KR20230018389A - 질 미생물총 조성물 - Google Patents
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Abstract
환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 예시적인 조성물은 질 미생물총 조성물을 포함할 수 있다. 질 미생물총 조성물은 세균의 혼합물을 포함할 수 있다. 세균의 혼합물은 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii) 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 포함할 수 있다.
Description
본 개시내용은 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
질환 및/또는 질병, 예를 들어, 생식계, 소화관, 간, 면역계 등의 질환 및/또는 질병을 치료하기 위한 매우 다양한 조성물 및 방법이 개발되었다. 공지된 조성물 및 방법 각각은 특정 장점 및 단점을 갖는다. 질환 및/또는 질병을 치료하기 위한 대안적인 조성물 및 방법을 제공할 필요성이 지속적으로 존재한다.
본 개시내용은 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 대한 설계, 물질, 제조 방법 및 사용 대안을 제공한다. 질 미생물총 조성물이 개시된다. 질 미생물총 조성물은 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 바지날리스(Lactobacillus vaginalis), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 및 락토바실러스 델브릭키이(Lactobacillus delbrueckii)를 포함하는 세균의 혼합물을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 10 내지 40%의 락토바실러스 이너스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 15 내지 30%의 락토바실러스 이너스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 20%의 락토바실러스 이너스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 5%의 락토바실러스 가세리를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 루테리를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 루테리를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 루테리를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 아시도필루스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 아시도필루스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 아시도필루스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 바지날리스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 바지날리스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 바지날리스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 존소니를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 존소니를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 존소니를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 헬베티쿠스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 헬베티쿠스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 헬베티쿠스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 플란타럼을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 플란타럼을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 약 1%의 락토바실러스 플란타럼을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 퍼멘텀을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 퍼멘텀을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 퍼멘텀을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 살리바리우스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 살리바리우스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 살리바리우스를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.1 내지 5%의 락토바실러스 델브릭키이를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 0.5 내지 4%의 락토바실러스 델브릭키이를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 1%의 락토바실러스 델브릭키이를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 세균의 하나 이상의 냉동건조된 균주를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 캡슐에 배치된다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 좌약에 배치된다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 세균의 혼합물은 가용성 쉘에 배치된다.
감염을 치료하는 방법이 개시된다. 방법은 상기 구현예 중 임의의 하나의 질 미생물총 조성물을 감염이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 감염은 세균성 질염, 칸디다증 감염, 인유두종 바이러스 감염, 요로 감염, 성매개 감염, 및 부인과 암 중 하나 이상을 포함한다.
환자를 치료하는 방법이 개시된다. 방법은 상기 구현예 중 임의의 하나의 질 미생물총 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 질 미생물총 조성물을 환자에게 투여하는 것은 조산 예방, 유산 예방, 불임 치료, 간질성 방광염 치료, 및 다낭성 난소 증후군 치료 중 하나 이상을 포함한다.
질 미생물총 조성물이 개시된다. 질 미생물총 조성물은 좌약; 및 좌약에 배치된 냉동건조된 세균의 혼합물을 포함하며, 냉동건조된 세균의 혼합물은 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 이너스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 바지날리스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 존소니, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 살리바리우스 및 락토바실러스 델브릭키이를 포함한다.
질 미생물총 조성물 뱅크(bank)가 개시된다. 질 미생물총 조성물 뱅크는 내부에 배치된 하나 이상의 미생물의 제1 개체군을 포함하는 제1 용기(container)로서, 제1 개체군은 제1 공여자로부터 수집되는, 제1 용기; 내부에 배치된 하나 이상의 미생물의 제2 개체군을 포함하는 제2 용기로서, 제2 개체군은 제2 공여자로부터 수집되는, 제2 용기; 및 제1 공여자 및 제2 공여자로부터의 공여자 데이터를 포함하는 인덱싱 시스템을 포함한다.
질 미생물총 조성물 뱅크가 개시된다. 질 미생물총 조성물 뱅크는 내부에 배치된 하나 이상의 미생물의 제1 개체군을 포함하는 제1 용기로서, 제1 개체군은 제1 공여자로부터 수집되는, 제1 용기; 및 내부에 배치된 하나 이상의 미생물의 제2 개체군을 포함하는 제2 용기로서, 제2 개체군은 제2 공여자로부터 수집되는, 제2 용기를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 질 미생물총 조성물 뱅크는 제1 공여자 및 제2 공여자로부터의 공여자 데이터를 포함하는 인덱싱 시스템을 포함한다.
질 미생물총 조성물 뱅크가 개시된다. 질 미생물총 조성물 뱅크는 내부에 배치된 하나 이상의 냉동건조된 미생물의 제1 개체군을 포함하는 제1 용기로서, 제1 개체군은 제1 공여자로부터 수집되는, 제1 용기; 내부에 배치된 하나 이상의 냉동건조된 미생물의 제2 개체군을 포함하는 제2 용기로서, 제2 개체군은 제2 공여자로부터 수집되는, 제2 용기; 및 제1 공여자 및 제2 공여자로부터의 공여자 데이터를 포함하는 인덱싱 시스템을 포함한다.
질 미생물총 조성물 뱅크가 개시된다. 질 미생물총 조성물 뱅크는 내부에 배치된 하나 이상의 냉동건조된 미생물의 제1 개체군을 포함하는 제1 용기로서, 제1 개체군은 제1 공여자로부터 수집되는, 제1 용기; 내부에 배치된 하나 이상의 냉동건조된 미생물의 제2 개체군을 포함하는 제2 용기로서, 제2 개체군은 제2 공여자로부터 수집되는, 제2 용기를 포함한다.
임의의 상기 구현예에 대한 대안 또는 추가로, 질 미생물총 조성물 뱅크는 제1 공여자 및 제2 공여자로부터의 공여자 데이터를 포함하는 인덱싱 시스템을 포함한다.
상기 일부 구현예의 개요는 각각의 개시된 구현예 또는 본 개시내용의 모든 구현을 기재하도록 의도되지 않는다. 다음의 상세한 설명은 이러한 구현예를 보다 구체적으로 예시한다.
하기 정의된 용어에 대해, 청구범위 또는 본 명세서의 다른 곳에서 다른 정의가 주어지지 않는 한, 이들 정의가 적용될 것이다.
모든 숫자 값은 본원에서 명시적으로 표시되는지 여부와 관계없이 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 가정된다. 용어 "약"은 일반적으로 당업자가 인용된 값(예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 가짐)과 동등하다고 간주할 숫자의 범위를 지칭한다. 많은 경우에, 용어 "약"은 가장 근접한 유효 숫자로 반올림된 숫자를 포함할 수 있다.
종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내의 모든 숫자를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 및 5를 포함한다).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an", 및 "the")는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 일반적으로 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 "일 구현예", "일부 구현예", "다른 구현예" 등에 대한 언급은 기재된 구현예가 하나 이상의 특정 특징, 구조 및/또는 특성을 포함할 수 있음을 나타낸다. 그러나 이러한 인용은 모든 구현예가 특정 특징, 구조 및/또는 특성을 포함하는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 추가로, 특정 특징, 구조 및/또는 특성이 일 구현예와 관련하여 기재되는 경우, 이러한 특징, 구조 및/또는 특성은 명확하게 반대로 언급되지 않는 한 명시적으로 기재되었는지 여부에 관계없이 다른 구현예와 관련하여 사용될 수 있음을 또한 이해해야 한다.
인간 미생물군집(또는 인간 미생물총)은 피부의 표면 및 깊은 층에, 타액 및 구강 점막에, 결막에, 그리고 위장관, 비뇨기관 및/또는 태반 미생물군집과 같은 생식 건강과 관련된 미생물을 포함하는 인간의 질관(vaginal tract)에 존재하는 미생물의 집합체이다. 인간 미생물군집은 세균으로 구성되지만 진균, 파지, 바이러스, 고세균 등을 포함할 수도 있다. 이들 유기체 중 일부는 인간 숙주에 유용한 작업을 수행하지만 인간 미생물군집을 구성하는 대부분의 유기체의 기능은 여전히 연구되고 있다. 정상적인 환경에서 이들 미생물은 인간 숙주에 질환을 야기하지 않고 대신 건강 유지에 관여한다.
질 미생물총은 다수의 상이한 건강 질병에서 역할을 할 수 있다. 이들 질병 중 일부는 세균성 질염, 칸디다증 감염, 인유두종 바이러스 감염, 요로 감염 및/또는 성매개 감염과 같은 감염을 포함할 수 있다. 다른 질병에는 부인과 암(예를 들어, 자궁경부암), 조산, 유산, 불임, 간질성 방광염, 다낭성 난소 증후군 등이 포함될 수 있다. 질 미생물총의 구성을 복원, 정상화 및/또는 그 외의 방식으로 쉬프팅(shifting)하면 이들 질병 및 다른 질병을 완화하는 데 도움이 될 수 있다. 본원에는 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 조성물 중 적어도 일부는 질 미생물총 조성물을 포함한다. 방법 중 적어도 일부는 세균성 질염 치료, 칸디다증 감염 치료, 인유두종 바이러스 감염 치료, 요로 감염 치료, 성매개 감염 치료, 부인과 암(예를 들어, 자궁경부암) 치료, 조산 예방, 유산 예방, 불임 치료, 간질성 방광염 치료, 다낭성 난소 증후군 치료 등의 방법을 포함한다.
