CN109562132A - 用于小型生物群疗法的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包括具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物的组合物。在一些实施方式中，组合物包括与微生物菌群具有高度相似性的多种细菌属。

Description

用于小型生物群疗法的组合物和方法
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及包括多种细菌属的组合物和使用其比如用于治疗生态失调的方法。
背景技术
胃肠道聚藏丰富的和多种多样的微生物群落。其是复杂体系，为许多不同物种或生物体的群落——包括多种多样的细菌菌株——提供环境或生态位。正常微生物菌群也通常栖息于皮肤、指甲、眼睛、口腔和上呼吸道以及泌尿生殖道。
健康的小型生物群要求细菌群集，其为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的抗性、必需营养物生物合成和吸收、以及维持健康肠上皮和适当受控的全身免疫性的免疫刺激。在‘生态失调’或破坏的共生关系的环境中，小型生物群功能可能丧失或被扰乱，导致对病原体增加的敏感性、改变的代谢曲线、或诱导可能导致局部或全身炎症或自身免疫性的促炎信号。因此，微生物菌群和具体地肠道小型生物群在许多疾病和紊乱的发病机理中起重要作用，这些疾病和紊乱包括但不限于肠的多种病原性感染。
存在对于治疗或预防各种疾病的组合物和方法的持续需要，这包括慢性病比如生态失调、肥胖、感染、结肠炎、炎症性肠病(比如克罗恩病)、自身免疫疾病和癌症免疫疗法。
发明内容
本发明在其一些实施方式中涉及多种细菌属的组合物，其中所述多种细菌属与小型生物群的起源群体具有高度相似性。
根据一方面，本发明提供合成组合物，其包括具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物。
根据另一方面，本发明提供包括多种细菌属和多种颗粒的合成组合物，其中多种细菌属是(i)具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物，和(ii)与小型生物群群体具有至少30％相似性。
根据一些实施方式，多种细菌属的至少一部分起源于小型生物群群体。根据一些实施方式，小型生物群群体是预定靶向的小型生物群的群体。
根据一些实施方式，组合物包括需氧细菌的至少一种或子集和厌氧细菌的至少一种或子集。根据一些实施方式，组合物包括以生物膜形式的细菌的至少一个细菌子集和浮游细菌的至少一个细菌子集。
根据一些实施方式，组合物包括多种细菌属，其与预定靶向的小型生物群的群体具有至少30％相似性。
根据一些实施方式，组合物包括多种细菌属，其与小型生物群起源群体具有至少30％相似性。
根据一些实施方式，小型生物群的群体选自肠小型生物群、唾液小型生物群、皮肤小型生物群、口腔小型生物群、支气管小型生物群、阴道小型生物群、土壤小型生物群或其混合物。
根据一些实施方式，多种细菌属来源于选自下列的一种或多种样品：排泄物样品、唾液样品、皮肤样品、口腔样品、支气管样品、阴道样品、土壤样品或其混合物。
根据一些实施方式，小型生物群的群体来源于至少一种起源。
根据一些实施方式，多种细菌属来源于一种或多种健康哺乳动物、动物供体、细菌菌株、储存的小型生物群样品、细菌菌落、浮游生物样品和生物膜。
根据一些实施方式，组合物进一步包括多种颗粒。
根据一些实施方式，其中每种颗粒包括至少两种不同细菌科的共培养物。
根据另一方面，提供了药物组合物，其包括本文描述的组合物和药学上可接受的运载体或赋形剂。
根据一些实施方式，药学上可接受的运载体或赋形剂选自稳定剂、防腐剂、螯合剂、粘度改性剂、缓冲剂和pH调节剂中的一种或多种。
根据一些实施方式，药物组合物被配制用于直肠、静脉内、肠胃外、粘膜、鼻部或口服施用。
根据一些实施方式，药物用于治疗生态失调。
根据另一方面，提供了治疗需要其的对象中的疾病或紊乱的方法，该方法包括给对象施用本文描述的组合物。根据一些实施方式，所述疾病或紊乱是生态失调。
根据另一方面，提供了用于获得包括具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物的组合物的方法，该方法包括下列步骤：
a.提供包括来自至少一种起源的小型生物群的多种细菌属；
b.悬浮所述多种细菌属以获得细菌属溶液；
c.过滤多种细菌属溶液从而获得包括多种细菌属的滤液；
d.利用多种颗粒培育滤液，并且使得多种细菌属附着至多种颗粒；
e.将(d)的多种细菌属分为多种细菌溶液子集；
f.在生长培养基中且在适合于单个子集增殖的增殖条件下培养每个细菌溶液子集；
g.去除生长培养基，并且重组单个子集；
从而获得包括具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物的组合物。
根据一些实施方式，增殖条件选自需氧、厌氧和微需氧条件。根据一些实施方式，增殖条件选自流动、摇动和静态条件。根据一些实施方式，增殖条件选自潮湿条件和低湿度条件。
除非另外限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方式，但是下面描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，本专利说明书包括定义将适用。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不意欲是必然限制性的。
附图说明
在本文中仅通过实例的方式参照附图描述本发明的一些实施方式。现在详细地具体参考附图，要强调的是示出的细节仅仅是举例说明和出于本发明的实施方式的说明性讨论的目的。在这方面，说明书连同附图使得本领域技术人员如何可以实践本发明的实施方式变得显而易见。
在附图中：
图1是流程图，其作为非限制性实例说明用于获得小型生物群组合物的步骤。
图2呈现以下列条件培养的细菌的相对分布：瓶1.需氧液体排泄物；瓶2.需氧TSB；瓶3.需氧RCM；瓶4.需氧排泄物滤液；瓶5.厌氧液体排泄物；瓶6.厌氧TSB；瓶7.厌氧RCM；瓶8.厌氧排泄物滤液；结果基于加权UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)，其基于每种条件(瓶)的微生物群落的16s rRNA分析。在轴上指示由主坐标阐明的变化百分比。
图3是柱状图，其说明不同样品与原始土壤小型生物群相比的相似性百分比。
图4是显示细菌属的图，其通过在不同条件中生长的土壤小型生物群和人口腔小型生物群的降趋对应分析(DCA)排序分析。
图5是显示来自在不同条件中生长的土壤和人口腔小型生物群的细菌群体的多维尺度法(multidimensional scaling)(MDS)排序分析的结果的图。
图6是显示小规模的乳杆菌属和双歧杆菌属菌株及其混合物的细菌生长的柱状图。
图7是显示中等规模的乳杆菌属和双歧杆菌属菌株及其混合物的细菌生长的柱状图。
图8A-8B是显示根据不同类型的接种物的细菌生长的柱状图：从生物膜(图8A)或基质接种物(图8B)分离的细菌。
图9是显示在中等规模条件下通过细菌细胞计数的细菌耐酸性的柱状图。
图10是显示在不同浓度的羧苄青霉素下通过细菌细胞计数的细菌菌株对抗生素抗性的柱状图。
具体实施方式
本发明提供包括多种细菌属的组合物和其使用方法。在一些实施方式中，本发明的组合物包括与微生物菌群具有高度相似性的多种细菌属。
在另外的实施方式中，本发明提供包括细菌属的共培养物的组合物。在一些实施方式中，细菌属的共培养物与微生物菌群具有高度相似性。
如本文所使用，术语“小型生物群”或“微生物菌群”指的是发现、构成或已知居住在环境生态位中的微生物(包括但不限于细菌、真菌比如酵母)的聚集。在一些实施方式中，微生物菌群是发现或已知居住在健康对象的环境生态位中的微生物的聚集。环境生态位的非限制性实例包括肠、皮肤、唾液、口腔和上呼吸道以及泌尿生殖道。环境生态位的另外非限制性示例包括土壤、地下水和开阔水域。
在一些实施方式中，微生物菌群具有共同起源(即，来源于类似的环境生态位)。在一些实施方式中，微生物菌群具有共同靶标。如本文所使用，本发明的方法可以获得各种细菌和形成具有与靶向的环境生态位高度同一性或相似性的合成组合物。在一些实施方式中，本发明的组合物包括与小型生物群靶向的环境生态位具有至少30％相似性的多种细菌属。
