CN105194690A - 长链非编码rna在发育性髋关节发育不良疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及长链非编码RNA？H19(LncRNA？H19)的一种新用途，即，过表达长链非编码RNA？H19能延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎。其优点表现在：本发明对7例DDH软骨组织和6例股骨颈骨折软骨组织研究发现，长链非编码RNA？H19在DDH中表达较股骨颈骨折中明显降低，H19可能与DDH的发生发展有关系；敲减H19会加速DDH进展为骨性关节炎；转染慢病毒LV-H19可促进H19的表达，过表达H19能延缓DDH进展为骨性关节炎。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是长链非编码RNAH19(LncRNAH19)在发育性髋关节发育不良(DDH)疾病中的应用。
背景技术
长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)定义为一类长度大于200nt，不编码蛋白质的RNA转录产物，起初被认为是基因组转录的“噪音”，仅仅是RNA聚合酶II转录副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输，蛋白质翻译后的修饰以及遗传学的表观调控等多种重要的调控过程。这些作用表明其与疾病的病理生理改变有着紧密联系，尤其是肿瘤。在哺乳动物基因组序列中4％-9％的序列产生的转录本是lncRNA(相应的蛋白编码RNA的比例是1％)。人lncRNAH19位于人染色体11p15.5，全长2.3kb，是最先被报道的lncRNA基因之一。同时该基因是最早发现的印记基因之一，系父系基因印记，母系基因表达。因进化上高度保守，胚胎发育期高表达，婴儿出生后在大多数组织表达下调，仅在骨骼肌和心肌中有少量表达。近来研究表明H19与肿瘤具有密切关联，并且在不同的肿瘤中作用不一致，有的表现为促进肿瘤发展，有的则表现为抑癌基因功能。有关lncRNA与肿瘤发生的研究报道逐年增多，但尚没有针对lncRNA在发育性髋关节发育不良(DDH)疾病中调控机制的研究。
发育性髋关节发育不良是指在生长发育过程中股骨头、髋臼在大小、形状、方向及组织学上的异常，或两者皆而有之。髋臼发育不良是以发育不成熟、变浅的髋臼为特征，它可以导致股骨头半脱位或完全脱位。从畸形学观点出发，髋关节发育不良指的是更严重的、固定的脱位，即发生于出生前，通常是在那些有遗传或神经肌肉疾病的患儿。其发生率的可变性是取决于许多因素。数据表明大约出生后儿童1/1000存在髋关节脱位，10/1000可能为髋关节半脱位。影响因素包括臀先露、女性、阳性家族史、第一胎和妊娠合并羊水过少。而宫内胎位、性别、种族和阳性家族史是最为重要的风险因素。阳性家族史在DDH患儿中的比例为12％-33％。DDH风险对于一个儿童而言，当存在一个受影响的兄弟姊妹时占6％；当存在一方父母患病时占12％；如果同时具有上述两种因素时则占到36％。治疗上，如果DDH不及时进行保守治疗或手术干预，可能会引起残留畸形、早期关节退变、痛性关节炎的发生，从而对生长发育过程中的儿童造成生理和心理上的不良影响。然而目前仍未能对其整个发病过程做全面的阐述。在这种背景下，加之DDH患儿有80％是女性，这与lncRNAH19基因特性——父系基因印记，母系基因表达相一致。因此，我们选择lncRNAH19作为靶基因，并且对其在DDH中的作用机制进行研究，希望通过该研究发现它们之间的相关性，并为DDH的诊断、治疗提供新思路。
中国专利文献CN103623429A公开了LncRNAH19在制备调控甲氨蝶呤肿瘤治疗耐药性的药物中的应用。中国专利文献CN101273130公开了包含能够联合其他抗癌疗法下调H19mRNA的物质的制品以及通过进行所述制品的给药而治疗癌症的方法。但是关于长链非编码RNAH19(LncRNAH19)在发育性髋关节发育不良(DDH)疾病中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供长链非编码RNAH19(LncRNAH19)的一种新用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：长链非编码RNAH19在制备治疗发育性髋关节发育不良的药物中的应用。
