ES2646212T3 - Ensayo de diagnóstico para determinar el estado de trasplante de tejidos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para determinar el estado de un tejido de donante implantado en un receptor, comprendiendo dicho procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de ácidos nucleicos circulatorios que tienen un polimorfismo de variación en el número de copias (CNV) que indica que son ácidos nucleicos procedentes de un donante, donde la presencia de dichos ácidos nucleicos circulatorios de donante es indicativa de un daño celular del tejido trasplantado y la ausencia de dichos ácidos nucleicos circulatorios de donante o un nivel de dichos ácidos nucleicos circulatorios de donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de daño celular o de un daño celular en un nivel aceptable

Description

DESCRIPCION

Ensayo de diagnostico para determinar el estado de trasplante de tejidos 5 DATOS DE PRESENTAClON

La presente solicitud esta asociada con y reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional australiana n° 2011904235, presentada el 7 de octubre de 2011, con el tftulo "Ensayo de diagnostico para determinar el estado de trasplante de tejidos".

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CAMPO

La presente descripcion se refiere en general a trasplante de tejidos, incluidos organos. En la presente memoria descriptiva se ensena un ensayo de diagnostico de base genetica para determinar el estado de un procedimiento de 15 trasplante de tejido en un receptor basado en una caracterizacion de un material acelular de acidos nucleicos circulantes u otros. La presente descripcion permite definir kits, cebadores y protocolos para determinar el estado de un procedimiento de trasplante.

ANTECEDENTES

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Al final de la descripcion se recogen en orden alfabetico los detalles bibliograficos de las publicaciones referidas por el autor de la presente memoria descriptiva.

Las referencias a cualquier tecnica anterior en la presente memoria descriptiva no constituyen, y no deben 25 entenderse como tales, un reconocimiento o cualquier forma de indicacion de que esta tecnica anterior forma parte del conocimiento general comun en cualquier pafs.

El trasplante de tejidos, incluidos organos, es un procedimiento medico importante para sustituir un tejido enfermo o traumatizado en un receptor paciente por un tejido de donante de un donante compatible geneticamente o con 30 histocompatibilidad. El exito o no de un procedimiento de trasplante se determina en la actualidad principalmente por un analisis histologico invasivo de material de biopsia. Sin embargo, el analisis histologico tiene un alto grado de error de muestreo, es invasivo, tiene baja sensibilidad, puede causar potencialmente danos en el tejido, requiere un alto grado de experiencia tecnica y por tanto resulta costoso.

35 A escala mundial, el numero de pacientes que necesitan un trasplante de organos supera con mucho la disponibilidad de organos adecuados. La capacidad de identificar de forma temprana el rechazo del organo trasplantado permitina a un medico intervenir con un tratamiento inmunosupresor adecuado y salvar el organo y potencialmente la vida del paciente. La reduccion del nivel de insuficiencia del organo debido al rechazo aumenta la disponibilidad de organos de donantes para otros pacientes y reduce significativamente el coste global.

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Los trasplantes de rinon suponen mas del 50% de todos los trasplantes de organos en Australia. Este porcentaje probablemente aumentara con el tiempo donde el numero de pacientes que reciben dialisis aumenta a un ritmo de aproximadamente el 60% al ano. En 2010, el coste de proporcionar dialisis y servicios de servicios de trasplante de rinon fue de aproximadamente 1.000 millones de dolares australianos (Howard y col. (2009) Nephrology 14:12345 132; Cass y col. (2010) Kidney Health Australia 27).

El coste medio de proporcionar dialisis es de 61.659 dolares australianos por persona y ano. Este valor contrasta con los 81.549 dolares australianos para un trasplante de rinon con costes adicionales de 11.770 dolares australianos al ano. Por ello, la capacidad de facilitar con exito trasplantes de rinon presenta importantes beneficios 50 economicos aparte de la mejora en la esperanza de vida y la mejor calidad de vida para los receptores de un trasplante de rinon con exito en comparacion con los que reciben dialisis.

La presencia de ADN circulante o sin celulas fue comunicada por primera vez por Mandel y col. (1948) C.R. Acad. Sci Pans 142:241-243. El ADN circulante puede aparecer despues de procesos como la apoptosis y la necrosis de 55 tejido (Giacona y col. (1998) Pancreas 17:89-97). En pacientes con cancer, el ADN circulante puede identificarse como procedente de celulas cancerosas sobre la base de oncogenes, alteraciones de microsatelites y otros biomarcadores geneticos en el ADN (Diehl y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci USA 102:16368-16373; Diehl y col. (2008) Nat. Med. 14:985-990). Por ello, el ADN circulante se ha usado en estudios de genotipado para detectar procesos patologicos y como un indicador de la salud de una persona o un feto.

La solicitud de patente internacional n° WO-2011/057.061 propuso un enfoque genetico para vigilar la presencia de ADN de tejido de donante en una muestra del receptor. El procedimiento se baso en determinar un perfil genetico del ADN del receptor y el donante de manera que la deteccion de ADN del donante libre proporciona una indicacion de que las celulas del donante se estaban destruyendo. El enfoque propuesto exigfa, sin embargo, el genotipado del 5 receptor y el donante con el fin de determinar un marcador genetico apropiado que fuera definitivamente acido nucleico del donante. Ademas, el perfil genetico se centraba principalmente en mutaciones o polimorfismos tales como polimorfismos de nucleotidos individuales, repeticiones en tandem en numero variable, minisatelites, polimorfismos de di-, tri- y tetra-nucleotido y similares.

10 Lee y col. (2006) Transfusion 46:1870-1878 utilizaron polimorfismos de insercion-delecion bialelicos para caracterizar el microquimerismo. Posteriormente, Abbott Laboratories produjo un ensayo basado en PCR en tiempo real para detectar 34 polimorfismos de insercion-delecion bialelicos.

Wu y col. (2009) Nature Medicine 15(2):215-219 usaron sondas de delecion polimorfica para identificar y llevar un 15 seguimiento del quimerismo celular entre el tejido del receptor y del donante, principalmente para determinar el exito o no del injerto de celulas madre. Los autores propusieron que la deteccion polimorfica de deleciones complementarfa pero no sustituirfa las tecnicas establecidas usadas para el seguimiento del quimerismo genetico. Se encontro que el analisis de sondas de delecion polimorfica basado en FISH no era tan sensible como el analisis de receptores en tandem cortos basado en PCR para detectar los niveles de quimerizacion de menos del 5%.

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Sin embargo, los polimorfismos de insercion-delecion se asocian normalmente con pequenas deleciones de nucleotidos seguidas por un pequeno numero de inserciones de nucleotidos (de algunas hasta decenas de pb). En terminos de su deteccion por metodologfas de PCR existe en general comparticion de identidad de secuencias entre los alelos naturales e indel, lo que tiene una incidencia (negativa) en la relacion senal-ruido para la cuantificacion de 25 quimerismo de ADN.

Por tanto existe una necesidad clara de manejar mejor los procedimientos de trasplante de tejidos, incluidos organos, con el fin de asegurar una alta tasa de supervivencia de organos de trasplante. Esta necesidad se satisface mediante una capacidad para detectar rechazos en una fase temprana usando un enfoque sensible de base 30 genetica.

RESUMEN

La presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en 35 un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulantes que tienen un polimorfismo de variacion en el numero de copias (CNV) que indica que los acidos nucleicos son acidos nucleicos procedentes de un donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular en el tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano 40 celular o de un dano celular mfnimo o clfnicamente aceptable. En una realizacion, la CNV es un polimorfismo de delecion de numero de copias (CND) que es uno de entre un panel de polimorfismos de CND donde un receptor dado se caracteriza por tener un genotipo nulo para al menos un polimorfismo de CND en el panel y el trasplante de donante por tener un genotipo no nulo para este polimorfismo de CND. En una realizacion, no es preciso que el genotipo del donante con respecto a los polimorfismos de CND se determine directamente. Ademas, no es preciso 45 determinar la presencia o ausencia del polimorfismo por secuenciacion de nucleotidos ni por microquimerismo bialelico. En la Tabla 2 se indican ejemplos de polimorfismos de CNV. En una realizacion, las CNV son CND tal como se indica en la Tabla 3.

La CNV se define mediante una secuencia de ADN que varfa en el numero de copias entre las personas en la 50 poblacion, la longitud de la secuencia de ADN afectada puede variar desde varios centenares de pares de bases hasta varios millones de pares de bases. En cambio, las deleciones del nivel de secuencias implican secuencias de ADN mas cortas, normalmente en el intervalo de 1 pb a 100 pb. La insercion-delecion se describe como una delecion de secuencia de ADN (normalmente unos pares de bases) seguido por una insercion de secuencia de ADN (normalmente unos pares de bases) despues de los nucleotidos sometidos a delecion.