在一些实施方式中，组合物的细菌属是细菌共培养物的合成集群(assembly)，从而类似共同起源(例如，预定的环境生态位)的微生物菌群或指定的细菌共培养物。
在一个实施方式中，本发明的组合物包括至少两种不同细菌的共培养物。在另一个实施方式中，本发明的组合物包括至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50种不同细菌的共培养物。在一个实施方式中，不同细菌是来自不同科的细菌。在一个实施方式中，不同细菌是来自不同属的细菌。术语“不同”指的是具有不同生长和/或增殖条件的细菌。在一个实施方式中，不同生长和/或增殖条件是至少两种最佳条件，其中第一条件允许第一细菌的基本上最佳生长增殖和培育并且第二条件允许第二细菌的基本上最佳生长增殖和培育。
在一些实施方式中，本发明的细菌共培养物包括需氧细菌的至少一种或子集。在一些实施方式中，本发明的细菌共培养物包括厌氧细菌的至少一种或子集。在一些实施方式中，本发明的细菌共培养物包括需氧细菌的至少一种或子集和厌氧细菌的至少一种或子集。
在一些实施方式中，本发明的细菌共培养物包括生物膜形式的细菌的至少一种或子集。在一些实施方式中，本发明的细菌共培养物包括浮游细菌的至少一种或子集。在一些实施方式中，本发明的细菌共培养物包括生物膜形式的细菌的至少一种或子集和浮游细菌的至少一种或子集。
在一些实施方式中，共培养物的至少一部分是互养关系。
如本文下面所证明的，在本文描述的方法下形成的组合物显示与肠细菌属的高度相似性(例如，与通常已知的肠细菌属多于90％的相似性)。进一步，本文描述的组合物显示与土壤细菌菌群的高度相似性(与土壤样品多于的30％相似性)。进一步，本文描述的组合物显示与口腔细菌菌群的高度相似性(与口腔样品多于30％的相似性)。
在一些实施方式中，本发明的组合物是合成组合物。如本文所使用，术语“合成”指的是在至少两种不同生长培养基和增殖条件下在体外生长的细菌组合物。
在一些实施方式中，小型生物群是肠小型生物群。在一些实施方式中，小型生物群是口腔小型生物群。在一些实施方式中，小型生物群从唾液获得。在一些实施方式中，小型生物群是支气管小型生物群。在一些实施方式中，小型生物群是皮肤小型生物群。在一些实施方式中，小型生物群是阴道小型生物群。在一些实施方式中，小型生物群是土壤小型生物群。
在一些实施方式中，多种细菌属来源于对象(比如人)。在一些实施方式中，多种细菌属来源于选自排泄物样品、唾液样品、口腔样品、支气管样品、皮肤样品和阴道样品的一种或多种样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于排泄物样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于唾液样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于口腔样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于支气管样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于皮肤样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于阴道样品。
细菌属可以来源于单一样品或多种样品。细菌属的至少一部分可以来源于除了动物之外的样品。在一些实施方式中，多种细菌属来源于土壤。在一些实施方式中，多种细菌属来源于植物物质。
在一些实施方式中，土壤小型生物群的组合物用于农业用途。在一些实施方式中，提供了如本文描述的组合物和农业上可接受的运载体。在一些实施方式中，土壤小型生物群的组合物在增强期望的植物性状中是有用的。在一些实施方式中，土壤小型生物群的组合物对于增强或改善植物生长是有用的。在一些实施方式中，土壤小型生物群的组合物对于杀虫剂降解是有用的。在一些实施方式中，土壤小型生物群的组合物改善土壤肥力。在一些实施方式中，土壤小型生物群的组合物用于调节固氮作用、脱氮作用和硝化作用，这是由于微生物在氮循环中的关键作用。在一个实施方式中，多种细菌属从未污染的土壤或水样品获得。
在一些实施方式中，组合物包含与环境生态位至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的相似性，包括其间的任何值。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括与小型生物群的起源群体至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的相似性，包括其间的任何值。
在一些实施方式中，组合物包含与靶小型生物群群体至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的相似性，包括其间的任何值。
在一些实施方式中，组合物包含与肠小型生物群的群体至少70％的相似性。表8列举肠小型生物群的非限制性实例。
在一些实施方式中，组合物包含与土壤小型生物群的群体至少25％的相似性。在一些实施方式中，组合物包含与土壤小型生物群的群体至少30％的相似性。表9列举肠小型生物群的非限制性实例。
在一些实施方式中，组合物包含与唾液小型生物群的群体至少25％的相似性。在一些实施方式中，组合物包含与唾液小型生物群的群体至少30％的相似性。表11列举肠小型生物群的非限制性实例。
在一些实施方式中，小型生物群的群体来源于至少一种起源。在一些实施方式中，小型生物群的群体来源于多种起源。在一些实施方式中，小型生物群的群体来源于至少3、至少4、至少5种起源。
在一些实施方式中，组合物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、45、50、55、60、65、70、80、90、100种细菌科，包括其间的任何值。在一些实施方式中，小型生物群的群体包括至少2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100种细菌属，包括其间的任何值。在一些实施方式中，组合物包括细菌属的至少一种群体。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括多种预定的细菌菌株。如本文所使用的术语“预定的”指的是包括根据具体需要选择的细菌菌株的定制组合物。如本文所示例的，包括预定的细菌菌株的组合物可以通过使用各种生长培养基和增殖条件培育小型生物群指定。
在一些实施方式中，组合物包含与表8、9或11中列举的小型生物群群体至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、至少95％的相似性。
在一些实施方式中，多种肠细菌属的组合物具有与在表8中列举的至少70％的相似性。
在一些实施方式中，多种土壤细菌科的组合物具有与在表9中列举的至少30％的相似性。
在一些实施方式中，多种口腔细菌科的组合物具有与在表11中列举的至少30％的相似性。
在一些实施方式中，组合物包括选自放线菌门(Actinobacteria)、古细菌(Archea)、拟杆菌门、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、硬壁菌门、梭杆菌门(Fusobacteria)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、变形菌门(Proteobacteria)、互养菌门(Synergistetes)、柔膜菌门(Tenericutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。
在一个实施方式中，多种细菌属从健康哺乳动物获得。在一个实施方式中，多种细菌属从动物供体获得。在一个实施方式中，可以筛选供体的健康状况和营养习惯。在一个实施方式中，多种细菌属来源于细菌菌株。在一些实施方式中，多种细菌属来源于储存的细菌菌株。在一些实施方式中，多种细菌属来源于冷冻的细菌菌株。在一些实施方式中，多种细菌属来源于冷冻的生物膜。在一些实施方式中，多种细菌属来源于冻干的细菌菌株。在一些实施方式中，多种细菌属是益生菌(probiotic)菌株。
