CN108165630B - 与nk/t细胞淋巴瘤的过度炎症反应相关的突变位点及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与NK/T细胞淋巴瘤的过度炎症反应相关的突变位点及应用，属于医学检测领域。申请人首次发现NF‑κB信号通路中进化保守的接头蛋白ECSIT基因在约20％的NK/TCL患者中都存在V140A的突变，并进一步利用收集丰富的NK/TCL临床样品和病例资料做进一步验证，揭示了ECSIT基因V140A突变激活NF‑κB信号通路诱导炎症反应的作用和机制，并检测靶向ECSIT对NK/TCL的潜在疗效，大规模临床样本分析表明ECSIT突变与肿瘤生存及预后的相关性。本发明研究成果为NK/T细胞淋巴瘤辅助诊断或肿瘤治疗/预后评估提供理论基础，为改善NK/TCL的治疗效果提供新的突破口。

Description

与NK/T细胞淋巴瘤的过度炎症反应相关的突变位点及应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及与NK/T细胞淋巴瘤的过度炎症反应相关的突变位点及应用。
背景技术
NK/T细胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma,NK/TCL)属结外非霍奇金淋巴瘤，是一种具有独特生物学特性的淋巴瘤亚型，好发于鼻咽，我国较西方国家多见，发病率可占非霍奇金淋巴瘤的5-10％。
NK/T细胞淋巴瘤虽然好发于鼻腔，但是与鼻咽癌有较大区别。目前鼻咽癌的治疗已取得比较明显进展，经治疗后患者5年生存率超过50％。而NK/TCL疾病进展快，具高度侵袭性，预后不良。经放疗或放化疗结合治疗，早期NK/TCL患者5年生存率为30％-70％，晚期NK/TCL患者的5年生存率仅为7％-31％。
目前医学界并未研究清楚NK/TCL发病机制，所以对于NK/TCL患者的治疗还是采用传统的放、化疗，对于II期以上的NK/TCL患者来说传统放化疗根本难以改善患者生存。而NK/TCL肿瘤在早期时就能及时得到发现的情况是比较少见的，多数是在中晚期发现，最终导致了NK/TCL患者的预后不良。
所以研究NK/TCL发病机制对于NK/TCL的早期筛查，以及NK/TCL发病过程中的治疗和预后的评估等都具有重大意义。
炎症(Inflammation)是机体组织对内外环境的有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应。它既是一种保护性防御反应，亦是引起人体多种重要疾病的共同通路。1863年，Rudolf Virchow观察到肿瘤组织中存在炎症细胞，并首次提出了炎症和肿瘤存在关联的假设。目前，炎症与肿瘤之间因果联系的临床证据主要来自于流行病学研究。流行病学(epidemiology)是研究特定人群中疾病、健康状况的分布及其决定因素，并研究防治疾病及促进健康的策略和措施的科学。流行病学是预防医学的一个重要组成部分，是预防医学的基础。流行病学研究证实，炎症患者更易继发各种肿瘤，约15％-20％的肿瘤患者中都存在潜在的炎症。也即，流行病学仅发现了炎症与肿瘤的相关性，而炎症的致瘤机制仍不清楚，一般认为炎症反应中巨噬细胞(macrophages)、T细胞、树突状细胞(dendritic cells)等分泌的大量炎性介质激活NF-κB信号通路，NF-κB家族广泛调控一系列基因的表达，促进癌症的发生发展。NF-κB是一类能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子。NF-κB家族由P50、P52、RelA、c-Rel和RelB五个成员组成，通过同源或异源二聚体的形式形成不同的转录因子。NF-κB家族的调控包括：如通过转录cyclin D1、c-MYC等促进肿瘤细胞增殖，转录MMP-9、VCAM-1等促进肿瘤转移，转录VEGF等促进肿瘤中血管生成。同时，转录IL-6、TNF-α等炎症因子进一步促进了炎症反应的发生。
虽然流行病学发现了炎症与肿瘤的相关性，但是由于炎症反应的细胞信号通路非常复杂，而且肿瘤根据发生的位置不同，其特点和发病机理也是千差万别的。所以在没有经过系统研究的情况下，很难说随意靶向一些炎症反应的信号通路的节点就可以获得治疗的效果，因为也可能会获得危害巨大的反作用。