건강한 가임 연령 여성의 경우, 락토바실러스 속의 세균이 질 미생물군집을 지배하는 경향이 있다. 여성 전체에 걸쳐 일관되게 확인된 다음과 같은 4개의 종이 있다: 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 이너스, 락토바실러스 가세리, 및 락토바실러스 젠세니. 이들 종은 백인, 흑인, 아시아인 및 히스패닉계 여성 간의 그의 우세 빈도 순으로 나열되어 있다. 일반적으로 질 미생물군집의 락토바실러스 우세는 건강과 관련이 있다. 단일 속 또는 종의 이러한 우세는 다양성이 낮은 미생물군집을 생성한다. 질 미생물군집의 다양성 증가는 불건강 및 보다 높은 감염 위험과 관련이 있다. 예를 들어, 스니시아(Sneathia), 메가스페라(Megasphaera), 아토포비움(Atopobium), 펩토니필루스(Peptoniphilus), 디알리스터(Dialister), 프레보텔라(Prevotella) 및/또는 가드네렐라(Gardnerella) 속의 세균은 불량한 질 건강의 다른 지표(높은 뉴젠트(Nugent) 점수 및 질 pH)를 갖는 여성에게서 확인되었으므로, 건강하지 않은 질 미생물총과 관련되는 경향이 있을 수 있다. 그러나 이러한 일반화는 개체군마다 다를 수 있다.
질 미생물군집은 사춘기 전, 폐경 전 및 폐경 후 여성 간에 상이할 수 있다. 예를 들어, 사춘기 이전의 여성은 락토바실러스의 상대적 풍부도가 상대적으로 낮고 미생물의 다양성이 상대적으로 높을 수 있다(뿐만 아니라 상대적으로 얇은 질 상피, 상대적으로 얇은 점액층 및 상대적으로 적은 양의 글리코겐을 가질 수 있음). 폐경 전 여성은 락토바실러스의 상대적 풍부도가 상대적으로 높고 미생물의 다양성이 상대적으로 낮을 수 있다(뿐만 아니라 상대적으로 두꺼운 질 상피, 상대적으로 두꺼운 점액층, 상대적으로 높은 에스트로겐 수준, 및 상대적으로 적은 양의 글리코겐을 가질 수 있음). 폐경 후 여성은 락토바실러스의 상대적 풍부도가 보통이고 미생물의 다양성이 상대적으로 낮거나 더 낮을 수 있다(뿐만 아니라 상대적으로 얇은 질 상피, 상대적으로 얇은 점액층, 상대적으로 보통인 에스트로겐 수준 및 상대적으로 보통 양의 글리코겐을 가질 수 있음). 질 감염(예를 들어, 세균성 질염)의 증상을 보이는 폐경 후 여성은 락토바실러스의 상대적 풍부도가 더 낮고 미생물의 다양성이 상대적으로 높을 수 있다. 종합적으로, 락토바실러스의 상대적 풍부도를 포함하거나, 그 외의 방식으로 증가시키는 경향이 있을 뿐만 아니라, 미생물 다양성을 낮추는 데 도움이 되는 조성물이 유익할 수 있다.
적어도 일부 경우에, 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 질 미생물총 조성물)은 질 미생물총 공여자로부터 수집된 질 미생물총을 활용한다. 그러나 세균 배양 등을 포함하는 질 미생물총의 다른 원천이 고려된다. 잠재적인 질 미생물총 공여자가 식별될 수 있고 다수의 선별 프로세스를 거칠 수 있다. 일부 경우에, 잠재적 공여자는 건강 이력 설문지를 사용하여 선별될 수 있다. 예시적인 설문지는 잠재적 혈액 공여자 선별을 위해 적십자사에 의해 사용되는 것과 동일하거나 유사할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에, 잠재적 공여자는 일반적인 감염성 질환 및 다른 질병에 대해 선별될 수 있다. 이러한 선별은 혈액 검사, 대변 검사, 소변 검사, 질 면봉 검사 등을 포함할 수 있다. 이러한 검사는 HIV, 간염(A, B 및/또는 C형 간염), 매독, C. 디피실(C. difficile), 세균성 병원체, 충란 및 기생충 등의 존재 여부에 대한 검사를 포함할 수 있다. 이들은 단지 예시이다. 공여자의 건강은 혈액 검사 시행, 대변 샘플 분석, 소변 샘플 분석, 질 분비물 분석, 건강 이력의 주기적 업데이트 등에 의해 모니터링할 수 있다. 질 면봉을 수집하여 그람 염색 및 뉴젠트 점수화, 백혈구 계산 및 효모의 존재의 검출을 통해 질 건강을 평가할 수 있다. 소변 및/또는 질 면봉을 수집하여 성매개 감염을 검사할 수 있다.
잠재적 공여자가 기증하기에 충분히 건강한 것으로 결정된 후, 공여자는 샘플 수집 키트(예를 들어, 샘플 자가 수집 키트)를 제공받는다. 샘플 수집 키트에는 공여자 설명서, 시퀀싱 분석을 위한 질 DNA/RNA 수집 키트(예를 들어, OMNIgene 질 수집 키트 ORM-130, DNAgeneotek™으로 시판됨), 및 검체 수집 및 운송 키트(예를 들어, Copan Diagnostics에서 시판하는, eSwab 480C Copan Liquid Amies Elution Swab Collection and Transport System)가 포함될 수 있다. 공여자는 사전 동의서에 서명하도록 요구받을 수 있다. 각 공여자는 2개의 샘플을 수집하도록 요구받을 수 있다. 첫 번째 샘플은 시퀀싱 분석에 사용될 수 있다. 예를 들어, 손을 씻은 후 질 DNA/RNA 수집 키트의 면봉을 사용하여 면봉을 질에 몇 인치 삽입하고 약 20초 동안 질 벽을 면봉으로 문질러 질 검체를 수집할 수 있다. 그런 다음 면봉을 안정화 완충액이 함유된 튜브에 삽입하고 튜브/검체를 추가로 분석할 수 있다. 두 번째 샘플은 질 미생물 배양에 사용될 수 있다. 예를 들어, 검체 수집 및 운송 키트의 면봉은 질 검체 수집에 사용될 수 있다. 그런 다음 면봉을 액체 Amies 용액이 함유된 튜브에 삽입할 수 있다(예를 들어, 호기성, 혐기성 및 까다로운(fastidious) 세균을 최대 48시간 동안 보존할 수 있음). 수집 시, 공여자는 샘플 튜브 및 물질을 바이오하자드 백(biohazard bag)에 넣은 다음 기증 시설에 검체를 갖다 놓는다.
시퀀싱(예를 들어, 샷건 시퀀싱)을 위한 샘플을 처리하기 위해, 먼저 프로테아제(예를 들어, QIAGEN Protease)를 멸균 PCR-인증된 물을 사용하여 재수화하여, 80 mg/mL 용액(이는 샘플을 10회 이상 인버팅하는 것을 포함할 수 있음)을 생성할 수 있다. 샘플(예를 들어, 질 DNA/RNA 수집 키트 샘플)을 냉장고로부터 꺼내 30초 동안 볼텍싱할 수 있다. 수집 튜브를 세 번 흔들어 샘플이 함유된 용액을 튜브 바닥으로 보낼 수 있다. 5 마이크로리터의 재수화된 프로테아제를 질 면봉 샘플이 함유된 수집 튜브에 첨가할 수 있다. 샘플은 10회 이상 인버팅할 수 있다. 그런 다음 샘플을 50℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 그런 다음 샘플을 30초 동안 볼텍싱할 수 있다. 그런 다음 수집 튜브를 3회 흔들어 샘플이 함유된 용액을 튜브 바닥으로 보낼 수 있다. 면봉을 튜브에서 제거할 수 있다(이는 면봉에 흡수된 샘플을 회수하기 위해 튜브의 측면 상에 면봉을 누르는 것을 포함할 수 있음). 500 마이크로리터의 샘플을 저장을 위해 2개의 2-mL 크리오바이알(cryovial) 각각에 분취할 수 있으며 샘플은 시퀀싱 분석 준비가 될 때까지 -80℃에서 저장할 수 있다(이는 미네소타주 세인트폴에서 Divergent™와 같은 적합한 가공/분석 시설에서 수행될 수 있음).