如本文所使用，术语“益生菌”指的是有益的或需要的细菌菌株，其也可以刺激其他微生物的生长，尤其是具有有益性质的那些(比如肠道菌群的那些)。在一个实施方式中，多种细菌属来源于储存的小型生物群样品。在一个实施方式中，多种细菌属来源于细菌菌落。
在一个实施方式中，多种细菌属的至少一部分来源于生物膜。在一个实施方式中，多种细菌属的至少一部分来源于浮游生物样品。
根据一些实施方式，本发明的组合物进一步包括多种颗粒。根据一些实施方式，颗粒被调整、配制或适合于生物膜形成。根据一些实施方式，多种颗粒包括选自下列的一种或多种类型的颗粒：种子(例如，百香果、黑种草属和石榴种子)，压碎的种子，谷物，包括膨润土颗粒、沙颗粒、白黏土颗粒在内的颗粒，包括纤维素纤维的颗粒，纤维素颗粒(例如，微晶纤维素(MCC))，磷酸氢钙颗粒(DCP)，琼脂糖珠和其任意组合。在一些实施方式中，一种或多种颗粒是多孔的。
在一些实施方式中，多种颗粒是合成支架。
在一些实施方式中，种子选自石榴种子和百香果种子。在一些实施方式中，种子是压碎的。
在一些实施方式中，颗粒的直径范围为5微米至1cm。在一些实施方式中，颗粒的直径为5微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为10微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为15微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为20微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为30微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为40微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为50微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为60微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为70微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为80微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为90微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为100微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为200微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为300微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为400微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为500微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为600微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为700微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为800微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为900微米。在一些实施方式中，颗粒的直径为1cm。
参考图1，其作为非限制性实例描述用于获得本发明的组合物的方法。首先，提供包括多种细菌属(例如，来自至少一个靶群体或起源群体的小型生物群)的样品(步骤200)；随后，悬浮多种细菌属以获得细菌属溶液(步骤220)。可以在任意溶液比如PBS中稀释细菌样品，该溶液仍维持细菌天然环境并适合至少一种细菌的生长。稀释可以是适合至少一种细菌属的生长的任何范围，比如1gr样品：1mL溶液–1g样品-10L溶液、1gr样品：10mL溶液–1g样品-5L溶液、或1gr样品：10mL溶液–1g样品-1L溶液。
可以过滤多种细菌属溶液以便于获得包含包括小型生物群的多种细菌属的滤液(步骤240)。可以利用多种颗粒在允许多种细菌属的至少一部分附着至多种颗粒的条件下培育滤液(步骤260)。
附着至多种颗粒的多种细菌属随后被分为颗粒的多个子集(以诱导生物膜的生长)(步骤280)。可选地，至少一个子集取自缺乏颗粒的(步骤220或240的)细菌溶液(从而诱导浮游细菌的生长)。随后，进行培养步骤，其中每个单个子集在对于单个子集独特的生长培养基和增殖条件下培养第一时间段(步骤300)；随后，去除第一培养基，和可以进行第二培养步骤，其中单个子集在生长培养基和增殖条件下培养第二时间段(步骤320)；随后，去除第二生长培养基，并且组合单个子集以形成本发明的组合物(步骤340)。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括需氧条件(存在氧)。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括厌氧条件(不存在游离或结合氧)。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括微需氧条件。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括气升式发酵罐。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括生物膜生长条件。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括静态条件(没有摇动，没有任何培养基的流动，使得没有剪切力施加在细菌上)。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括浮游生物生长条件。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括流动条件(培养基相对于附着至表面的细菌流动，使得附着的细菌经历剪切力)。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15ml/hr的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括至多30、至多25、至多20、至多19、至多18、至多17、至多16、至多15、至多14、至多13、至多12、至多11或至多10ml/hr的流动速率。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约5至大约10ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约6至大约10ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约7至大约10ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约8至大约10ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约6至大约12ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约7至大约12ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约8至大约12ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约9至大约12ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约10至大约12ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约10至大约14ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约11至大约14ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约12至大约14ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约12至大约15ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约15至大约20ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约15至大约18ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约17至大约20ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约20至大约23ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约22至大约25ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约25至大约30ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约10至大约20ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约5至大约15ml/hr范围内的流动速率。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约15至大约30ml/hr范围内的流动速率。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动条件。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括通过倾斜摇动器摇动。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约80、90、100、120、140、150、160、180、200、210、220、230、240、250、260、280、300、350、400、450、500rpm或其间的任何值摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约100rpm摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约150rpm摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约180rpm摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约230rpm摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约240rpm摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约250rpm摇动。在一个实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括以大约260rpm摇动。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动大约30分钟。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动1、2、3、4、5、6、10、12、15小时或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括过夜摇动。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动1、2、3、4、5、6、7、10天。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动1天。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动4天。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括摇动7天。
在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是1、2、3、4、5、6、10、12、15小时或其间的任何值。在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是过夜。在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是至少1、2、3、4、5、6、7、10天。在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是至多2、3、4、5、6、7、10天。在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是至少1天。在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是至少4天。在一些实施方式中，增殖条件的培育时间是至少7天。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括如在起源组织中已知的pH梯度。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约6.6至大约7.5之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约5.6至大约7.9之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约4.5至大约8之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约4.0至大约7.0之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约3.0至大约4.5之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约7.0至大约7.5之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约7.0至大约7.4之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括高于5.5的pH。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约3.0至大约10.0之间的范围内的pH或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括大约5.5至大约7.5之间的范围内的pH或其间的任何值。
在一个实施方式中，多种细菌属被配制为在胃肠道中pH依赖性靶向释放。在一个实施方式中，组合物被配制为以在肠中发现的pH下释放至少一种细菌菌株。
在一些实施方式中，组合物在施用后可以在至少大约2×102至大约2×1010个细菌/克每天的范围内持续至少5天定居肠。
在一些实施方式中，哺乳动物小型生物群的至少一种增殖条件是在大约30℃至大约40℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，土壤小型生物群的至少一种增殖条件是在大约15℃至大约25℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约15℃至大约20℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约20℃至大约30℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约30℃至大约37℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约40℃至大约55℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约50℃至大约60℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约5℃至大约37℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一些实施方式中，土壤小型生物群的增殖条件是在大约30℃至大约75℃之间的范围内的温度或其间的任何值。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括大约30℃的温度。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括大约37℃的温度。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括潮湿条件。在一些实施方式中，单一子集的增殖条件包括低湿度条件。
