CN108660204B - lncRNA在制备诊断或治疗骨关节炎的产品上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了RP11‑848P1.5和/或RP11‑566K11.7在制备诊断或治疗骨关节炎的产品上的应用,并进一步证实RP11‑848P1.5和RP11‑566K11.7在骨关节炎组织中表达上调。本发明进一步公开了RP11‑848P1.5和RP11‑566K11.7用于制备检测骨关节炎的诊断试剂盒,所述试剂盒包括特异性扩增骨关节炎相关lncRNA的引物和说明书。本发明还公开了RP11‑848P1.5和RP11‑566K11.7在制备骨关节炎药物上的应用。利用RP11‑848P1.5和/或RP11‑566K11.7检测骨关节炎不仅能够快速有效的做到早期检测,而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7在制备诊断或治疗骨关节炎的产品上的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病,所述关节软骨覆盖在骨末端,形成关节的关节面。据报道有许多因素使患者易患骨关节炎,包括遗传易感性、肥胖症、意外或运动创伤、手术、药物和重体力需求。骨关节炎被认为是从关节软骨的损伤开始的。最普遍的两种对关节的损伤是运动相关损伤和长期"反复使用"关节损伤。最经常受骨关节炎影响的关节是膝、髋和手。在多数情况下,由于膝和髋必要的承重功能,这些关节中的骨关节炎比手骨关节炎更易导致残疾。随着软骨退化的发展,关节中和关节周围的其他组织(包括骨、肌肉、韧带、半月板和滑膜)中发生次级变化。软骨组织初级衰竭和其他组织次级损伤的净效应是患者发生疼痛、肿胀、虚弱和患病关节丧失机能。这些症状经常发展到具有严重影响的程度,如使患者丧失劳动力或影响生活质量。
关节软骨主要由软骨细胞、II型胶原、蛋白聚糖和水组成。关节软骨没有血或神经分布,软骨细胞是该组织中仅有的细胞类型。软骨细胞负责制造形成软骨基质的II型胶原和蛋白聚糖。其后该基质又具有允许用水使基质饱和的物理化学特性。这种结构功能关系的净效应是关节软骨具有特殊的耐磨特征,并且关节软骨面之间发生几乎无摩擦的移动。在未患骨关节炎时,关节软骨经常在甚至高需求的身体条件下提供终生的无痛承重和无限制的关节移动。
与所有的活组织一样,关节软骨持续地经历更新过程,其中去除(分解代谢活性)"老"细胞和基质组分并产生(合成代谢活性)"新"细胞和分子。相对于多数组织,关节软骨的合成代谢或分解代谢周转率较低。成熟软骨结构完整性的长期维持依赖于基质合成和降解之间适当的平衡。软骨细胞通过应答于来自其环境中的化学和机械剌激维持基质平衡。软骨细胞对这些剌激合适并有效的应答是软骨动态平衡所必需的。通过合成代谢活性不足或分解代谢活性过剩破坏动态平衡可引起软骨降解和骨关节炎(Adams等,1995,Nature377Suppl:3-174)。多数受到损伤和分解代谢活性提高的组织能够启动增强的合成代谢应答,允许组织复原。不幸的是,关节软骨应答于软骨基质损伤或消耗而上调其合成代谢活性以及提高合成蛋白聚糖和II型胶原的能力非常有限。
现有的骨关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、疼痛缓解技术、替代治疗和体重控制。治疗骨关节炎中常用的药物包括非甾族抗炎药如阿司匹林、布洛芬等;直接用于皮肤的局部疼痛缓解乳膏、橡胶和喷雾剂等。可进行手术以使骨表面重建、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗法己被用于治疗疾病,但是它们对长期控制和预防是无效的。此外,由于骨关节炎隐匿式发生并且发展缓慢,因此骨关节炎经常在疾病发展的晚期才得到鉴定,而不是潜在治疗可能更有效的疾病发展早期。因此预防、改变或治疗骨关节炎疾病过程中的进一步发展严重依赖于鉴定疾病的早期诊断标志物,从而允许早期干涉。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的标记物在诊断或治疗骨关节炎的产品上的应用。
为实现上述目的,本发明提供了RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7作为分子标记物在制备诊断或治疗骨关节炎的产品上的应用。
进一步地,所述RP11-848P1.5和RP11-566K11.7在骨关节炎生物学样品中均表达上调。
更进一步地,所述标记物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
优选地,所述产品为芯片、试剂盒。
本发明还提供了一种诊断骨关节炎的检测试剂,所述检测试剂包括特异性扩增RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7的引物以及说明书。
进一步地,所述特异性扩增RP11-848P1.5的引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示,所述特异性扩增RP11-566K11.7的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
本发明还提供了一种诊断骨关节炎的检测试剂盒,其特征在于,其包括检测样本中RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7表达情况的试剂。
进一步地,所述试剂盒包括特异性扩增RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7的引物。
本发明还提供了一种治疗骨关节炎的药物组合物,所述药物组合物包括含有抑制RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7表达的生物试剂。
进一步地,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
优选地,所述的药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于:稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