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El uso de lugares de delecion de CNV permite consultar las grandes secuencias de ADN (por qPCR u otra metodologfa molecular) que estan ausentes en el receptor, evitando asf completamente la cuestion de distinguir entre ADN de donante del ADN de receptor de base y llevando a mejoras en la relacion senal-ruido para la medida de niveles de ADN diana.

La referencia a "tejido" incluye un organo, extremidad y apendice asf como microtejidos y celulas madre. Los ejemplos de organos incluyen un rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado, un intestino y la piel.

5 Los ejemplos de extremidades incluyen una pierna, un brazo, una mano y un pie. Los ejemplos de un apendice incluyen un dedo del pie, una nariz y una oreja. Los ejemplos de celulas madre incluyen celulas madre de adulto y embrionarias. La muestra que se somete a cribado de acidos nucleicos libres se selecciona de entre plasma, sangre entera, suero, orina, pus, lfquido respiratorio, lfquido linfatico, heces, bilis, saliva, esputo, semen, flujo vaginal, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido cerebral, ascitis, leche, secreciones de las vfas genitourinarias y un lavado de un tejido u 10 organo (por ejemplo, un pulmon) En una realizacion, la muestra es plasma, sangre entera o suero. En una realizacion, la muestra es orina. Un acido nucleico “libre” incluye un acido nucleico circulante y se refiere a acido nucleico liberado despues de un dano celular. El dano celular puede proceder de procesos tales como apoptosis o necrosis, citotoxicidad de farmacos o una reaccion de rechazo de base inmunologica.

15 Otro aspecto contemplado en la presente memoria descriptiva es un protocolo de trasplante para trasplantar tejido desde un donante a un receptor, comprendiendo el protocolo el trasplante del tejido y despues el seguimiento de la muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes que son de celulas del donante donde si se detectan acidos nucleicos del donante, el receptor se somete a terapia de inmunosupresion o, si el paciente esta en terapia de inmunosupresion, la terapia puede modificarse.

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La descripcion objeto ensena ademas un ensayo para llevar un seguimiento del equilibrio entre la inmunosupresion y el dano en el tejido debido por ejemplo a rechazo o citotoxicidad farmaceutica. Por ello, la descripcion objeto ensena un procedimiento para tratar a un sujeto que se ha sometido a un procedimiento de trasplante mediante supervision de los cambios en los niveles de acidos nucleicos del donante. Dichos cambios pueden darse con respecto a un 25 control. El control incluye los niveles antes del trasplante de acidos nucleicos libres del receptor o un cambio en la proporcion entre acidos nucleicos totales y acidos nucleicos del donante.

Ademas se proporciona el uso de un panel de CNV tal como CND que identifica un acido nucleico como de origen de un donante o, por deduccion, de origen no de un receptor en la fabricacion de un ensayo de diagnostico para 30 detectar el estado de un tejido trasplantado en el receptor. En una realizacion, uno entre el receptor o el donante tiene un genotipo nulo con respecto a al menos uno de los polimorfismos de CND y el otro entre el receptor o el donante no lo tiene.

La Tabla 2 proporciona una lista de CNV comunes que son caracterfsticas del ADN de un receptor. La lista de la 35 Tabla 2 debe leerse conjuntamente con, e incluye, otras CNV conocidas como las definidas en Conrad y col. (2010) Nature 464:704-712; McCarroll y col. (2008) Nat Genet 40(10):1166-1174. En la Tabla 3 se indica un grupo de 10 CNV, en forma de CND. En una realizacion, esta presente al menos un genotipo nulo de CND en cualquier receptor dado. No es necesario obtener el genotipo del donante ya que los polimorfismos de CND se seleccionan de manera que existe aproximadamente una probabilidad del 50% de que si un receptor tiene un genotipo CND nulo, el donante 40 no lo tendra. En receptores de trasplantes que muestran signos clfnicos de rechazo variables, las concentraciones en plasma de acidos nucleicos especfficas del donante pueden variar, lo que esta relacionado con el mecanismo inmunologico de rechazo (es decir, humoral frente a celular) asf como con la categorfa medica del rechazo (es decir, agudo frente a cronico).

45 En la Tabla 1 se definen las siguientes abreviaturas usadas en la memoria descriptiva.

Tabla 1

Abreviaturas

Abreviatura

Definicion

AP-PCR

PCR cebada arbitrariamente

ADNcf

ADN libre circulante

CND

Delecion de numero de copias

CNV

Variante de numero de copias

CP-PCR

PCR cebada con secuencia de consenso

DOP-PCR

PCR de oligonucleotido-cebador degenerada

MF-PCR

PCR fluorescente multiple

PCR

Reaccion en cadena de la polimerasa

PCR/RFLP

PCR de longitud de fragmento de restriccion

q-PCR

PCR cuantitativa

qf-PCR

PCR fluorescente cuantitativa

RT-PCR

PCR en tiempo real

NABSA

Amplificacion de secuencias basada en acidos nucleicos

Genotipo nulo

Copias cero de un marcador genetico (nulisomico)

SRY

Region Y de determinacion del sexo

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Se hace referencia a un "CND_0X" donde X es un numero de 1 a 10. Existen CNV que se definen en la Tabla 3 y se 5 seleccionan a partir de la Tabla 2.

Figura 1 es una representacion esquematica y fotografica de (a) CND_01 PCR interna: la region sombreada indica el segmento de delecion. Las pistas 2-22 son 2l muestras de control (12/21-copia nula, 9/21- 1 o 2 copias), pistas 1 y 24 - Marcador VIII y pista 23-muestra en blanco; (b) CND_01 PCR flanqueante: las pistas 2-22 son las mismas 21 10 muestras de control (19/21 son nulas o 1 copia; 2/21 son tipo natural de 2 copias (flecha); pista 1 y 24 - Marcador VIII y pista 23 - muestra en blanco.

Figura 2 es una representacion fotografica de PCR interna en ADN celular y de plasma para CND_02:- Para 4 muestras de control, la muestra de ADN celular y de plasma se sometio a ensayo en pistas alternas (pista 2 a 9). La 15 diferencia en la intensidad de banda se debe a las diferentes cantidades de ADN en la muestra de plasma y celular (el ADN celular es equivalente a -19000 GE, mientras que el ADN de plasma es equivalente a -250GE en la reaccion).

Figura 3 es una representacion fotografica de sensibilidad de genotipado de delecion de CNV. La sensibilidad fue de 20 solo el 1%.

Figura 4 es una representacion grafica de la deteccion de una region Y de determinacion del sexo no propia (SRY). El ADN en el plasma sangufneo del receptor usa PCR cuantitativa (q-PCR).

25 Figuras 5a a c son representaciones graficas de CND_01, CND_02 y CDN_03 que muestran medidas exactas, precisas y robustas de ADN raro.

Figura 6 es una representacion fotografica de PCR interna en ADN celular y de plasma para la muestra del paciente. Pistas 2-5 CND_02 (no informativas ya que el receptor y el donante son 'nulos'), pista 7-10 CND_03 (informativa), 30 pista 12-15 CND_08 (informativa).

Figuras 7a y b son representaciones graficas de ADNc derivado del trasplante en plasma (a) y ADNcf total (b) para 35 receptores de trasplante. En los receptores de trasplante que experimentan signos clfnicos de rechazo, se encontro que las concentraciones de ADN en plasma especfficas del donante variaban y este hecho parecfa estar 35 relacionado con el mecanismo inmunologico de rechazo (es decir, de mediacion humoral frente a celular) asf como con la categorfa medica del rechazo (es decir, aguda frente a cronica).

Figuras 8a y b son representaciones graficas de ADNcf derivado del plasma (a) y ADNcf de plasma total (b) en los receptores de antes y despues del trasplante.

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descripciOn detallada

En la presente memoria descriptiva, salvo que del contexto se derive lo contrario, se entendera que el termino "comprenden" o variaciones como "comprende" o "que comprende", implican la inclusion de un elemento declarado 45 o un numero entero o una etapa del procedimiento o un grupo de elementos o numeros enteros o etapas del procedimiento pero no la exclusion de ningun elemento o numero entero o etapa de procedimiento o grupo de elementos o numeros enteros o etapas de procedimiento.

Tal como se usa en la memoria descriptiva objeto, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen los aspectos 50 singular y plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a una "variante del numero de copias" incluye una unica variante del numero de copias, asf como dos o mas variantes del numero de copias diferentes; la referencia a "un organo" incluye un unico organo, asf como dos o mas organos; la referencia a "la descripcion" incluye uno o varios aspectos ensenados por la descripcion; y asf sucesivamente. Los aspectos ensenados y contemplados en la presente memoria descriptiva estan comprendidos por el termino "invencion". 55 Todos dichos aspectos estan contemplados en el alcance de las reivindicaciones.