NK/TCL的发生发展与炎症相关，多数NK/TCL患者在发病前有多年“慢性鼻炎”病史，在就诊时有明显的发热、溃疡糜烂、坏死等炎症表现。该病好发于面部中线如鼻腔、鼻咽和口咽等部位，且以面部中线部位的进行性损坏性破坏为特征，因此也称为“中线致死性肉芽肿”；后期常浸润至周围组织造成严重坏死。其他淋巴结外病变部位如皮肤可表现为结节、溃疡和黏膜红斑等；胃肠道受累可引起腹痛、肠梗阻或穿孔等。此外，NK/TCL无论是在病程初期还是晚期均容易出现噬血细胞综合症，表现为发热、肝脾肿大、血乳酸脱氢酶升高等。NK/TCL病灶局部的炎症细胞浸润更为明显，可见大量炎症细胞(包括巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、粒细胞)，而肿瘤细胞较少。免疫组化检测炎症因子如IL-1，TNF-α，IL-6等呈阳性。
因此，NK/TCL是具有明显炎症背景的恶性肿瘤，而目前NK/TCL中关于炎症促进肿瘤发生发展的机制研究还很少。Nagato等检测SNK-6及SNT-8两株NK/TCL细胞系，发现IL-9,IL-10,IP-10等因子高表达。Ho等检测了3例NK/TCL病例的组织，发现IL-6,TNF-α,IL-10,IL-1Rα等升高。上述研究仅仅是说明NK/TCL的发生伴随着大量的炎性因子的释放，但由于出现异常的炎性因子很多，这些研究并未指明哪一类因子在NK/TCL中起主要作用，无法对这些因子一一进行靶向。
目前，系统性研究NK/TCL患者中炎症状态的调控机制，包括分子机制，尤其是其中细胞遗传学基础，及炎症状态的调控机制在NK/TCL发生发展中的具体作用还未见报道。
此外，NK/T细胞淋巴瘤是相对小众的恶性肿瘤，在国际上的一些肿瘤信息平台，如Tumorscape中并没有相关的标本数据，所以在研究时会存在一定的难度，需要研究者自行获取相关足够数量的标本做研究，此外还需要在大量标本中进行验证，非本行业技术人员可以随意得到的。
发明内容
本发明的目的在于提供与NK/T细胞淋巴瘤的过度炎症反应相关的突变位点、应用及相关试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种与肿瘤相关的突变位点，所述突变位点为ECSIT氨基酸序列的V140A。
ECSIT(Evolutionarily conserved signaling intermediate in Tollpathway)基因为Toll信号通路上重要的调节基因，NCBI登记号(Gene ID)为51295。ECSIT基因编码的蛋白(NP_057665.2)全长为431个氨基酸。V140A描述的是在该蛋白第140位的氨基酸由缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)，V140A的写法为本行业的公知常识。
优选的，ECSIT氨基酸序列的V140A所对应的ECSIT基因的突变情况包括：编码ECSIT氨基酸序列第140位氨基酸的遗传密码子对应的DNA由GTC突变为GCC，或DNA互补位置的CAG突变为CGG，导致遗传密码子对应的缬氨酸突变为丙氨酸。也即，人类基因组19号染色体第11624714位碱基由T突变为C，或者互补位置的碱基A突变为G，使这一位置的遗传密码子由GTC突变为GCC，或互补位置的CAG突变为CGG，导致该基因编码蛋白的第140位的氨基酸由缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)。
优选的，所述肿瘤为NK/T细胞淋巴瘤。
一种与NK/T细胞淋巴瘤相关的突变位点，所述突变位点为ECSIT氨基酸序列的V140A。
优选的，ECSIT氨基酸序列的V140A所对应的ECSIT基因的突变情况包括：编码ECSIT氨基酸序列第140位氨基酸的遗传密码子对应的DNA由GTC突变为GCC，或DNA互补位置的CAG突变为CGG，导致遗传密码子对应的缬氨酸突变为丙氨酸。
一种引起NK/T细胞淋巴瘤炎性反应的突变位点，所述突变位点为ECSIT氨基酸序列的V140A。
优选的，ECSIT氨基酸序列的V140A所对应的ECSIT基因的突变情况包括：编码ECSIT氨基酸序列第140位氨基酸的遗传密码子对应的DNA由GTC突变为GCC，或DNA互补位置的CAG突变为CGG，导致遗传密码子对应的缬氨酸突变为丙氨酸。
