CN105853464A - 一种利用肠壁优势菌替代天然菌群的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种利用肠壁优势菌替代天然菌群的制备方法及其应用，是采用肠镜活体收集健康人和肠道疾病患者肠道粘膜样品，之后于样品保存于‑80℃冰箱。再将经过严格筛选的健康人粪便样品中的微生物分离出来，直接灌肠或者制成药丸给肠道疾病患者服用，同时收集患者治疗期肠壁粘膜样本。本发明针对健康人和肠道疾病患者肠壁粘膜差异细菌进行有益菌筛选，之后通过先的进微生物组学确定粪菌移植中起作用的优势菌，通过优化组合确定最佳细菌种类、比例和浓度。该发明与天然菌群移植方法相比，菌群种类明确、可控，无病毒及其它可能损害人体健康物质存在，本发明配方细菌可工业化批量生产，避开了天然菌群移植过程中供体选择、粪便处理等一系列繁琐手续和短板。

Description

一种利用肠壁优势菌替代天然菌群的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种利用肠壁优势菌替代天然菌群的制备方法及其应用，通过活菌筛选和验证，避免了天然粪菌移植中复杂成分对人体造成的影响，又实现了可控的、组成成分明确细菌移植，最终达到疾病预防、治疗和维护健康的目的。

背景技术

在人体肠道内环境中，肠道菌群数量约1000至1500种，细菌数量达到10万亿个，肠道存在许多不同益生菌包括乳酸菌属、双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属、粪杆菌属等，共同维持肠道微生态平衡。

众多对人体肠道健康的研究表明，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到70%，普通人则是25%，便秘人群减少到15%，而癌症病人肠道内的益生菌的比例只有10%，所以肠道健康对维持机体正常运转起着重要作用。

目前国内外粪菌移植技术主要应用于复发性难辨梭状芽胞杆菌感染的治疗。难辨梭状芽孢杆菌是一种袭击肠道的厌氧性细菌，通常因健康细菌被大剂量抗生素杀死后出现，导致肠道发炎。美国每年有超过30万病人在医院中感染难辨梭状芽孢杆菌，出现腹泻、毒血症和肾衰竭症状，并造成每年1.4万人死亡。

目前，粪菌移植已经被被FDA批准用于北美部分地区进行难辨梭状芽孢杆菌感染的治疗，多例病人经过粪菌移植已经取得良好的治疗效果，短期内即可缓解腹痛、腹泻、解粘液脓血便的症状，效果显著。但是，粪便中成分复杂，含有多种致病菌和有毒有害物质，据现有的分离方法，很多不明确的成分仍然无法完全去除，这就导致粪菌移植过程可能出现的不良反应。

本发明主要采用16S 高通量测序的方法，通过分析粪菌移植过程中肠壁菌群的变化，并确定优先定植肠壁的菌属，从健康人群的肠壁菌群样品中筛选出所需细菌，并通过优化，确定最佳菌群组合，实现更安全、更高效的治疗复杂肠道疾病的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可替代粪便菌群移植治疗肠道相关疾病的方法，通过筛选优先定植肠壁的益生菌，优化组合后，实现高效、安全且无复发的根治由肠道菌群失衡导致的多种肠道疾病。

本发明所述制备方法包括下列步骤：

一、健康人群肠粘膜样品获取

通过与胃肠科医院合作，采用肠镜采集健康人肠壁菌群样品，-80 ℃冻存；健康人群肠壁菌群采集的筛选条件为：

a、常规血液检查正常；

b、至少近3-6个月内没有发生腹泻且没有使用过抗生素；

c、无传染性疾病，如HIV、乙肝、丙肝等；

d、无糖尿病及恶性肿瘤病史；

e、没有胃肠道疾病；

f、没有胃肠道手术史；

g、没有系统自身免疫疾病及其他过敏性疾病；

h、没有代谢疾病；

i、没有不良性生活嗜好；

j、小孩、年轻人、伴侣或者伴侣亲属优先选择；

二 患者肠粘膜样品获取

患者群体包括：复发性难辨梭菌感染，炎症性肠病，肠易激综合征，慢性便秘，慢性疲劳综合征，代谢疾病和自身免疫性疾病等。

三、粪菌移植治疗期间样品获取

将经严格筛选的健康人群的粪便样品制备成粪菌悬液，直接将菌悬液或者制成的菌群药丸送入病人肠道，用以治疗各种疾病。在治疗期第7天，第14天，第28天，第56天取病人肠粘膜样品，-80 ℃冻存；

四、肠壁优势细菌分离

a，活菌分离及鉴定

1，取新鲜的的粪便，加入适量生理盐水，用匀浆机充分悬浮，呈泥浆状；采用过滤器或医用纱布过滤匀浆，去除排泄废弃物，保留混合菌悬液；

2，取混合菌悬液涂布于MRS平板、BHI平板、LB平板、LB+5%脱脂乳平板、血平板上，置于厌氧和需氧两种条件下培养，挑选单菌落

3，所有筛选得到的细菌经生理生化和分子生物学测序确定菌体种类。

b，高通量测序

1，提取所有样品中微生物基因组DNA；

2，将所取得的DNA送测序公司进行测序并分析

本发明所述制备的利用肠壁优势菌替代天然菌群的应用为：

根据分离得到的细菌和高通量测序结果，将各种微生物按照肠道菌群结构进行组合和优化，复配为混合细菌制剂，确定最佳细菌组合比例、剂量，之后将该混合菌制剂用于治疗人体各种疾病，并以天然肠道菌群移植作为阳性对照进行比较。