La presente descripcion ensena un ensayo no invasivo para valorar el resultado de un procedimiento de trasplante de tejido. El ensayo se basa en la identificacion de acidos nucleicos no del receptor (es decir, acidos nucleicos del donante) en una muestra biologica del receptor de tejido trasplantado a partir del donante. Por "identificacion" se 5 incluye caracterizacion y cuantificacion. El ensayo caracteriza un polimorfismo de variante del numero de copias (CNV), tal como una delecion del numero de copias (CND), que identifica el acido nucleico del donante en una mezcla de acido nucleico del receptor en la muestra. La CNV tal como una CND no requiere analisis de secuencias o analisis de microquimerismo bialelico. El dano en un tejido trasplantado activa la liberacion de acidos nucleicos del donante desde las celulas trasplantadas en el sistema circulatorio y otros lfquidos del receptor. Puede llevarse un 10 seguimiento del estado del tejido trasplantado e identificarse los signos tempranos de dano celular que llevaran a la intervencion clfnica apropiada para salvar el tejido. El dano celular puede proceder entre otros de un rechazo de base inmunologica, apoptosis, necrosis, citotoxicidad farmacologica, traumatismo, isquemia de flujo sangufneo e infeccion. La intervencion clfnica puede implicar la administracion de farmacos inmunosupresores, si el paciente esta en terapia de inmunosupresion, un cambio en la dosis del farmaco o el tipo de farmaco. Otras intervenciones 15 incluyen terapia antipatogenos, farmacos para mejorar el flujo sangufneo o protocolos para reducir la tumefaccion o los traumatismos en el tejido. El ensayo puede aplicarse universalmente a todos los procedimientos de trasplante sin necesidad de determinar directamente el genotipo del polimorfismo de CNV del donante. La deteccion de un polimorfismo de CNV permite un enfoque altamente sensible de identificacion de ADN humano no del receptor. En una realizacion, el receptor tiene un genotipo nulo con respecto al polimorfismo de CNV y el donante no lo tiene. 20 Alternativamente, el donante tiene un genotipo nulo con respecto al polimorfismo de CNV y el receptor no lo tiene.

Un CNV es una variante genomica estructural, que mide 1 kb de longitud o mas (por ejemplo, 1 kb-108 kb), que produce cambios confinados en el numero de copias en una region cromosomica especffica. Si su frecuencia de alelos de poblacion es inferior al 1%, se refiere como variantes (CNV) que incluyen inserciones y deleciones asf 25 como cambios mas complejos que afectan a las ganancias y perdidas en el mismo locus. La CNV se definio originalmente como inserciones y deleciones de mas de 1 kb de tamano (Feuk y col. (2006) Nature Rev 7:85-97). Con el tiempo, con la profusion de datos procedentes de la secuenciacion de genomas humanos (The 1000 Genomes Project Consortium (2010) Nature 467:1061-1073), el espectro operativo de variantes del numero de copias (CNV) se ha ampliado para incluir episodios mucho menores (por ejemplo, de >50 pb de longitud). Estos se 30 distinguen de los polimorfismos de delecion de secuencias pequenas (tambien denominados cambios de base individual) por su tamano genomico (Weber y col. (2002) Am J Human Genet 71:854-862).

Los polimorfismos de CNV se seleccionan sobre la base de que debido a su alta incidencia en la poblacion, un receptor se caracterizara por tener acidos nucleicos con al menos un genotipo de CNV y una probabilidad del 50% 35 de que si un receptor o donante tiene un genotipo CNV dado, entonces el otro entre el receptor o el donante no lo tendra. En una realizacion, el acido nucleico del receptor se caracteriza por ser nulisomico para al menos uno de los sitios de CNV y el donante no lo es.

Por consiguiente, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un tejido de 40 donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulantes que tienen un polimorfismo de variacion en el numero de copias (CNV) que indica que son acidos nucleicos del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un 45 dano celular en un nivel aceptable. Un "nivel aceptable" significa efectos secundarios clfnicos adversos mfnimos.

La deteccion de acidos nucleicos del donante significa la deteccion de material de acidos nucleicos procedente no del receptor que a su vez es indicativa de rechazo al trasplante u otro dano en el trasplante que incluye apoptosis, necrosis, isquemia, traumatismo o infeccion. El dano puede deberse tambien a un farmaco administrado al paciente 50 tal como un farmaco de inmunosupresion. La ausencia de acidos nucleicos del donante significa que el material de acidos nucleicos no del receptor no se esta liberando lo que es indicativo de un trasplante sano o con exito. No es necesario determinar el genotipo del polimorfismo de CNV del donante para que el ensayo sea eficaz. Se somete a cribado un panel de polimorfismos de CNV sobre la base de que cualquier receptor dado tendra o no tendra al menos uno de estos polimorfismos y el donante tendra o no tendra un polimorfismo diferente al del receptor. En una 55 realizacion, el receptor es nulisomico para al menos uno de los sitios de CNV en el panel y el donante no lo es. En otra realizacion, el donante es nulisomico para al menos uno de los sitios de CNV en el panel y el receptor no lo es. Ademas, en los receptores de trasplante que experimentan signos clfnicos variables de rechazo, las concentraciones de acidos nucleicos en plasma especfficas del donante pueden variar lo cual guarda relacion con el mecanismo inmunologico de rechazo (es decir, humoral frente a celular) asf como la categorfa medica del rechazo (es decir, 60 agudo frente a cronico).

En consecuencia, la presente memoria descriptiva ensena un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos circulantes en la muestra del receptor para determinar la presencia de un polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel 5 de polimorfismos donde los acidos nucleicos del donante comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el receptor donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable aunque no se limita a la salud continuada de un paciente.

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En una realizacion relacionada, la presente memoria descriptiva facilita un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia 15 de acidos nucleicos con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del donante se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con 20 respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable. En una realizacion, el panel comprende de 1 a 100 pares de oligonucleotidos dirigidos a 1 a 100 polimorfismos de CNV. En una realizacion, existen de 1 a 10 pares de oligonucleotidos dirigidos a 1 a 10 polimorfismos de CNV. Por "1 a 200" se entiende 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,

25 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,

94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,

120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142,

143, 144, 145, 146, 1.47, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165,

166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188,

30 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200.

La referencia a "tejido" con respecto a trasplante incluye un organo, extremidad, apendice y piel asf como microtejido y celulas madre. Los ejemplos de organos incluyen rinon, corazon, pulmon, islote pancreatico, hfgado, intestino y piel. Una extremidad incluye una pierna, un brazo, una mano y un pie. Un apendice incluye un dedo del pie, una 35 nariz y una oreja.

En una realizacion, el tejido es un organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado, un intestino y la piel.

40 Por tanto, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulantes que tienen un polimorfismo de CNV que indica que no son los acidos nucleicos del receptor donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del 45 donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

La presente memoria descriptiva ensena ademas un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos circulantes en 50 una muestra del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel de polimorfismos donde los acidos nucleicos del receptor comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel 55 aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado 60 de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia de acidos

nucleicos con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del donante basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la 5 ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 10 100 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 100 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 100 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del donante basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el 15 receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un 20 organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 10 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos 25 nucleicos del donante se distinguen del donante basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

30 En una realizacion, el tejido es un organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado, un intestino y la piel.

En una realizacion, el organo es un rinon.

35 Por consiguiente, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulantes que tienen un polimorfismo de CNV que indica que no son los acidos nucleicos del receptor donde la presencia de acidos nucleicos no del receptor es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos 40 no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable para que un paciente disfrute de buena salud continuada. Por "no receptor" se entiende "donante".

La presente memoria descriptiva ensena tambien un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos circulantes en 45 la muestra del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel de polimorfismos donde los acidos nucleicos del receptor comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel 50 aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una 55 muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la 60 ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control

es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable para que un paciente disfrute de buena salud continuada.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un rinon 5 de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 100 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 100 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 100 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos 10 nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable para que un paciente disfrute de buena salud continuada.

15

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 10 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos circulantes con la presencia de acidos 20 nucleicos con los de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control 25 es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable para que un paciente disfrute de buena salud continuada.

