CN115768451A - 阴道微生物群组合物 - Google Patents

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CN115768451A CN202180039476.4A CN202180039476A CN115768451A CN 115768451 A CN115768451 A CN 115768451A CN 202180039476 A CN202180039476 A CN 202180039476A CN 115768451 A CN115768451 A CN 115768451A
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Abstract

披露了用于治疗患者的组合物和方法。实例组合物可以包括阴道微生物群组合物。阴道微生物群组合物可以包括细菌混合物。细菌混合物可以包括卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。

Description

阴道微生物群组合物
技术领域
本披露涉及用于治疗患者的组合物和方法。
背景技术
已开发出多种组合物和方法用于治疗疾病和/或病症，例如生殖系统、消化道、肝、免疫系统等的疾病和/或病症。已知的组合物和方法中，各自都具有某些优点和缺点。仍需要提供用于治疗疾病和/或病症的可替代的组合物和方法。
发明内容
本披露提供了用于治疗患者的组合物和方法的设计、材料、制造方法和使用替代方案。披露了阴道微生物群组合物。该阴道微生物群组合物包含：细菌混合物，其包括卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、阴道乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌和戴耳布吕克氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括25％-75％卷曲乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括30％-60％卷曲乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括40％卷曲乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括10％-40％惰性乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括15％-30％惰性乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括20％惰性乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％-10％格氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括2％-8％格氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括5％格氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％-10％詹氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括2％-8％詹氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括5％詹氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％罗伊氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％罗伊氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％罗伊氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％嗜酸乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％嗜酸乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％嗜酸乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％阴道乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％阴道乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％阴道乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％鼠李糖乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％鼠李糖乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％鼠李糖乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％约氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％约氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％约氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％瑞士乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％瑞士乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％瑞士乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％植物乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％植物乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％植物乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％发酵乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％发酵乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％发酵乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％唾液乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％唾液乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％唾液乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.1％-5％戴耳布吕克氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括0.5％-4％戴耳布吕克氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括1％戴耳布吕克氏乳杆菌。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物包括一种或多种冻干的细菌菌株。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物置于胶囊中。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物置于栓剂中。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该细菌混合物置于可溶性壳中。