优选地,所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药:口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。所述的药物的制剂选自下组:片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
本发明的有益效果如下:
本发明首次公开了RP11-848P1.5和RP11-566K11.7与骨关节炎相关,并进一步证实了以上lncRNA在骨关节炎组织中表达上调,利用以上lncRNA检测骨关节炎,不仅能够快速有效的做到早期检测,还为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1 RP11-848P1.5在骨关节炎组织样本中的表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
实施例中未注明具体条件的实验方法,通常为本领域常规方法,如按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆,实验手册(第三版)(科学出版社,2002)中的所述条件,或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人对OA患者软骨组织样本及正常软骨组织样本进行高通量转录组测序,通过生物信息学方法进行基因筛选,挑选出差异表达明显的lncRNA RP11-848P1.5和RP11-566K11.7,现有研究中并没有RP11-848P1.5和RP11-566K11.7与骨关节炎相关的报道,进一步,发明人进行了分子生物学方法验证,证实了RP11-848P1.5和RP11-566K11.7在骨关节炎组织中表达上调。
本发明的RP11-848P1.5和RP11-566K11.7是在本发明之前的已知lncRNA,其基本信息如下:
RP11-848P1.5来源于已公开的人类基因组序列,位于人类17号染色体上,具体位置为chr17:31090786-31377677。
RP11-566K11.7来源于已公开的人类基因组序列,位于人类16号染色体上,具体位置为chr16:89873585-89938761。
本文使用的术语“骨关节炎”指关节炎的特定形式,特别是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病,所述关节软骨覆盖再形成关节面的骨末端上。
本文使用的术语“表达上调”指对应于所表达基因的序列,其中序列量的测量证明,与从正常个体或从通过骨关节炎分期确定与骨关节炎不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比,所述基因在从患骨关节炎或通过骨关节炎分期确定的骨关节炎已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平增加。根据本发明,“表达上调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更高的表达增加,例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高或者高于1倍,最高为2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更高。
本文使用的术语“表达水平”指通过本领域技术人员已知和本文所述的方法测定的给定核酸或蛋白质的可测量。涉及本发明分子标记物对应的lncRNA时,表达水平可以通过杂交或更多定量测量来测定,如包括使用SYBR绿、TaqMan和定量实时RT-PCR。
实施例1 高通量测序筛选差异表达基因
1、取样
取在北京协和医院骨科骨关节炎手术中获得软骨组织标本19例(平均年龄64.5岁,年龄范围58-75岁,2男性,17女性),所有标本均经病理学检查证实,诊断为膝关节骨性关节炎;正常软骨组织来自于北京协和医院骨科,为外伤手术病人关节软骨组织。获得的组织在编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究中所用的临床样本,均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。
2、对组织样本进行总RNA提取
收集样本后冻存于液氮,取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨,待组织样本成粉末状后:
①加入Trizol,室温保存5分钟;
②加氯仿0.2mL,用力振荡离心管,充分混匀,室温下放置5分钟-10分钟;
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70%)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀,置于冰上10分钟;
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液,按1mL/mL Trizol的比例加入75%DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存),洗涤沉淀物,振荡混合,4℃下12000rpm高速离心5分钟;
⑤弃去乙醇液体,室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀;
⑥用分光光度计(IMPLEN,CA,USA)测量RNA纯度及使用RNA Assay Kit in2.0 Flurometer检测试剂盒(Life Technologies,CA,USA)浓度,冻存于-80℃。通过分光光度计检测RNA样品的提取情况,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。
RNA质量判定标准:RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间;总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带;70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