El "estado" del tejido trasplantado significa la presencia o ausencia de algun dano celular en el tejido trasplantado. La presencia de dano en el tejido se indica mediante la liberacion de acidos nucleicos de las celulas del tejido de 30 donante trasplantado en el receptor. El estado es el resultado del ensayo. Los acidos nucleicos liberados se refieren en la presente memoria descriptiva como acidos nucleicos "libres" o "circulantes" (por ejemplo, ADN libre circulante [ADNcf]). La muestra incluye plasma, sangre entera, suero, orina, pus, lfquido respiratorio, lfquido linfatico, heces, bilis, saliva, esputo, semen, flujo vaginal, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido cerebral, ascitis, leche, secreciones de las vfas genitourinarias y un lavado de un tejido u organo (por ejemplo, un pulmon). En una realizacion, la muestra es 35 plasma, sangre entera o suero. En una realizacion, la muestra es orina. Por tanto, los aspectos contemplados en la presente memoria descriptiva incluyen el ensayo en lfquido biologico de acidos nucleicos libres circulantes, tales como ADNcf.

Un acido nucleico “libre” incluye un acido nucleico circulante (por ejemplo, ADNcf) y se refiere a un acido nucleico 40 liberado despues de un dano celular. El dano celular puede proceder de procesos como entre otros apoptosis o necrosis, citotoxicidad de farmacos o una reaccion de rechazo de base inmunologica.

El ensayo se basa en la deteccion en el nivel de presencia o ausencia de no receptor (es decir, procedente del donante) de acidos nucleicos. Los niveles de acidos nucleicos procedentes de un donante tambien pueden seguirse 45 con el tiempo tal como despues de un trasplante o despues de la administracion de farmacos de inmunosupresion u otras terapias. La deteccion de acidos nucleicos procedentes de un donante puede usarse tambien para valorar la probabilidad de que el tejido trasplantado sobreviva o requiera la eliminacion y/o para valorar la toxicidad de un farmaco que se suministra a un paciente. El dano en el tejido incluye rechazo inmunologico, apoptosis, necrosis, traumatismo, lesion isquemica, infeccion por un patogeno, isquemia perioperatoria, lesion por reperfusion, 50 hipertension, lesiones debidas a especies de oxfgeno reactivo y toxicidad farmaceutica.

Pueden usarse terminos como "diagnostico", "pronostico", "determinacion", "monitor", "ensayo" y similares para describir la metodologfa de deteccion de acidos nucleicos del donante o acidos nucleicos que no son de origen del receptor. El ensayo de diagnostico puede usarse tambien en un protocolo para llevar un seguimiento de la salud de 55 un paciente con respecto al estado del tejido trasplantado y/o el nivel de toxicidad de los farmacos que se administran al paciente.

Por tanto, el procedimiento facilitado en la presente memoria descriptiva proporciona un medio para valorar el estado o resultado del trasplante. El estado o resultado puede estar comprendido entre el rechazo al trasplante y la 60 tolerancia al trasplante o cualquier forma de dano celular. El dano en el tejido se pone de relieve mediante la

deteccion de acidos nucleicos no del receptor (es decir, tejido procedente del donante). Estos son liberados en diversos lfquidos en el receptor despues de la apoptosis de las celulas del tejido de donante. La tolerancia al trasplante o la ausencia de dano en el tejido se pone de relieve por la ausencia de acidos nucleicos procedentes de un donante o un nivel de acidos nucleicos procedentes de un donante que con respecto a un control es indicativa de 5 dano celular mmimo o un nivel de dano celular que es clmicamente aceptable para la buena salud continuada del paciente. La evidencia de tolerancia al trasplante proporciona una indicacion de que el trasplante sobrevivira probablemente o al menos estara sano en cualquier periodo de tiempo dado.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el diagnostico o pronostico del estado del trasplante incluye la 10 prediccion, evaluacion, determinacion y diagnostico del estado o resultado del trasplante y en algunos casos la probabilidad de que un paciente sobreviva a un procedimiento de trasplante o a un protocolo medico posterior a un trasplante.

El polimorfismo de CNV puede ser una delecion, una insercion o una expansion. En una realizacion, es una delecion 15 de CNV, referida en la presente memoria descriptiva como una delecion del numero de copias CND o polimorfismo de CND.

Se selecciona un panel de deleciones de CNV que se espera que tengan frecuencias nulas aproximadas del 40-50% en la poblacion general. Esto se lleva a cabo mediante un analisis in silico de datos publicos (Conrad y 20 col. (2010) ver mas arriba; McCarroll y col. (2008) ver mas arriba). Estas regiones de CNV son polimorficas y no tienen significacion clmica intrmseca. La seleccion de CNV y los calculos de frecuencias se realizan del modo siguiente: El conjunto de datos HapMap incluye una funcion trio-data para cada CNV. Para los calculos de frecuencias, solo se incluyen muestras singleton y parentales. Las CNV con solo genotipos de 0, 1 y 2 copias se seleccionan para su analisis (es decir, CNV de mas de 2 copias y se excluyen CNV de cromosomas X e Y). Para 25 cada CNV seleccionada, se calculan las frecuencias de genotipos de 0, 1 y 2 copias. Se excluyeron las CNV en forma de solapamiento de CND con duplicaciones de segmentos. De la Tabla 2 se seleccionaron CNV con frecuencia de 0,4-0,5 copias nulas y menos de 3 kb de tamano. En la Tabla 3 se indica un ejemplo de las CND.

La Tabla 2 proporciona una lista de sitios de CNV comunes que estan presentes normalmente en el acido nucleico 30 del receptor. La lista de la Tabla 2 debe leerse conjuntamente con, e incluye, otras CNV conocidas como las definidas en Conrad y col. (2010) ver mas arriba; McCarroll y col. (2008) ver mas arriba. En la presente memoria descriptiva se incluye un aspecto en el que el receptor es nulisomico para al menos uno de los sitios de CND y el donante no lo es. En otra realizacion, el donante es nulisomico para un sitio de CND y el receptor no lo es. No es necesario obtener el genotipo del donante ya que existe una probabilidad de 1 sobre 2 (probabilidad del 50%) de 35 que si un receptor tiene un sitio de CND dado, el donante no lo tenga, o a la inversa. La Tabla 3 es un ejemplo de un panel de sitios de CND adecuados utiles en la practica del presente ensayo. Los CND de la Tabla 3 se refieren como "CND_0X" donde X es un numero de 1 a 10. Estos valores estan correlacionados con un ID de CNP en la Tabla 2 por medio de su CNP_id. en la Tabla 3.

40 Por tanto, la memoria descriptiva objeto ensena un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulatorios que tienen o no un polimorfismo de CND que indica que son acidos nucleicos del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del 45 donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En la presente memoria descriptiva se ensena ademas un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos circulatorios en 50 la muestra del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel de polimorfismos donde los acidos nucleicos del receptor comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel 55 aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una 60 muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos

circulatorios con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de apoptosis de dano celular del tejido 5 trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 100 pares 10 de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 100 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos circulatorios con los de 1 a 100 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el 15 receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de apoptosis de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un tejido 20 de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 10 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos circulatorios con los de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos 25 nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de apoptosis de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

30 En una realizacion, el polimorfismo de CNV panel se selecciona de entre la lista de la Tabla 2 donde el receptor se caracteriza por tener el genotipo nulo para al menos una region de CNV en el panel donde la presencia de acidos nucleicos caracterizados por no tener el genotipo nulo para al menos una region de CNV en el panel indica que los acidos nucleicos son acidos nucleicos no del receptor donde la presencia de acidos nucleicos del donante (no del receptor) es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante (no del 35 receptor) o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

Un ejemplo de un panel de CNV es el panel de CND indicado en la Tabla 3.

40 Por consiguiente, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulatorios que tienen un polimorfismo de CNV seleccionado de entre la lista de la Tabla 2 donde los acidos nucleicos caracterizados por no tener el genotipo nulo para al menos una region de CNV en el panel indica acidos nucleicos son acidos nucleicos del donante donde la 45 presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de

acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de

ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un organo de 50 donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulatorios que tienen un polimorfismo de CND seleccionado de entre la lista de la Tabla 3 donde los acidos nucleicos caracterizados por no tener el genotipo nulo para al menos una region de CND en el panel indica acidos nucleicos que son acidos nucleicos del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de

55 acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de

ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

La presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 200 pares de 60 cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos seleccionado de entre

la lista indicada en la Tabla 2, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos circulatorios con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor 5 basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos no del receptor o un nivel de acidos nucleicos no del receptor con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

10 La presente memoria descriptiva ensena ademas un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos circulatorios en la muestra del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel de polimorfismos tal como se indica en la Tabla 2 donde los acidos nucleicos del receptor comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el donante donde la presencia de acidos nucleicos del 15 donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, el tejido es un organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un corazon, un 20 pulmon, un islote pancreatico, un hfgado y un intestino.

