CN101965798B - 一种花生体胚诱导及植株再生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种花生体胚诱导及植株再生的方法，可以解决现有技术存在的植株再生频率低的问题。主要步骤是将表面消毒并浸泡好的花生种胚分离胚小叶，接种到添加5～10mg/L2，4-D的诱导培养基中培养形成体胚，然后转移到添加了4mg/LBAP的体胚萌发培养基上，继代两次后得再生苗；当体胚萌发伸长后从基部切下，转移至添加0.2～0.5mg/LNAA的1/2MS无机盐+B5有机的生根培养基中诱导生根得完整植株。通过以花生成熟种子胚小叶为外植体，在5～10mg/L2，4-D的诱导培养基上及4mg/L BAP的体胚萌发培养基上，体胚诱导率及植株再生率高，同时体细胞胚起源于一个细胞，避免了再生植株的嵌合性。

Description

一种花生体胚诱导及植株再生的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及花生培育方法，具体地说，是涉及一种花生体胚诱导及植株再生的方法。

背景技术

[0002] 花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和质量，尽管育种家们试图培育抗逆品种，但由于花生栽培种中缺乏高抗性品种资源，抗病品种的选育一直是一个难以解决的问题。目前，抗性基因的遗传转化及离体诱变育种受 到国内外广泛重视。而能否将基因转化和离体诱变成功应用于花生育种，关键依赖于花生组织培养高效植株再生体系的建立。

[0003] 近年来，国内外研究者开展了利用花生的不同外植体（把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体）离体培养再生植株的研究，但多数试验是通过器官发生途径再生植株，即进行初始培养的外植体经脱分化后，细胞分裂形成愈伤组织，然后细胞再度分化，进一步组织分化（即形成拟分生组织和维管组织结节），再进行器官分化，形成不定芽，由不定芽可形成完整再生植株。通过器官发生途径再生植株，目前再生率较高的是2009年本申请人在《中国油料作物学报》上发表的论文《花生组织培养及高频率植株再生》中公开的再生率最高可达到85%左右，然而由于通过器官发生途径再生植株一般不定芽起源于多个细胞，应用于遗传转化和离体诱变时，再生植株会形成嵌合性植株。

[0004] 利用花生不同外植体离体培养再生植株的研究中，有少数试验是通过体细胞胚胎发生途径再生植株的，体细胞胚胎发生是指在离体培养条件下，体细胞通过与合子胚发生相似的途径形成类似合子胚结构的过程。通过体细胞胚胎发生途径再生植株，体胚一般起源于一个胚性细胞，胚性细胞的第一次不均等分裂形成两个子细胞，处于上部的顶细胞继续发育为多细胞原胚，而处于下部的基细胞则形成胚柄类似物。这种再生方法应用于遗传转化和离体诱变时，可避免再生植株的嵌合性，但在现有利用花生体胚发生途径再生植株的研究中，一般是采用花生种子在培养基上培养5〜7d后发芽形成的幼叶进行诱导培养，体胚诱导率和再生率不高。

发明内容

[0005] 本发明提供一种花生体胚诱导及植株再生的方法，可以解决现有技术存在的花生体胚诱导及植株再生的方法植株再生频率低的问题。

[0006] 为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0007] 一种花生体胚诱导及植株再生的方法，包括如下步骤，

[0008] (I)制备体胚诱导培养基：选取MSB5为基本培养基，在所述基本培养基中添加2，4-D制成体胚诱导培养基，2，4-D的添加量为每升所述基本培养基中添加5〜IOmg ；

[0009] (2)选择外植体材料：将花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒，取胚小叶为外植体材料；

[0010] (3)按以下步骤进行体胚诱导及植株再生：[0011] a将花生种子去子叶后的种胚外植体进行表面消毒，然后用无菌水漂洗后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡12〜16h ；

[0012] b取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离种胚的胚小叶，接种到所述诱导培养基中进行诱导培养，25〜30d后形成体胚；

[0013] c将形成有体胚的外植体转移至体胚萌发培养基上进行萌发培养，每隔25〜30d继代一次，继代两次后得到再生苗；所述体胚萌发培养基是由选取MSB5为基本培养基，在所述基本培养基中添加BAP制成，BAP的添加量为每升所述基本培养基中添加4mg ；

[0014] d当再生苗生长至2〜3cm时，从基部切下，转移至生根培养基中诱导生根，获得完整植株；所述生根培养基是由选取1/2MSB5为基本培养基，在所述1/2MSB5基本培养基中添加NAA制成，NAA的添加量为每升所述基本培养基中添加0. 2〜0. 5mg。

