消毒15s，倒掉酒精后，用无菌水反复冲洗3次；半木质化茎段先用再用70％-75％的酒精溶液消毒60s，倒掉酒精，再用1％的次氯酸钠溶液消毒3min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率。

将上述消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有1个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上，每瓶培养基内只接种一个腋芽茎段。培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。启动培养基为：wpm+0.004mg/L噻苯隆(TDZ)+0.01mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；启动培养约20d以后，休眠的腋芽萌发，抽出新的枝条，将新萌发的幼嫩枝条切成2cm左右的小芽茎段，接种到增殖培养基上。培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。增殖培养基为：wpm+0.01mg/L玉米素(ZT)+0.5mg/L激动素(KT)+0.005mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；增殖培养约10d以后，在小芽茎段与培养基接触的基部产生大量的不定芽；增殖培养约20d以后，小芽茎段伸长并萌发出大量的侧芽枝条。经过增殖培养约35d以后，得到了大量的不定芽(丛)和侧芽枝条，不定芽分化为再生小苗，选取其中长势较弱的，将小苗基部的愈伤组织切掉，接种到壮苗培养基上。培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。壮苗培养基为：wpm+0.005mg/L玉米素(ZT)+0.1mg/L激动素(KT)+0.005mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；壮苗培养约30d以后，小苗生长旺盛，叶片数量较多，高度为5-8cm，切掉小苗基部的愈伤组织，接种到生根培养基上。培养条件为：温度28±2℃，光照时间为8h/d，光照强度为1000-1500Lx，湿度为60％-65％。生根培养基为：1/2wpm+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+0.1g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；生根培养约50d以后，将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，按照上述发明内容步骤7)相关的技术操作进行炼苗移栽。

本实施案例获得的外植体消毒处理污染率为13％，不定芽增殖系数达到6.3，侧芽增殖系数达到5.2，瓶内生根率达到84％，瓶内生根周期为50d左右，单株组培苗平均约产生3.6条不定根，均长为3.25cm，炼苗移栽成活率达到82％。

实施案例2

2013年6月16日上午，温室内选取生长旺盛，无病虫害，性状表现优良的灯笼树野生单株，剪取当年新抽的枝条(极幼嫩茎段和半木质化茎段)，用剪刀将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，用清水反复冲洗3-4次，备用。配制5L0.3％的新洁尔灭消毒液(加入适量洗洁精混匀)，加入超声波清洗机的清洗槽中，将冲洗过的小芽茎段均匀的分散到清洗槽中，超声波清洗1.5小时，然后无菌水冲洗干净，超净工作台中备用。超净工作台上，将上述处理过备用的小段先用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，挑选其中极幼嫩茎段用70％-75％的酒精溶液消毒15s，倒掉酒精后，用无菌水反复冲洗3次；半木质化茎段先用再用70％-75％的酒精溶液消毒60s，倒掉酒精，再用1％的次氯酸钠溶液消毒5min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率。

将上述消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有1个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上，每瓶培养基内只接种一个腋芽茎段。启动培养基为：wpm+0.001mg/L噻苯隆(TDZ)+0.005mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；启动培养约28d以后，休眠的腋芽萌发，抽出新的枝条，将新萌发的幼嫩枝条切成2cm左右的小芽茎段，接种到增殖培养基上。增殖培养基为：wpm+0.04mg/L玉米素(ZT)+1mg/L激动素(KT)+0.01mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；增殖培养约15d以后，在小芽茎段与培养基接触的基部产生大量的不定芽；增殖培养约20d以后，小芽茎段伸长并萌发出大量的侧芽枝条。经过增殖培养约42d以后，得到了大量的不定芽(丛)和侧芽枝条，不定芽分化为再生小苗，选取其中长势较弱的，将小苗基部的愈伤组织切掉，接种到壮苗培养基上。壮苗培养基为：wpm+0.01mg/L玉米素(ZT)+0.5mg/L激动素(KT)+0.01mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；壮苗培养约30d以后，切掉小苗基部的愈伤组织，接种到生根培养基上。生根培养基为：1/2wpm+1mg/L吲哚丁酸(IBA)+1mg/L萘乙酸(NAA)+0.2g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8；生根培养约45d以后，将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，按照上述发明内容步骤7)相关的技术操作进行炼苗移栽。本案例在外植体各个阶段的培养条件，如未特别指出，均同实施案例1中对应培养阶段的培养条件。