La presente descripcion tambien ensena un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos circulatorios que tienen un polimorfismo de CNV 25 seleccionado de entre la lista indicada en la Tabla 2 donde la presencia de acidos nucleicos que no tienen el genotipo nulo para al menos una region de CNV en el panel indica que los acidos nucleicos son acidos nucleicos del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

30

La presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 50 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos tales como los seleccionados de entre la lista indicada en la Tabla 2, el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos 35 nucleicos circulatorios con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un 40 nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

La presente memoria descriptiva ensena ademas un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos circulatorios en 45 la muestra del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel de polimorfismos tal como se indica en la Tabla 2 donde la presencia de acidos nucleicos que no tienen el genotipo nulo para al menos una region de CNV en el panel indica que los acidos nucleicos son acidos nucleicos del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es 50 indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

La muestra biologica incluye un lfquido corporal tal como plasma, sangre entera, suero, orina, pus, lfquido respiratorio, lfquido linfatico, heces, bilis, saliva, esputo, semen, flujo vaginal, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido cerebral, ascitis, leche, secreciones de las vfas genitourinarias y un lavado de un tejido u organo (por ejemplo, a 55 pulmon).

En una realizacion, la muestra es plasma sangufneo.

En una realizacion, la CNV es una CND. En la Tabla 3 se indican ejemplos de CND.

La presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de una muestra de plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos que tienen un polimorfismo de CNV que incluye un polimorfismo de CND tal como un CND indicado en la Tabla 2 o 3 que indica que son acidos nucleicos del donante 5 donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

Un ejemplo de un nivel aceptable de acidos nucleicos del donante es un nivel que permite mantener la buena salud 10 del paciente.

En la presente memoria descriptiva se ensena un procedimiento para determinar el estado de un tejido de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos tales como los CND 15 indicados en la Tabla 2 o 3, el cribado de un plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano 20 celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

La presente memoria descriptiva ensena ademas un procedimiento para determinar el estado de un tejido de 25 donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos en plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV tal como un polimorfismo de CND seleccionado de entre un panel de polimorfismos tal como se indica en la Tabla 2 o 3 donde los acidos nucleicos del receptor comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de apoptosis de dano celular del tejido trasplantado y la 30 ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor el donante organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un 35 corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado y un intestino, comprendiendo el procedimiento el cribado de un plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos que tienen un polimorfismo de CNV que indica que es del tejido trasplantado del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un 40 dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor el donante organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado y un intestino, comprendiendo el procedimiento la 45 seleccion de un panel de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 200 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado una muestra de plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 200 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el 50 polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

55 En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor el donante organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado y un intestino, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 100 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 100 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado una muestra de plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia de acidos 60 nucleicos con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 100 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los

acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del 5 donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, la presente memoria descriptiva permite un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor el donante organo seleccionado de entre la lista que consiste en un 10 rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado y un intestino, comprendiendo el procedimiento la seleccion de un panel de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos que se dirigen a de 1 a 10 polimorfismos de CNV conocidos, el cribado una muestra de plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos con la presencia de acidos nucleicos con los de 1 a 10 pares de cebadores de oligonucleotidos donde los acidos nucleicos del receptor se caracterizan por tener o no al menos uno de los polimorfismos de CNV conocidos a 15 partir del panel y los acidos nucleicos del donante se distinguen del receptor basandose en que tengan o no el polimorfismo compartido por el receptor, donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

20

Las CNV incluyen CND tales como las indicadas en la Tabla 2 segun se ilustra en la Tabla 3.

La presente memoria descriptiva ensena ademas un procedimiento para determinar el estado de un organo de donante trasplantado en un receptor, el donante organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un 25 corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado y un intestino, comprendiendo el procedimiento el cribado de acidos nucleicos en muestra de plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia de polimorfismo de CNV seleccionado de entre un panel de polimorfismos seleccionado de entre la lista de la Tabla 2 donde los acidos nucleicos del receptor comprenden la presencia o ausencia de al menos un polimorfismo no compartido por el donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la 30 ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

En una realizacion, el tejido es un organo que es un rinon.

35 Por tanto, la presente descripcion ensena un procedimiento para determinar el estado de un rinon de donante trasplantado en un receptor, comprendiendo el procedimiento el cribado de un plasma sangufneo del receptor para determinar la presencia o ausencia de acidos nucleicos que tienen un polimorfismo de CNV seleccionado de entre la lista de la Tabla 2 que indica que son acidos nucleicos del donante donde la presencia de acidos nucleicos del donante es indicativa de dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de acidos nucleicos del donante o un nivel 40 de acidos nucleicos del donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

La extraccion de muestras de sangre puede realizarse mediante cualquier tecnica conocida en la tecnica tal como mediante jeringa, dispositivo de aspiracion al vacfo, puncion y similares. Una muestra de sangre puede tratarse o 45 procesarse ademas de manera que se concentre la presencia de acidos nucleicos para eliminar moleculas con alta abundancia, para reducir la coagulacion, para reducir la trombolisis, para ajustar el pH o la osmolalidad o para estabilizar el lfquido. La muestra de sangre, si se trata de forma apropiada, incluido su almacenamiento, puede mantenerse y someterse a ensayo desde menos de una hora a entre 24 horas y 2 semanas despues de su recogida. Alternativamente, se somete a ensayo inmediatamente o en un periodo de 24 horas desde la recogida.

50

Los acidos nucleicos son en general ADN genomico pero tambien pueden ser ARNm u otra especie de ARN. El ARN puede cribarse directamente o despues de su conversion a ADN, por ejemplo ADNc.

En la presente memoria descriptiva se ensenan procedimientos y kits para el cribado sencillo de un paciente 55 despues de un procedimiento de trasplante. Se usa un panel de cebadores que detallan polimorfismos comunes de CNV. En la Tabla 2 se indica un ejemplo en relacion con polimorfismos de CNV. En una realizacion, los receptores tienen el genotipo nulo (es decir, cero copias) para al menos un sitio de CND en el panel. La Tabla 3 es un ejemplo de un subconjunto de CND de las CNV indicadas en la Tabla 2.

60 El receptor puede expresar parte o la totalidad de los polimorfismos de CNV. No es necesario el genotipado del

donante con respecto a los polimorfismos de CNV ya que cualquier acido nucleico que no sea un acido nucleico del receptor se supone que es acido nucleico del donante. El procedimiento contemplado en la presente memoria descriptiva proporciona un enfoque fiable para llevar un seguimiento del exito o no de un procedimiento de trasplante y/o un procedimiento de tratamiento para mitigar el rechazo u otra forma de lesion en el tejido.

5

Convenientemente, el genotipo de CNV de acidos nucleicos lfquidos se determina mediante una reaccion de amplificacion, tal como PCR digital o en tiempo real seguida por electroforesis en gel, secuenciacion de nucleotidos, expresion de moleculas reporteras (Gonzalez y col. (2005) Environ. Microbiol. 7(7): 1024-1028; DeLa Vega y col. (2005) Mutation Research 573:111-135; Livak y col. (1995) Nature Genetics 9:341-342).

10

Las reacciones de amplificacion utiles en la practica del presente procedimiento incluyen PCR cuantitativa (q-PCR), PCR fluorescente cuantitativa (qf-PCR), PcR fluorescente multiple (MF-PCR), PCR en tiempo real (RT-PCR), PcR de celulas individual, PCR de longitud de fragmentos de restriccion (PCR-rFlP), PCR-RfLp/RT-PCR-RFLP, PCR de inicio en caliente, PCR anidada, PCR in situ, amplificacion de cfrculos rodantes in situ, PCR de puente, PCR de 15 picovaloracion y PCR de emulsion. Otros procedimientos de amplificacion incluyen amplificacion selectiva de secuencias de polinucleotidos diana, PCR cebada con secuencias de consenso (CP-PCR), PCR cebada arbitrariamente (AP-PCR), PCR de oligonucleotido-cebador degenerado (DOP-PCR) y amplificacion de secuencias basadas en acidos nucleicos (NABSA).

20 Despues de la amplificacion, el genotipo de CNV se determina por ejemplo por electroforesis que incluye capilar, zona capilar, enfoque isoelectrico capilar y electroforesis en gel de capilar asf como electrocromatografia capilar, cromatograffa capilar electrocinetica micelar y transitoria mediante el uso de matrices, perlas, cromatograffa gaseosa, cromatograffa de fluidos supercrfticos, cromatograffa lfquida (que comprende particion, adsorcion, intercambio de iones, exclusion de tamano, cromatograffa de capa fina y afinidad). Otras tecnicas incluyen 25 hibridacion genomica comparativa, micromatrices, matrices de perlas y genotipado de alto rendimiento tal como con el uso de una sonda de inversion molecular.