用于检测上述任一项所述突变位点的试剂在制备NK/T细胞淋巴瘤辅助诊断或肿瘤治疗/预后评估试剂中的应用。
优选的，用于检测突变位点V140A的试剂包括用于扩增包括突变位点V140A在内的ECSIT基因片段的特异性引物对及扩增相关试剂、和/或测序分析扩增得到包括突变位点V140A在内的ECSIT基因片段所用的试剂、或利用飞行时间质谱平台检测V140A所用的试剂、或利用实时荧光定量PCR检测V140A所用的试剂。
一种NK/T细胞淋巴瘤的诊断试剂盒，所述试剂盒含有检测上述任一项所述突变位点的试剂。
一种NK/T细胞淋巴瘤的治疗评估试剂盒，所述试剂盒含有检测上述任一项所述突变位点的试剂。
一种NK/T细胞淋巴瘤的预后评估试剂盒，所述试剂盒含有检测上述任一项所述突变位点的试剂。
ECSIT基因突变位点V140A在制备NK/T细胞淋巴瘤的动物模型中的应用。
一种联合抑制肿瘤的组合物，含有能够抑制ECSIT V140A突变引起的炎症反应的药物。
优选的，所述药物包括地塞米松、沙利多胺、硼替佐米中的至少一种。
优选的，所述药物包括地塞米松和沙利多胺。
由于ECSIT基因突变后激活NF-KB信号通路，申请人采用地塞米松(dexamethasone)与沙利多胺(thalidomide)联合治疗，能有效抑制NF-KB信号通路，进而抑制ECSIT基因突变导致的过度炎症反应，提高病人生存。
本发明的有益效果是：
申请人首次发现NF-κB信号通路中进化保守的接头蛋白ECSIT基因在约20％的NK/TCL患者中都存在V140A的突变。并进一步利用收集丰富的NK/TCL临床样品和病例资料做进一步验证，揭示了ECSIT基因V140A突变激活NF-κB信号通路诱导炎症反应的作用和机制，并检测靶向ECSIT对NK/TCL的潜在疗效，大规模临床样本分析表明ECSIT突变与肿瘤生存及预后的相关性，其中，申请人在53例NK/TCL病例中发现14例病人肿瘤中带有ECSIT V140A突变，未携带ECSIT V140A突变的病人中生存期为42个月，而携带ECSIT V140A突变的病人中生存期仅为9个月，两组病人的生存差异显著(log-rank test，p＝0.0026)。本发明研究成果为NK/TCL中靶向ECSIT的治疗提供理论基础，为改善NK/TCL的治疗效果提供新的突破口。
附图说明
图1：sanger测序验证39个体细胞突变的结果。
图2：qPCR实验验证ECSITV140A对NF-KB通路的激活；其中EV为空载；WT为野生型ECSIT；MU为V140A突变型ECSIT。
图3：western blot验证ECSITV140A对NF-KB通路的激活；其中EV为空载；WT为野生型ECSIT；MU为V140A突变型ECSIT。
图4：免疫荧光技术验证ECSITV140A对NF-KB通路的激活；其中EV为空载；WT为野生型ECSIT；MU为V140A突变型ECSIT。
图5：NK/TCL肿瘤标本中p52表达评分标准。
图6：NK/TCL病人肿瘤标本中ECSIT突变状态与NF-KB激活的相关性；其中，WT指不含ECSIT V140A突变的肿瘤样品，MU指含有ECSIT V140A突变的肿瘤样品。
图7：ECSIT V140A突变与NK/TCL病人预后的相关性。
图8：地塞米松和沙利多胺联合用药能有效抑制ECSIT V140A突变引起的炎症因子(TNFa和IFNr)释放。
具体实施方式
申请人及其课题组通过收集丰富的NK/TCL临床样品和病例资料用于本发明的研究，其中包括5对NK/TCL样品(肿瘤活检组织以及癌旁正常组织)，NK/TCL石蜡组织样品77份，血清样品59份；这为在临床样品中验证ECSIT V140A突变在NK/TCL发生发展中的作用提供了基础条件。
下面进一步用相关实验用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实验一、测序和Sequenom质谱分析实验
收集NK/TCL细胞淋巴瘤患者活检组织，其中肿瘤细胞含量(tumor content)需≥80％，同时收集癌旁正常组织。提取DNA后利用Agilent液相芯片抓取基因组的外显子区，然后利用Illumina HiSeq2000进行测序。因为人类基因组总大小为3Gbp，而外显子区只有50Mbp左右，所以抓取外显子后再进行测序能显著降低成本，提高基因区的测序深度(Sequencing depth)。