本实施案例获得的外植体消毒处理污染率为18％，不定芽增殖系数达到8.2，侧芽增殖系数达到6.3，瓶内生根率达到87％，瓶内生根周期为40d左右，单株组培苗平均约产生4.2条不定根，均长为3.17cm，炼苗移栽成活率达到90％。

实施案例3

2013年6月24日上午，温室内选取生长旺盛，无病虫害，性状表现优良的灯笼树野生单株，剪取当年新抽的枝条(极幼嫩茎段和半木质化茎段)，用剪刀将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，用清水反复冲洗3-4次，备用。配制5L0.3％的新洁尔灭消毒液(加入适量洗洁精混匀)，加入超声波清洗机的清洗槽中，将冲洗过的小芽茎段均匀的分散到清洗槽中，超声波清洗2小时，然后无菌水冲洗干净，超净工作台中备用。超净工作台上，将上述处理过备用的小段先用无菌水冲洗一下，倒掉无菌水，挑选其中极幼嫩茎段用70％-75％的酒精溶液消毒15s，倒掉酒精后，再用1％的次氯酸钠溶液消毒处理3min，最后用无菌水反复冲洗3次；半木质化茎段先用再用70％-75％的酒精溶液消毒90s，倒掉酒精，再用1％的次氯酸钠溶液消毒处理5min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次。无菌水冲洗和消毒处理的过程中，都要不间断地摇动，以保证无菌水和消毒液能够完全与外植体接触，提高消毒效率。

将上述消毒处理过的茎段切成2cm左右的小段(每段上有1个休眠的腋芽)，用无菌刀片先把茎段最下端切口褐化的部分切去，迅速将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上，每瓶培养基内只接种一个腋芽茎段。启动培养基为：wpm+0.005mg/L噻苯隆(TDZ)+0.002mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；启动培养约32d以后，休眠的腋芽萌发，抽出新的枝条，将新萌发的幼嫩枝条切成2cm左右的小芽茎段，接种到增殖培养基上。增殖培养基为：wpm+0.05mg/L玉米素(ZT)+0.8mg/L激动素(KT)+0.003mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；增殖培养约18d以后，在小芽茎段与培养基接触的基部产生大量的不定芽；增殖培养约20d以后，小芽茎段伸长并萌发出大量的侧芽枝条。经过增殖培养约50d以后，得到了大量的不定芽(丛)和侧芽枝条，不定芽分化为再生小苗，选取其中长势较弱的，将小苗基部的愈伤组织切掉，接种到壮苗培养基上。壮苗培养基为：wpm+0.04mg/L玉米素(ZT)+0.25mg/L激动素(KT)+0.002mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；壮苗培养约30d以后，切掉小苗基部的愈伤组织，接种到生根培养基上。生根培养基为：1/2wpm+0.8mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.6mg/L萘乙酸(NAA)+0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8；生根培养约60d以后，将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，按照上述发明内容步骤7)相关的技术操作进行炼苗移栽。本案例在外植体各个阶段的培养条件，如未特别指出，均同实施案例1中对应培养阶段的培养条件。

本实施案例获得的外植体消毒处理污染率为24％，不定芽增殖系数达到8.0，侧芽增殖系数达到5.8，瓶内生根率达到94％，瓶内生根周期为45d左右，单株组培苗平均约产生5.1条不定根，均长为3.62cm，炼苗移栽成活率达到95％。

上述实施案例均是按照本专利的发明内容所阐述的技术操作和技术方案所进行的，过程中所涉及的技术数据在一定范围内均是可调的。本发明专利所涉及的一切技术操作和技术方案均属本发明专利的保护范围。