En la presente memoria descriptiva se facilitan tambien reactivos y kits para cribado o cuantificacion de acidos nucleicos procedentes de un donante. Los reactivos y kits objeto pueden variar de forma y control. Los reactivos de 30 interes incluyen reactivos disenados especfficamente para (i) genotipado de acidos nucleicos a partir de un receptor; (ii) identificacion de perfiles de marcadores; y (ii) deteccion y/o cuantificacion de uno o mas acidos nucleicos a partir de un donante de trasplante en una muestra obtenida de un receptor de trasplante.

Un tipo de estos reactivos es una o mas sondas o una matriz de sondas para el genotipado y/o la deteccion y/o la 35 cuantificacion de uno o mas acidos nucleicos. En la tecnica se conoce una diversidad de diferentes formatos de matriz, con una amplia variedad de diferentes estructuras de sonda, composiciones de sustratos y tecnologfas de fijacion. En un ejemplo, los polimorfismos de CNV indicados en la Tabla 2 se someten a cribado mediante un panel de cebadores y/o sondas de oligonucleotido. En un ejemplo, los polimorfismos de CND indicado en la Tabla 3 se someten a cribado mediante un panel de cebadores y/o sondas de oligonucleotidos.

40

Los kits de la presente memoria descriptiva pueden incluir matrices u otras plataformas de fase solida. Dichos kits pueden comprender ademas uno o mas agentes terapeuticos. El kit puede comprender ademas un paquete de software para analisis de datos, que puede incluir perfiles de referencia para comparacion con el perfil de prueba.

45 Los kits pueden comprender reactivos tal como tampones y H2O u otros excipientes. Los kits pueden comprender reactivos necesarios para realizar extraccion de acidos nucleicos y/o deteccion de acidos nucleicos usando los procedimientos descritos la presente memoria descriptiva tales como PCR y secuenciacion.

Dichos kits pueden incluir tambien informacion, tal como referencias a bibliograffa cientffica, materiales de 50 prospectos de envases, resultados de pruebas diagnosticas y/o resumenes de los mismos y similares, que indican o establecen las actividades y/o ventajas del ensayo de diagnostico indicativo de la presencia de acidos nucleicos del donante en una muestra corporal. Dichos kits tambien pueden incluir instrucciones para acceder a una base de datos. Dicha informacion puede incluir resultados de ensayos y controles predeterminados basados en ensayos de diagnostico en seres humanos y animales. Los kits descritos en la presente memoria descriptiva pueden 55 proporcionarse, comercializarse y/o promoverse entre los profesionales sanitarios, incluyendo medicos, profesionales de enfermerfa, farmaceuticos, responsables de medicamentos de formulario, y similares. En algunas realizaciones, los kits pueden comercializarse tambien directamente al consumidor. Esto ultimo es util especialmente en medicamentos de asistencia a domicilio y personalizados.

60 Cualquiera de los procedimientos anteriores puede ser realizado por un producto de programa informatico que

comprende una logica ejecutable por ordenador que se graba en un medio legible por ordenador. Por ejemplo, el programa informatico puede ejecutar parte o la totalidad de las funciones siguientes: (i) control del aislamiento de los acidos nucleicos de una muestra, (ii) preamplificacion de acidos nucleicos de la muestra, (iii) amplificacion, secuenciacion u ordenacion de regiones polimorficas especfficas en la muestra, (iv) identificacion y cuantificacion de 5 un perfil de marcadores de CNV en la muestra, (v) comparacion de datos en el perfil de marcadores de CNV detectado a partir de la muestra con un umbral predeterminado, (vi) determinacion del estado o resultado del trasplante, (vi) declaracion de un estado o resultado del trasplante normal o anomalo. En una realizacion, la logica ejecutable por ordenador puede analizar los datos sobre la deteccion y cantidad de polimorfismos de CND.

10 La logica ejecutable por ordenador puede funcionar en cualquier ordenador que puede ser cualquiera de diversos tipos de ordenadores de uso generico tales como un ordenador personal, un servidor en red, una estacion de trabajo u otra plataforma informatica que incluye dispositivos manuales y portatiles. En una realizacion, se describe un producto de programa informatico que comprende un medio utilizable por ordenador que tiene la logica ejecutable por ordenador (programa de software informatico, que incluye codigo de programa) almacenada en el mismo. La 15 logica ejecutable por ordenador puede ser ejecutada por un procesador, para hacer que el procesador ejecute las funciones descritas en la presente memoria descriptiva. En otra realizacion, algunas funciones se implementan principalmente en hardware usando, por ejemplo, una maquina de estado de hardware. La implementacion de la maquina de estado de hardware que ejecuta las funciones descritas en la presente memoria descriptiva sera evidente para los expertos en la materia.

20

El programa puede proporcionar un procedimiento para evaluar un estado o resultado del trasplante en el receptor de un trasplante accediendo a datos que reflejan el genotipado del receptor del trasplante y/o la presencia o ausencia de uno o mas acidos nucleicos del donante del trasplante en la circulacion del paciente de trasplante despues del trasplante.

25

En una realizacion, el ordenador que ejecuta la logica informatica descrita en la presente memoria descriptiva tambien puede incluir un dispositivo de entrada digital tal como un escaner. El dispositivo de entrada digital puede proporcionar informacion sobre un acido nucleico, por ejemplo presencia o cantidad de CNV (por ejemplo, CND). Por ejemplo, un escaner descrito en la presente memoria descriptiva puede proporcionar una imagen de la CNV (por 30 ejemplo, CND) de acuerdo con el procedimiento de ensayo objeto. Por ejemplo, un escaner puede proporcionar una imagen detectando una emision fluorescente, radiactiva u otra; detectando radiacion emitida, reflejada o dispersada; detectando propiedades electromagneticas u otras caracterfsticas; o por otras tecnicas. Los datos detectados se almacenan normalmente en un dispositivo de memoria en forma de un archivo de datos. En una realizacion, un escaner puede identificar uno o mas objetos etiquetados. Por ejemplo, puede etiquetarse un primer polimorfismo de 35 CNV con un primer colorante que experimenta fluorescencia para una frecuencia caracterfstica en particular, o una banda estrecha de frecuencias, en respuesta a una fuente de excitacion de una frecuencia en particular. Puede etiquetarse un segundo polimorfismo de CNV con un segundo colorante que experimenta fluorescencia en una frecuencia caracterfstica diferente. Las fuentes de excitacion para el segundo colorante pueden tener, aunque no necesariamente, una frecuencia de excitacion diferente a la fuente que excita el primer colorante, por ejemplo, las 40 fuentes de excitacion podrfan ser los mismos laseres o laseres diferentes.

En una realizacion, la descripcion objeto ensena un medio legible por ordenador que comprende un conjunto de instrucciones grabadas en el mismo que hacen que un ordenador ejecute las etapas de (i) recepcion de los datos de uno o mas acidos nucleicos detectados en una muestra de un sujeto que ha recibido un trasplante de un donante, 45 donde el uno o mas acidos nucleicos son acidos nucleicos no del receptor (es decir, el uno o mas acidos nucleicos son del trasplante del donante) y donde el uno o mas acidos nucleicos del donante se identifican basandose en un perfil de marcadores de CNV predeterminado (por ejemplo, perfil de CNV indicado en la Tabla 2); y (ii) diagnostico o prediccion del estado o resultado del trasplante basandose en la presencia o ausencia del uno o mas acidos nucleicos.

50

La presente descripcion permite ademas un protocolo de trasplante para trasplantar tejido de un donante a un receptor, comprendiendo el protocolo el trasplante del tejido y despues el seguimiento de una muestra del receptor para determinar la presencia de acidos nucleicos que no son del receptor donde si se detectan acidos nucleicos del donante, el receptor se somete a terapia de inmunosupresion o si el paciente esta en terapia de inmunosupresion, se 55 modifica la terapia.

Otro aspecto en la presente memoria descriptiva ensena el uso de un panel de CNV que identifican un acido nucleico como de origen de un receptor o no de origen de un receptor en la preparacion de un ensayo de diagnostico para detectar el estado de un tejido trasplantado en el receptor.

La descripcion objeto ensena ademas un ensayo para llevar un seguimiento del equilibrio entre la inmunosupresion y el dano en el tejido tal como el debido a un rechazo o a citotoxicidad farmaceutica. Por tanto, la descripcion objeto ensena un procedimiento de tratamiento de un sujeto que se ha sometido a un procedimiento de trasplante mediante el seguimiento de los cambios en los niveles de acidos nucleicos no del receptor. Dichos cambios pueden realizarse 5 con respecto a un control. El control incluye los niveles anteriores a un trasplante de acidos nucleicos libres del receptor o a un cambio en la proporcion entre acidos nucleicos totales y acidos nucleicos no del receptor.

Mientras la Tabla 2 proporciona una lista de polimorfismos de CNV, el presente procedimiento se extiende a otros polimorfismos de cNv conocidos tales como los descritos por Conrad y col. (2010) ver mas arriba y McCarroll y 10 col. (2008) ver mas arriba.