在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括紫外线(UV)暴露。在一些实施方式中，单一子集的至少一种增殖条件包括存在为2-3％w/v的高NaCl浓度。
在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括厌氧条件。术语“厌氧条件”指的是包含小于5ppm(百万分之一份)的氧，优选地小于0.5ppm的氧，并且更优选地小于0.1ppm的氧的气氛。任何适合的方法可以被用于提供期望的厌氧条件或气氛。
在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括静态和厌氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括静态和需氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括流动和厌氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括流动和需氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在6.6-7.5的范围内的pH以及静态和厌氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在6.6-7.5的范围内的pH以及流动和厌氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在6.6-7.5的范围内的pH以及摇动和厌氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在6.6-7.5的范围内的pH以及摇动和需氧条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括摇动和浮游生物生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括摇动和生物膜生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约30℃下的摇动和生物膜生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约37℃下的摇动和生物膜生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约30℃下的摇动和浮游生物生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约37℃下的摇动和浮游生物生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约15-25℃下的摇动和浮游生物生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约15-25℃下的摇动和生物膜生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约30℃下的需氧和生物膜生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约37℃下的需氧和生物膜生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约30℃下的需氧和浮游生物生长条件。在一个实施方式中，单一子集的增殖条件包括在大约37℃下的需氧和浮游生物生长条件。
在一些实施方式中，起源小型生物群可以悬浮在盐水中(步骤220)并且在培养之前过滤以便于除去至少一些不必要的固体(步骤240)。在一些实施方式中，包括起源小型生物群的样品可以被灭菌以便去除病原体(步骤240)。
在一些实施方式中，多种细菌属可以利用抗生素、噬菌体、竞争细菌或任何其他方法培养，所述任何其他方法将降低某种群体的生长以允许更多属生长或增强作为生物膜的其他特征能力(图1中的步骤300或260)。在一些实施方式中，多种细菌属可以利用针对胚芽乳杆菌的具体抗生素培养(图1中的步骤300或260)，抗生素比如青霉素，或具体地羧基青霉素(例如，羧苄青霉素)。本领域技术人员能够确定针对具体细菌待使用的抗生素的具体类型和剂量。
在一些实施方式中，改变每个单个子集的生长培养基和增殖条件可以是重复步骤(图1中的步骤340：步骤320和300)。在一些实施方式中，颗粒的多个子集在培养之后组合(图1中的步骤360)。在一些实施方式中，颗粒的多个子集在培养持续具体配方(formula)之后不组合。
在一些实施方式中，组合物可以进一步经历扩展步骤，比如进行新的培养的起子(starter)(利用颗粒再接种)(步骤380)。在一些实施方式中，通过冷冻储存组合物(步骤380)。在一些实施方式中，组合物包括冷冻缓冲液。在一些实施方式中，通过冻干法储存组合物(步骤380)。在一些实施方式中，组合物包括用于冻干法的干燥缓冲液。在一些实施方式中，用于冻干法的干燥缓冲液包括例如，10％蔗糖、蛋白质、脱脂牛奶、麦芽糖、甘露糖等(以非限制性方式)，用于较长的保存期限和运输。在一些实施方式中，组合物包括与合成液体组合的小型生物群，用于在递送至患者之前冷冻或冷冻干燥为粉末或等价物的重构。
生长培养基可以是任何已知或商业可得的生长培养基，或可以以其它方式合成以提供具体细菌菌株的生长和增殖。生长培养基的非限制性实例包括：胰胨豆胨培养液(TSB)、Robertson庖肉、强化梭菌培养基(RCM)肉汤、营养肉汤、溶源性肉汤(LB)、1/4LB、心浸液肉汤、Wilkins-Chalgren肉汤、布氏肉汤(Brucella broth)、麦麸、脑心浸液琼脂(BHI1)、M9基本培养基或0.2X BHI、肠小型生物群培养基(GMM)、哥伦比亚血琼脂(CBA)、巧克力琼脂(CHOC)、胰胨豆胨琼脂(TSY)、苛养厌氧菌琼脂(FAA)、庖肉琼脂(BEEF)、双歧杆菌属选择培养基(BSM)、苯乙醇琼脂(PEA)、放线菌属隔离琼脂(isolation agar)(AIA)、黏菌素萘啶酮酸琼脂(Colistin naladixic acid agar)(CNA)、McKay琼脂(MK)、甘露醇食盐琼脂(Mannitol slat agar)(MSA)、de Man Rogosa Sharpe琼脂(MRS)、拟杆菌属胆汁七叶甙琼脂(Bacteroides bile esculin agar)(BBE)、脱氧胆酸盐琼脂(DOC)、麦氏琼脂(MAC)和卡那霉素万古霉素血球溶解血琼脂(KVLB)。
在一些实施方式中，生长培养基选自胰胨豆胨培养液(TSB)、Robertson庖肉、强化梭菌培养基(RCM)肉汤、营养肉汤、溶源性肉汤(LB)、1/4LB、心浸液肉汤、Wilkins-Chalgren肉汤、布氏肉汤、脑心浸液培养基(BHI)、麦麸或其组合。在一些实施方式中，具体生长培养基可以被用于富集具体细菌属或群体，例如但不限于用于富集乳杆菌属的de man、rogosa和sharpe(MRS)琼脂。在一些实施方式中，生长培养基包括干燥的不能独立生存的生物膜。
在一些实施方式中，生长培养基也可以包括促进细菌附着至表面，或以促进生物膜的创建的材料。在一些实施方式中，生长培养基也包括降低细菌增殖的材料——作为抗生素、噬菌体、竞争细菌或将降低某种群体以允许更多属生长的任何其他方法。
在一些实施方式中，组合物阻止患者中一种或多于一种病原菌物种的生长。在一个实施方式中，组合物杀死患者中一种或多于一种病原菌物种。
在一些实施方式中，本发明提供组合物和方法，其包括从多种细菌属分离的细菌属的至少一种群体。本领域技术人员可以通过16S核糖体RNA的测序或具体DNA探针的检测确定本发明的组合物的细菌成分。