本发明的有益效果：本发明通过活菌筛选和验证，避免了天然粪菌移植中复杂成分对人体造成的影响，又实现了可控的、组成成分明确细菌移植，最终达到疾病预防、治疗和维护健康的目的。

具体实施方式

本发明所述制备方法包括下列步骤：

一、健康人群肠粘膜样品获取

通过与胃肠科医院合作，采用肠镜采集健康人肠壁菌群样品，-80 ℃冻存；健康人群肠壁菌群采集的筛选条件为：

a、常规血液检查正常；

b、至少近3-6个月内没有发生腹泻且没有使用过抗生素；

c、无传染性疾病，如HIV、乙肝、丙肝等；

d、无糖尿病及恶性肿瘤病史；

e、没有胃肠道疾病；

f、没有胃肠道手术史；

g、没有系统自身免疫疾病及其他过敏性疾病；

h、没有代谢疾病；

i、没有不良性生活嗜好；

j、小孩、年轻人、伴侣或者伴侣亲属优先选择；

二 患者肠粘膜样品获取

患者群体包括：复发性难辨梭菌感染，炎症性肠病，肠易激综合征，慢性便秘，慢性疲劳综合征，代谢疾病和自身免疫性疾病等。

三、粪菌移植治疗期间样品获取

将经严格筛选的健康人群的粪便样品制备成粪菌悬液，直接将菌悬液或者制成的菌群药丸送入病人肠道，用以治疗各种疾病。在治疗期第7天，第14天，第28天，第56天取病人肠粘膜样品，-80 ℃冻存；

四、肠壁优势细菌分离

a，活菌分离及鉴定

1，取新鲜的的粪便，加入适量生理盐水，用匀浆机充分悬浮，呈泥浆状；采用过滤器或医用纱布过滤匀浆，去除排泄废弃物，保留混合菌悬液；

2，取混合菌悬液涂布于MRS平板、BHI平板、LB平板、LB+5%脱脂乳平板、血平板上，置于厌氧和需氧两种条件下培养，挑选单菌落

3，所有筛选得到的细菌经生理生化和分子生物学测序确定菌体种类。

b，高通量测序

1，提取所有样品中微生物基因组DNA；

2，将所取得的DNA送测序公司进行测序并分析

本发明所述制备的利用肠壁优势菌替代天然菌群的应用为：

根据分离得到的细菌和高通量测序结果，将各种微生物按照肠道菌群结构进行组合和优化，复配为混合细菌制剂，确定最佳细菌组合比例、剂量，之后将该混合菌制剂用于治疗人体各种疾病，并以天然肠道菌群移植作为阳性对照进行比较。

Claims (2)

1.一种利用肠壁优势菌替代天然菌群的制备方法,其特征在于：

一、健康人群肠粘膜样品获取

通过与胃肠科医院合作，采用肠镜采集健康人肠壁菌群样品，-80 ℃冻存；健康人群肠壁菌群采集的筛选条件为：

a、常规血液检查正常；

b、至少近3-6个月内没有发生腹泻且没有使用过抗生素；

c、无传染性疾病，如HIV、乙肝、丙肝等；

d、无糖尿病及恶性肿瘤病史；

e、没有胃肠道疾病；

f、没有胃肠道手术史；

g、没有系统自身免疫疾病及其他过敏性疾病；

h、没有代谢疾病；

i、没有不良性生活嗜好；

j、小孩、年轻人、伴侣或者伴侣亲属优先选择；

二 患者肠粘膜样品获取

患者群体包括：复发性难辨梭菌感染，炎症性肠病，肠易激综合征，慢性便秘，慢性疲劳综合征，代谢疾病和自身免疫性疾病;

三、粪菌移植治疗期间样品获取

将经严格筛选的健康人群的粪便样品制备成粪菌悬液，直接将菌悬液或者制成的菌群药丸送入病人肠道，用以治疗各种疾病；在治疗期第7天，第14天，第28天，第56天取病人肠粘膜样品，-80 ℃冻存；

四、肠壁优势细菌分离

a，活菌分离及鉴定

1），取新鲜的的粪便，加入适量生理盐水，用匀浆机充分悬浮，呈泥浆状；采用过滤器或医用纱布过滤匀浆，去除排泄废弃物，保留混合菌悬液；

2），取混合菌悬液涂布于MRS平板、BHI平板、LB平板、LB+5%脱脂乳平板、血平板上，置于厌氧和需氧两种条件下培养，挑选单菌落；

3），所有筛选得到的细菌经生理生化和分子生物学测序确定菌体种类;

b，高通量测序

1），提取所有样品中微生物基因组DNA；

2），将所取得的DNA送测序公司进行测序并分析。

2.一种利用肠壁优势菌替代天然菌群的应用，其特征在于：

根据分离得到的细菌和高通量测序结果，将各种微生物按照肠道菌群结构进行组合和优化，复配为混合细菌制剂，确定最佳细菌组合比例、剂量，之后将该混合菌制剂用于治疗人体各种疾病，并以天然肠道菌群移植作为阳性对照进行比较。