一种延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎的药物，所述的药物能够过表达长链非编码RNAH19。
过表达长链非编码RNAH19的质粒作为延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎的药物的应用。
所述的过表达长链非编码RNAH19的质粒通过慢病毒介导的方法转染质粒制得。
长链非编码RNAH19作为诊断发育性髋关节发育不良的标记物的应用。
长链非编码RNAH19作为区分发育性髋关节发育不良患者软骨组织和股骨颈骨折患者软骨组织的标记物的应用。
一种区分发育性髋关节发育不良患者软骨组织和股骨颈骨折患者软骨组织的方法，所述的方法为：通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行realtimePCR扩增，分析长链非编码RNAH19的表达。
本发明优点在于：
1、本发明对7例DDH软骨组织和6例股骨颈骨折软骨组织研究发现，长链非编码RNAH19在DDH中表达较股骨颈骨折中明显降低，H19可能与DDH的发生发展有关系。
2、本发明研究发现敲减H19会加速DDH进展为骨性关节炎。
3、本发明研究发现转染慢病毒LV-H19可促进H19的表达，过表达H19能延缓DDH进展为骨性关节炎。
附图说明
附图1是LncRNAH19在DDH软骨组织中的表达差异，其中，con是股骨颈骨折患者。
附图2是FISH检测LncRNAH19分布情况。
附图3是siRNA敲减H19。
附图4是转染慢病毒LV-H19，其中pUbi是慢病毒的作用元件。
附图5是敲减H19的促炎作用。
附图6是过表达H19的抑制炎症作用。
注：图中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一：材料、方法：
1.1材料
1.1.1收集2015年4月至2015年8月在上海交通大学附属新华医院就诊的DDH患者的髋关节软骨组织标本7例，股骨颈骨折患者6例，其中男8例，女5例，年龄31-76岁，平均51.1±14.4岁。本研究经医院医学伦理学委员会批准且患者知情同意。
1.1.2SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，雌雄不限，体重在200g±15g。
1.1.3主要材料与试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清FBS和青霉素链霉素双抗溶液(hyClone，美国)；EDTA-胰蛋白酶(Gibco，美国)；DMSO(Sigma，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce，美国)；NF-κB抗体试剂盒和MAPK抗体试剂盒(CellSignalingTechnology，美国)。
1.1.4大鼠原代软骨细胞：取5只SD大鼠用断颈法处死，将大鼠浸入75％乙醇消毒约10min，无菌条件下用灭菌的手术刀片取膝关节胫骨平台和髋关节软骨，放在盛有PBS缓冲液的培养皿中洗2～3次。用刀片尽量将软骨切成1mm×1mm×1mm的小块，切碎后将小软骨快收集到50ml离心管中，加入5ml0.25％的胰酶，在37℃条件下消化30min，5mlPBS缓冲液洗2次。加10ml0.2％的Ⅱ型胶原酶，在37℃条件下消化4-5h，悬浊液用70μm孔径滤筛网过滤去除软骨组织，过滤后的液体2000rpm离心10min，去除消化液后用PBS缓冲液漂洗，加8ml含10％胎牛血清，1％双抗的DMEM/F12培养基，混匀成细胞悬液后均匀地接种于30mm培养皿。
1.2细胞实验
1.2.1细胞培养DDH患者髋关节、大鼠原代软骨细胞，均用含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12培养基进行培养。3-4d细胞长到90％左右融合时PBS缓冲液清洗，用胰酶消化，离心收集细胞，细胞计数仪计数后细胞按1×106/孔接种于6孔板。
1.2.2L-1β和TNF-α刺激软骨细胞接种于6孔板的软骨细胞，用含1％双抗、含血清的DMEM/F12培养基培养1d，大致长到100％融合，IL-1β和TNF-α联合刺激(10ng/mLIL-1β和50ng/mLTNF-α)，在相应时间点收集各组细胞并提取RNA。