Los aspectos contemplados en la presente memoria descriptiva se describen adicionalmente por medio de los siguientes Ejemplos no limitativos.

15 EJEMPLO 1

Desarrollo de un panel de genotipado de deleciones de CNV para distinguir el ADN en plasma del receptor y el donante

20 Se selecciona un panel de deleciones de CNV de las que se espera que tengan frecuencias nulas aproximadas del 40-50% en la poblacion general. Esto se realiza mediante analisis in silico datos publicos (Conrad y col. (2010) ver mas arriba; McCarroll y col. (2008) ver mas arriba). Estas regiones de CNV son polimorficas y no tienen significacion clfnica intrfnseca. La seleccion de CNV y los calculos de frecuencias se realizan del modo siguiente: El conjunto de datos HapMap incluye funcion trio-data para cada CNV. Para los calculos de frecuencias, se incluyen solo muestras 25 singleton y parentales. Para el analisis se seleccionan las CNV con solo genotipos de 0, 1 y 2 copias (es decir, se excluyen las CNV de mas de 2 copias y CNV de cromosomas X e Y). Para cada CNV seleccionada, se calculan las frecuencias de los genotipos de 0, 1 y 2 copias. Se excluyeron las CNV en forma de CND con solapamiento con duplicaciones de segmentos. De la Tabla 2 se seleccionaron las CNV con frecuencia de 0,4-0,5 copias nulas y menos de 3 kb de. La lista de la Tabla 2 debe leerse conjuntamente con, e incluye, otras CNV conocidas tales como 30 las definidas en Conrad y col. (2010) ver mas arriba; McCarroll y col. (2008) ver mas arriba. Un ejemplo es el de las CNV indicadas en la Tabla 3.

Tabla 2

Polimorfismos de variantes del numero de copias

ID CNP

Chr Inicio (hg18) Fin (hg 18) Tamano (pb) Frecuencia 0 copias Frecuencia 1 copia Frecuencia 2 copias