披露了用于治疗感染的方法。该方法包括：向感染患者施用以上实施例中任一项所述的阴道微生物群组合物。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，其中该感染包括细菌性阴道病、念珠菌感染、人乳头瘤病毒感染、尿路感染、性传播感染和妇科癌症中的一种或多种。
披露了用于治疗患者的方法。该方法包括：向患者施用以上实施例中任一项所述的阴道微生物群组合物。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，其中向患者施用该阴道微生物群组合物包括预防早产、预防流产、治疗不孕症、治疗间质性膀胱炎和治疗多囊卵巢综合征中的一种或多种。
披露了阴道微生物群组合物。该阴道微生物群组合物包含：栓剂；以及置于栓剂中的冻干细菌混合物，该冻干细菌混合物包括卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、阴道乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌和戴耳布吕克氏乳杆菌。
披露了阴道微生物群组合物库。该阴道微生物群组合物库包括：第一容器，其包括一种或多种置于其中的微生物的第一群体，该第一群体从第一供体收集；第二容器，其包括一种或多种置于其中的微生物的第二群体，该第二群体从第二供体收集；以及索引系统，其包括来自第一供体和第二供体的供体数据。
披露了阴道微生物群组合物库。该阴道微生物群组合物库包括：第一容器，其包括一种或多种置于其中的微生物的第一群体，该第一群体从第一供体收集；以及第二容器，其包括一种或多种置于其中的微生物的第二群体，该第二群体从第二供体收集。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该阴道微生物群组合物库含有包括来自第一供体和第二供体的供体数据的索引系统。
披露了阴道微生物群组合物库。该阴道微生物群组合物库包括：第一容器，其包括一种或多种置于其中的冻干微生物的第一群体，该第一群体从第一供体收集；第二容器，其包括一种或多种置于其中的冻干微生物的第二群体，该第二群体从第二供体收集；以及索引系统，其包括来自第一供体和第二供体的供体数据。
披露了阴道微生物群组合物库。该阴道微生物群组合物库包括：第一容器，其包括一种或多种置于其中的冻干微生物的第一群体，该第一群体从第一供体收集；第二容器，其包括一种或多种置于其中的冻干微生物的第二群体，该第二群体从第二供体收集。
对以上实施例中任一项而言可替代地或另外地，该阴道微生物群组合物库含有包括来自第一供体和第二供体的供体数据的索引系统。
一些实施例的以上概述并非旨在描述本披露的每个所披露的实施例或每个实施方式。以下的详细描述更特别地举例说明这些实施方案。
具体实施方式
对于以下定义的术语而言，除非权利要求或本说明书中的其他地方给出不同的定义，否则便使用这些定义。
本文所有的数值(不论是否明确地表明)都假定由术语“约”修饰。术语“约”通常是指本领域的技术人员认为相当于所列举的值(例如，具有相同功能或结果)的数字范围。在许多情况下，术语“约”可以包括四舍五入到最接近的有效数字的数字。
借助端点对数值范围进行的描述包括该范围的全部数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”、以及“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确规定，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用。
应当注意，说明书中对“一个实施例”、“一些实施例”、“其他实施例”等的提及表明，所描述的实施例可能包括一种或多种特定特征、结构和/或特性。然而，此类叙述不一定意指所有实施例都包括特定特征、结构和/或特性。另外地，当特定特征、结构和/或特性结合一个实施例进行描述时，应当理解的是，无论此类特征、结构和/或特性是否被明确描述(除非清楚地说明意思相反)，则此类特征、结构和/或特性也可以结合其他实施例进行使用。
人类微生物组(或人类微生物群)是驻留在皮肤的表面和深层、唾液和口腔粘膜中、结膜中以及人类胃肠道、泌尿生殖道和/或阴道中的微生物的聚集体，包括与生殖健康相关的微生物，如胎盘微生物组。人类微生物组由细菌组成，但还可能包括真菌、噬菌体、病毒、古细菌等。这些生物体中的一些执行对人类宿主有用的任务，但组成人类微生物组的大多数生物体的功能仍有待研究。在正常情况下，这些微生物不会对人类宿主引起疾病，而是参与维持健康。
阴道微生物群可能在许多不同健康病症中起作用。一些此类病症可能包括感染，如细菌性阴道病、念珠菌感染、人乳头瘤病毒感染、尿路感染和/或性传播感染。其他病症可能包括妇科癌症(例如，宫颈癌)、早产、流产、不孕症、间质性膀胱炎、多囊卵巢综合征等。恢复、标准化和/或以其他方式改变阴道微生物群的组成可帮助减轻这些病症以及其他病症。本文披露了用于治疗患者的组合物和方法。至少一些组合物包括阴道微生物群组合物。至少一些方法包括用于治疗细菌性阴道病、治疗念珠菌感染、治疗人乳头瘤病毒感染、治疗尿路感染、治疗性传播感染、治疗妇科癌症(例如，宫颈癌)、预防早产、预防流产、治疗不孕症、治疗间质性膀胱炎、治疗多囊卵巢综合征等的方法。
在健康的育龄女性中，乳杆菌属的细菌倾向于在阴道微生物组中占主导地位。在女性中，有四种物种一致被鉴定出：卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌和詹氏乳杆菌。这些物种按照它们在白种人、黑种人、亚洲人和西班牙种族女性中的主导地位频率被列出。通常，阴道微生物组的乳酸杆菌主导地位与健康相关。单一属或物种的这种主导地位产生了低多样性的微生物组。阴道微生物组多样性增加与不良健康和感染高风险相关。例如，来自纤毛菌属、巨型球菌属、奇异菌属、嗜胨菌属、小杆菌属(Dialister)、普雷沃菌属和/或加德纳菌属的细菌可能倾向于与不健康的阴道微生物群相关，因为它们已在具有其他不良阴道健康指标(高的Nugent评分和阴道pH)的女性中已被鉴定出。然而，这些概况在不同群体中可能有所不同。