体细胞突变是指除性细胞外的体细胞发生的突变。体细胞突变不会造成后代的遗传改变，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变，而且绝大部分体细胞突变无表型效应。申请人对NK/T细胞淋巴瘤患者活检组织的外显子区进行测序后利用Samtools或GATK等软件进行分析，得到只在癌组织中突变而正常组织中与参考序列一致的位点，确定为体细胞突变(somatic mutation)。
具体的，5对NK/TCL样品的外显子进行分析，共发现43个体细胞突变(somaticmutation)，结果见表1。
表1、5对NK/TCL病人癌-癌旁样品外显子测序结果
Figure BDA0001486870930000051
Figure BDA0001486870930000061
其中，测序深度(Sequencing Depth)：测序得到的碱基总量(bp)与基因组大小(Genome)的比值，它是评价测序量的指标之一。测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。
表1结果显示：对5对NK/TCL样品(包括肿瘤组织和癌旁正常组织)的外显子区进行分析，平均测序深度(depth)多数都>60X，符合生物信息学分析的要求。在5对样品中共发现42个体细胞突变(somatic mutation)。
实验二、Sanger测序验证
利用Sanger测序法，在5对样品中验证通过生物信息学找到的42个体细胞突变，其中39个突变可以成功验证，验证结果见图1。
其中，V140A突变是基因组19号染色体第11624714位的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)，导致该基因编码蛋白的第140位氨基酸由缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)。
实验三、Sequenom质谱分析实验
随后利用Sequenom质谱分析平台分析上述体细胞突变(39个)在大量肿瘤样品(77个石蜡样品+6个新鲜组织样品，以及上述利用新一代测序技术分析的5对癌-癌旁样品，共88个样品)中的突变频率，寻找高频突变的位点，定义为肿瘤的“驱动突变”(drivermutation)，明确肿瘤发生发展的遗传基础。
具体结果见表2。
表2、8个重复出现突变(recurrent mutation)在88个NK/TCL样品中的频率
Figure BDA0001486870930000062
Figure BDA0001486870930000071
表2结果显示：检测39个体细胞突变在88例NK/TCL样品中的频率，一共发现8个重复出现突变(recurrent mutation，出现次数≥2)，其中ECSIT基因V140A突变频率最高，在88例样品中出现了17次，约为20％，是NK/TCL中的驱动突变(driver mutation)。
其中，出现17次的V140A突变均是基因组19号染色体第11624714位的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)，导致该基因编码蛋白的第140位氨基酸由缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)。
实验四、ECSIT V140A突变激活NF-KB信号通路
NF-KB信号通路是控制炎症反应的中心信号通路，其转录功能主要由p65和p52这两个转录因子控制，上游基因还包括IKBa，IKBb，IKK等。NF-KB信号通路的激活依赖于IKBa和IKBb的降解(蛋白表达量降低)，IKKb的磷酸化(磷酸化IKKb的表达量增高)，以及p65和p52从细胞质转移到细胞核中(细胞核内p65和p52的表达量增高)，行使转录因子的功能，促进下游基因的表达。
为研究ECSIT V140A的作用机制，申请人分别构建了转入空载体(empty vector，EV)，野生型ECSIT(wild type，ECSITWT)，以及V140A突变型ECSIT(ECSITV140A)的NK/TCL细胞系(SNK6以及NKYS)，利用新一代测序技术分析这些细胞的转录组与NF-KB信号通路的关键基因、蛋白的相关性，发现NF-KB信号通路在转入ECSITV140A的NK/TCL细胞系中显著高表达。