배양을 위한 샘플을 처리하기 위해, 샘플(예를 들어, 검체 수집 및 운송 키트 샘플)을 혐기성 챔버의 에어록(airlock)에 넣고 챔버에 도입할 수 있다. 면봉이 제자리에 있는 상태에서, 튜브를 5초 동안 격렬하게 볼텍싱하여 면봉 팁으로부터 샘플을 분리할 수 있다. 이는 희석되지 않거나 100 희석이다. 그런 다음 면봉을 제거할 수 있다. 샘플은 900 마이크로리터의 멸균 생리식염수(0.9%)가 함유된 튜브에 100 마이크로리터를 옮겨 10배 연속 희석을 거칠 수 있다. 샘플을 5초 동안 격렬하게 볼텍싱하고/하거나, 인버팅함으로써 혼합할 수 있다. 이는 10-1 희석이다. 10-1 희석의 100 마이크로리터를 900 마이크로리터의 멸균 생리식염수(0.9%)가 함유된 새로운 튜브로 옮길 수 있다. 샘플을 5초 동안 격렬하게 볼텍싱하고/하거나, 인버팅함으로써 혼합할 수 있다. 이는 10-2 희석이다. 이 프로세스는 검체가 10-6 희석될 때까지 반복될 수 있다.
삼중으로, 스프레드 플레이트는 CDC Anaerobe 5% 양 혈액 한천, De Man, Rogosa and Sharpe(MRS) 한천, 및 50% MRS 한천 플레이트에서 다음의 희석 튜브로부터 제조될 수 있다: 10-3, 10-4, 10-5. 간단히, 적절한 튜브로부터 100 μL을 한천 플레이트의 표면 상으로 직접 옮기고 멸균 L자형 스프레더 및 플레이트 로테이터를 사용하여 플레이트 표면을 가로질러 접종물을 스프레드할 수 있다. 플레이트를 혐기성 조건하에 35℃에서 24 내지 120시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 새로운 콜로니의 출현에 대해 플레이트를 매일 체크할 수 있다. 플레이트가 건조되기 시작하면, 이를 파라필름으로 감싼다. 콜로니를 관찰할 수 있으며 콜로니 수와 형태를 기록할 수 있다(콜로니 형태의 기록에 도움이 되도록 플레이트의 캡처 사진을 찍는 것을 포함할 수 있음). 추가적 특성규명을 위해 개별 콜로니를 선택하고 새로운 플레이트에 획선(streak)할 수 있다. 원하는 경우, 비피도박테리움 선택 한천(BSA), 엔테로코코셀 한천(ECA), 세트리미드 한천(CA), 만니톨 염 한천(MSA) 등과 같은 선택 배지를 활용할 수 있다.
일부 경우에, 그람 염색이 활용될 수 있다. 이와 같이 수행할 시에는 검체를 유리 슬라이드에 도포할 수 있다. 액체 배양물을 염색하는 경우 멸균 접종 루프를 사용하여 배양물을 도말로 슬라이드에 직접 도포할 수 있다. 플레이트에서 콜로니를 염색하는 경우 접종 루프를 사용하여 슬라이드 중앙에 멸균 식염수 한 방울을 도포한 다음, 소량의 단일 콜로니를 수집하고 그 방울에 추가할 수 있다. 가능하면 방울과 샘플을 부드럽게 혼합하여 얇고 균일한 도말을 산출할 수 있다. 방울을 건조되도록 할 수 있다. 슬라이드는 무수 메탄올로 1 내지 2분 동안 플러딩(flooding)된 다음 수돗물로 헹굼으로써 메탄올 고정될 수 있다. 고정된 도말은 1분 동안 1차 염색(예를 들어, 크리스탈 바이올렛)으로 플러딩할 수 있다. 1차 염색은 수돗물로 부드럽게 헹구어 제거할 수 있다. 고정된 도말은 1분 동안 2차 염색/매염제(예를 들어, 그람 이오딘)로 플러딩한 다음 수돗물로 부드럽게 헹굴 수 있다. 슬라이드로부터 흘러나오는 용매가 무색이 될 때까지(예를 들어, 약 3 내지 60초) 슬라이드를 탈색할 수 있고 슬라이드를 수돗물로 부드럽게 세척할 수 있다. 그런 다음 슬라이드를 대조염색(예를 들어, 사프라닌; 초기 대조염색 결과가 만족스럽지 않은 경우 염기성 푹신으로 대체할 수 있음)으로 1분 동안 플러딩할 수 있다. 슬라이드는 수돗물로 세척하고 건조시킬 수 있다. 도말은 오일 침지 렌즈하에서 예시될 수 있고 결과/관찰을 기록할 수 있다.
카탈라제 검사를 포함하여 다른 샘플 검사를 수행할 수 있으며, 여기에는 포도상구균(Staphylococci)과 연쇄상구균(Streptococci)을 구별하기 위한 과산화수소의 첨가가 포함될 수 있다. 수행될 수 있는 또 다른 샘플 검사에는 포도상구균과 연쇄상구균을 구별하기 위한 혈장의 첨가를 포함할 수 있는 응고효소 검사가 포함될 수 있다.
락토바실러스로 결정된 분리주는 항생제 감수성 프로파일을 결정하기 위해 추가로 특성규명될 수 있다. 여기에는 현탁액이 McFarland 표준 1과 동등해질 때까지 90% Iso-sensitest 브로쓰 및 10% MRS 브로쓰로 구성된 브로쓰에 하룻밤 플레이트로부터의 락토바실러스 콜로니를 현탁하는 것이 포함될 수 있다. 다음으로 멸균 면봉을 접종물에 담그고 과도한 액체를 제거하기 위해 튜브의 벽에 대고 압착할 수 있다. 면봉은 한천 표면 전체에 획선할 수 있다(고른 분포를 보장하기 위해 2회 이상 회전시킴). 과량의 수분이 흡수되도록 한 후 최소 억제 농도(MIC) 검사 스트립을 적용할 수 있다(예를 들어, 눈금이 위쪽을 향하고 스트립 코드가 장소의 외부를 향하는 상태에서, 스트립을 적용하는 것을 포함할 수 있음). 스트립은 항생제 구배의 길이 전체가 한천 표면과 완전히 접촉하도록 하고, 필요한 경우 재배치한 상태에서, 한천 표면 상에 눌릴 수 있다. 플레이트를 인버팅하고 35℃에서 24 내지 48시간(또는 그 이상) 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 결과를 해석할 수 있다.
분리된 균주는 동결보존 및 저장될 수 있다. 이는 획선 플레이트로부터 선택된 잘 분리된 콜로니를 하룻밤 배양물에 접종하는 것을 포함할 수 있다. 많은 콜로니를 선택하는 경우 96-웰 플레이트 포맷을 사용할 수 있다. 적합한 브로쓰를 사용할 수 있다(예를 들어, 락토바실러스는 MRS를 사용할 수도 있음). 배양물을 혐기성 챔버 인큐베이터에서 밤새 35℃에서 인큐베이션되도록 할 수 있다. 배양물이 다음날 아침까지 탁하지 않으면 추가의 인큐베이션 시간이 활용될 수 있다. 배양물이 육안으로 탁하게 보이면 200 내지 300 마이크로리터를 동결보호제(예를 들어, 50% 글리세롤 50 내지 60 마이크로리터)가 함유된 새로운 96-웰 플레이트로 옮길 수 있다. 글리세롤의 최종 농도는 10%일 수 있다. 96-웰 플레이트는 밀봉하여 -80℃ 냉동고에 저장될 수 있다.
본원에서 제안된 바와 같이, 개별 미생물 균주(예를 들어, 세균의 개별 균주 또는 종)는 면봉으로부터 분리될 수 있다. 여기에는 원하는 균주에 대해 선택적인 한천 배지 상에 플레이팅하고 후속하여 단일 콜로니 분리주로서 균주를 "정제"하는 것과 같은 하나 이상의 프로세스가 포함될 수 있다. 개별 미생물 균주는 성장/배양될 수 있으며 시퀀싱, 생화학적 검사, 콜로니 형태, 세포 형태, 현미경적 사망률 및 다른 대표적인 항생제에 대한 감수성에 의해 종-식별/특성규명될 수 있다. 미생물 균주는 다를 수 있다. 일부 경우에, 미생물 균주는 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 이너스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 바지날리스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 존소니, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 델브릭키이, 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 비-락토바실러스 박테리아(non-Lactobacillus bacteria), 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae), 프레보텔라 비비아(Prevotella bivia), 이들 속의 다른 종, 메가스페라, 스니시아, 디알리스터, 펩토니필루스 속, 진균류, 이들의 조합 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
단일의 분리된 균주 또는 둘 이상의 분리된 균주의 혼합물을 포함하는 질 미생물총 조성물이 고려된다. 예시적인 조성물은 약 20 내지 85%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 10 내지 50%의 락토바실러스 이너스, 또는 약 10 내지 40%의 락토바실러스 이너스, 또는 약 15 내지 30%의 락토바실러스 이너스, 또는 약 20%의 락토바실러스 이너스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 5%의 락토바실러스 가세리를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 루테리, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 루테리, 또는 약 1%의 락토바실러스 루테리를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 아시도필루스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 아시도필루스, 또는 약 1%의 락토바실러스 아시도필루스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 바지날리스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 바지날리스, 또는 약 1%의 락토바실러스 바지날리스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 존소니, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 존소니, 또는 약 1%의 락토바실러스 존소니를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 헬베티쿠스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 헬베티쿠스, 또는 약 1%의 락토바실러스 헬베티쿠스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 플란타럼, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 플란타럼, 또는 약 1%의 락토바실러스 플란타럼을 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 퍼멘텀, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 퍼멘텀, 또는 약 1%의 락토바실러스 퍼멘텀을 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 살리바리우스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 살리바리우스, 또는 약 1%의 락토바실러스 살리바리우스를 포함할 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에(예를 들어, 위에 열거된 미생물 중 임의의 하나 이상에 추가하여 또는 대안에서), 예시적인 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 델브릭키이, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 델브릭키이, 또는 약 1%의 락토바실러스 델브릭키이를 포함할 수 있다.