阴道微生物组在青春期前、绝经前和绝经后的女性之间可能发生改变。例如，青春期前的女性可能具有相对低的乳酸杆菌相对丰度和相对高的微生物多样性(以及具有相对薄的阴道上皮、相对薄的黏液层和相对低的糖原量)。绝经前的女性可能具有相对高的乳酸杆菌相对丰度和相对低的微生物多样性(以及具有相对厚的阴道上皮、相对厚的黏液层、相对高的雌激素水平和相对低的糖原量)。绝经后的女性可能具有中等的乳酸杆菌相对丰度和相对低或较低的微生物多样性(以及具有相对薄的阴道上皮、相对薄的黏液层、相对中等的雌激素水平和相对中等的糖原量)。有阴道感染(例如，细菌性阴道病)症状的绝经后的女性可能具有较低的乳酸杆菌相对丰度和相对高的微生物多样性。总体上，倾向于包括或以其他方式增加乳酸杆菌的相对丰度以及帮助降低微生物多样性的组合物可能是有益的。
至少在一些情况下，本文披露的组合物(例如，阴道微生物群组合物)利用从阴道微生物群供体收集的阴道微生物群。然而，考虑了阴道微生物群的其他来源，包括细菌培养物等。潜在的阴道微生物群供体可以被鉴别，并且可能经受许多筛选过程。在一些情况下，可以使用健康史问卷来筛选潜在供体。实例问卷可以与红十字会用于筛选潜在血液供体的问卷相同或相似。在一些此类情况和在其他情况中，可以对潜在供体进行常见的感染性疾病和其他病症的筛选。此类筛选可以包括血液测试、粪便测试、尿液测试、阴道拭子测试等。此类测试可以包括测试HIV、肝炎(甲型肝炎、乙型肝炎和/或丙型肝炎)、梅毒、艰难梭菌、细菌性病原体、卵细胞和寄生虫和/或诸如此类是否存在。这些仅是实例。供体的健康可以通过施行血液测试、分析粪便样品、分析尿液样品、分析阴道分泌物、周期性更新健康史等进行监测。可以收集阴道拭子以经由革兰氏染色和Nugent评分、白细胞计数和检测酵母是否存在来评估阴道健康。可以收集尿液和/或阴道拭子以测试性传播感染。
在已经确定潜在供体足够健康可以捐献后，为该供体提供样品收集试剂盒(例如，样品自收集试剂盒)。样品收集试剂盒可以包括供体说明书、用于测序分析的阴道DNA/RNA收集试剂盒(例如，OMNIgene阴道收集试剂盒ORM-130，可商购于DNAgeneotekTM公司)以及样本收集和运输试剂盒(例如，eSwab 480C科潘液体艾米斯洗脱拭子收集和运输系统，可商购于科潘诊断公司(Copan Diagnostics))。可以要求供体签署知情同意书。可以要求每名供体收集两份样品。第一份样品用于测序分析。例如，洗手后，来自阴道DNA/RNA收集试剂盒的拭子可用于通过将该拭子插入阴道几英寸并且擦拭阴道壁约20秒来收集阴道样本。然后可以将该拭子插入至含有稳定性缓冲液的管中，并且可以进一步分析该管/样本。第二份样品可用于培养阴道微生物。例如，来自样本收集和运输试剂盒的拭子可用于收集阴道样本。然后将该拭子插入至包含液体艾米斯溶液(例如，其可以保存需氧、厌氧和难养菌长达48个小时)的管中。收集后，供体将样品管和材料放置在生物危害品袋中，然后将样本放入捐献物设施中。
为了处理样品进行测序(例如，鸟枪法测序)，首先可以使用无菌的达到PCR标准的水使蛋白酶(例如，QIAGEN蛋白酶)再水合，以产生80mg/mL溶液(这可以包括将样品倒置10次或更多次)。可以从冰箱中取出样品(例如，阴道DNA/RNA收集试剂盒样品)并且涡旋30秒。可以摇晃收集管三次以使含有样品的溶液到达管底部。可以将五微升的再水合蛋白酶添加至含有阴道拭子样品的收集管中。可以将样品倒置10次或更多次。然后将样品在50℃培养箱内孵育2个小时。然后将样品涡旋30秒。然后可以摇晃收集管三次以使包含样品的溶液到达管底部。可以从管中取出拭子(其可以包括将拭子按压在管侧面，以回收被吸收至拭子中的样品)。可以将500微升样品等分至两个冷冻管(每一个都是2mL)中进行储存，并且可以在-80℃下储存样品直到准备好测序分析(其可以在合适的处理/分析设施(如DivergentTM，圣保罗，明尼苏达州)中进行)。
为了处理样品用于培养，可以将样品(例如，样本收集和运输试剂盒样品)放置在厌氧培养室的气闸中并引入培养室中。拭子仍处于原来的位置时，可以将管剧烈地涡旋5秒以从拭子尖端释放样品。这是未稀释的或是100稀释液。然后可以移除拭子。可以通过将100微升样品转移至含有900微升无菌生理盐水(0.9％)的管中对样品进行10倍的连续稀释。可以将样品剧烈地涡旋5秒并且/或者通过倒置混合。这是10-1稀释液。可以将100微升的10-1稀释液转移至新的含有900微升无菌生理盐水(0.9％)的管中。可以将样品剧烈地涡旋5秒并且/或者通过倒置混合。这是10-2稀释液。可以重复此过程直到已将样本稀释至10-6稀释液。
一式三份，可以在CDC厌氧菌5％绵羊血琼脂、De Man，Rogosa和Sharpe(MRS)琼脂以及50％MRS琼脂板上从以下稀释管制备涂布板：10-3、10-4、10-5。简言之，可以从适当的管中直接将100μL转移至琼脂板的表面，并且使用无菌的L形涂布器和板旋转器将接种物涂布在整个板表面。可以将板在35℃于缺氧条件下孵育24-120小时。可以每天检查板上新菌落的出现。如果板开始变干，则用石蜡膜将它们包裹住。可以观察菌落并且可以记录集落数和形态(其可以包括对板进行捕获拍照以辅助记录菌落形态)。可以选择用于进一步表征的单个菌落并在新板上划线。如果需要，可以利用选择性培养基，如双歧杆菌选择性琼脂(BSA)、肠球菌琼脂(ECA)、溴化十六烷基三甲铵琼脂(CA)、甘露醇盐琼脂(MSA)等。
在一些情况下，可以利用革兰氏染色。当这样做时，可以将样本应用到载玻片上。如果对液体培养物进行染色，可以使用无菌接种环将培养物直接应用在载玻片上作为涂片。如果对来自板的菌落进行染色，可以使用接种环将一滴无菌盐水滴加在载玻片中心，然后可以收集少量的单一菌落并将其添加至该液滴中。如有可能，可以温和地将液滴和样品混合以产生薄的、均一的涂片。可以使液滴干燥。可以通过用无水甲醇浸没1-2分钟将载玻片用甲醇固定，然后用自来水冲洗。可以用初染剂(例如，结晶紫)将固定的涂片浸没1分钟。可以通过用自来水温和地冲洗去除初染剂。可以用第二染剂/媒染剂(例如，革兰氏碘)将固定的涂片浸没1分钟，随后用自来水温和地冲洗。可以将载玻片脱色，直到从载玻片流出的溶剂无色(例如，约3-60秒)，并且可以用自来水温和地洗涤载玻片。然后可以用复染剂(例如，番红；如果最初的复染结果令人不满意，则碱性品红可以被取代)将载玻片浸没1分钟。可以用自来水洗涤载玻片并且使其干燥。可以在油浸透镜下对涂片进行示例说明，并且可以记录结果/观察情况。
可以进行其他的样品测试(包括过氧化氢酶测试)，过氧化氢酶测试可以包括添加过氧化氢以区分葡萄球菌和链球菌。可以进行的另一个样品测试可以包括凝固酶测试，其可以包括添加血浆以区分葡萄球菌和链球菌。
可以对确定为乳酸杆菌的分离株进一步表征，以确定它们的抗生素敏感性特征。这可以包括将来自过夜板的乳酸杆菌菌落悬浮在由90％Iso-sensitest肉汤和10％MRS肉汤组成的肉汤中，直到悬浮液与为1的马克法兰氏(McFarland)标准相当。然后，可以将无菌拭子浸入接种物中，并且挤压管壁以消除过量的液体。可以用拭子在整个琼脂表面划线(旋转两次或更多次以确保均匀分布)。使过量的水分被吸收后，可以应用最低抑菌浓度(MIC)试纸条(例如，其可以包括将带有朝上刻度的试纸条和试纸条的代码应用于该位置的外侧)。可以将试纸条按压在琼脂表面，同时确保抗生素梯度的全长完全与琼脂表面接触(如果需要，重新定位)。可以将板倒置并且在35℃下孵育24-48小时(或更长)。可以对这些结果进行解释说明。