Claims

1.一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

1)3月份选取灯笼树性状优良单株，将其放到温室内养护，直至5月份，待新芽抽出后，剪取其中半木质化的嫩茎作为外植体材料，将叶片沿叶柄基部切去，嫩茎切成小段，每段有一个休眠腋芽，清洗、消毒处理后备用，将腋芽茎段的芽向上接种到启动培养基上，启动培养基为：wpm+0.001-0.005mg/L噻苯隆TDZ+0.005-0.01mg/L萘乙酸NAA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

2)启动培养一段时间以后，休眠的腋芽萌发，抽出新的幼嫩枝条，将得到的幼嫩枝条切下，接种到增殖培养基上，增殖培养10天以后，不定芽开始大量分化，15天以后，侧芽开始萌动，40-50天以后，得到了大量的不定芽和侧芽枝条，不定芽分化为再生小苗；所述增殖培养基的培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％，增殖培养基为：wpm+0.01-0.05mg/L玉米素ZT+0.5-1mg/L激动素KT+0.005-0.01mg/L萘乙酸NAA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0；

3)小苗培养30天以后，高度为5-8cm，切掉小苗基部的愈伤组织，接种到生根培养基上进行培养，生根培养基为：1/2wpm+0.5-1mg/L吲哚丁酸IBA+0.5-1mg/L萘乙酸NAA+0.1-0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0，所述的1/2wpm是指在wpm培养基的基础上，大量元素减半，其他元素不变；

4)小苗生根培养一段时间后将生根的组培瓶苗转移到炼苗坑道中的苗床上，自然环境下炼苗15-20天；

5)移栽前清洗生根苗根部的培养基，并将其插入炼苗基质进行生长。

2.如权利要求1所述的灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于步骤1)中时将外植体材料叶片去掉，切成带有休眠腋芽的小段后，先用清水反复冲洗3-4次，然后配制5L0.3％的新洁尔灭消毒液，加入洗洁精混匀，再加入超声波清洗机的清洗槽中，将冲洗过的小芽茎段均匀地分散到清洗槽中，超声波清洗1-2小时，最后无菌水冲洗干净，备用；所述步骤1)中经超声波清洗备用的小芽茎段在超净工作台中先用70％-75％的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用1％的次氯酸钠溶液消毒5-10min，倒掉消毒液，最后用无菌水反复冲洗4-5次。

3.如权利要求1所述的灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于步骤1) 中培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％。

4.如权利要求1所述的灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于步骤2)中增殖培养后的再生小苗，选取其中长势较弱的小苗，将小苗基部的愈伤组织切掉，接种到壮苗培养基上，壮苗培养条件为：温度25±2℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000-2500Lx，湿度为60％-65％，壮苗培养基为：wpm+0.005-0.01mg/L玉米素ZT+0.1-0.5mg/L激动素KT+0.005-0.01mg/L萘乙酸NAA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0。

5.如权利要求1所述的灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于步骤3)中生根培养的条件为：温度28±2℃，光照时间为8h/d，光照强度为1000-1500Lx，湿度为60％-65％。

6.如权利要求1所述的灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法，其特征在于步骤5)中移栽前3-4d，将组培瓶的瓶盖松动，但不要完全打开，移栽前1-2d，将组培瓶的瓶盖完全打开，并往组培瓶内灌入少量的无菌水，生根组培苗移栽前，先用镊子将生根苗轻轻地从培养基内夹出来，将根部所带的培养基用清水完全清洗干净，将清洗好的生根苗轻轻插入炼苗基质，炼苗基质为珍珠岩：泥炭＝1:1，v/v。

7.一种灯笼树组培苗高频再生快速繁殖方法的增殖培养基，其特征在于由以下成分组成：wpm+0.01-0.05mg/L玉米素ZT+0.5-1mg/L激动素KT+0.005-0.01mg/L萘乙酸NAA+3％蔗糖+0.6％琼脂，pH为5.8-6.0。