예시적인 조성물은 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스, 약 20%의 락토바실러스 이너스, 약 5%의 락토바실러스 가세리, 약 5%의 락토바실러스 젠세니, 약 1%의 락토바실러스 루테리, 약 1%의 락토바실러스 아시도필루스, 약 1%의 락토바실러스 바지날리스, 약 1%의 락토바실러스 람노서스, 약 1%의 락토바실러스 존소니, 약 1%의 락토바실러스 헬베티쿠스, 약 1%의 락토바실러스 플란타럼, 약 1%의 락토바실러스 퍼멘텀, 약 1%의 락토바실러스 살리바리우스, 및 약 1%의 락토바실러스 델브릭키이를 포함할 수 있다.
예시적인 조성물은 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 및 락토바실러스 람노서스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 20 내지 85%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 5%의 락토바실러스 가세리를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함할 수 있다. 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 성분 각각은 냉동건조될 수 있다. 예시적인 조성물에서 미생물의 총 수는 약 1 x 105 내지 1 x 1015 CFU, 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU, 또는 약 1 x 107 내지 1 x 1010 CFU 정도일 수 있다. 조성물은 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등과 같은 적합한 전달 비히클에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 다른 경우에, 조성물은 국부적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등을 질에 삽입함으로써).
예시적인 조성물은 바람직한 특성을 갖는 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 및 락토바실러스 람노서스의 균주를 포함할 수 있다. 예를 들어, 성분 각각의 균주는 pH 감소 활성, 젖산 생성, 다른 미생물에 대한 억제 활성, 다른 독특한 활성, 이들의 조합 등을 갖도록 선택될 수 있다.
예시적인 조성물은 냉동건조된 락토바실러스 크리스파투스, 냉동건조된 락토바실러스 가세리, 냉동건조된 락토바실러스 젠세니, 및 냉동건조된 락토바실러스 람노서스의 혼합물을 포함할 수 있다. 성분 각각은 공여자로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 20 내지 85%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 5%의 락토바실러스 가세리를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함할 수 있다. 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함할 수 있다. 성분 각각은 공여자 검체로부터 유래/분리될 수 있다. 예시적인 조성물에서 미생물의 총 수는 약 1 x 105 내지 1 x 1015 CFU, 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU, 또는 약 1 x 107 내지 1 x 1010 CFU 정도일 수 있다. 조성물은 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등과 같은 적합한 전달 비히클에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 다른 경우에, 조성물은 국부적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등을 질에 삽입함으로써).
예시적인 조성물은 냉동건조된 락토바실러스 크리스파투스, 냉동건조된 락토바실러스 가세리, 냉동건조된 락토바실러스 젠세니, 및 냉동건조된 락토바실러스 람노서스의 혼합물을 포함할 수 있다. 성분 각각은 공여자로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 20 내지 85%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 5%의 락토바실러스 가세리를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함할 수 있다. 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함할 수 있다. 성분 각각은 세균 배양물로부터 유래될 수 있다. 예시적인 조성물에서 미생물의 총 수는 약 1 x 105 내지 1 x 1015 CFU, 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU, 또는 약 1 x 107 내지 1 x 1010 CFU 정도일 수 있다. 조성물은 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등과 같은 적합한 전달 비히클에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 다른 경우에, 조성물은 국부적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등을 질에 삽입함으로써).
예시적인 조성물은 냉동건조된 락토바실러스 크리스파투스, 냉동건조된 락토바실러스 가세리, 냉동건조된 락토바실러스 젠세니, 및 냉동건조된 락토바실러스 람노서스의 혼합물을 포함할 수 있다. 성분 각각은 공여자로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 20 내지 85%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스, 또는 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리, 또는 약 5%의 락토바실러스 가세리를 포함할 수 있다. 조성물은 약 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니, 또는 약 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함할 수 있다. 조성물은 약 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스, 또는 약 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함할 수 있다. 성분 중 하나 이상은 공여자 검체로부터 유래/분리될 수 있으며 하나 이상의 성분은 세균 배양물로부터 유래될 수 있다. 예시적인 조성물에서 미생물의 총 수는 약 1 x 105 내지 1 x 1015 CFU, 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU, 또는 약 1 x 107 내지 1 x 1010 CFU 정도일 수 있다. 조성물은 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등과 같은 적합한 전달 비히클에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 다른 경우에, 조성물은 국부적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등을 질에 삽입함으로써).
예시적인 조성물은 바람직한 특성을 갖는 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니 및 락토바실러스 람노서스의 균주를 포함할 수 있다. 예를 들어, 성분 각각의 균주는 pH 감소 활성, 젖산 생성, 다른 미생물에 대한 억제 활성, 다른 독특한 활성, 이들의 조합 등을 갖도록 선택될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 예시적인 조성물에서 미생물의 총 수는 약 1 x 105 내지 1 x 1015 CFU, 또는 약 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU, 또는 약 1 x 107 내지 1 x 1010 CFU 정도일 수 있다. 이는 단일 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등 내의 미생물의 총 수에 해당할 수 있다. 대안적으로, 이는 조성물의 적합한 투여량(예를 들어, 이는 하나 이상의 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등을 포함할 수 있음) 내 미생물의 총 수에 해당할 수 있다.
단일 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등은 환자에게 투여될 수 있는 캡슐화된 약물 제품 또는 용량으로 기재될 수 있다. 여기에는 적합한 투여 요법을 사용하여 환자에게 용량을 투여하는 것이 포함될 수 있다. 여기에는 환자에게 하나 이상의 용량을 투여하는 것이 포함될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에, 캡슐화된 약물 제품은 하루 이상 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상에 걸쳐 투여될 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에, 용량은 하루에 1회 이상 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 용량은 하루에 1, 2, 3, 4, 5, 6회 이상 환자에게 투여될 수 있다.
하나의 예시적인 투여 요법은 2일 동안 하루에 2회 환자에게 2개의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 투여 요법은 2일 동안 하루에 2회 환자에게 4개의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 투여 요법은 4일 동안 하루에 2회 환자에게 4개의 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 투여 요법은 4일 동안 환자에게 하루에 2개의 용량을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 투여 요법은 8일 동안 환자에게 하루에 하나의 용량을 포함할 수 있다. 이들은 단지 예시이다. 이들 예시 중 적어도 일부에서, 각각의 용량은 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 및 락토바실러스 람노서스의 혼합물을 포함하는 냉동건조된 물질을 포함할 수 있다.
적어도 일부 경우에, 질 미생물총 조성물에는 스니시아, 메가스페라, 아토포비움, 펩토니필루스, 디알리스터, 프레보텔라 및/또는 가드네렐라 속의 세균이 없을 수 있다. 예를 들어, 질 미생물총 조성물에는 아토포비움, 가드네렐라 및 프레보텔라 속의 세균이 없을 수 있다.
본원에 개시된 질 미생물총 조성물은 다수의 상이한 건강 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 질 미생물총 조성물은 세균성 질염 치료, 칸디다증 감염 치료, 인유두종 바이러스 감염 치료, 요로 감염 치료, 성매개 감염 치료, 부인과 암(예를 들어, 자궁경부암) 치료, 조산 감소 및/또는 예방, 유산 감소 및/또는 예방, 불임 치료, 간질성 방광염 치료, 다낭성 난소 증후군 치료 등에 사용될 수 있다.
하나 이상의 추가 미생물(예를 들어, 공여자로부터 수집 및 분리된 것들 등)과 조합되거나 혼합된, 모든 스펙트럼의 질 미생물총 조합을 포함하는 질 미생물총 조성물이 또한 고려된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 모든 스펙트럼의 질 미생물총은 전형적인 여성의 질에 존재하는 미생물의 집합으로 이해될 수 있다. 모든 스펙트럼의 질 미생물총은 샘플에 있는 임의의 특정 미생물의 존재 또는 부재를 변경하기 위해 의도적으로 조작된 것이 아니며, 대신 샘플 내 유기체의 전체 개체군을 나타내기 위한 것이다. 질 미생물총의 구성은 사람마다 다를 수 있음을 이해할 수 있다. 이 때문에 모든 스펙트럼의 질 미생물총에는 차이가 있을 수 있다. 일부 경우에, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 이너스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 바지날리스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 존소니, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 델브릭키이 중 하나 이상과 조합, 혼합 또는 도핑된, 모든 스펙트럼의 질 미생물총을 포함하는 질 미생물총 조성물이 고려된다. 적어도 일부 경우에, 모든 스펙트럼의 질 미생물총 및 추가 미생물 둘 모두의 원천은 질 미생물총 공여자이다.