可以将分离的菌株冷冻保存并储存。这可以包括用从划线板选择的良好分离的菌落接种过夜培养物。如果要选择许多菌落，可以使用96孔板的规格。可以使用合适的肉汤(例如，乳酸杆菌可能使用MRS)。可以使培养物在35℃下于厌氧培养室培养箱中孵育过夜。如果在第二天早上培养物不混浊，则可以利用额外的时间进行孵育。一旦培养物出现肉眼可见的混浊，可以将200-300微升转移至含有冷冻保护剂(例如，50-60微升50％的甘油)的新96孔板中。甘油的最终浓度可以是10％。可以将96孔板密封并在-80℃冷冻机中储存。
如本文建议的，可以将单个微生物菌株(例如，单个细菌菌株或物种)从拭子分离。这可以包括一个或多个过程，在对想要的菌株具有选择性的琼脂培养基上进行铺板，随后“纯化”菌株作为单一菌落分离物。可以使单个微生物菌株生长/培养，并且可以通过以下进行物种鉴定/表征：测序、生化测试、菌落形态学、细胞形态学、微观死亡率和对不同代表性抗生素的敏感性。微生物菌株可以改变。在一些情况下，微生物菌株可以包括以下中的一种或多种：卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、阴道乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌、阴道加德纳菌，非乳酸杆菌的细菌：阴道阿托波氏菌、二路普雷沃菌，以下这些属的其他物种：巨型球菌属、纤毛菌属、小杆菌属、嗜胨菌属、真菌、其组合等。
考虑的阴道微生物群组合物包括单一分离的菌株或两种或更多种分离的菌株的混合物。实例组合物可以包括约20％-85％卷曲乳杆菌、或约25％-75％卷曲乳杆菌、或约30％-60％卷曲乳杆菌、或约40％卷曲乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约10％-50％惰性乳杆菌、或约10％-40％惰性乳杆菌、或约15％-30％惰性乳杆菌、或约20％惰性乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约1％-10％格氏乳杆菌、或约2％-8％格氏乳杆菌、或约5％格氏乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约1％-10％詹氏乳杆菌、或约2％-8％詹氏乳杆菌、或约5％詹氏乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％罗伊氏乳杆菌、或约0.5％-4％罗伊氏乳杆菌、或约1％罗伊氏乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％嗜酸乳杆菌、或约0.5％-4％嗜酸乳杆菌、或约1％嗜酸乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％阴道乳杆菌、或约0.5％-4％阴道乳杆菌、或约1％阴道乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％鼠李糖乳杆菌、或约0.5％-4％鼠李糖乳杆菌、或约1％鼠李糖乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％约氏乳杆菌、或约0.5％-4％约氏乳杆菌、或约1％约氏乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％瑞士乳杆菌、或约0.5％-4％瑞士乳杆菌、或约1％瑞士乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％植物乳杆菌、或约0.5％-4％植物乳杆菌、或约1％植物乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％发酵乳杆菌、或约0.5％-4％发酵乳杆菌、或约1％发酵乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％唾液乳杆菌、或约0.5％-4％唾液乳杆菌、或约1％唾液乳杆菌。在一些此类情况和在其他情况中(例如，除任何一种或多种以上列出的微生物外或在替代方案中)，实例组合物可以包括约0.1％-5％戴耳布吕克氏乳杆菌、或约0.5％-4％戴耳布吕克氏乳杆菌、或约1％戴耳布吕克氏乳杆菌。
实例组合物可以包括约40％卷曲乳杆菌、约20％惰性乳杆菌、约5％格氏乳杆菌、约5％詹氏乳杆菌、约1％罗伊氏乳杆菌、约1％嗜酸乳杆菌、约1％阴道乳杆菌、约1％鼠李糖乳杆菌、约1％约氏乳杆菌、约1％瑞士乳杆菌、约1％植物乳杆菌、约1％发酵乳杆菌、约1％唾液乳杆菌以及约1％戴耳布吕克氏乳杆菌。
实例组合物可以包括卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。例如，组合物可以包括约20％-85％卷曲乳杆菌、或约25％-75％卷曲乳杆菌、或约30％-60％卷曲乳杆菌、或约40％卷曲乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％格氏乳杆菌、或约2％-8％格氏乳杆菌、或约5％格氏乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％詹氏乳杆菌、或约2％-8％詹氏乳杆菌、或约5％詹氏乳杆菌。组合物可以包括约0.1％-5％鼠李糖乳杆菌、或约0.5％-4％鼠李糖乳杆菌、或约1％鼠李糖乳杆菌。在一些情况下，每种组分都可以是冻干的。实例组合物中微生物的总数可以近似于约1x105至1x1015CFU、或约1x106至1x1012CFU、或约1x107至1x1010CFU。可以将组合物置于合适的递送媒介物中，例如胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类。在一些情况下，组合物可以口服施用。在其他情况下，组合物可以局部施用(例如，通过将胶囊、栓剂、可溶性壳等插入阴道内)。
实例组合物可以包括具有所希望的特性的卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株。例如，可以选择每种组分的菌株以具有降低pH的活性、产生乳酸、对其他微生物具有抑制活性、具有其他独特活性、其组合和/或诸如此类。