在一些实施方式中，来自至少一种起源的小型生物群首先被处理生物危害物，比如病毒、寄生虫等。
根据本发明的实施方式的另一方面，提供了在其实施方式中的药物组合物和药学上可接受的运载体。
在一些实施方式中，组合物可以被施用用于治疗需要其的对象中与贯穿本文描述的任何疾病、医学病症或紊乱相关联的医学病症。在一些实施方式中，可以提供组合物自身或者可以作为药物组合物的一部分提供组合物。在一些实施方式中，本发明提供通过施用组合物来治疗疾病或紊乱的方法。在一些实施方式中，组合物以非限制性方式用于治疗炎症性肠病、慢性疲劳综合征、小肠细菌过渡生长综合征、肥胖、癌症、细菌性阴道病、结肠炎、糖尿病、抑郁、便秘等。
如本文所使用，“药物组合物”指的是具有其他化学组分比如生理学上适合的运载体和赋形剂的本文描述的组合物的制品。这些运载体能够使得药物组合物被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬浮液等，以由患者口服摄取。药物组合物的目的是促进化合物施用至生物体。在本文中，术语“赋形剂”和“药学上可接受的药剂”可互换使用并且指的是添加至药物组合物以进一步促进组合物施用的至少一种惰性物质，其选自但不限于：稳定剂、防腐剂、螯合剂、粘度改性剂、缓冲剂和pH调节剂。适合的施用途径可以例如包括口服、直肠、跨粘膜尤其是经鼻、肠、或肠胃外递送——包括肌肉内、皮下和髓内注射，以及囊内、直接心室内、静脉内、腹膜内、心脏内、鼻内或眼内注射。在一个实施方式中，组合物被配制用于直肠施用。在一个实施方式中，组合物被配制用于口服施用。在一个实施方式中，组合物被配制用于局部施用。在一个实施方式中，组合物被配制用于全身施用。本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的过程制造，例如借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂制造(dragee-making)、研磨、乳化、胶囊化、截留、或冻干过程。
一般描述
如本文所使用，术语“大约”指的是±10％。
术语包括(comprise，comprising)、包含(includes，including)、具有(having)和其同源词意思是“包括但不限于”。术语“由……组成”意思是“包括并限于”。术语“基本上由……组成”意思是组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但是只有在另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征的情况下。
词语“示例性”在本文中用于指“充当实例、例子或说明”。描述为“示例性”的任何实施方式不必须被解释为相对于其他实施方式是优选的或有利的和/或排除来自其他实施方式的特征的并入。
词语“任选地”在本文中用于指“在一些实施方式中提供并且在其他实施方式中不提供”。本发明的任何具体实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征冲突。
如本文所使用，单数形式“一个、一种(a，an)”和“该(the)”包括复数指代对象，除非上下文明确地指示其他方面。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
贯穿本说明书，本发明的各种实施方式可以以范围形式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅为了方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的僵硬的限制。因此，范围的描述应当被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围比如从1到6的描述应当被视为已经具体地公开了子范围比如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。
在本文指示数值范围的时候，其意思是包括在该指示的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围”和“从第一指示数字到第二指示数字的范围”在本文中可互换地使用并且意思是包括第一和第二指示的数字和其间的所有分数和整数数字。
如本文所使用，术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或容易地由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者根据已知的方式、手段、技术和程序研发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所使用，术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
在其中使用类似于“A、B和C等的至少一种”的惯例的那些情形中，一般而言，这种结构在本领域技术人员将理解该惯例的意义下使用(例如，“具有A、B和C的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独A、单独B、单独C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，呈现个或多个可选术语的实质上任何转折性词语和/或短语，不管是在说明书、权利要求书或附图中，应当被理解为预期包括术语中的一个、术语中的任一个、或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
将理解，出于简洁在单独实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单一实施方式中组合提供。相反地，出于简洁在单一实施方式的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何适合的子组合提供或作为适合于在本发明的任何其他描述的实施方式提供。在各种实施方式的背景下描述的某些特征不被视为那些实施方式的必要特征，除非实施方式在没有那些要素的情况下是不能实施的。
上文描绘的和在所附权利要求书中要求保护的本发明的各种实施方式和方面在下列实施例中发现实验性依据。
实施例
现在参照下列实施例，其以非限制性方式与上面的描述一起说明本发明。
实施例1
在颗粒上培养排泄物来源的细菌
在搅拌器中将100gr新鲜排泄物与600ml盐水溶液混合。一次通过过滤器然后两次通过网垫(Gauze pad)过滤混合物。将滤液的一小部分在-20℃下保存。制备包含等量的石榴种子、百香果种子和磷酸氢钙(DCP)黑种草属的颗粒混合物。
将10g混合物插入8个瓶中，每个包含60ml过滤的新鲜排泄物。将4个瓶在37℃下在需氧条件下(瓶1-4)培育，并且将剩余的4个瓶在37℃下在厌氧条件下(瓶5-8)培育7天。
瓶处理：
瓶1和5：
培育7天后，取出排泄物液体，并且温和洗涤基质两次(一次利用25ml和第二次利用10ml无菌PBSX1)。使瓶涡旋3次持续30秒并且使来自液体的样品进行16S核糖体RNA(rRNA)测序。
瓶2和6：
培育7天后，加入60ml胰胨豆胨培养液(TSB)并且培育瓶另外的7天。取出生长培养基，并且温和地洗涤基质两次(一次利用25ml和第二次利用10ml无菌PBSX1)。使瓶涡旋3次持续30秒并且使来自液体的样品进行16S rRNA测序。
瓶3和7：
培育7天后，加入60ml强化梭菌培养基(RCM)肉汤并且培育瓶另外的7天。取出生长培养基，并且温和地洗涤基质两次(一次利用25ml和第二次利用10ml无菌PBSX1)。使瓶涡旋3次持续30秒并且使来自液体的样品进行16S rRNA测序。
瓶4和8：
培育7天后，加入60ml无菌排泄物(通过0.2μm的过滤器过滤的排泄物滤液)肉汤并且培育瓶另外的7天。取出生长培养基，并且温和地洗涤基质两次(一次利用25ml和第二次利用10ml无菌PBSX1)。使瓶涡旋3次持续30秒并且使来自液体的样品进行16S rRNA测序。
准备测序：
使来自每个瓶(在第二洗涤和涡旋后)的2ml样品在14000rpm下离心2min。去除上清液，并且将100μl无菌PBSX1加入至样品并且由每个样品纯化DNA。
在流动中细菌生长：
