CN114350520A - 一种肠道菌群的过滤提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肠道菌群的过滤提取方法，本发明通过对菌群重量、活性、单位菌量和菌群结构为指标对肠道菌群提取过程中的不同洗脱层级数进行评估，得到最优的洗脱层级为5层过滤网(50目、80目、100目、120目、150目)。菌液分别经4层、5层和6层过滤得到的菌泥，使用生理盐水进行洗脱后离心获得菌泥，结合高通量测序从菌落结构和菌群相对丰度进行评估验证，发现经过5层滤网洗脱与经过4层过滤和6层过滤洗脱后菌落结构不同，并且5层滤网洗脱后菌群丰度种类多于经过4层和6层过滤网洗脱。实现了确保减少除优质肠道菌群以外的成分并确保获得优质肠道菌群得率和活性。
Description
技术领域
本发明涉及菌群提取技术领域，尤其涉及一种肠道菌群的过滤提取方法。
背景技术
菌群移植是一种将从健康供体提取出的菌群移植到患者的肠道从而实现疾病治疗的微生态干预方法，其能够有效治疗艰难梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征等各种传统治疗手段难以根治的疾病，同时在肿瘤、糖尿病、自闭症等一些难以治愈的重大疾病上也有较好的辅助治疗能力。诸多环节中，菌群的高效提取是保证移植有效及安全的重要因素之一。健康人群的粪便中大部分是水分，其余主要由各种微生物、纤维成分和可溶性物质组成。因此，如何有效的分离出肠道菌群，保持肠道菌群的数量、活性及菌群丰度，成为亟待解决的问题。
目前常用的肠道菌群分离提取技术主要有过滤法、离心法以及先过滤后离心的联合使用方法。研究表明，过滤网层数、口径等参数对收集的菌群质量和数量有较大影响，如过滤条件直接影响菌群的得率、活菌数量以及菌群多样性等；过滤对收集菌群至关重要，而现有技术中，一部分研究主要集中在菌群的品质纯度上，牺牲了菌群得率；而另一部分研究重心则放在菌群的得率上，牺牲了菌群的活性，收集到的菌泥中含有大量菌泥以外的杂质成分，在过滤的工艺上无法兼顾品质与得率。因此，本研究进行了不同洗脱层级过滤对菌群影响的探讨工作，以期解决上述问题。
发明内容
本发明旨在解决上述问题。本发明的一个目的是提供一种肠道菌群的过滤提取方法，该方法能减少肠道菌群以外的杂质成分并确保肠道菌群的高得率和高活性。
为达到此目标，本发明采用以下技术方案：
一种肠道菌群的过滤提取方法，包括以下步骤：
步骤S00初步处理：收集健康供体新鲜粪便a份，按稀释比例溶解于b份的生理盐水中，得到混合液D；
步骤S10洗脱处理：将步骤S00中的混合液D通过5层滤网过滤，其中滤网目数依次为50目、80目、100目、120目、150目，在每次过滤时用刮板手动协助过滤，收集得到d份菌群悬液E；
步骤S20离心处理：将步骤S10中得到的菌群悬液E离心处理得到菌泥F；
步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌泥F加入相应的冻存保护剂后放入冰箱中进行冷冻保存。
本发明优选的技术方案在于，还包括步骤S11取样检测：将步骤S10中得到的菌群悬液E取样2份至不同的无菌离心管中离心处理，分别进行活菌数及菌群重量测定。
本发明优选的技术方案在于，在步骤S11中，在对活菌数测定时，先将离心得到的菌泥稀释若干倍，用LIVE/DEADBacLight Bacterial Viability Kit对稀释后的菌泥进行染色，采用BD Accuri C6流式细胞仪分析菌泥的活菌率和总菌数。
本发明优选的技术方案在于，在步骤S11中，在对菌群重量测定时，通过分析天平称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。
本发明优选的技术方案在于，步骤S11中对活菌数测定以及菌群重量测定的试验数据均采用SPSS 22.0Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子进行方差分析并进行Duncan氏组间多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
本发明优选的技术方案在于，统计显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。
本发明优选的技术方案在于，还包括步骤S12，对步骤S10离心后的菌悬液取样，使用QIAamp Fast DNA Stool Mini KIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNA V3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，对测序数据通过Usearch进行OTU聚类分析，以获得菌群丰度和组成信息。
本发明优选的技术方案在于，所述步骤S20中，离心转速设置为5000r pm。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种肠道菌群的过滤提取方法，本发明通过对菌群重量、活性、单位菌量和菌群结构为指标对肠道菌群提取过程中的不同洗脱层级数进行评估，得到最优的洗脱层级为5层过滤网(50目、80目、100目、120目、150目)。菌液分别经4层、5层和6层过滤得到的菌泥，使用生理盐水进行洗脱后离心获得菌泥，结合高通量测序从菌落结构和菌群相对丰度进行评估验证，发现经过5层滤网洗脱后菌落结构不同与经过4层过滤和6层过滤洗脱，并且5层滤网洗脱后菌群丰度种类多于经过4层和6层过滤网洗脱；实现了确保减少除优质肠道菌群以外的成分并确保获得优质肠道菌群得率和活性。
参照附图来阅读对于示例性实施例的以下描述，本发明的其他特性特征和优点将变得清晰。