实例组合物可以包括冻干的卷曲乳杆菌、冻干格氏乳杆菌、冻干詹氏乳杆菌和冻干鼠李糖乳杆菌的混合物。每种组分都可以从供体分离。例如，组合物可以包括约20％-85％卷曲乳杆菌、或约25％-75％卷曲乳杆菌、或约30％-60％卷曲乳杆菌、或约40％卷曲乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％格氏乳杆菌、或约2％-8％格氏乳杆菌、或约5％格氏乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％詹氏乳杆菌、或约2％-8％詹氏乳杆菌、或约5％詹氏乳杆菌。组合物可以包括约0.1％-5％鼠李糖乳杆菌、或约0.5％-4％鼠李糖乳杆菌、或约1％鼠李糖乳杆菌。每种组分都可以从供体样本衍生/分离。实例组合物中微生物的总数可以近似于约1x105至1x1015CFU、或约1x106至1x1012CFU、或约1x107至1x1010CFU。可以将组合物置于合适的递送媒介物中，例如胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类。在一些情况下，组合物可以口服施用。在其他情况下，组合物可以局部施用(例如，通过将胶囊、栓剂、可溶性壳等插入阴道内)。
实例组合物可以包括冻干的卷曲乳杆菌、冻干格氏乳杆菌、冻干詹氏乳杆菌和冻干鼠李糖乳杆菌的混合物。每种组分都可以从供体分离。例如，组合物可以包括约20％-85％卷曲乳杆菌、或约25％-75％卷曲乳杆菌、或约30％-60％卷曲乳杆菌、或约40％卷曲乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％格氏乳杆菌、或约2％-8％格氏乳杆菌、或约5％格氏乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％詹氏乳杆菌、或约2％-8％詹氏乳杆菌、或约5％詹氏乳杆菌。组合物可以包括约0.1％-5％鼠李糖乳杆菌、或约0.5％-4％鼠李糖乳杆菌、或约1％鼠李糖乳杆菌。每种组分都可以从细菌培养物衍生。实例组合物中微生物的总数可以近似于约1x105至1x1015CFU、或约1x106至1x1012CFU、或约1x107至1x1010CFU。可以将组合物置于合适的递送媒介物中，例如胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类。在一些情况下，组合物可以口服施用。在其他情况下，组合物可以局部施用(例如，通过将胶囊、栓剂、可溶性壳等插入阴道内)。
实例组合物可以包括冻干的卷曲乳杆菌、冻干格氏乳杆菌、冻干詹氏乳杆菌和冻干鼠李糖乳杆菌的混合物。每种组分都可以从供体分离。例如，组合物可以包括约20％-85％卷曲乳杆菌、或约25％-75％卷曲乳杆菌、或约30％-60％卷曲乳杆菌、或约40％卷曲乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％格氏乳杆菌、或约2％-8％格氏乳杆菌、或约5％格氏乳杆菌。组合物可以包括约1％-10％詹氏乳杆菌、或约2％-8％詹氏乳杆菌、或约5％詹氏乳杆菌。组合物可以包括约0.1％-5％鼠李糖乳杆菌、或约0.5％-4％鼠李糖乳杆菌、或约1％鼠李糖乳杆菌。一种或多种组分可以从供体样本衍生/分离，以及一种或多种组分可以从细菌培养物衍生。实例组合物中微生物的总数可以近似于约1x105至1x1015CFU、或约1x106至1x1012CFU、或约1x107至1x1010CFU。可以将组合物置于合适的递送媒介物中，例如胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类。在一些情况下，组合物可以口服施用。在其他情况下，组合物可以局部施用(例如，通过将胶囊、栓剂、可溶性壳等插入阴道内)。
实例组合物可以包括具有所希望的特性的卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株。例如，可以选择每种组分的菌株以具有降低pH的活性、产生乳酸、对其他微生物具有抑制活性、具有其他独特活性、其组合和/或诸如此类。
如上所述，实例组合物中微生物的总数可以近似于约1x105至1x1015CFU、或约1x106至1x1012CFU、或约1x107至1x1010CFU。这可以对应于单一胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类中微生物的总数。可替代地，这可以对应于合适剂量的组合物(例如，其可以包括一种或多种胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类)中微生物的总数。
可以将单一胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类描述为包封的药物产品或剂量，该包封的药物产品或剂量可以向患者施用。这可以包括使用合适的给药方案向患者施用此剂量。这可以包括向患者施用一个或多个剂量。例如，可以向患者施用1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个剂量。在一些此类情况和在其他情况中，包封的药物产品可以在一天或更多天内向患者施用。例如，这些剂量可以在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天内施用。在一些此类情况和在其他情况中，这些剂量可以向患者每天一次或多次施用于患者。例如，这些剂量可以每天向患者施用1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。
一种实例给药方案可以包括每天两次向患者施用两个剂量，持续两天。另一种实例给药方案可以包括每天两次向患者施用四个剂量，持续两天。另一种实例给药方案可以包括每天两次向患者施用四个剂量，持续四天。另一种实例给药方案可以包括每天给予患者两个剂量，持续四天。另一种实例给药方案可以包括每天给予患者一个剂量，持续八天。这些仅是实例。在至少一些此类实例中，每个剂量都可以包括包含卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的混合物的冻干材料。
在至少一些情况中，阴道微生物群组合物可以不含来自纤毛菌属、巨型球菌属、奇异菌属、嗜胨菌属、小杆菌属、普雷沃菌属和/或加德纳菌属的细菌。例如，阴道微生物群组合物可以不含来自奇异菌属、加德纳菌属和普雷沃菌属的细菌。
本文披露的阴道微生物群组合物可用于治疗多种不同的健康病症。例如，阴道微生物群组合物可用于治疗细菌性阴道病、治疗念珠菌感染、治疗人乳头瘤病毒感染、治疗尿路感染、治疗性传播感染、治疗妇科癌症(例如，宫颈癌)、减少和/或预防早产、减少和/或预防流产、治疗不孕症、治疗间质性膀胱炎、治疗多囊卵巢综合征等。
还考虑的阴道微生物群组合物包括与一种或多种另外的微生物(例如，如从供体收集和分离的那些)组合或混合的全谱阴道微生物群的组合。出于本披露的目的，全谱阴道微生物群可理解为存在于典型女性阴道中的微生物的集合。目的不是对全谱阴道微生物群进行操作以改变样品中任何特定微生物的存在或缺乏，而是旨在代表样品中的全部生物群体。可以理解，阴道微生物群的组成可能因人而异。因此，全谱阴道微生物群可能具有差异。在一些情况下，考虑的阴道微生物群组合物包括与以下中的一种或多种组合、混合或掺杂的全谱阴道微生物群：卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、阴道乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌。在至少一些情况中，全谱阴道微生物群和另外的微生物都来源于阴道微生物群供体。