RNA完整性评估使用RNA Nano 6000检测试剂盒以及生物分析仪2100系统(Agilent Technologies,CA,USA)。正常组和骨关节炎组各样本稀释至同一浓度,将正常组样本和骨关节炎组样本分别制备用于文库的构建和测序。
4、高通量测序
每个RNA样品输入3μg。首先利用Epicentre Ribo-zeroTMrRNA Removal试剂盒(Epicentre,USA)将上步提取的总RNA去除rRNA,然后用乙醇沉淀法清除rRNA游离残留物。再利用UltraTMDirectional RNA Library Prep试剂盒(NEB,USA)按照说明书制备测序文库,并在每个样品的属性序列中加入索引编码。将测序文库在NEBNext的第一链合成反应缓冲液(First Strand Synthesis Reaction Buffer,5×)中利用二价阳离子进行高温下裂解。利用随机引物(random hexamer primer)和M-MuLV反转录酶合成第一链cDNA。随后用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成,反应缓冲液中,用dUTP代替dNTPS中的dTTP。再用聚合酶和外切核酸酶把cDNA片段转换成平末端。将DNA片段3’端磷酸化之后,与带有发夹结构的NEBNext Adaptor连接以备杂交。为了选择长度约为150~200bp的cDNA片段,用ApHealthXP系统(Beckman Coulter,Beverly,USA)对文库片段进行纯化。然后用3μL的USER Enzyme(NEB,USA)进行大小选择,在37℃下连接cDNA进行15分钟,再在95℃下进行5分钟。使用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR。根据说明书在cBot ClusterGeneration系统上使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂盒(Illumia)进行索引编码样本的聚类,再通过Illumina Hiseq 4000平台进行高通量测序,获得Sequenced Reads,之后在参考有关物种参考序列或基因组的情况下,进行生物信息分析。
4、检测数据分析
4.1Reads质量控制
上步中获得的Fastq形式的数据首先通过原始数据内部脚本编程,去掉带接头的reads、包含多聚N的reads以及低质量的reads得到clean data。同时,计算clean data的Q20、Q30和GC含量。所有的后续分析都基于高质量的clean data。
4.2Reads比对参考基因
基因组和基因组模型注释文件直接从基因组站点下载。参考基因组索引通过bowtie2v2.2.8进行构建,双端的clean reads通过HISAT2v2.0.4.HISAT2与参考基因组比对。采用HISAT2对过滤后的reads进行参考基因组的比对分析,正常情况下,如果参考基因组选择合适,而且相关实验不存在污染,实验样品测序所产生的reads比对的百分比会高于70%(Total Mapped Reads or Fragments)。
4.3转录本拼接
StringTie利用HISAT2比对的结果进行转录本的拼接,能得到尽可能小的转录本集合,并能对转录本进行定量分析。
4.4lncRNA的筛选
在进行筛选之前,我们首先使用Cuffmerge软件,对各样品拼接得到的转录本进行合并,并去掉其中链方向不确定的转录本,得到本次测序完整的转录组信息。之后,对合并的转录本集合进行lncRNA的筛选,主要步骤如下:
步骤1:转录本exon个数筛选:过滤转录本拼接结果中大量低表达量,低可信度的单外显子转录本,选择exon个数>=2的转录本;
步骤2:转录本长度筛选:选择转录本长度>200bp的转录本;
步骤3:转录本已知注释筛选:通过Cuffcompare软件,筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本,并将数据库中,与本次拼接转录本exon区域有重叠的lncRNA作为数据库注释lncRNA纳入到后续分析;
步骤4:转录本表达量筛选:通过Cuffquant计算每条转录本的表达量,选择FPKM>=0.5的转录本;
步骤5:编码潜能筛选:是否具有编码潜能是判断转录本是否为lncRNA的关键条件。针对拼接得到的转录本,综合了目前主流的编码潜能分析方法进行该项筛选,取这些软件分析结果中没有编码潜能的转录本的交集作为本次分析预测得到的lncRNA数据集,然后将至少被一种编码潜能预测软件认为有编码潜能的转录本作为本次分析的TUCP(transcripts of uncertain coding potential),这些转录本中,可能包含一部分具有一定编码潜能的lncRNA,因此我们将它们作为单独的一类转录本纳入到了后续的分析(Cabili MN et al.,2011)。
4.5定量分析
筛选得到lncRNA转录本和TUCP(transcripts of uncertain coding potential)转录本之后,使用Cuffdiff软件对包括mRNA,lncRNA以及TUCP在内的转录本进行定量分析。
4.5lncRNA的表达水平分析
将lncRNA,TUCP以及mRNA的表达量进行比较分析,得到不同类型转录本整体表达水平的差异。具体方法为对各个转录本的表达量在不同样品间取平均值,然后根据lncRNA,TUCP以及mRNA的各转录本log10(FPKM+1)数值分别绘制violin图。
通过所有转录本的FPKM的箱形图和密度分布图对不同实验条件下的表达水平进行比较。对于同一实验条件下的重复样品,最终的FPKM为所有重复数据的平均值。
4.6 lncRNA差异表达分析结果
差异表达分析使用Cuffdiff。从统计学意义的角度上考虑,将不同类型转录本(lncRNA,TUCP和mRNA)整体进行差异分析,结果无分子类型的偏好。
4.7差异表达circRNA的进一步分析
为了更好的理解差异表达基因的功能,我们对差异表达基因进行了GeneOntology(GO)分析、信号通路(KEGG)分析,并对差异表达基因进行功能注释,鉴于以上数据分析的结果,结合文献我们筛选了差异表达的RP11-848P1.5和RP11-566K11.7用于本申请的研究,以上lncRNA在OA患者的软骨组织样本中表达上调。