附图说明
并入到说明书中并且构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且与描述一起用于解释本发明的原理。在这些附图中，类似的附图标记用于表示类似的要素。下面描述中的附图是本发明的一些实施例，而不是全部实施例。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明不同层级过滤对菌群重量、菌群活性和单位菌量的影响情况表，a,b,c表示差异分组；
图2是本发明不同层级洗脱对菌群得率、活菌率和单位菌量的影响情况图；
图3是本发明不同层级过滤后菌群丰度图(图中A、B、C分别为供体L MX、PLH、OYC菌群丰度图)；
图4是本发明不同供体不同层级过滤后菌群PCA图(图中A、B、C分别为供体LMX、PLH、OYC菌群PCA图)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
下面结合附图及实施例，进一步的说明本发明的技术方案。
一种肠道菌群的过滤提取方法，包括以下步骤：
步骤S00初步处理：收集健康供体新鲜粪便a份，按稀释比例溶解于b份的生理盐水中，得到混合液D；
步骤S10洗脱处理：将步骤S00中的混合液D通过5层滤网过滤，其中滤网目数依次为50目、80目、100目、120目、150目，在每次过滤时用刮板手动协助过滤，收集得到d份菌群悬液E；
步骤S20离心处理：将步骤S10中得到的菌群悬液E离心处理得到菌泥；
步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌泥F加入相应的冻存保护剂后放入冰箱中进行冷冻保存。
优选的，还包括步骤S11取样检测：将步骤S10中得到的菌群悬液E取样2份至不同的无菌离心管中离心处理，分别进行活菌数及菌群重量测定。
优选的，在步骤S11中，在对活菌数测定时，先将离心得到的菌泥稀释若干倍，用LIVE/DEAD BacLightBacterial Viability Kit对稀释后的菌泥进行染色，采用BD AccuriC6流式细胞仪分析菌泥的活菌率和总菌数。
优选的，在步骤S11中，在对菌群重量测定时，通过分析天平称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。
优选的，步骤S11中对活菌数测定以及菌群重量测定的试验数据均采用SPSS 22.0Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子进行方差分析并进行Duncan氏组间多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
进一步的，统计显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。
优选的，还包括步骤S12，对步骤S10离心后的菌悬液取样，使用QIAamp Fast DNAStool Mini KIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNA V3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，对测序数据通过Usearch进行OTU聚类分析，以获得菌群丰度和组成信息。
优选的，所述步骤S20中，离心转速设置为5000rpm。
在本实施例中，对三个健康供体分别编号为LMX、PLH和OYC,对三个供体以每组3个重复进行取样，取3个重复组的平均值。
本实施例中，三个健康供体经过严格条件筛选的供体，样本的重量、形状和颜色均符合试验要求。
本实施例中，优选的，试验所涉及的器材包括高速离心机、移液枪、生物安全柜、高通量测序仪、流式细胞仪、电子天平、涡旋振荡器、过滤网、Illumina HiSeq2500。
本实施例中，a、b和d的比例为：a为100-200g，b为750-1000mL，d为600-850mL。
本实施例中，在步骤S20中，菌群悬液E离心处理时，将1mL的菌液添加至2mL的无菌离心管。
对混合溶液D分别使用4层过滤(50目、80目、100目、120目)，5层过滤(50目、80目、100目、120目、150目)和6层过滤(50目、80目、100目、120目、150目、200目)进行处理，再通过步骤S20对得到的菌泥F进行取样检测，每组试验3个重复，取3个重复组的平均值。
不同层级洗脱对菌群重量(g)、活菌率(％)和单位菌量(cell/μl)影响的数据如图1所示。图1-2结果表明，供体LMX中，不同洗脱层级间的菌群重量和菌群活性无显著性差异(P＞0.05)，但单位菌量上组间差异显著(P＜0.05)，经过5层和6层滤网洗脱的单位菌量上无显著差异(P＞0.05)，但它们均显著高于经过4层滤网洗脱的单位菌量(P＜0.05)，其中，经过第5层滤网洗脱后得到的单位菌量比用4层滤网的多1626.67cell/μl；
供体PLH中，不同洗脱层级间的菌群重量和单位菌量有显著差异(P＜0.05)，而活性则无显著差异(P＞0.05)，经过4层滤网洗脱后的菌群重量显著高于5层和6层滤网洗脱(P＜0.05)，其中，第4层滤网洗脱比第5层多0.06g的菌群重量，第4层滤网洗脱比第6层多0.08g的菌群重量，而经过5层滤网洗脱后的菌群重量显著高于6层滤网洗脱(P＜0.05)，菌群重量多0.02g；而从单位菌量来看，经过5层滤网洗脱后的单位菌量显著高于4层和6层滤网洗脱(P＜0.05)，其中，第5层滤网洗脱得到的单位菌量比第4层多3011cell/μl，比第6层多2866cell/μl；而经过4层和5层滤网洗脱的单位菌量差异不显著(P＞0.05)。