可以将细菌/微生物置于合适的容器(例如胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类)中，用于口服或局部递送。在一些情况下，可以将模拟阴道液掺入阴道微生物群组合物中。在一些此类情况和在其他情况中，阴道微生物群组合物可以包括糖原。包含在容器/栓剂中的总体积可以近似于约100微升至约10毫升。
在至少一些情况中，阴道微生物群组合物中的细菌/微生物可以包括冻干的细菌/微生物。这可以包括冻干过程，其中将细菌/微生物冷冻干燥。可以将细菌/微生物和/或冻干的细菌/微生物置于合适的容器(例如胶囊、栓剂、可溶性壳和/或诸如此类)中，用于口服或局部递送。
患者的治疗可以包括向患者施用阴道微生物群组合物。一个治疗目的可以是通过用阴道微生物群组合物有效地代替患者的阴道微生物群以使患者的阴道微生物群标准化。这可以包括通过植入、以栓剂或另一种合适的施用途径，向患者阴道直接施用阴道微生物群组合物。
在至少一些情况中，多种阴道微生物群组合物可以储存于或存入合适的储存设备/设施中。储存设备可以包括温度控制设备，如冷冻设备(例如，4℃冷冻设备)、冷冻机(例如-20℃冷冻机)、深度冷冻机(例如，-80℃冷冻机)等。在一些情况下，索引系统还可以连接至阴道微生物群组合物库或以其他方式与阴道微生物群组合物库相关联。索引系统可以包括可用于与来自包括合适患者的给定供体的阴道微生物群组合物相匹配的数据，如供体数据。供体数据可以包括收集时的年龄、收集时的生殖状态(非绝经期的、绝经期的)、种族、收集时的月经阶段、细菌性阴道病史、念珠菌感染史、人乳头瘤病毒史、其他病史(例如，艰难梭菌感染史、癌症诊断/治疗史等)、其组合和/或诸如此类。临床医生可以利用供体数据来调整特定患者的治疗方案。例如，细菌性阴道病患者可以用阴道微生物群组合物治疗，该阴道微生物群组合物衍生自具有细菌性阴道病成功缓解史的供体。
在一些情况下，供体数据可以包括妊娠史。例如，一些供体当寻求怀孕或以其他方式具有真实或感知的生育能力升高时，这些供体可能具有高概率怀孕史。为了试图增加或提高患者的生育能力，可以向正在经历生育挑战的患者施用包括来自此类供体的微生物的阴道微生物群组合物。在此类情况下，阴道微生物群组合物可以作为口服胶囊施用。可替代地，阴道微生物群组合物可以作为植入物和/或以其他方式直接插入患者阴道中施用。
美国专利号9,675,648通过引用并入本文。
美国专利号9,629,881通过引用并入本文。
美国专利号10,226,431通过引用并入本文。
美国专利申请公开号US 2018/0289750通过引用并入本文。
实例
可以通过参考以下实例进一步阐明本披露，这些实例本质上是预测性的并用于举例说明一些实施例，并且不以任何方式限制本披露。
实例1
可以制造阴道微生物群组合物。阴道微生物群组合物包括细菌混合物，该细菌混合物包括约40％卷曲乳杆菌、约20％惰性乳杆菌、约5％格氏乳杆菌、约5％詹氏乳杆菌、约1％罗伊氏乳杆菌、约1％嗜酸乳杆菌、约1％阴道乳杆菌、约1％鼠李糖乳杆菌、约1％约氏乳杆菌、约1％瑞士乳杆菌、约1％植物乳杆菌、约1％发酵乳杆菌、约1％唾液乳杆菌以及约1％戴耳布吕克氏乳杆菌。
可以将细菌混合物置于栓剂中。包含在栓剂中的总体积(例如，包括细菌混合物的材料的体积)可以近似于约100微升至约10毫升。
可以向患者施用栓剂。例如，可以向患者施用栓剂以治疗细菌性阴道病、念珠菌感染、人乳头瘤病毒感染、尿路感染、性传播感染和妇科癌症中的一种或多种。
可以向患者施用栓剂。例如，可以向患者施用栓剂以预防早产、预防流产、治疗不孕症、治疗间质性膀胱炎、治疗多囊卵巢综合征和/或其组合。
实例2-用于在阴道微生物群组合物中使用的实例詹氏乳杆菌菌株
詹氏乳杆菌的菌株(指定为菌株8001-D01-M006)是从在捐赠期间保藏的(例如，如本文所述捐赠的)供体样本分离的。供体通过捐献阴道拭子尿液样本获得资格，这些阴道拭子尿液样本被提交至Fairview诊断实验室进行革兰氏染色和Nugent评分(GRAM)以及测试以下STI：阴道毛滴虫(TVPCR)、淋病奈瑟菌(GCPCR)和沙眼衣原体(CHPCR)。
在为8001-D01-M006制备工作细胞贮存液期间，不是针对设定的培养细胞密度，而是通过从先前制备的划线板中选择单一良好分离的菌落开始过夜培养。第二天早上，将该过夜培养物按1:5稀释到新鲜的肉汤中，并且允许其至少生长4小时，然后将培养物与甘油组合以制备10％甘油贮存液。通常，以这种方式制备甘油贮存液产生了具有约1x109CFU/ml细胞密度的贮存液。
提供OmniGene和ESwab阴道拭子样本(8001-D01)用于宏基因组学测序(OmniGene)，以及培养和qPCR鉴定测试(ESwab)。将用于培养和qPCR鉴定测试的ESwab样本8001-D01引入厌氧培养室中。短暂涡旋ESwab样本，然后去除50μL样品。将样品等分试样通过离心进行沉淀。从沉淀中提取DNA，并且通过qPCR评估样品以确定乳酸杆菌物种的身份。
从原始的ESwab样本中去除另外的100μL样品。将等分试样进行10倍连续稀释，然后将来自10-3、10-4和10-5稀释液的100μL涂布在MRS琼脂上，然后在35℃下孵育24-72小时。
在琼脂板上通过菌落形态和革兰氏染色鉴定假定的乳酸杆菌。使用无菌的牙签挑取具有与假定乳酸杆菌菌落形态相匹配的菌落形态的单个菌落，然后在96深孔板的孔中接种MRS肉汤前，将这些单个菌落贴片在新鲜的MRS琼脂、LAMVAB琼脂(乳酸杆菌选择性培养基)上。将含有在MRS肉汤中生长的乳酸杆菌的96深孔板孵育24小时。将贴片板在35℃下孵育24-72小时。
从一个原始的MRS琼脂稀释板上挑取出菌株8001-D01-M006，涂布在MRS琼脂贴片板上的6号网格点上、LAMVAB板上的6号网格点上，并且接种至孔F7的MRS肉汤中。将在96深孔板的孔F7中生长的菌株8001-D01-M006的肉汤培养物转移至96孔PCR板的孔F7中以及两个96孔微量滴定板的孔F7(孔中含有50％甘油，使得添加了8001-D01-M006培养物后，最终的甘油浓度为10％)中。将等分至96孔PCR板的培养物进行沉淀，提取DNA，并且通过qPCR测试样品以确定乳酸杆菌物种的身份(在可能的情况下)。通过qPCR确定菌株8001-D01-M006是詹氏乳杆菌。用粘合箔密封纸将含有培养物和10％甘油的这2个96孔微量滴定板(冷冻保存板)密封，然后将其在-70℃或-70℃以下冷冻储存。
从冷冻的96孔微量滴定板恢复菌株8001-D01-M006用于扩增和表征。将含有培养物和10％甘油的一个96孔微量滴定板引入厌氧培养室中，并且使其在室温下解冻1小时。通过吸移将孔F7中的培养物温和地混合，然后在MRS琼脂上划线进行分离。将板在35℃下孵育24-72小时。
从划线板选择单一良好分离的菌落，并且用于在预减少的MRS肉汤中接种过夜培养物(在35℃下持续18-24小时)。第二天，将过夜培养物稀释到新鲜的MRS肉汤中，使其孵育约4小时，然后与50％甘油组合(最终浓度为10％甘油，等分至冻存管中，1mL/管)，并在-70℃或-70℃以下冷冻储存。