세균/미생물은 경구 또는 국부적 전달을 위해 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등과 같은 적합한 용기 내에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 모의 질액이 질 미생물총 조성물에 포함될 수 있다. 이들 중 일부 및 다른 경우에, 질 미생물총 조성물은 글리코겐을 포함할 수 있다. 용기/좌약 내에 함유된 총 부피는 약 100 마이크로리터 내지 약 10 밀리리터 정도일 수 있다.
적어도 일부 경우에, 질 미생물총 조성물 내 세균/미생물은 냉동건조된 세균/미생물을 포함할 수 있다. 여기에는 세균/미생물이 동결건조되는 냉동건조 프로세스가 포함될 수 있다. 세균/미생물 및/또는 냉동건조된 세균/미생물은 경구 또는 국부적 전달을 위해 캡슐, 좌약, 가용성 쉘 등과 같은 적합한 용기 내에 배치될 수 있다.
환자의 치료는 질 미생물총 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 치료의 한 가지 목적은 환자의 질 미생물총을 질 미생물총 조성물로 효과적으로 대체함으로써 환자의 질 미생물총을 정상화하는 것일 수 있다. 이는 이식, 좌약, 또는 또 다른 적합한 투여 경로에 의해 질 미생물총 조성물을 환자의 질에 직접 투여하는 것을 포함할 수 있다.
적어도 일부 경우에, 다수의 질 미생물총 조성물은 적합한 저장 장치/시설에 저장되거나 보관될 수 있다. 저장 장치는 냉장 장치(예를 들어, 4℃ 냉장 장치), 냉동고(예를 들어, -20℃ 냉동고), 초저온 냉동고(예를 들어, -80℃ 냉동고) 등과 같은 온도 제어 장치를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 인덱싱 시스템은 또한 질 미생물총 조성물 뱅크에 결합되거나 그 외의 방식으로 이와 연관될 수 있다. 인덱싱 시스템은 주어진 공여자로부터의 질 미생물총 조성물을 적합한 환자와 매치시키는 데 사용될 수 있는 공여자 데이터와 같은 데이터를 포함할 수 있다. 공여자 데이터에는 수집 시 연령, 수집 시 생식 상태(비폐경, 폐경), 인종, 수집 시 월경 단계, 세균성 질염 이력, 칸디다증 감염 이력, 인유두종 바이러스 이력, 기타 병력(예를 들어, C. 디피실 감염 이력, 암 진단/치료 이력 등), 이들의 조합 등이 포함될 수 있다. 임상의는 공여자 데이터를 활용하여 특정 환자에 맞도록 치료 요법을 조정할 수 있다. 예를 들어, 세균성 질염 환자는 세균성 질염의 성공적인 개선 이력이 있는 공여자로부터 유래된 질 미생물총 조성물로 치료될 수 있다.
일부 경우에, 공여자 데이터에 임신 이력이 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 공여자는 임신을 원할 때 임신할 가능성이 높은 이력을 갖거나, 그렇지 않으면 실제 또는 인지된 생식능력 증가를 가질 수 있다. 이러한 공여자로부터의 미생물을 포함하는 질 미생물총 조성물은 환자의 생식능력을 증가시키거나 증진시키려는 시도를 위해 생식능력 문제를 겪는 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 경우, 질 미생물총 조성물은 경구 캡슐제로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 질 미생물총 조성물은 이식조직(transplant)으로서 투여될 수 있고/있거나 그렇지 않으면 환자의 질 내로 직접 삽입될 수 있다.
미국 특허 제9,675,648호는 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 제9,629,881호는 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 제10,226,431호는 본원에 참조로 포함된다.
미국 특허 출원 공개 US 2018/0289750은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 더 명확해질 수 있으며, 하기 실시예는 본질적으로 예언적이고 일부 구현예를 예시하는 역할을 하며, 어떤 식으로든 개시내용을 제한하지 않는다.
실시예 1
질 미생물총 조성물이 제조될 수 있다. 질 미생물총 조성물은 약 40%의 락토바실러스 크리스파투스, 약 20%의 락토바실러스 이너스, 약 5%의 락토바실러스 가세리, 약 5%의 락토바실러스 젠세니, 약 1%의 락토바실러스 루테리, 약 1%의 락토바실러스 아시도필루스, 약 1%의 락토바실러스 바지날리스, 약 1%의 락토바실러스 람노서스, 약 1%의 락토바실러스 존소니, 약 1%의 락토바실러스 헬베티쿠스, 약 1%의 락토바실러스 플란타럼, 약 1%의 락토바실러스 퍼멘텀, 약 1%의 락토바실러스 살리바리우스, 및 약 1%의 락토바실러스 델브릭키이를 포함하는 세균의 혼합물을 포함한다.
세균의 혼합물은 좌약에 배치될 수 있다. 좌약 내에 함유된 총 부피(예를 들어, 세균의 혼합물을 포함하는 물질의 부피)는 약 100 마이크로리터 내지 약 10 밀리리터 정도일 수 있다.
좌약은 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 좌약은 세균성 질염, 칸디다증 감염, 인유두종 바이러스 감염, 요로 감염, 성매개 감염, 및 부인과 암 중 하나 이상을 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
좌약은 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 좌약은 조산 예방, 유산 예방, 불임 치료, 간질성 방광염 치료, 다낭성 난소 증후군 치료, 및/또는 이들의 조합을 위해 환자에게 투여될 수 있다.
실시예 2 - 질 미생물총 조성물에 사용하기 위한 예시적인 락토바실러스 젠세니 균주
균주 8001-D01-M006으로 지정된 락토바실러스 젠세니의 균주를 기증(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 기증됨) 동안 기탁된 공여자의 검체로부터 분리하였다. 공여자는 질 면봉에 그람 염색 및 뉴젠트 점수화(GRAM)를 위해 페어뷰 진단 연구소(Fairview Diagnostics Laboratory)에 제출되는 소변 검체를 기증하고, 다음 STI에 대해 검사함으로써 자격을 갖췄다: 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)(TVPCR), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae)(GCPCR), 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)(CHPCR).
8001-D01-M006에 대한 작업 세포 스톡을 제조하는 동안, 설정된 배양 세포 밀도를 목표로 하지 않고, 오히려 이전에 제조된 획선 플레이트로부터 잘 분리된 단일 콜로니를 선택하여 하룻밤 배양을 시작하였다. 이 하룻밤 배양물을 다음날 아침 신선한 브로쓰에 1:5로 희석하고 적어도 4시간 동안 성장되도록 한 후, 배양물을 글리세롤과 조합하여 10% 글리세롤 스톡을 제조하였다. 일반적으로, 이러한 방식으로 글리세롤 스톡을 제조함으로써, 세포 밀도가 약 1 x 109 CFU/ml인 스톡을 생성하였다.
OmniGene 및 ESwab 질 면봉 검체(8001-D01)를 메타유전체학 시퀸싱(OmniGene), 및 배양 및 qPCR 동일성 검사(ESwab)를 위해 제공하였다. 배양 및 qPCR 동일성 검사를 위한 ESwab 검체 8001-DO1을 혐기성 챔버에 도입하였다. ESwab 검체를 50 μL의 샘플을 제거하기 전에 잠시 볼텍싱하였다. 샘플 분취액을 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛으로부터 DNA를 추출하고, 샘플을 qPCR로 평가하여 락토바실러스 종 동일성을 결정하였다.