1.2.3Real-TimePCR吸取去除6孔培养板中的培养基，每孔加1mlTrizol，按照Invitrogen公司Trizol产品说明书提取总RNA。NanoDrop2000测定RNA纯度和浓度，取1ugRNA，加DEPC水至总体积12.5uL，充分混匀之后，加1uloligo-dT(100μmol/L)，5×反转录缓冲液4uL，dNTP(10mmol/L)2uL，200U反转录酶0.5uL，总体积20uL，置于PCR仪运行42℃1h，70℃10min，4℃保存。反转录cDNA用灭菌超纯水稀释10倍，进行Real-TimePCR。扩增总体系为10uL:SYBRRPremi×E×TaqTM(2×)5.0uL，PCRForwardPrimer(10umol/L)0.2uL，PCRReversePrimer(10umol/L)0.2uL，稀释的cDNA模板4uL，超纯水0.6uL。样品混合后于定量PCR仪Lightcycler(RocheLightCycler480)上反应。循环条件:95℃预变性30s；95℃变性5s、60℃退火延伸25s，扩增50个循环。熔解曲线分析:95℃0s、65℃15s、95℃0s，熔解曲线是单一峰表明是特异性扩增。应用灭菌超纯水作阴性对照，每个模板设置3个复孔，结果用相对定量2-ΔΔCt方法进行分析。
1.2.4Westernblotting①蛋白收取:吸取细胞培养液，PBS洗涤3次；新鲜配制蛋白裂解液(RIPA：PMSF＝100：1)冰上操作，6孔板每孔视细胞量加入约100uL裂解液，用细胞刮刮下，吹吸混匀，放置冰上30min；将裂解液转移到干净预冷的EP管中，4℃，12000×g离心10min，取上清。②蛋白浓度测定:临时配制BCA液(A液∶B液＝50：1)；在96孔板每个孔内加入10uL蛋白液和200uL新鲜配制的BCA液，对照组加入10uL蛋白裂解液和200uL新鲜配制的BCA液，混匀，37℃孵育30min；采用BCA法用酶标仪测定蛋白浓度；剩余蛋白加入loadingbuffer，95℃加热5min变性。③SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:根据蛋白的相对分子质量灌注不同浓度的分离胶，分离胶凝固之后上面灌注浓缩胶；等量蛋白经不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，先用80V电压浓缩胶压缩，然后用120V分离胶进行分离；将蛋白经湿式电转法转移至硝酸纤维素膜，恒流300mA90min，具体时间依蛋白相对分子质量而定；将膜根据条带分剪之后于封闭液中室温封闭1h；加适量的稀释至工作浓度的一抗4℃轻摇过夜；TBST漂洗15min×3次；加适量稀释至工作浓度的hRP二抗室温轻摇1h；TBST漂洗15min×3次；用显影液进行显影，胶片曝光成像；扫描仪扫描成像胶片。
1.2.5siRNA干扰试验按脂质体2000的说明书操作，将脂质体2000与H19的siRNA混匀，室温放置20分钟后，将其滴入培养有软骨细胞的培养皿中，混匀培养。RT-PCR检测siRNA的干扰效率。
1.2.6过表达质粒的转染应用慢病毒介导的方法转染GV303-H19质粒及空载体于软骨细胞中，realtimePCR检测其过表达情况和转染效率。
1.2.7FluorescentInSituhybridizationKit
1.2.7.1细胞培养将细胞爬片置于24孔板孔底，培养适量细胞(～6×104/孔)。实验前使细胞融合度达到60％-70％。
1.2.7.2细胞固定与通透a.【1×PBS】清洗细胞5min；b.【4％多聚甲醛】室温固定10min；试剂APre-hybridizationBuffer1×10mL×2避光低温存储试剂BhybridizationBuffer1×10mL×1试剂CBlockingSolution100×0.3mL试剂DDAPI染色液100×200c.【1×PBS】清洗细胞5min，共3次；d.每孔加入1mL预冷的【通透液】，4℃静置5min；e.弃去【通透液】后，加入【1×PBS】清洗细胞5min，3次。