使用预减少的MRS琼脂和肉汤分离和繁殖菌株8001-D01-M006。在P249-01样本培养工作表上记录样本8001-D01使用的培养基批次。将针对每个批次的MRS肉汤和MRS琼脂所完成的培养基制备工作表存储在P249活页夹中。简言之，使用哈帝诊断公司(HardyDiagnostic)的CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤自行制备MRS琼脂和MRS肉汤生长培养基，该CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤包含以下组分(克重/升)：右旋糖(20.0g)、动物组织胃蛋白酶消化物(10.0g)、牛肉提取物(10.0g)、酵母提取物(5.0g)、醋酸钠(5.0g)、磷酸二钠(2.0g)、柠檬酸铵(2.0g)、吐温80(1.0g)、硫酸镁(0.1g)和硫酸锰(0.05g)。MRS琼脂板使用相同的CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤作为基础成分，并且包括15g/LBDDifco琼脂。MRS肉汤和琼脂还含有0.5g/L的L-半胱氨酸。
已通过qPCR和Strainview测序鉴定了该菌株8001-D01-M006。qPCR方法通过比较从未知的分离物和已知的阳性对照菌株产生的扩增子的熔解曲线特征来检测乳酸杆菌属和七(7)种不同的乳酸杆菌物种(瑞士乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌和瑞士乳杆菌)。由Diversigen公司进行Strainview测序。当使用Strainview管道(pipeline)分析时，发现菌株含有零抗生素抗性基因和零致病基因。
菌株8001-D01-M006可以是可用于阴道微生物群组合物的合适的詹氏乳杆菌菌株的实例。
实例3-用于在阴道微生物群组合物中使用的实例格氏乳杆菌菌株
格氏乳杆菌的菌株(指定为菌株8018-IN-M001)是从在捐赠期间保藏的(例如，如本文所述捐赠的)供体样本分离的。供体已通过捐献阴道拭子尿液样本获得资格，这些阴道拭子尿液样本被提交至Fairview诊断实验室进行革兰氏染色和Nugent评分(GRAM)以及测试以下STI：阴道毛滴虫(TVPCR)、淋病奈瑟菌(GCPCR)和沙眼衣原体(CHPCR)。
在为8018-IN-M001制备工作细胞贮存液期间，不是针对设定的培养细胞密度，而是通过从先前制备的划线板中选择单一良好分离的菌落开始过夜培养。第二天早上，将该过夜培养物按1:5稀释到新鲜的肉汤中，并且允许其至少生长4小时，然后将培养物与甘油组合以制备10％甘油贮存液。通常，以这种方式制备甘油贮存液产生了具有约1x108至7x108CFU/ml细胞密度的贮存液。
提供OmniGene和ESwab阴道拭子样本(8018-IN)用于宏基因组学测序(OmniGene)，以及培养和qPCR鉴定测试(ESwab)。将用于培养和qPCR鉴定测试的ESwab样本8018-IN引入厌氧培养室中。短暂涡旋ESwab样本，然后去除50μL样品。将样品等分试样通过离心进行沉淀。从沉淀中提取DNA，并且通过qPCR评估样品以确定乳酸杆菌物种的身份。
从原始的ESwab样本中去除另外的100μL样品。将等分试样进行10倍连续稀释，然后将来自10-3、10-4和10-5稀释液的100μL涂布在MRS琼脂上，然后在35℃下孵育24-72小时。
在琼脂板上通过菌落形态和革兰氏染色鉴定假定的乳酸杆菌。使用无菌的牙签挑取具有与假定乳酸杆菌菌落形态相匹配的菌落形态的单个菌落，然后在96深孔板的孔中接种MRS肉汤前，将这些单个菌落贴片在新鲜的MRS琼脂、LAMVAB琼脂(乳酸杆菌选择性培养基)上。将含有在MRS肉汤中生长的乳酸杆菌的96深孔板孵育24小时。将贴片板在35℃下孵育24-72小时。
从一个原始的MRS琼脂稀释板上挑取出菌株8018-IN-M001，涂布在MRS琼脂贴片板上的1号网格点上、LAMVAB板上的1号网格点上，并且接种至孔A7的MRS肉汤中。将在96深孔板的孔A7中生长的菌株8018-IN-M001的肉汤培养物转移至96孔PCR板的孔A7中以及两个96孔微量滴定板的孔A7中(孔中含有50％甘油，使得添加了8018-IN-M001培养物后，最终的甘油浓度为10％)。将等分至96孔PCR板的培养物进行沉淀，提取DNA，并且通过qPCR测试样品以确定乳酸杆菌物种的身份(在可能的情况下)。通过qPCR确定菌株8018-IN-M001是格氏乳杆菌。用粘合箔密封纸将含有培养物和10％甘油的这2个96孔微量滴定板(冷冻保存板)密封，然后将其在-70℃或-70℃以下冷冻储存。
从冷冻的96孔微量滴定板恢复菌株8018-IN-M001用于扩增和表征。将含有培养物和10％甘油的一个96孔微量滴定板引入厌氧培养室中，并且使其在室温下解冻1小时。通过吸移将孔A7中的培养物温和地混合，然后在MRS琼脂上划线进行分离。将板在35℃下孵育24-72小时。
从划线板选择单一良好分离的菌落，并且用于在预减少的MRS肉汤中接种过夜培养物(在35℃下持续18-24小时)。第二天，将过夜培养物稀释到新鲜的MRS肉汤中，使其孵育约4小时，然后与50％甘油组合(最终浓度为10％甘油，等分至冻存管中，1mL/管)，并在-70℃或-70℃以下冷冻储存。
使用预减少的MRS琼脂和肉汤分离和繁殖菌株8018-IN-M001。在P249-01样本培养工作表上记录样本8018-IN使用的培养基批次。将针对每个批次的MRS肉汤和MRS琼脂所完成的培养基制备工作表存储在P249活页夹中。简言之，使用哈帝诊断公司的CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤自行制备MRS琼脂和MRS肉汤生长培养基，该CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤包含以下组分(克重/升)：右旋糖(20.0g)、动物组织胃蛋白酶消化物(10.0g)、牛肉提取物(10.0g)、酵母提取物(5.0g)、醋酸钠(5.0g)、磷酸二钠(2.0g)、柠檬酸铵(2.0g)、吐温80(1.0g)、硫酸镁(0.1g)和硫酸锰(0.05g)。MRS琼脂板使用相同的CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤作为基础成分，并且包括15g/L BD Difco琼脂。MRS肉汤和琼脂还含有0.5g/L的L-半胱氨酸。
已通过qPCR和Strainview测序鉴定了该菌株8018-IN-M001。qPCR方法通过比较从未知的分离物和已知的阳性对照菌株产生的扩增子的熔解曲线特征来检测乳酸杆菌属和七(7)种不同的乳酸杆菌物种(瑞士乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌和瑞士乳杆菌)。由Diversigen公司进行Strainview测序。当使用Strainview管道分析时，发现菌株含有零抗生素抗性基因和零致病基因。
菌株8018-IN-M001可以是可用于阴道微生物群组合物的合适的格氏乳杆菌菌株的实例。
实例4-用于在阴道微生物群组合物中使用的实例卷曲乳杆菌菌株