[0015] 本发明花生体胚诱导及植株再生的方法，其中所述培养基均在培养室温度为24〜26°C、光照强度为2500〜3500Lx、光照时间为10〜15h/d的培养条件下培养。

[0016] 本发明花生体胚诱导及植株再生的方法，其中所述花生种胚的表面消毒采用75%的酒精浸泡15〜25s，再用0. I %的升汞浸泡。

[0017] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

[0018] I、本发明以花生成熟种子胚的胚小叶为外植体，在每升基本培养基中添加5〜10mg2，4-D(氯化苯氧乙酸类除草剂）所形成的诱导培养基上及在每升基本培养基中添加4mg BAP (苄基氨基嘌呤）所形成的体胚萌发培养基上，进行体胚诱导和萌发，经试验表明，体胚诱导率多数品种达到90%以上，每个外植体形成体胚数在4〜5个以上，有的在10个甚至20个以上，从而每个外植体再生植株数也多，再生率高。

[0019] 2、本发明以花生成熟种子作为试验材料可不受季节限制，常年可以进行试验；通过胚胎发生途径再生植株，体细胞胚起源于一个细胞，再生的方法应用于遗传转化和离体诱变时，可避免再生植株的嵌合性。

具体实施方式

[0020] 实施例I

[0021] 一种花生体胚诱导及植株再生的方法，包括如下步骤：

[0022] I制备体胚诱导培养基：

[0023] 选取MSB5 (MS无机盐+B5有机成分）为基本培养基，添加浓度为3%的蔗糖、浓度为0. 8 %的琼脂，将MSB5培养基的pH值调至5. 8，在培养室温度为24〜26°C、光照强度为2500〜3000Lx、每日光照为13h的条件下进行培养，在此MSB5培养基中添加2，4_D形成体胚诱导培养基，2,4-D的添加量为每升MSB5培养基中添加5mg,2,4-D是一种氯化苯氧乙酸类除草剂，也可用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用生长素。

[0024] 2选择外植体材料：

[0025] 供试材料为由山东省花生研究所（原中国农科院花生研究所）选育推广的“花育”系列新花生品种中的花育20号、花育22号、花育23号和花育25号，以及由青岛农业大学(原莱阳农学院）选育推广的新花生品种鲁花11号，选取各品种中粒大饱满的成熟花生种子去子叶后的种胚作为试验材料。

[0026] 3体胚诱导及植株再生：

[0027] (I)将种胚用75%的酒精浸泡15〜25s，再用0. I %的升汞（氯化高汞,俗称升汞）浸泡进行表面消毒，浸泡时间为IOmin左右，用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡12〜16h，备用。

[0028] (2)在超净工作台中取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离种胚的胚小叶，接种到在诱导培养基中进行诱导培养，胚小叶外植体为乳白色，当在诱导培养基上培养4d后颜色逐渐变黄，7d后胚小叶长大展开向上卷曲呈黄绿色，12〜17d后外植体开始形成体胚，培养25〜30d后，各花生品种均形成体胚。统计体胚形成结果见表I。

[0029] 表I浓度为5mg/L的2，4_D对不同花生品种胚小叶胚胎发生的影响

[0030]

[0031] (3)将诱导培养基上形成体胚的外植体转接到体胚萌发培养基上，体胚萌发培养基也是选取MSB5为基本培养基，在MSB5培养基中添加BAP形成，BAP的添加量为每升MSB5培养基中添加4mg，诱导体胚萌发成苗，每隔25〜30d继代一次，继代两次得到再生苗。50天后统计体胚萌发结果见表2。

[0032] 表2浓度为4mg/L的BAP对不同花生品种胚小叶体胚萌发的影响

[0033]

[0034] (4)当再生苗伸长至2〜3cm时，从再生苗基部切下，转移至生根培养基中诱导生根，获得完整植株。生根培养基是选取1/2MSB5为基本培养基，在1/2MSB5培养基中添加NAA形成，NAA的添加量为每升1/2MSB5培养基中添加0. 2〜0. 5mg。

[0035] 实施例2

[0036] 一种花生体胚诱导及植株再生的方法，包括如下步骤：

[0037] I制备体胚诱导培养基：

[0038] 选取MSB5为基本培养基，添加浓度为3%的蔗糖，浓度为0. 8%的琼脂，将MSB5培养基的pH值调至5. 8，在培养室温度为24〜26°C、光照强度为2500〜3000Lx、每日光照为10〜15h的条件下进行培养，在此MSB5培养基中添加2，4-D形成体胚诱导培养基，2,4-D的添加量为每升MSB5培养基中添加10mg。