추가로 100 μL의 샘플을 원래의 ESwab 검체로부터 제거하였다. 분취액을 10배 연속 희석한 다음, 10-3, 10-4 및 10-5 희석액으로부터의 100 μL를 MRS 한천 상에 스프레드 플레이팅한 다음 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
콜로니 형태 및 그람 염색에 의해 한천 플레이트 상에서, 추정되는 락토바실러스를 확인하였다. 추정되는 락토바실러스 콜로니 형태와 매치되는 콜로니 형태를 가진 개별 콜로니를 멸균 이쑤시개를 사용하여 픽킹(pick)하고, 이어서 신선한 MRS 한천, LAMVAB 한천(락토바실러스에 대해 선택적인 배지) 상에 패치를 적용한 다음 MRS 브로쓰를 96-깊이 웰 플레이트의 웰에 접종하였다. MRS 브로쓰에서 성장한 락토바실러스를 함유하는 96-깊이 웰 플레이트를 약 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 패치 플레이트를 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
균주 8001-D01-M006을 원래의 MRS 한천 희석 플레이트 중 하나로부터 픽킹하고, MRS 한천 패치 플레이트 상의 그리드 스팟 #6, LAMVAB 플레이트 상의 그리드 스팟 #6에 스프레드하고, 웰 F7에서 MRS 브로쓰에 접종하였다. 96-깊이 웰 플레이트의 웰 F7에서 성장하는 균주 8001-D01-M006에 대한 브로쓰 배양물을 96-웰 PCR 플레이트의 웰 F7 및 2개의 96-웰 미량역가 플레이트의 웰 F7(웰에 50% 글리세롤을 함유하고, 그에 따라 8001-D01-M006 배양물 첨가 시 최종 글리세롤 농도는 10%였음)로 옮겼다. 96-웰 PCR 플레이트에 분취된 배양물을 펠렛화하고, DNA를 추출하고, 샘플을 qPCR로 검사하여 락토바실러스 종 동일성을 결정하였다(가능한 경우). 균주 8001-D01-M006을 qPCR에 의해 락토바실러스 젠세니로 결정하였다. 배양물 및 10% 글리세롤을 함유하는 2 x 96-웰 미량역가 플레이트(동결보존 플레이트)를 접착 포일 시일로 밀봉한 다음 -70℃ 이하에서 냉동 저장하였다.
확장 및 특성규명을 위해 균주 8001-D01-M006을 동결된 96-웰 미량역가 플레이트로부터 회수하였다. 배양물 및 10% 글리세롤을 함유하는 하나의 96-웰 미량역가 플레이트를 혐기성 챔버에 도입하고 실온에서 1시간 동안 해동시켰다. 웰 F7에서 배양물을 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 MRS 한천에서 분리하기 위해 획선하였다. 플레이트를 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
단일의 잘 분리된 콜로니를 획선 플레이트로부터 선택하고 사전 환원된 MRS 브로쓰에 하룻밤 배양물을 접종하는 데 사용하였다(35℃에서 18 내지 24시간). 다음날, 하룻밤 배양물을 신선한 MRS 브로쓰로 희석하고 50% 글리세롤(최종 농도 10% 글리세롤)과 조합하기 전에 약 4시간 동안 인큐베이션되게 하고, 크리오바이알(바이알당 1 mL)로 분취하고, -70℃ 이하에서 냉동 저장하였다.
균주 8001-D01-M006을 분리하고 사전 환원된 MRS 한천 및 브로쓰를 사용하여 증식시켰다. 사용된 배지의 로트는 검체 8001-D01에 대한 P249-01 검체 배양 워크시트에 기록되어 있다. MRS 브로쓰 및 MRS 한천의 각 로트에 대해 완성된 배지 제조 워크시트는 P249 바인더에 저장된다. 간단히 말해서, MRS 한천 및 MRS 브로쓰 성장 배지는 하기 성분(리터당 그램 중량)을 함유하는 Hardy Diagnostic의 Criterion™ 락토바실러스 MRS 브로쓰를 사용하여 사내에서 제조하였다: 덱스트로스(20.0 g), 동물 조직의 펩신 소화제(10.0 g), 쇠고기추출물(10.0 g), 효모추출물(5.0 g), 아세트산나트륨(5.0 g), 인산이나트륨(2.0 g), 시트르산암모늄(2.0 g), 트윈 80(1.0 g), 황산마그네슘(0.1 g), 및 황산망간(0.05 g). MRS 한천 플레이트는 동일한 Criterion™ 락토바실러스 MRS 브로쓰를 기본으로 사용하며 15 g/L의 BD Difco 한천을 포함한다. MRS 브로쓰 및 한천은 0.5 g/L의 L-시스테인도 함유한다.
이 균주 8001-D01-M006은 qPCR 및 스트레인뷰(Strainview) 시퀸싱에 의해 식별하였다. qPCR 방법은 알려지지 않은 분리주 및 알려진 양성 대조군 균주로부터 생성된 앰플리콘에 대한 용융 곡선 프로파일을 비교하여 락토바실러스 속 및 일곱(7) 개의 상이한 락토바실러스 종(L. 크리스파투스, L. 가세리, L. 젠세니, L. 이너스, L. 아시도필루스, L. 델브릭키이, 및 L. 헬베티쿠스)을 검출한다. 스트레인뷰 시퀀싱은 Diversigen에 의해 수행하였다. 이 균주는 스트레인뷰 파이프라인을 사용하여 분석했을 때 항생제 내성 유전자 및 독성 유전자를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다.
균주 8001-D01-M006은 질 미생물총 조성물에 활용될 수 있는 적합한 락토바실러스 젠세니 균주의 예일 수 있다.
실시예 3 - 질 미생물총 조성물에 사용하기 위한 예시적인 락토바실러스 가세리 균주
균주 8018-IN-M001로 지정된 락토바실러스 가세리의 균주를 기증(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 기증됨) 동안 기탁된 공여자의 검체로부터 분리하였다. 공여자는 질 면봉에 그람 염색 및 뉴젠트 점수화(GRAM)를 위해 페어뷰 진단 연구소에 제출되는 소변 검체를 기증하고, 다음 STI에 대해 검사함으로써 자격을 갖췄다: 트리코모나스 바지날리스(TVPCR), 네이세리아 고노르호애(GCPCR), 및 클라미디아 트라코마티스(CHPCR).
8018-IN-M001에 대한 작업 세포 스톡을 제조하는 동안, 설정된 배양 세포 밀도를 목표로 하지 않고, 오히려 이전에 제조된 획선 플레이트로부터 잘 분리된 단일 콜로니를 선택하여 하룻밤 배양을 시작하였다. 이 하룻밤 배양물을 다음날 아침 신선한 브로쓰에 1:5로 희석하고 적어도 4시간 동안 성장되도록 한 후, 배양물을 글리세롤과 조합하여 10% 글리세롤 스톡을 제조하였다. 일반적으로, 이러한 방식으로 글리세롤 스톡을 제조함으로써, 세포 밀도가 약 1 x 108 내지 7 x 108 CFU/ml인 스톡을 생성하였다.
OmniGene 및 ESwab 질 면봉 검체(8018-IN)를 메타유전체학 시퀸싱(OmniGene), 및 배양 및 qPCR 동일성 검사(ESwab)를 위해 제공하였다. 배양 및 qPCR 동일성 검사를 위한 ESwab 검체 8001-IN을 혐기성 챔버에 도입하였다. ESwab 검체를 50 μL의 샘플을 제거하기 전에 잠시 볼텍싱하였다. 샘플 분취액을 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛으로부터 DNA를 추출하고, 샘플을 qPCR로 평가하여 락토바실러스 종 동일성을 결정하였다.
추가로 100 μL의 샘플을 원래의 ESwab 검체로부터 제거하였다. 분취액을 10배 연속 희석한 다음, 10-3, 10-4 및 10-5 희석액으로부터의 100 μL를 MRS 한천 상에 스프레드 플레이팅한 다음 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
콜로니 형태 및 그람 염색에 의해 한천 플레이트 상에서, 추정되는 락토바실러스를 확인하였다. 추정되는 락토바실러스 콜로니 형태와 매치되는 콜로니 형태를 가진 개별 콜로니를 멸균 이쑤시개를 사용하여 픽킹하고, 이어서 신선한 MRS 한천, LAMVAB 한천(락토바실러스에 대해 선택적인 배지) 상에 패치를 적용한 다음 MRS 브로쓰를 96-깊이 웰 플레이트의 웰에 접종하였다. MRS 브로쓰에서 성장한 락토바실러스를 함유하는 96-깊이 웰 플레이트를 약 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 패치 플레이트를 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
균주 8018-IN-M001을 원래의 MRS 한천 희석 플레이트 중 하나로부터 픽킹하고, MRS 한천 패치 플레이트 상의 그리드 스팟 #1, LAMVAB 플레이트 상의 그리드 스팟 #1에 스프레드하고, 웰 A7에서 MRS 브로쓰에 접종하였다. 96-깊이 웰 플레이트의 웰 A7에서 성장하는 균주 8018-IN-M001에 대한 브로쓰 배양물을 96-웰 PCR 플레이트의 웰 A7 및 2개의 96-웰 미량역가 플레이트의 웰 A7(웰에 50% 글리세롤을 함유하고, 그에 따라 8018-IN-M001 배양물 첨가 시 최종 글리세롤 농도는 10%였음)로 옮겼다. 96-웰 PCR 플레이트에 분취된 배양물을 펠렛화하고, DNA를 추출하고, 샘플을 qPCR로 검사하여 락토바실러스 종 동일성을 결정하였다(가능한 경우). 균주 8018-IN-M001을 qPCR에 의해 락토바실러스 가세리로 결정하였다. 배양물 및 10% 글리세롤을 함유하는 2 x 96-웰 미량역가 플레이트(동결보존 플레이트)를 접착 포일 시일로 밀봉한 다음 -70℃ 이하에서 냉동 저장하였다.