CNVR358.1

chr1 150.822.234 150.856.715 34.481 0,393 0,459 0,148

CNVR217.1

chr1 72.538.870 72.584.557 45.687 0,393 0,459 0,148

CNVR483.1

chr1 205.359.125 205.359.831 706 0,459 0,426 0,115

CNVR451 full

chr1 192.716.897 192.721.360 4.463 0,459 0,418 0,107

CNVR376.1

chr1 157.134.152 157.136.674 2.522 0,508 0,418 0,074

CNVR381.1

chr1 157.915.386 157.916.253 867 0,582 0,344 0,049

88

chr1 110.025.907 110.044.476 18.569 0,583 0,350 0,067

CNVR431.1

chr1 185.731.458 185.733.106 1.648 0,598 0,320 0,041

262

chr2 97.507.179 97.528.142 20.963 0,367 0,450 0,167

CNVR1138.2

chr2 219.761.436 219.762.572 1.136 0,385 0,410 0,180

CNVR1138.3

chr2 219.760.351 219.762.572 2.221 0,385 0,418 0,164

CNVR966.1

chr2 126.159.644 126.168.438 8.794 0,393 0,418 0,164

CNVR1037.1

chr2 159.668.040 159.669.209 1.169 0,492 0,418 0,066

CNVR952.1

chr2 121.513.996 121.515.257 1.261 0,516 0,352 0,098

CNVR801 full

chr2 54.419.132 54.420.976 1.844 0,574 0,361 0,041

CNVR842.1

chr2 76.627.234 76.628.943 1.709 0,582 0,320 0,074

CNVR1041 full

chr2 162.039.479 162.042.198 2.719 0,672 0,270 0,033

CNVR1058.1

chr2 176.973.956 176.980.168 6.212 0,672 0,254 0,049

CNVR894.2

chr2 101.419.843 101.420.750 907 0,680 0,180 0,008

CNVR1648.2

chr3 180.032.900 180.033.574 674 0,352 0,492 0,156

CNVR1438 full

chr3 80.144.512 80.147.226 2.714 0,377 0,484 0,139

CNVR1576.1

chr3 147.867.879 147.873.031 5.152 0,426 0,459 0,115

CNVR1419.1

chr3 68.822.189 68.830.557 8.368 0,426 0,393 0,180

CNVR1685.1

chr3 194.358.041 194.368.093 10.052 0,443 0,443 0,115

CNVR1610,1

chr3 164.247.638 164.251.756 4.118 0,508 0,426 0,066

CNVR1341.1

chr3 32.077.088 32.082.966 5.878 0,516 0,361 0,107

CNVR1464.1

chr3 100.381.786 100.385.095 3.309 0,656 0,295 0,041

CNVR2196.1

chr4 182.293.552 182.294.187 635 0,352 0,443 0,148

CNVR1894.1

chr4 39.701.722 39.702.524 802 0,361 0,516 0,123

CNVR2221 full

chr4 187.330.507 157.348.434 17.927 0,361 0,492 0,123

CNVR1937.1

chr4 61.621.762 61.624.843 3.081 0,369 0,525 0,107

CNVR1935 full

chr4 61.012.725 61.017.305 4.580 0,492 0,434 0,074

CNVR1819.6

chr4 9.783.252 9.843.664 60.412 0,508 0,410 0,082

CNVR2172 full

chr4 173.661.594 173.670.645 9.051 0,525 0,434 0,016

CNVR2168 full

chr4 172.610.978 172.616.208 5.230 0,557 0,361 0,025

726

chr4 173.661.522 173.665.218 3.696 0,567 0,350 0,067

CNVR2613 full

chr5 135.143.151 135.148.760 5.609 0,377 0,484 0,139

CNVR2535 full

chr5 98.373.056 98.375.260 2.204 0,402 0,410 0,189

CNVR2344 full

chr5 10.326.006 10.327.951 1.945 0,467 0,385 0,115

CNVR2469.1

chr5 57.359.283 57.369.499 10.216 0,615 0,361 0,025

CNVR2304.1

chr5 1.977.604 1.978.111 507 0,672 0,328 0,000

896

chr5 177.160.157 177.165.211 5.054 0,683 0,300 0,017

CNVR2939.3

chr6 65.405.092 65.405.828 736 0,369 0,426 0,139

CNVR2939.2

chr6 65.401.412 65.406.139 4.727 0,369 0,475 0,156

CNV2799.1

chr6 18.510.098 18.510.860 761 0,393 0,426 0,148

CNVR3004.1

chr6 95.250.114 95.251.113 999 0,393 0,459 0,123

CNVR2906.1

chr6 54.036.723 54.042.793 6.070 0,451 0,475 0,066

CNVR2972 full

chr6 77.154.212 77.160.412 6.200 0,459 0,443 0,090

CNVR2859 full

chr6 35.734.415 35.737.723 3.308 0,467 0,443 0,082

933

chr6 32.539.530 32.681.749 142.219 0,550 0,383 0,067

CNVR3009.1

chr6 100.141.275 100.141.994 719 0,623 0,377 0,000

CNVR3472 full

chr7 81.279.416 81.280.521 1.105 0,377 0,467 0,156

CNVR3319.1

chr7 24.004.755 24.006.584 1.829 0,434 0,344 0,139

CNVR3495.1

chr7 93.379.735 93.380.461 726 0,443 0,410 0,148

1103

chr7 70.058.925 70.064.077 5.152 0,450 0,483 0,067

CNVR3451.1

chr7 73.467.042 73.469.172 2.130 0,549 0,328 0,123

CNVR3609.1

chr7 147.704.059 147.707.263 3.204 0,656 0,311 0,033

CNVR3753 full

chr8 4.110.308 4.112.335 2.027 0,426 0,426 0,131

CNVR3935.1

chr8 75.525.410 75.529.549 4.139 0,451 0,369 0,172

CNVR4014.1

chr8 112.363.260 112.365.469 2.209 0,500 0,410 0,082

CNVR3831.1

chr8 25.122.647 25.126.577 3.930 0,598 0,328 0,049

CNVR3689.1

chr8 584.449 589.454 5.005 0,689 0,262 0,041

CNVR4250,1

chr9 36.352.611 36.353.818 1.207 0,369 0,508 0,115

CNVR4331.1

chr9 70.927.946 70.933.190 5.244 0,443 0,467 0,082

CNVR4374.1

Chr9 88.344.772 88.345.596 824 0,557 0,361 0,074

CNVR4203.1

chr9 17.900.038 17.901.633 1.595 0,598 0,352 0,025

CNVR4332.1

chr9 71.085.050 71.086.301 1.251 0,631 0,328 0,025

CNVR4841.1

chr10 89.265.522 89.266.538 1.016 0,377 0,459 0,156

CNVR4665.1

chr10 27.039.121 27.041.860 2.739 0,377 0,410 0,213

CNVR4886.1

chr10 108.020.303 108.022.518 2.215 0,410 0,418 0,172

CNVR4596.1

chr10 4.698.559 4.700.493 1.934 0,607 0,311 0,082

CNVR4906.1

chr10 122.216.913 122.218.702 1.789 0,664 0,270 0,057

1730

chr11 54.458.221 54.514.519 56.298 0,433 0,367 0,100

CNVR5122.1

chr11 28.963.726 28.969.302 5.576 0,434 0,434 0,115

CNVR5294.1

chr11 103.772.866 103.778.468 5.602 0,475 0,369 0,148

CNVR5429.1

chr12 9.524.006 9.626.453 102.447 0,393 0,402 0,139

CNVR5853 full

chr13 38.831.627 38.833.387 1.760 0,385 0,451 0,148

CNVR5923.1

chr13 71.743.783 71.744.892 1.109 0,402 0,533 0,041

CNVR5850,1

chr13 37.955.318 37.958.191 2.873 0,426 0,434 0,139

CNVR5871.1

chr13 49.967.347 49.973.131 5.784 0,590 0,361 0,033

CNVR6133.1

chr14 39.679.595 39.687.469 7.874 0,352 0,475 0,156

CNVR6211.1

chr14 81.568.879 81.573.106 4.227 0,385 0,377 0,189

CNVR6084.1

chr14 21.951.540 21.952.070 530 0,451 0,418 0,107

CNVR6074 full

chr14 19.621.390 19.625.018 3.628 0,582 0,344 0,057

CNVR6357.1

chr15 37.531.690 37.532.136 446 0,508 0,410 0,066

CNVR6540,1

chr15 97.392.250 97.392.985 735 0,508 0,426 0,057

CNVR6670,1

chr16 22.955.370 22.957.061 1.691 0,377 0,525 0,074

CNVR6676.1

chr16 25.247.611 25.250.595 2.984 0,443 0,459 0,074

CNVR6782.1

chr16 75.096.634 75.101.530 4.896 0,443 0,443 0,098

CNVR7144.1

chr17 53.042.845 53.044.836 1.991 0,410 0,434 0,148

CNVR7096.1

chr17 36.675.163 36.685.731 10.568 0,484 0,402 0,107

CNVR7301.1

chr18 33.560.073 33.560.645 572 0,418 0,451 0,123

CNVR7344.1

chr18 53.097.735 53.099.702 1.967 0,508 0,393 0,082

CNVR7543.1

chr19 12.555.939 12.559.475 3.536 0,475 0,402 0,057

CNVR7581 full

chr19 22.932.698 22.934.767 2.069 0,648 0,270 0,025

2434

chr19 58.210.563 58.244.245 33.682 0,683 0,233 0,067

2454

chr20 1.509.580 1.541.893 32.313 0,483 0,467 0,050

CNVR7808.1

chr20 21.234.267 21.236.529 2.262 0,516 0,418 0,066

CNVR7849.1

chr20 41.705.581 41.707.310 1.729 0,664 0,311 0,008

CNVR7796 full

chr20 15.657.506 15.660.363 2.857 0,672 0,279 0,033

2559

chr22 22.613.016 22.670.785 57.769 0,383 0,467 0,150

CNVR8147.1

chr22 33.975.445 33.976.472 1.027 0,451 0,426 0,115

CNVR8114.4

chr22 22.604.143 22.607.619 3.476 0,451 0,434 0,107

CNVR8154.1

chr22 35.473.303 35.476.957 3654 0,566 0,352 0,074

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento in vitro para determinar el estado de un tejido de donante implantado en un receptor, comprendiendo dicho procedimiento el cribado de una muestra del receptor para determinar la presencia o ausencia

   5 de acidos nucleicos circulatorios que tienen un polimorfismo de variacion en el numero de copias (CNV) que indica que son acidos nucleicos procedentes de un donante, donde la presencia de dichos acidos nucleicos circulatorios de donante es indicativa de un dano celular del tejido trasplantado y la ausencia de dichos acidos nucleicos circulatorios de donante o un nivel de dichos acidos nucleicos circulatorios de donante con respecto a un control es indicativa de ausencia de dano celular o de un dano celular en un nivel aceptable.

   10
2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 donde los acidos nucleicos en la muestra se

   someten a ensayo en relacion con una CNV a partir de un panel de sitios de CNV donde un receptor o donante dado se caracteriza por ser nulisomico para al menos uno de los sitios de CNV y el otro entre el receptor o el donante no lo es, donde preferentemente el sitio de CNV se selecciona de entre la lista indicada en la Tabla 2.

   15
3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 donde la presencia de la CNV no se determina por analisis de secuencia de nucleotidos o analisis de microquimerismo bialelico.
4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3 donde la CNV es un polimorfismo de delecion 20 de numero de copias (CND).
5. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4 donde el sitio de CND se selecciona de entre la

   lista indicada en la Tabla 3 donde el receptor se caracteriza por tener un genotipo nulo para al menos un sitio de CND.

   25
6. 6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el tejido trasplantado es un organo seleccionado de entre la lista que consiste en un rinon, un corazon, un pulmon, un islote pancreatico, un hfgado, un intestino y la piel.

   30 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el tejido

   trasplantado es una extremidad seleccionada de entre la lista que consiste en una pierna, un brazo, una mano y un pie.
7. 8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el tejido 35 trasplantado es un apendice seleccionado de entre la lista que consiste en un dedo del pie, una nariz y una oreja.
8. 9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el tejido es microtejido o celulas madre

   40 10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el tejido

   trasplantado es un rinon.
9. 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde la muestra se selecciona de entre la lista que consiste en plasma, sangre entera, suero, orina, pus, lfquido respiratorio, lfquido

   45 linfatico, heces, bilis, saliva, esputo, semen, flujo vaginal, lfquido cefalorraqufdeo, lfquido cerebral, ascitis, leche, secreciones de las vfas genitourinarias y un lavado de un tejido u organo.
10. 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11 donde la muestra es plasma, sangre entera o suero.

    50
11. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11 donde la muestra es orina.
12. 14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde si se detectan acidos nucleicos del donante, el receptor debe someterse a terapia de inmunosupresion o si el paciente esta en

    55 terapia de inmunosupresion, la terapia debe modificarse.
13. 15. Uso de un panel de CNV que identifica un acido nucleico circulatorio como de origen de un receptor o de origen de un donante en un ensayo de diagnostico in vitro para detectar el estado de dano celular del tejido trasplantado en el receptor, donde preferentemente el panel de CNV es tal como se indica en la Tabla 2, donde

    60 preferentemente la CNV es una CND, donde preferentemente la CND se selecciona de entre la lista indicada en la

    Tabla 3, donde el receptor se caracteriza por tener un genotipo nulo para al menos un sitio de CND.

    imagen1

    imagen2

    Figura 1b

    imagen3

    Figura 2

    imagen4

    L 1.02-1.1.-20 86068821-3

    Curvas de amplification

    imagen5

    GE observado

    imagen6

    o

    -O

    co

    £

    CD

    tt>

    _Q

    O

    LU

    0

    imagen7

    600

    500

    400

    300

    200

    100

    0

    RJ= 0,9908

    imagen8

    -----------1------------------------1---- I---

    300 400 500

    GE esperado

    600

    CO

    CO

    500

    o

    -O

    03

    £

    03

    </)

    .Q

    O

    LD

    O

    500

    400

    imagen9

    R1 = 0,9635

    imagen10

    300 400 500 600

    GE esperado

    Figura 6

    imagen11

    L 1.02-1.1.-20 86068821-3

    CO

    cn

    imagen12

    CO

    CD

    imagen13

    Gt/mt.

    350

    ADN de donante

    ♦ Q1

    ■ Win

    T

    i

    "

    x i r—X— : ___________

    A —

    I ■

    i

    I i

    ____ _j. .

    j !--------•--------.-----

    : =»= t 4 !

    ORG_02A (Antes ORG_02B (1 semana ORG_02C (2 semana ORG_02D (3 semana ORG_02E (4 semana ORG_02F (12 semana ORG_02G (24 semana

    de trasplante) despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante

    A Mediana x Max ' Q3

    GE/ml

    ADN total

    ♦ Q1 ■ Min

    30000

    25000

    20000

    15000

    10000

    5000

    0

    J—*—

    rr

    .

    1

    ' ------------------ H

    X

    =f= •4- +

    HH* t ' 1 ' r

    ORG 02A (Antes ORG_02B (1 semana ORG_02C (2 semana ORG_02D (3 semana ORG 02E (4 semana ORG_02F (12 semana ORG_02G (24 semana

    de trasplante) despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante despues de trasplante

    ▲ Mediana XMax * Q3