[0039] 2选择外植体材料：[0040] 供试材料为由山东省花生研究所（原中国农科院花生研究所）选育推广的“花育”系列新花生品种中的花育20号、花育22号、花育23号和花育25号，以及由青岛农业大学(原莱阳农学院）选育推广的新花生品种鲁花11号，选取各品种中粒大饱满的成熟花生种子去子叶后的种胚作为试验材料。

[0041] 3体胚诱导及植株再生：

[0042] (I)将种胚用75%的酒精浸泡15〜25s，再用0. I %的升汞（氯化高汞,俗称升汞）浸泡进行表面消毒，浸泡时间为IOmin左右，用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡1216h，备用。

[0043] (2)在超净工作台中取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离种胚的胚小叶，接种到在诱导培养基中进行诱导培养，培养25〜30d后，各花生品种均形成体胚。统计体胚形成结果见表3。 [0044] 表3浓度为10mg/L的2，4-D对不同花生品种胚小叶胚胎发生的影响

[0045]

[0046] (3)将形成体胚的外植体转接到体胚萌发培养基上，体胚萌发培养基也是选取MSB5为基本培养基，在MSB5培养基中添加BAP形成，BAP的添加量为每升MSB5培养基中添加4mg，诱导体胚萌发成苗，每隔25〜30d继代一次，继代两次得到再生苗。50天后统计体胚萌发结果见表4。

[0047] 表4浓度为4mg/L的BAP对不同花生品种胚小叶体胚萌发的影响

[0048]

[0049] (4)当再生苗伸长至2〜3cm时，从再生苗基部切下，转移至生根培养基中诱导生根，获得完整植株。生根培养基是选取1/2MSB5为基本培养基，在1/2MSB5培养基中添加NAA形成，NAA的添加量为每升1/2MSB5培养基中添加0. 2〜0. 5mg。

[0050] 试验研究表明，以花生种胚胚小叶为外植体进行体胚诱导时，随2，4_D浓度的提高，开始形成体胚的时间延长。同时，由表I和表3可以看出，在添加2，4-D的培养基上均有体胚形成，但浓度不同，体胚形成率有明显差异。花育23号在添加5mg/L2，4-D的诱导培养基上的体胚形成率高于添加10mg/L2,4-D的诱导培养基,花育20号在二种浓度诱导培养基上的体胚形成率无明显差异，其余3个品种在添加10mg/L 2,4-D的诱导培养基上体胚形成率最高。5个品种花生种胚胚小叶的外植体在添加4mg/LBAP的萌发培养基上成苗率均很高,并且每个外植体再生植株数也多,再生率高。

[0051] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。、

Claims (3)

1. 一种花生体胚诱导及植株再生的方法，其特征在于包括如下步骤， (1)制备体胚诱导培养基：选取MSB5为基本培养基，在所述基本培养基中添加2，4-D制成体胚诱导培养基，2，4-D的添加量为每升所述基本培养基中添加5〜10mg，所述MSB5为MS无机盐+B5有机成分所组成的培养基； (2)选择外植体材料：将花生种子去子叶后的种胚表面消毒，取胚小叶为外植体材料； (3)按以下步骤进行体胚诱导及植株再生： a将花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒，然后用无菌水漂洗后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡12〜16h ； b取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离种胚的胚小叶，接种到所述诱导培养基中进行诱导培养，25〜30d后形成体胚； c将形成有体胚的外植体转移至体胚萌发培养基上进行萌发培养，每隔25〜30d继代一次，继代两次后得到再生苗；所述体胚萌发培养基是由选取MSB5为基本培养基，在所述基本培养基中添加BAP形成，BAP的添加量为每升所述基本培养基中添加4mg ； d当再生苗生长至2〜3cm时，从基部切下，转移至生根培养基中诱导生根，获得完整植株；所述生根培养基是由选取1/2MSB5为基本培养基，在所述1/2MSB5基本培养基中添加NAA形成，NAA的添加量为每升所述基本培养基中添加0. 2〜0. 5mg。

2.根据权利要求I所述的花生体胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，所述培养基均在培养室温度为24〜26°C、光照强度为2500〜3500Lx、光照时间为13h/d的培养条件下培养。

3.根据权利要求I所述的花生体胚诱导及植株再生的方法，其特征在于，所述花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒是采用75%的酒精浸泡15〜25s，再用0. I %的升汞浸泡。