随后利用qPCR技术对NF-KB上10个基因的表达进行了检测，结果见图2。图2结果显示在转入ECSITV140A的细胞中NF-KB目标蛋白的表达量明显升高，其中IL1b，TNFa，IFNr等基因都有10倍以上表达量的增高。
利用western blot分析，结果见图3。图3结果显示：在转入ECSITV140A的细胞中，IKBa和IKBb的表达量明显降低，磷酸化IKK的表达量明显升高，细胞核内的p65和p52的表达量明显升高，进一步说明了ECSITV140A对NF-KB的激活作用。
利用免疫荧光技术，申请人也发现在转入ECSITV140A的细胞中，p65和p52有明显向细胞核内转移的现象，结果见图4。与qPCR和western blot分析的结果一致，验证了ECSITV140A能显著激活NF-KB信号通路。
通过上述的研究分析，申请人首次发现NF-κB信号通路中进化保守的接头蛋白ECSIT基因在约20％的NK/TCL患者中都存在V140A的突变。为了进一步对其的机理进行研究，本发明利用收集丰富的NK/TCL临床样品和病例资料做进一步验证。
实验五、ECSIT V140A突变与NK/TCL病人的过度炎症相关
对88例NK/TCL病人的肿瘤组织样品进行免疫组化分析，检测肿瘤标本中NF-KB(包括p65和p52)的表达，发现p65在大部分病人中都不表达，对病人肿瘤标本中p52的表达进行评分，具体评分结果见图5。图5中，<10％细胞核表达p52评为“-”，10-30％细胞核表达p52评为“+”，30-50％细胞核表达p52评为“++”，>50％细胞核表达p52评为“+++”。
通过比较，发现在含有ECSIT V140A突变的病人肿瘤标本中，p52核表达的阳性比率明显增高，证明ECSIT V140A突变在NK/TCL病人肿瘤样品中NF-KB的激活明显相关，具体结果见图6。由于NF-KB信号通路是控制炎症的中心信号通路，这也证明了ECSIT V140A突变与NK/TCL病人的过度炎症相关。
实验六、ECSIT V140A突变与NK/TCL病人的预后相关
在88例NK/TCL肿瘤标本中，选取53例有详细临床资料的标本，分析ECSIT V140A突变与病人预后的相关性，具体结果见图7。
图7结果显示：带有ECSIT V140A突变的病人明显预后较差。
实验七、同时使用地塞米松和沙利多胺能有效抑制ECSIT V140A突变引起的过度炎症反应
为了在NK/TCL中抑制ECSIT V140A突变引起的过度炎症反应，申请人在转入了ECSITV140A的细胞中测试了3种常用抗炎药物：地塞米松(DEXA)，沙利多胺(THAD)，硼替佐米(BOTZ)，3种抗炎药物的单独使用以及联用的效果，结果见图8。
图8结果显示：地塞米松和沙利多胺处理二者联合用药比单独用地塞米松能更明显抑制TNF-a和IFN-r这两类重要炎症因子的释放，也优于地塞米松和硼替佐米联用的效果，证明地塞米松和沙利多胺的联合用药在治疗ECSIT V140A突变引起的过度炎症反应的潜在应用价值。

Claims (3)

1.检测突变位点V140A的试剂在制备NK/T细胞淋巴瘤检测或预后评估试剂中的应用，其特征在于：所述突变位点为ECSIT氨基酸序列的V140A。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述ECSIT氨基酸序列的V140A所对应的ECSIT基因的突变情况包括：编码ECSIT氨基酸序列第140位氨基酸的遗传密码子对应的DNA由GTC突变为GCC，或DNA互补位置的CAG突变为CGG。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测突变位点V140A的试剂包括用于扩增包括突变位点V140A在内的ECSIT基因片段的特异性引物对及扩增相关试剂、和/或测序分析扩增得到包括突变位点V140A在内的ECSIT基因片段所用的试剂、或利用飞行时间质谱平台检测V140A所用的试剂、或利用实时荧光定量PCR检测V140A所用的试剂。
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