实施例2 RT-PCR验证OA患者的软骨组织RP11-848P1.5和RP11-566K11.7表达情况
1、材料
20例骨关节炎软骨组织样本取自北京协和医院骨关节炎手术中(平均年龄65岁),对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实,对照组为半月板损伤及交叉韧带损伤进行关节镜手术治疗的患者。所有样本编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、方法
2.1对组织样本进行总RNA提取,同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
使用逆转录试剂盒,用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μL反应体系,每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。
2.3 Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪,采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件,基因序列参照人类基因组chr17:31090786-31377677(RP11-848P1.5)和chr16:89873585-89938761(RP11-566K11.7),内参选GAPDH,引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下:
表1引物序列
操作过程如下:
表2 Real Time反应体系
组分 | 加入量 |
2×mix | 10μL |
上游引物(10μM) | 0.5μL |
下游引物(10μM) | 0.5μL |
模板 | 2μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至25μL |
用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen,货号4367659)分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。实验操作按产品说明书进行。扩增程序为:95℃5min,(95℃ 15sec,60℃ 45sec,72℃ 35sec)×40个循环。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。反应结束后,取5μl的PCR产物进行2%琼脂糖电泳,用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为71bp和140bp的片段进行切胶回收并测序,结果用blast软件进行同源性分析。
3、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚,扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,基线平而无上扬现象,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线都是单峰,说明扩增产物只有一条,为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2-ΔΔCt×100%,比较RP11-848P1.5和RP11-566K11.7在骨关节炎组织和正常组织中的表达水平。结果显示:qRT-PCR扩增结果稳定,其中RP11-848P1.5在骨关节炎组织中的表达水平约为正常组织的45倍,RP11-566K11.7在在骨关节炎组织中的表达水平约为正常组织的29倍,log2Fold_change=log2(正常组织样本/骨关节炎组织样本),具体见图1,以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析RP11-848P1.5和RP11-566K11.7在骨关节炎患者中表达上调的结果;RT-PCR产物经回收后,在ABI3730全自动测序仪上测序,核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。用Vector NTI advance 10软件(Invitrogen公司)将该序列与RP11-848P1.5和RP11-566K11.7整个lncRNA序列进行比对,比对结果显示,如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为RP11-848P1.5基因的一部分序列,SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为RP11-566K11.7基因的一部分序列符合率为100%。
实施例3骨关节炎诊断试剂盒
基于实施例2得到的引物组,组装本发明所述的用于骨关节炎的试剂盒,所述试剂盒包括特异扩增RP11-848P1.5的引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示,和/或特异扩增RP11-566K11.7的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示,和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系,如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCL,2.5mMMgCL2,200mM(NH4)2SO4;还包括骨关节软骨正常组织cDNA:作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测,每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。
通过对引物浓度和退火温度的优化,确定最佳反应体系如表5所示:
表5 PCR反应体系
组分 | 加入量 |
SYBR Green聚合酶链式反应体系 | 12.5μL |
上游引物(10μM) | 0.5μL |
下游引物(10μM) | 0.5μL |
模板cDNA | 2.0μL |
加入灭菌蒸馏水 | 至25μL |
最佳反应条件为:
95℃预变性5min,(95℃变性15sec,60℃退火45sec,72℃延伸35sec)×40个循环,72℃延伸15min。
实施例4骨关节炎诊断试剂盒检测效果
取30例待检测骨关节炎就诊患者的少量软骨组织细胞,来自北京协和医院骨科。本研究的所有临床样本,均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从软骨组织细胞中提取RNA,使用试剂盒中试剂,按照最佳反应体系与条件进行PCR反应,使用试剂盒中正常软骨组织cDNA作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA,检测组织样本的RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7相对正常软骨组织表达量变化,分析检测结果,样本和对照间比较采用t检验,P<0.05为差异显著,判为检测样本阳性。
1、RP11-848P1.5作为分子标记物的试剂盒的检测效果
检测结果显示,在30例待检测病人中,有23例病人的RP11-848P1.5在骨关节炎软骨细胞表达水平为正常组织中的10-40倍,另外7例表达量未发现差异。经临床进一步检测,结果与本发明制备的试剂盒检测结果基本一致。据此推断,本诊断试剂盒可以明确区分出骨关节炎患者,并以此为临床提供诊断线索。
2、RP11-566K11.7作为分子标记物的试剂盒的检测效果
检测结果显示,在30例待检测病人中,有21例病人的RP11-566K11.7在骨关节炎软骨细胞表达水平为正常组织中的5-25倍,另外9例表达量未发现差异。经临床进一步检测,结果与本发明制备的试剂盒检测结果基本一致。据此推断,本诊断试剂盒可以明确区分出骨关节炎患者,并以此为临床提供诊断线索。
3、RP11-848P1.5和RP11-566K11.7作为分子标记物的试剂盒的检测效果
检测结果显示,在30例待检测病人中,有25例病人的RP11-848P1.5和RP11-566K11.7在骨关节炎软骨细胞表达水平为正常组织中的5-35倍,另外5例表达量未发现差异。经临床进一步检测,结果与本发明制备的试剂盒检测结果基本一致。据此推断,本诊断试剂盒可以明确区分出骨关节炎患者,并以此为临床提供诊断线索。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> lncRNA在制备诊断或治疗骨关节炎的产品上的应用
<130> P18022
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gccggttacc tgctcgtcga agcggctgac cacggcctgg acccattcca ccggcctgtg 60
cgcggccatg t 71
<210> 2
<211> 140
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
tatccaccgc catgtgatcc tctctgagat caaggaagcc gtcgctgccc tgcccccggc 60
taagtcctat cagccatgga aacaccattg ctctcttctt ccggtcactg ttgccaaact 120
ataccatgga gcacagacgc 140
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gccggttacc tgctcgtc 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
acatggccgc gcacag 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
tatccaccgc catgtgatcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gcgtctgtgc tccatggtat 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
Claims (4)
1.RP11-848P1.5和/或RP11-566K11.7作为分子标记物在制备诊断骨关节炎的产品上的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述RP11-848P1.5和RP11-566K11.7在骨关节炎生物学样品中均表达上调。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述标记物包括如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为芯片、试剂盒。
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CN105194690A (zh) * | 2015-11-03 | 2015-12-30 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 长链非编码rna在发育性髋关节发育不良疾病中的应用 |
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expression of lncRNAs in low-grade gliomas and glioblastoma multiforme:an in silico analysis;Brian J.Reon等;《PLOS Medicine》;20161206;第13卷(第12期);第9页第4段和表S3 * |
long noncoding RNA related to cartilage injury promotes chondrocyte extracellular matrix degradation in osteoarthritis;Qiang Liu等;《arthritis & rheumatology》;20140430;第66卷(第4期);摘要 * |
骨关节炎长链非编码RNA及信使RNA表达谱的构建与分析;张海斌;《万方》;20170904;第1-76页 * |
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