供体OYC中，不同洗脱层级间的菌群重量有显著性差异(P＜0.05)，经过4层滤网洗脱的菌群重量显著高于经过5层和6层滤网洗脱(P＜0.05)，其中，第4层滤网洗脱得到的菌群重量比第5层多0.02g，比第6层多0.03g，而经过5层滤网洗脱的菌群重量显著高于经过6层滤网洗脱(P＜0.05)，菌群重量多0.01g；不同洗脱层级间的活性有显著性差异(P＜0.05)，经过4层滤网洗脱的菌群活性显著高于经过6层滤网洗脱(P＜0.05)，菌群活性高出0.96％，其余各组差异不显著(P＞0.05)；不同洗脱层级对单位菌量有显著差异(P＜0.05)，经过5层和6层滤网洗脱的菌群单位菌量显著高于经过4层滤网洗脱(P＜0.05)，其中，第4层滤网洗脱后得到的单位菌量比第5层少1834.67cell/μl，比第6层少1654cell/μl，经过5层和6层滤网洗脱的单位菌量差异不显著(P＞0.05)。
从三个供体样本的试验数据来看，随着滤网层数增加，菌群重量有所减少，重量减少范围为8％～22％；不同洗脱层级对菌群活性无显著影响，各个供体菌群活性比较一致，差异仅为0.06％～3.53％；但是不同洗脱层级对单位菌量有显著影响，经过5层滤网洗脱的单位菌量高于其它两组，比经4层多出9.56％～26.48％的单位菌量，比经6层多出2.10％～9.33％的单位菌量。
通过高通量测序，从菌群结构和菌群丰度上来看，不同层级过滤处理后的菌群结构差异显著，其中LMX和PLH供体4层过滤与6层过滤后菌群结构相似，供体OYC 4层过滤与5层过滤后菌群结构较为相似；菌群的丰度上，OYC供体三组菌群相对丰度接近。相比4层和6层滤网，LMX和PLH供体经5层滤网后的特征菌群相对丰度表现出显著差异，如Faecalibacterium属丰度高于其他组。
综上所述，以菌群重量、活性和单位菌量为指标对肠道菌群提取过程中的洗脱层级进行评估，得到最优的洗脱层级为5层过滤网(50目、80目、100目、120目、150目)。菌液分别经4层、5层和6层过滤得到的菌泥，使用生理盐水进行洗脱后离心获得菌泥，通过刮板手动协助洗脱液的洗脱，收集菌群悬液，得到600～850mL菌悬液；同时结合高通量测序进一步从菌落结构和菌群相对丰度进行评估，发现较其他层级，5层过滤对菌落结构和菌群相对丰度可产生显著差异，如Faecalibacterium属相对丰度高于其他层级。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，仅仅参照较佳实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S00初步处理：收集健康供体新鲜粪便a份，按稀释比例溶解于b份的生理盐水中，得到混合液D；
步骤S10洗脱处理：将步骤S00中的混合液D通过5层滤网过滤，其中滤网目数依次为50目、80目、100目、120目、150目，在每次过滤时用刮板手动协助过滤，收集得到d份菌群悬液E；
步骤S20离心处理：将步骤S10中得到的菌群悬液E离心处理得到菌泥F；
步骤S30产品获取：将步骤S20中得到的菌泥F加入相应的冻存保护剂后放入冰箱中进行冷冻保存。
2.根据权利要求1所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
还包括步骤S11取样检测：将步骤S10中得到的菌群悬液E取样2份至不同的无菌离心管中离心处理，分别进行活菌数及菌群重量测定。
3.根据权利要求2所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
在步骤S11中，在对活菌数测定时，先将离心得到的菌泥稀释若干倍，用LIVE/DEADBacLight Bacterial Viability Kit对稀释后的菌泥进行染色，采用BD Accuri C6流式细胞仪分析菌泥的活菌率和总菌数。
4.根据权利要求2所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
在步骤S11中，在对菌群重量测定时，通过分析天平称取离心后收集菌群的重量，并进行得率的计算。
5.根据权利要求2所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
步骤S11中对活菌数测定以及菌群重量测定的试验数据均采用SPSS 22.0Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子，并进行方差分析并进行Duncan氏多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
6.根据权利要求5所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
统计显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。
7.根据权利要求1所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
还包括步骤S12，对步骤S10离心后的菌悬液取样，使用QIAamp Fast DNA Stool MiniKIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNA V3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，对测序数据通过Usearch进行OTU聚类分析，以获得菌群丰度和组成信息。
8.根据权利要求1所述一种肠道菌群的过滤提取方法，其特征在于：
所述步骤S20中，离心转速设置为5000rpm。
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