1.2.7.3.探针检测a.每孔加入200uL【预杂交液】，37℃封闭30min；b.预杂交同时，将【杂交液】在37℃中预热；c.避光条件下，把2.5uL20uM【lncRNAFISHProbeMi×储存液】或【内参FISHProbeMi×储存液】加入到【杂交液】中；d.弃去每孔细胞中的【预杂交液】，加入适量含有探针的【探针杂交液】，避光，37℃杂交过夜；e.避光，42℃，【洗液I】清洗每孔细胞3次，每次5min，以降低背景信号；f.避光，42℃，【洗液II】清洗细胞1次；g.避光，42℃，【洗液III】清洗细胞1次；h.避光，【1×PBS】清洗细胞，室温5min。
1.2.7.4DNA染色a.避光，【DAPI染色液】染色10min；b.避光，【1×PBS】清洗细胞3次，每次5min。
1.2.7.5封片避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂(如指甲油)将其固定于载玻片上，进行荧光检测。
二：结果
2.1LncRNAH19在DDH软骨组织中的表达差异，手术收集7例DDH软骨组织和6例股骨颈骨折软骨组织，通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行realtimePCR扩增，对实验结果分析发现长链非编码RNAH19在DDH中表达较股骨颈骨折中明显降低。提示H19可能与DDH的发生发展有关系，结果见图1。
2.2FISH检测LncRNAH19分布情况红色荧光标记提示H19绝大部分分布在胞质中，少量位于核内，表明其主要在胞质中发挥细胞功能。如图2所示。
2.3SiRNA干扰H19为了验证设计的siRNA对H19的干扰效率，应用脂质体2000介导的方法转染了阴性对照siRNA，该干扰片段与人的基因没有任何同源性，并转染了特异性敲除H19的siRNA片段，转染24小时后，收集细胞，逆转录并通过realtimePCR的方法鉴定其敲减效率，实验结果发现siH19的细胞组明显低表达H19，说明该特异性作用于H19的siRNA能够有效地干扰其靶基因的表达，结果见图3。
2.4转染慢病毒LV-H19促进H19的表达为了验证过表达H19的转染效率，我们应用慢病毒转染了空白对照质粒GV303和H19的过表达质粒，转染72后，收集细胞，应用realtimePCR扩增检测H19的表达情况，我们发现转染过表达质粒组能够明显上调H19的表达，结果见图4。
2.5敲减H19的促炎作用为了验证H19在DDH患者发展到骨性关节炎中的作用，我们通过转染siRNA的方法干扰H19的表达，发现和对照组比较，si-H19组中金属基质蛋白酶MMP3，MMP13表达增强，二型胶原COL2A1，SOX-9下调，和加入炎症因子刺激组趋势一致，说明H19在调控DDH进展为骨性关节炎过程中起重要作用，结果见图5。
2.6过表达H19的抑制炎症作用过表达H19后检测DDH软骨细胞中金属基质蛋白酶MMP3，MMP13表达减弱；二型胶原COL2A1，SOX-9增强，表明过表达H19能缓解DDH进展成为骨性关节炎，结果见图6。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.长链非编码RNAH19在制备治疗发育性髋关节发育不良的药物中的应用。
2.一种延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎的药物，其特征在于，所述的药物能够过表达长链非编码RNAH19。
3.过表达长链非编码RNAH19的质粒作为延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎的药物的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的过表达长链非编码RNAH19的质粒通过慢病毒介导的方法转染质粒制得。
5.长链非编码RNAH19作为诊断发育性髋关节发育不良的标记物的应用。
6.长链非编码RNAH19作为区分发育性髋关节发育不良患者软骨组织和股骨颈骨折患者软骨组织的标记物的应用。
7.一种区分发育性髋关节发育不良患者软骨组织和股骨颈骨折患者软骨组织的方法，其特征在于，所述的方法为：通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行realtimePCR扩增，分析长链非编码RNAH19的表达。
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