在根据上述方案利用颗粒使排泄物细菌静态生长后，在厌氧条件或需氧条件下利用生长培养基(如上面所列举)的组合以10-12ml/小时的流动速率持续7天将颗粒从瓶1和5转移至玻璃柱。取出样品，利用PBSX1洗涤并测序。
表1-7中示出结果，其包括在起始原料(排泄物样品)中和在根据本发明的一些实施方式培养的组合物中存在，但是在排泄物样品中存在的各种系统发生水平下微生物的定量。
表1：在具有严格(45个拷贝的最小值)截止的每种生长条件下发现的微生物。
‘+’符号表示某个瓶中属的存在。在排泄物中存在的31个属中，仅2个属没有出现在任何瓶中。这表明在组合各个瓶之后与原始排泄物样品93％的相似性。
表2：在具有宽松(所有结果)截止的每种生长条件下发现的微生物。
‘+’符号表示某个瓶中属的存在。在原始排泄物中出现的68个属中，仅4个属没有出现在任何瓶中。这表明与原始排泄物样品94％的相似性。
表3：每个在不同条件下生长的不同瓶中的门分布。数字表示瓶的细菌群体中具体门的％。
门 瓶2 瓶3 瓶4 瓶6 瓶7 瓶8 原始排泄物
广古菌门 0.0362 0.000174 0.005728 0.043009 0.004738 0.023296 0.121371
放线菌门 0.011255 0.051137 0.019861 0.02041 0.007511 0.011519 0.04217
拟杆菌门 0.0333 0.001174 0.277208 0.188729 0.206208 0.265022 0.04493
硬壁菌门 0.865729 0.585984 0.640651 0.638442 0.577003 0.596923 0.260076
变形菌门 0.052076 0.361286 0.052595 0.102764 0.201088 0.095246 0.217608
柔膜菌门 1.08E-05 0 0.000138 0 0.002337 0 0.000595
疣微菌门 0.001429 0.000244 0.003819 0.006645 0.001115 0.007994 0.313251
表4：每个在不同条件下生长的不同瓶中的纲分布。数字表示瓶的细菌群体中具体门的％。
表5：每个在不同条件下生长的不同瓶中的目分布。数字表示瓶的细菌群体中具体门的％。
表6：每个在不同条件下生长的不同瓶中的科分布。数字表示瓶的细菌群体中具体门的％。
表7：每个在不同条件下生长的不同瓶中的属分布。数字表示瓶的细菌群体中具体门的％。
表8：通常在人排泄物样品中发现的微生物属和门的代表性实例。
实施例2
使用土壤作为原始小型生物群在颗粒上的生物膜生长
获得并混合新鲜土壤样品。将小部分送去测序(原始样品)。剩余在PBSX1中混合并且将25ml转移至包含2gr无菌基质的样品管，无菌基质包括石榴、百香果、DCP和MCC颗粒。管在PBSX1中伴随在100rpm下的过夜摇动生长为生物膜。在培育1天后，对一部分样品测序(土壤生物膜1–B1)。利用4种不同的合成生长培养基(每个管中一种)培育剩余样品，合成生长培养基包括：脑心浸液培养基(BHI)、LB、1/4LB和布氏肉汤。管生长为生物膜持续4天，包括在100rpm下2小时摇动，而剩余的时间，管处于静态条件下。每天更换生长培养基。重组并测序来自所有管的生物膜(土壤生物膜5–B5)。
作为对照，在管中在无基质的浮游生物生长条件下生长土壤细菌。在PBSX1中放置具有土壤细菌的管持续在230rpm下过夜摇动。在培育1天后，对少量液体测序(土壤浮游生物的1–P1)。对剩余液体进行离心并且将细菌沉淀物分入包括BHI、LB、1/4LB和布氏肉汤的4种不同合成生长培养基。在浮游生物条件下持续另外的4天伴随在230rpm下的恒定摇动生长管。每天更换生长培养基。重组并测序来自所有管的生物膜(土壤浮游生物的5–P5)。
结果
在表9和图3中呈现序列分析结果。原始土壤小型生物群包括154种细菌科。43种细菌科在B1生物膜样品中鉴定，因而与原始小型生物群28％的相似性。相应的浮游生物样品(P1)包含25种细菌科，因而与原始小型生物群16％的相似性。
土壤细菌通常被分为三种状态：活跃的、休眠的和不能存活的。根据本领域，土壤中活跃的细菌在理想条件下从大约0.1至大约50％变化。因而，假设样品具有50％活跃细胞，相似性的调整率范围到大约56％。
表9
进行排序分析以便于比较细菌科的相似性。降趋对应分析(DCA)是多元排序模型，其专门用于具有丰富数据的生态学数据集。与在图4中示出的浮游生物样品相比，DCA分析显示与在基质生长的样品中的原始土壤小型生物群更高的丰度和相似性。基于不同相似性或距离指数进行土壤原始小型生物群与其他样品之间的相似性比较。在Bray-Curtis和Simpson指数中，当指数值接近1时，两种样品更接近。在欧几里得距离中，小指数值表示更高的接近度。该分析的结果在表10中呈现。
表10.从土壤数据分析获得的相似性/距离指数
这些结果得到其他排序分析模型比如非度量多维尺度法(MDS)的支持，非度量多维尺度法基于分析的样品的距离矩阵。可以使用不同的相似性指数根据数据的性质执行MDS分析。MDS分析基于考虑样品(OTU)中存在的物种的数目的Simpson相似性指数，以及每个物种的相对丰度。该分析也揭示与在图5中示出的浮游生物样品相比，与在基质生长的样品中的原始小型生物群更高的丰度和相似性。
通过将基质生长的样品与浮游生物生长的样品比较，产生包括与来源具有高比率相似性的组合物是可能的。将在该实验中基质生长的样品中存在的细菌科与浮游生物生长的样品中存在的细菌科组合得到包括与来源40％相似性的组合物。
在一些土壤样品(土壤P1、P5和B5)中，一个属与其他属相比是大幅度更丰富的。例如，在B5样品中，克雷白氏菌属的相对丰度是38％。由于在共培养物中，不同菌株彼此竞争资源，因此减少某个属或科的百分比可以允许更丰富的多样性。使用抗生素、噬菌体、竞争细菌或将降低某个群体以允许样品中更多属生长的任何其他方法是任择的。
实施例3
使用人口腔小型生物群作为原始小型生物群在颗粒上的生物膜生长
取来自人口腔的五个拭子，一个被立即送去测序(原始样品)并且其余4个每个被放置在包含2gr石榴、百香果、DCP和MCC颗粒的无菌基质以及包括BHI、LB、1/4LB和布氏肉汤在内的4种不同生长培养基的不同管中(每个管中一种培养基)。在100rpm下的摇动条件下过夜放置管。第二天，更新培养基并且管生长为生物膜持续另外4天。然后合并和测序来自所有样品的具有生物膜的基质。
口腔拭子样品的序列分析鉴定49种细菌科。在这些中，17种细菌科在生长的生物膜样品中被鉴定，相当于与原始小型生物群35％的相似性，如在表11中详细说明的。
表11.与原始小型生物群相比在生物膜生长的培养物中鉴定的细菌科
实施例4
使用冷冻样品作为原始小型生物群在颗粒上的生物膜生长
从土壤小型生物群和口腔小型生物群(实施例2和3)以及从单个菌株或两种已知菌株的混合物获得细菌群落以便于检查按比例放大工艺的可能性。
检查在-20℃下储存1周的土壤小型生物群和口腔小型生物群样品中细菌的存活力。这通过解冻和平板接种为LB、MRS、RCM、布氏的不同琼脂培养基中3μL的稀释液完成，一式两份。在需氧和厌氧条件下，在室温下培育板。将来自原液的植物乳杆菌(L.plantarum)和长双歧杆菌(B.longum)分别平板接种在MRS和RCM琼脂板中，并且在37℃下在厌氧罩(hood)中培育。在第二天，在板上检查细菌生长。在厌氧和需氧条件下，在室温下培育板持续周末。将植物乳杆菌和长双歧杆菌的几个小菌落分别添加至MRS和RCM肉汤。植物乳杆菌在37℃下伴随需氧条件和在180rpm下的摇动培育过夜。长双歧杆菌在37℃下在厌氧罩中培育过夜。第二天，测量每种菌株(植物乳杆菌和长双歧杆菌)的光学密度(OD)，并且根据表12制备在新无菌管中达到0.1的最终OD的每种菌株的稀释液。
表12.小规模基质的细菌和增殖条件
样品在100rpm下的振荡中在30℃下培育2小时。在2小时后，将管转移至它们各自的增殖条件(根据表12)。
为了按比例放大土壤和口腔小型生物群的培养体积，在500rpm下离心每种样品的一个管持续两分钟。丢弃上清液并且每个管加入10ml的PBSX1。在培养箱中在100rpm下温和地混合管1分钟。将每种样品转移通过80μm的真空过滤器。组合来自三种样品的基质并送去DNA测序分析。