확장 및 특성규명을 위해 균주 8018-IN-M001을 동결된 96-웰 미량역가 플레이트로부터 회수하였다. 배양물 및 10% 글리세롤을 함유하는 하나의 96-웰 미량역가 플레이트를 혐기성 챔버에 도입하고 실온에서 1시간 동안 해동시켰다. 웰 A7에서 배양물을 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 MRS 한천에서 분리하기 위해 획선하였다. 플레이트를 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
단일의 잘 분리된 콜로니를 획선 플레이트로부터 선택하고 사전 환원된 MRS 브로쓰에 하룻밤 배양물을 접종하는 데 사용하였다(35℃에서 18 내지 24시간). 다음날, 하룻밤 배양물을 신선한 MRS 브로쓰로 희석하고 50% 글리세롤(최종 농도 10% 글리세롤)과 조합하기 전에 약 4시간 동안 인큐베이션되게 하고, 크리오바이알(바이알당 1 mL)로 분취하고, -70℃ 이하에서 냉동 저장하였다.
균주 8018-IN-M001을 분리하고 사전 환원된 MRS 한천 및 브로쓰를 사용하여 증식시켰다. 사용된 배지의 로트는 검체 8018-IN에 대한 P249-01 검체 배양 워크시트에 기록되어 있다. MRS 브로쓰 및 MRS 한천의 각 로트에 대해 완성된 배지 제조 워크시트는 P249 바인더에 저장된다. 간단히 말해서, MRS 한천 및 MRS 브로쓰 성장 배지는 하기 성분(리터당 그램 중량)을 함유하는 Hardy Diagnostic의 Criterion™ 락토바실러스 MRS 브로쓰를 사용하여 사내에서 제조하였다: 덱스트로스(20.0 g), 동물 조직의 펩신 소화제(10.0 g), 쇠고기추출물(10.0 g), 효모추출물(5.0 g), 아세트산나트륨(5.0 g), 인산이나트륨(2.0 g), 시트르산암모늄(2.0 g), 트윈 80(1.0 g), 황산마그네슘(0.1 g), 및 황산망간(0.05 g). MRS 한천 플레이트는 동일한 Criterion™ 락토바실러스 MRS 브로쓰를 기본으로 사용하며 15 g/L의 BD Difco 한천을 포함한다. MRS 브로쓰 및 한천은 0.5 g/L의 L-시스테인도 함유한다.
이 균주 8018-IN-M001은 qPCR 및 스트레인뷰 시퀸싱에 의해 식별하였다. qPCR 방법은 알려지지 않은 분리주 및 알려진 양성 대조군 균주로부터 생성된 앰플리콘에 대한 용융 곡선 프로파일을 비교하여 락토바실러스 속 및 일곱(7) 개의 상이한 락토바실러스 종(L. 크리스파투스, L. 가세리, L. 젠세니, L. 이너스, L. 아시도필루스, L. 델브릭키이, 및 L. 헬베티쿠스)을 검출한다. 스트레인뷰 시퀀싱은 Diversigen에 의해 수행하였다. 이 균주는 스트레인뷰 파이프라인을 사용하여 분석했을 때 항생제 내성 유전자 및 독성 유전자를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다.
균주 8018-IN-M001은 질 미생물총 조성물에 활용될 수 있는 적합한 락토바실러스 가세리 균주의 예일 수 있다.
실시예 4 - 질 미생물총 조성물에 사용하기 위한 예시적인 락토바실러스 크리스파투스 균주
균주 8001-D01-M004로 지정된 리스파투스의 균주를 기증(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 기증됨) 동안 기탁된 공여자의 검체로부터 분리하였다. 공여자는 질 면봉에 그람 염색 및 뉴젠트 점수화(GRAM)를 위해 페어뷰 진단 연구소에 제출되는 소변 검체를 기증하고, 다음 STI에 대해 검사함으로써 자격을 갖췄다: 트리코모나스 바지날리스(TVPCR), 네이세리아 고노르호애(GCPCR), 및 클라미디아 트라코마티스(CHPCR).
8001-D01-M004에 대한 작업 세포 스톡을 제조하는 동안, 설정된 배양 세포 밀도를 목표로 하지 않고, 오히려 이전에 제조된 획선 플레이트로부터 잘 분리된 단일 콜로니를 선택하여 하룻밤 배양을 시작하였다. 이 하룻밤 배양물을 다음날 아침 신선한 브로쓰에 1:5로 희석하고 적어도 4시간 동안 성장되도록 한 후, 배양물을 글리세롤과 조합하여 10% 글리세롤 스톡을 제조하였다. 일반적으로, 이러한 방식으로 글리세롤 스톡을 제조함으로써, 세포 밀도가 약 1 x 107 내지 7 x 109 CFU/ml인 스톡을 생성하였다.
OmniGene 및 ESwab 질 면봉 검체(8001-D01)를 메타유전체학 시퀸싱(OmniGene), 및 배양 및 qPCR 동일성 검사(ESwab)를 위해 제공하였다. 배양 및 qPCR 동일성 검사를 위한 ESwab 검체 8001-D01을 혐기성 챔버에 도입하였다. ESwab 검체를 50 μL의 샘플을 제거하기 전에 잠시 볼텍싱하였다. 샘플 분취액을 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛으로부터 DNA를 추출하고, 샘플을 qPCR로 평가하여 락토바실러스 종 동일성을 결정하였다.
추가로 100 μL의 샘플을 원래의 ESwab 검체로부터 제거하였다. 분취액을 10배 연속 희석한 다음, 10-3, 10-4 및 10-5 희석액으로부터의 100 μL를 MRS 한천 상에 스프레드 플레이팅한 다음 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
콜로니 형태 및 그람 염색에 의해 한천 플레이트 상에서, 추정되는 락토바실러스를 확인하였다. 추정되는 락토바실러스 콜로니 형태와 매치되는 콜로니 형태를 가진 개별 콜로니를 멸균 이쑤시개를 사용하여 픽킹하고, 이어서 신선한 MRS 한천, LAMVAB 한천(락토바실러스에 대해 선택적인 배지) 상에 패치를 적용한 다음 MRS 브로쓰를 96-깊이 웰 플레이트의 웰에 접종하였다. MRS 브로쓰에서 성장한 락토바실러스를 함유하는 96-깊이 웰 플레이트를 약 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 패치 플레이트를 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
균주 8001-D01-M004를 원래의 MRS 한천 희석 플레이트 중 하나로부터 픽킹하고, MRS 한천 패치 플레이트 상의 그리드 스팟 #4, LAMVAB 플레이트 상의 그리드 스팟 #4에 스프레드하고, 웰 D7에서 MRS 브로쓰에 접종하였다. 96-깊이 웰 플레이트의 웰 D7에서 성장하는 균주 8001-D01-M004에 대한 브로쓰 배양물을 96-웰 PCR 플레이트의 웰 D7 및 2개의 96-웰 미량역가 플레이트의 웰 D7(웰에 50% 글리세롤을 함유하고, 그에 따라 8001-D01-M004 배양물 첨가 시 최종 글리세롤 농도는 10%였음)로 옮겼다. 96-웰 PCR 플레이트에 분취된 배양물을 펠렛화하고, DNA를 추출하고, 샘플을 qPCR로 검사하여 락토바실러스 종 동일성을 결정하였다(가능한 경우). 균주 8001-D01-M004를 qPCR에 의해 락토바실러스 크리스파투스로 결정하였다. 배양물 및 10% 글리세롤을 함유하는 2 x 96-웰 미량역가 플레이트(동결보존 플레이트)를 접착 포일 시일로 밀봉한 다음 -70℃ 이하에서 냉동 저장하였다.
확장 및 특성규명을 위해 균주 8001-D01-M004를 동결된 96-웰 미량역가 플레이트로부터 회수하였다. 배양물 및 10% 글리세롤을 함유하는 하나의 96-웰 미량역가 플레이트를 혐기성 챔버에 도입하고 실온에서 1시간 동안 해동시켰다. 웰 D7에서 배양물을 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 MRS 한천에서 분리하기 위해 획선하였다. 플레이트를 35℃에서 24 내지 72시간 동안 인큐베이션시켰다.
단일의 잘 분리된 콜로니를 획선 플레이트로부터 선택하고 사전 환원된 MRS 브로쓰에 하룻밤 배양물을 접종하는 데 사용하였다(35℃에서 18 내지 24시간). 다음날, 하룻밤 배양물을 신선한 MRS 브로쓰로 희석하고 50% 글리세롤(최종 농도 10% 글리세롤)과 조합하기 전에 약 4시간 동안 인큐베이션되게 하고, 크리오바이알(바이알당 1 mL)로 분취하고, -70℃ 이하에서 냉동 저장하였다.