通过转移解冻的基质颗粒至新基质测试用于按比例放大培养体积的另一种途径。每种植物乳杆菌和长双歧杆菌样品的一个管在500rpm下离心两分钟。丢弃上清液并且加入每个管10ml的PBSX1。在培养箱中在100rpm下温和地混合管1分钟。将每种样品转移通过80μm的真空过滤器。最后，将1gr的基质转移至新的基质瓶。通过植物乳杆菌和长双歧杆菌样品的生物膜分离的细菌的转移测试用于按比例放大培养体积的又另一种途径。在500rpm下离心每种样品的一个管持续两分钟。丢弃上清液，利用10ml PBSX1洗涤样品一次并过滤。加入1ml RCM肉汤，使样品高速涡旋3次持续30秒。将上清液转移至新基质。
仅为了植物乳杆菌和长双歧杆菌样品的定量和耐酸性，去除每种样品的培养基和每个管加入10ml的PBSX1，并且在100rpm下通过培养箱温和地混合1分钟。将样品转移至80μm的真空过滤器并在过滤后充分地混合。通过将5ml的pH 2的溶液加入至每种样品测试在pH2下的耐酸性。在室温下培育细胞1小时。培育后，利用5ml PBSX1洗涤样品1次，并且加入1mlPBSX1然后高速涡旋3次持续30秒。通过将5ml的pH 7的溶液加入至每种样品测试在pH 7下的耐酸性。在室温下培育细胞1小时。培育后，利用5ml PBSX1洗涤样品1次，并且加入1mlPBSX1然后高速涡旋3次持续30秒。对于长期培育，根据在表12中规定的条件培育剩余的管(包括对照管)。
不同培养基中，在需氧和厌氧增殖条件中进行的每种稀释下，观察土壤和口腔小型生物群的细菌生长。在土壤基质和土壤浮游生物来源中观察到的细菌生长高于在口腔样品中观察到的细菌生长(平均地，在土壤样品中多于400个菌落/板对在口腔样品中110个菌落)。通常对于迁移，结果表明从小规模基质到中等规模基质的良好迁移。在小规模下培育24小时之后获得的细菌的量在图6中总结。培育后，将来自小规模基质的接种物转移至中等规模基质并且提高平均细菌生长，如在图7中所图解的。有趣地，当将乳杆菌属和双歧杆菌属接种在一起时，在中等规模中观察到细菌的显著生长。另外，根据两种接种类型评估细菌迁移：从生物膜或生物膜基质分离的细菌。如在图8中证明的，结果表明基质接种物对于双歧杆菌属生长可以是有利的。
图9表明在中等规模条件下的耐酸性和细菌存活。因而，在pH 7或pH 2下的细菌细胞计数是高度类似的。这些结果与先前结果一致并且表明作为生物膜的细菌的较高pH抗性。当中等规模过程开始于细菌分离的接种物时，在耐酸性测试中没有观察到显著差异。
实施例5
植物乳杆菌菌株获得自新鲜的板并在37℃下在25ml MRS肉汤中生长48小时。将15ml转移至麦麸管和将7ml转移至石榴籽管并培育3天。表13表明每克的细菌细胞计数。
表13
小麦(塑料管) POM(塑料管)
细胞计数(细菌/gr) 2.3*10<sup>5</sup> 7*10<sup>6</sup>
实施例6
抗生素抗性
在37℃下在200ml 25％MRS肉汤和80gr DCP颗粒中生长植物乳杆菌菌株。瓶的盖具有一直通向瓶底的两个硅氧烷管道。将来自瓶的一个管连接至2升PVC瓶，该PVC瓶的盖具有含有用于硅氧烷管的两个出口(outing)。PVC瓶填充有1500ml的25％MRS。在静态条件下培育瓶2小时。然后，其在流动条件下在倾斜摇床上以15rpm培育6天。加入不同浓度的羧苄青霉素以便于测试0、1、2、4、8、16、32、64、128和256μg/ml的抗生素抗性，并且在37℃下在静态条件中培育过夜。
结果
图10图解由4μg/ml的羧苄青霉素生长抑制植物乳杆菌菌株。
虽然已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是显而易见的是许多替代方案、修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，意欲涵盖落入所附权利要求书的精神和宽范围内的所有这样的替代方案、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用以其全部并入说明书，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用被并入本文。另外，在本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应被解释为承认这种参考文献可用作本发明的现有技术。就章节标题的使用而言，它们不应被解释为必然限制性的。

Claims (21)

1.一种包括多种细菌属和多种颗粒的合成组合物，其中所述多种细菌属是(i)具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物，和(ii)与小型生物群群体具有至少30％相似性。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述多种细菌属的至少一部分起源于所述小型生物群群体。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述小型生物群群体是预定靶向的小型生物群的群体。
4.权利要求1所述的组合物，包括需氧细菌的至少一个细菌子集和厌氧细菌的至少一个细菌子集。
5.权利要求1所述的组合物，包括生物膜形式的细菌的至少一个细菌子集和浮游细菌的至少一个细菌子集。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述小型生物群的群体选自：肠小型生物群、唾液小型生物群、皮肤小型生物群、口腔小型生物群、支气管小型生物群、阴道小型生物群、土壤小型生物群或其混合物。
7.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述多种细菌属来源于选自下列的一种或多种样品：排泄物样品、唾液样品、皮肤样品、口腔样品、支气管样品、阴道样品、土壤样品或其混合物。
8.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述小型生物群的群体来源于至少一种起源。
9.权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述多种细菌属来源于一种或多种健康哺乳动物、动物供体、细菌菌株、储存的小型生物群样品、细菌菌落、浮游生物样品和生物膜。
10.权利要求1-9中任一项所述的组合物，进一步包括多种类型的颗粒。
11.权利要求10所述的组合物，其中每种颗粒包括至少2种不同细菌科的共培养物。
12.一种药物组合物，其包括权利要求1或11中任一项所述的组合物和药学上可接受的运载体或赋形剂。
13.权利要求12所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的运载体或赋形剂选自稳定剂、防腐剂、螯合剂、粘度改性剂、缓冲剂和pH调节剂中的一种或多种。
14.权利要求12和13中任一项所述的药物组合物，其被配制用于直肠、静脉内、肠胃外、粘膜、鼻部或口服施用。
15.权利要求12和14中任一项所述的药物组合物，其用于治疗生态失调。
16.一种治疗有需要的对象中的疾病或紊乱的方法，所述方法包括给所述对象施用权利要求12-14中任一项所述的组合物。
17.权利要求16所述的方法，其中所述疾病或紊乱是生态失调。
18.用于获得包括具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物的组合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a.提供包括来自至少一种起源的小型生物群的多种细菌属；
b.悬浮所述多种细菌属以获得细菌属溶液；
c.过滤所述多种细菌属溶液从而获得包括所述多种细菌属的滤液；
d.利用多种颗粒培育所述滤液，并且使得所述多种细菌属附着至所述多种颗粒；
e.将附着至所述多种颗粒的所述多种细菌属分为多种细菌溶液子集；
f.在生长培养基中且在适合于单个子集增殖的增殖条件下培养每个细菌溶液子集；
g.去除所述生长培养基，并且重组所述单个子集；
从而获得包括具有不同生长和/或增殖条件的至少两种不同细菌科的共培养物的组合物。
19.权利要求18所述的方法，其中所述增殖条件选自需氧、厌氧和微需氧条件。
20.权利要求18所述的方法，其中所述增殖条件选自流动、摇动和静态条件。
21.权利要求18所述的方法，其中所述增殖条件选自潮湿条件和低湿度条件。
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