균주 8001-D01-M004를 분리하고 사전 환원된 MRS 한천 및 브로쓰를 사용하여 증식시켰다. 사용된 배지의 로트는 검체 8001-D01에 대한 P249-01 검체 배양 워크시트에 기록되어 있다. MRS 브로쓰 및 MRS 한천의 각 로트에 대해 완성된 배지 제조 워크시트는 P249 바인더에 저장된다. 간단히 말해서, MRS 한천 및 MRS 브로쓰 성장 배지는 하기 성분(리터당 그램 중량)을 함유하는 Hardy Diagnostic의 Criterion™ 락토바실러스 MRS 브로쓰를 사용하여 사내에서 제조하였다: 덱스트로스(20.0 g), 동물 조직의 펩신 소화제(10.0 g), 쇠고기추출물(10.0 g), 효모추출물(5.0 g), 아세트산나트륨(5.0 g), 인산이나트륨(2.0 g), 시트르산암모늄(2.0 g), 트윈 80(1.0 g), 황산마그네슘(0.1 g), 및 황산망간(0.05 g). MRS 한천 플레이트는 동일한 Criterion™ 락토바실러스 MRS 브로쓰를 기본으로 사용하며 15 g/L의 BD Difco 한천을 포함한다. MRS 브로쓰 및 한천은 0.5 g/L의 L-시스테인도 함유한다.
이 균주 8001-D01-M004는 qPCR 및 스트레인뷰 시퀸싱에 의해 식별하였다. qPCR 방법은 알려지지 않은 분리주 및 알려진 양성 대조군 균주로부터 생성된 앰플리콘에 대한 용융 곡선 프로파일을 비교하여 락토바실러스 속 및 일곱(7) 개의 상이한 락토바실러스 종(L. 크리스파투스, L. 가세리, L. 젠세니, L. 이너스, L. 아시도필루스, L. 델브릭키이, 및 L. 헬베티쿠스)을 검출한다. 스트레인뷰 시퀀싱은 Diversigen에 의해 수행하였다. 이 균주는 스트레인뷰 파이프라인을 사용하여 분석했을 때 항생제 내성 유전자 및 독성 유전자를 함유하지 않는 것으로 밝혀졌다.
균주 8001-D01-M004는 질 미생물총 조성물에 활용될 수 있는 적합한 락토바실러스 크리스파투스 균주의 예일 수 있다.
실시예 5 - 질 미생물총 조성물에 사용하기 위한 예시적인 락토바실러스 람노서스 균주
균주 BPL5로 지정된 락토바실러스 람노서스의 예시적인 균주는 미국 특허 제10,588,926호에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
균주 BPL5는 질 미생물총 조성물에 활용될 수 있는 적합한 락토바실러스 람노서스 균주의 예일 수 있다.
실시예 6 - MRS 브로쓰에서 48시간 동안 혐기성으로 성장시킨 경우의 균주 pH 감소 능력 및 젖산 생산
균주 BPL5(L. 람노서스; 실시예 6), 8001-D01-M006(L. 젠세니; 실시예 2), 8001-D01-M004(L. 크리스파투스; 실시예 4), 및 8018-IN-M001(L. 가세리; 실시예 3)은 시간이 지남에 따라 MRS 브로쓰의 pH를 낮추는 시험관내 능력에 대해 평가되었다. pH 감소를 평가하기 위해, 각 균주를 MRS 브로쓰에 배양하였고 하룻밤 (혐기성 조건 하에) 성장시켰다. 다음날, 하룻밤 배양물을 대략 1.0의 OD 600 nm로 조정한 다음(이는 약 1 x 108 CFU/mL에 해당하였음), 신선한 MRS 브로쓰에 추가로 희석하였다(8001-D01-M006, 8001-D01-M004 및 8018-IN-M001의 경우 약 1 x 106 CFU/mL의 시작 농도를 목표로 함). 균주 BPL5는 개별적으로 그리고 상이한 시작 농도(약 1 x 107 CFU/mL)에서 검사되었다. 성장 0시간 및 48시간 후의 pH에 대해 수집된 샘플로 모든 배양물을 48시간 동안 혐기성으로 인큐베이션시켰다. 모든 균주는 L. 람노서스 및 L. 크리스파투스의 균주가 가장 유의미한 pH 감소를 나타내면서 48시간까지 브로쓰 pH를 유의미하게 감소시킬 수 있었다(표 1). BPL5(L. 람노서스) 및 8001-D01-M004(L. 크리스파투스) 균주 둘 모두는 48시간까지 브로쓰 pH를 4.0 미만으로 낮출 수 있었다(각각 3.78 및 3.77). 8001-D01-M006(L. 젠세니) 및 8018-IN-M001(L. 가세리) 균주도 브로쓰 pH를 48시간까지 감소시켰지만(각각 4.02 및 4.06) L. 람노서스 및 L. 크리스파투스 균주와 동일한 정도는 아니다.
[표 1]
추가 샘플을 48시간 시점에 수집하고 여과하여 세균을 제거하였다. 그런 다음 이러한 무세포 상층액을 분석하여 D- 및 L-젖산 수준을 검출하였다. D- 및 L-젖산은 메가자임(Megazyme)에 의해 제조된 D-/L-젖산(D-/L-락테이트)(Rapid) 검정 키트(카탈로그 # K-DLATE)를 사용하여 정량화하였다. 이 키트는 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase) 및 글루타메이트(glutamate)를 이용한 효소반응을 이용하여 D- 및 L-젖산 둘 모두를 정량화하도록 설계되었다. 젖산의 산화에 의해 생산된 NADH의 양은 젖산의 시작 농도에 대해 화학양론적이다. 이 키트는 제조업체의 권장 절차에 따라 사용되었다. 검사한 모든 균주는 검출 가능한 수준의 젖산을 생산하였다(표 2). 8001-D01-M004(L. 크리스파투스) 균주는 가장 큰 수준의 D- 및 L-젖산(20.9 g/L) 및 가장 많은 양의 D-젖산(13.5)을 생산한 반면, BPL5(L. 람노서스) 균주는 가장 많은 양의 L-젖산(17.3 g/L) 및 매우 적은 D-젖산(0.8 g/L)을 생산하였다. L. 크리스파투스 및 L. 가세리 균주 둘 모두는 많은 양의 두 젖산 이성질체 모두를 생산했으며 둘 모두 L-젖산보다 D-젖산을 더 많이 생산하였다. L. 젠세니의 8001-D01-M006 균주는 D-젖산(12.4 g/L)을 우세하게 생산하였고 L-젖산(0.3 g/L)을 거의 생성하지 않았다.
[표 2]
이들 결과는 균주 BPL5(L. 람노서스; 실시예 6), 8001-D01-M006(L. 젠세니; 실시예 2), 8001-D01-M004(L. 크리스파투스; 실시예 4), 및 8018-IN-M001(L. 가세리; 실시예 3)이 질 미생물총 조성물에 사용하기에 적합한 물질임을 나타낸다.
실시예 7 - 예시적인 질 미생물총 조성물
예시적인 질 미생물총 조성물은 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니, 락토바실러스 람노서스를 조합함으로써 형성될 수 있다. 적어도 일부 경우에, 락토바실러스 젠세니는 실시예 2에 기재된 균주일 수 있다. 적어도 일부 경우에, 락토바실러스 가세리는 실시예 3에 기재된 균주일 수 있다. 적어도 일부 경우에, 락토바실러스 크리스파투스는 실시예 4에 기재된 균주일 수 있다. 적어도 일부 경우에, 락토바실러스 람노서스는 실시예 5에 기재된 균주일 수 있다.
본 개시내용은 많은 면에서 단지 예시적인 것임을 이해해야 한다. 특히, 본 개시내용의 범위를 초과하지 않으면서, 형상, 크기 및 단계의 배열의 문제에 세부적으로 변경이 이루어질 수 있다. 이는, 적절할 경우에, 다른 구현예에서 사용되는 하나의 예시적인 구현예의 임의의 특징의 사용을 포함할 수 있다. 물론, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위를 표현하는 언어로 정의된다.
Claims (22)
- 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 포함하는 세균의 혼합물을 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항에 있어서, 세균의 혼합물이 25 내지 75%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 세균의 혼합물이 30 내지 60%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 40%의 락토바실러스 크리스파투스를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 1 내지 10%의 락토바실러스 가세리를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 2 내지 8%의 락토바실러스 가세리를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 5%의 락토바실러스 가세리를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 1 내지 10%의 락토바실러스 젠세니를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 2 내지 8%의 락토바실러스 젠세니를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 5%의 락토바실러스 젠세니를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 0.1 내지 5%의 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 0.1 내지 5%의 락토바실러스 람노서스를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 0.5 내지 4%의 락토바실러스 람노서스를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 1%의 락토바실러스 람노서스를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 캡슐에 배치되는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 좌약에 배치되는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 가용성 쉘에 배치되는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 1 x 105 내지 1 x 1015 CFU를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 1 x 106 내지 1 x 1012 CFU를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이 1 x 107 내지 1 x 1010 CFU를 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세균의 혼합물이, 냉동건조된 세균의 혼합물을 포함하는, 질 미생물총 조성물.
- 감염을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 질 미생물총 조성물을 감염이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 감염은 세균성 질염, 칸디다증 감염, 인유두종 바이러스 감염, 요로 감염, 성매개 감염, 및 부인과 암 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
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