卷曲乳杆菌的菌株(指定为菌株8001-D01-M004)是从在捐赠期间保藏的(例如，如本文所述捐赠的)供体样本分离的。供体已通过捐献阴道拭子尿液样本获得资格，这些阴道拭子尿液样本被提交至Fairview诊断实验室进行革兰氏染色和Nugent评分(GRAM)以及测试以下STI：阴道毛滴虫(TVPCR)、淋病奈瑟菌(GCPCR)和沙眼衣原体(CHPCR)。
在为8001-D01-M004制备工作细胞贮存液期间，不是针对设定的培养细胞密度，而是通过从先前制备的划线板中选择单一良好分离的菌落开始过夜培养。第二天早上，将该过夜培养物按1:5稀释到新鲜的肉汤中，并且允许其至少生长4小时，然后将培养物与甘油组合以制备10％甘油贮存液。通常，以这种方式制备甘油贮存液产生了具有约1x107至1x109CFU/ml细胞密度的贮存液。
提供OmniGene和ESwab阴道拭子样本(8001-D01)用于宏基因组学测序(OmniGene)，以及培养和qPCR鉴定测试(ESwab)。将用于培养和qPCR鉴定测试的ESwab样本8001-D01引入厌氧培养室中。短暂涡旋ESwab样本，然后去除50μL样品。将样品等分试样通过离心进行沉淀。从沉淀中提取DNA，并且通过qPCR评估样品以确定乳酸杆菌物种的身份。
从原始的ESwab样本中去除另外的100μL样品。将等分试样进行10倍连续稀释，然后将来自10-3、10-4和10-5稀释液的100μL涂布在MRS琼脂上，然后在35℃下孵育24-72小时。
在琼脂板上通过菌落形态和革兰氏染色鉴定假定的乳酸杆菌。使用无菌的牙签挑取具有与假定乳酸杆菌菌落形态相匹配的菌落形态的单个菌落，然后在96深孔板的孔中接种MRS肉汤前，将这些单个菌落贴片在新鲜的MRS琼脂、LAMVAB琼脂(乳酸杆菌选择性培养基)上。将含有在MRS肉汤中生长的乳酸杆菌的96深孔板孵育24小时。将贴片板在35℃下孵育24-72小时。
从一个原始的MRS琼脂稀释板上挑取出菌株8001-D01-M004，涂布在MRS琼脂贴片板上的4号网格点上、LAMVAB板上的4号网格点上，并且接种至孔D7的MRS肉汤中。将在96深孔板的孔D7中生长的菌株8001-D01-M004的肉汤培养物转移至96孔PCR板的孔D7中以及两个96孔微量滴定板的孔D7中(孔中含有50％甘油，使得添加了8001-D01-M004培养物后，最终的甘油浓度为10％)。将等分至96孔PCR板的培养物进行沉淀，提取DNA，并且通过qPCR测试样品以确定乳酸杆菌物种的身份(在可能的情况下)。通过qPCR确定菌株8001-D01-M004是卷曲乳杆菌。用粘合箔密封纸将含有培养物和10％甘油的这2个96孔微量滴定板(冷冻保存板)密封，然后将其在-70℃或-70℃以下冷冻储存。
从冷冻的96孔微量滴定板恢复菌株8001-D01-M004用于扩增和表征。将含有培养物和10％甘油的一个96孔微量滴定板引入厌氧培养室中，并且使其在室温下解冻1小时。通过吸移将孔D7中的培养物温和地混合，然后在MRS琼脂上划线进行分离。将板在35℃下孵育24-72小时。
从划线板选择单一良好分离的菌落，并且用于在预减少的MRS肉汤中接种过夜培养物(在35℃下持续18-24小时)。第二天，将过夜培养物稀释到新鲜的MRS肉汤中，使其孵育约4小时，然后与50％甘油组合(最终浓度为10％甘油，等分至冻存管中，1mL/管)，并在-70℃或-70℃以下冷冻储存。
使用预减少的MRS琼脂和肉汤分离和繁殖菌株8001-D01-M004。在P249-01样本培养工作表上记录样本8001-D01使用的培养基批次。将针对每个批次的MRS肉汤和MRS琼脂所完成的培养基制备工作表存储在P249活页夹中。简言之，使用哈帝诊断公司的CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤自行制备MRS琼脂和MRS肉汤生长培养基，该CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤包含以下组分(克重/升)：右旋糖(20.0g)、动物组织胃蛋白酶消化物(10.0g)、牛肉提取物(10.0g)、酵母提取物(5.0g)、醋酸钠(5.0g)、磷酸二钠(2.0g)、柠檬酸铵(2.0g)、吐温80(1.0g)、硫酸镁(0.1g)和硫酸锰(0.05g)。MRS琼脂板使用相同的CriterionTM乳酸杆菌MRS肉汤作为基础成分，并且包括15g/L BD Difco琼脂。MRS肉汤和琼脂还含有0.5g/L的L-半胱氨酸。
已通过qPCR和Strainview测序鉴定了该菌株8001-D01-M004。qPCR方法通过比较从未知的分离物和已知的阳性对照菌株产生的扩增子的熔解曲线特征来检测乳酸杆菌属和七(7)种不同的乳酸杆菌物种(瑞士乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、惰性乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌和瑞士乳杆菌)。由Diversigen公司进行Strainview测序。当使用Strainview管道分析时，发现菌株含有零抗生素抗性基因和零致病基因。
菌株8001-D01-M004可以是可用于阴道微生物群组合物的合适的卷曲乳杆菌菌株的实例。
实例5-用于在阴道微生物群组合物中使用的实例鼠李糖乳杆菌菌株
实例鼠李糖乳杆菌菌株(指定为菌株BPL5)披露于美国专利号10,588,926(其全部内容通过引用并入本文)中。
菌株BPL5可以是可用于阴道微生物群组合物的合适的鼠李糖乳杆菌菌株的实例。
实例6-当在MRS肉汤中厌氧生长48小时时的菌株的降低pH能力和乳酸产生
评估菌株BPL5(鼠李糖乳杆菌；实例6)、8001-D01-M006(詹氏乳杆菌；实例2)、8001-D01-M004(瑞士乳杆菌；实例4)和8018-IN-M001(格氏乳杆菌；实例3)在体外随时间降低MRS肉汤pH的能力。为了评估pH的降低，在MRS肉汤中接种每种菌株，并且生长过夜(在缺氧条件下)。第二天，将过夜培养物的OD600nm调整为大约1.0(这相当于约1x108CFU/mL)，然后进一步稀释到新鲜的MRS肉汤中(目标起始浓度约1x106CFU/mL(对于8001-D01-M006、8001-D01-M004和8018-IN-M001))。单独地并且以不同的起始浓度(约1x107CFU/mL)测试菌株BPL5。将所有培养物厌氧孵育48小时，在生长0小时和48小时后收集样品的pH。所有菌株48小时后都能够显著降低肉汤pH，其中鼠李糖乳杆菌菌株和瑞士乳杆菌菌株显示最显著的pH降低(表1)。BPL5(鼠李糖乳杆菌)菌株和8001-D01-M004(瑞士乳杆菌)菌株48小时后都能够将肉汤pH降低至小于4.0(分别是3.78和3.77)。8001-D01-M006(詹氏乳杆菌)菌株和8018-IN-M001(格氏乳杆菌)菌株48小时后也降低了肉汤pH(分别为4.02和4.06)，但与鼠李糖乳杆菌菌株和瑞士乳杆菌菌株的程度不同。
Figure BDA0003972604950000261
在48小时的时间点收集另外的样品并过滤以去除细菌。然后分析这些无细胞上清液以检测D-乳酸和L-乳酸的水平。使用由Megazyme公司制造的D-/L-乳酸(D-/L-乳酸盐)(快速)测定试剂盒(目录号K-DLATE)定量D-乳酸和L-乳酸。设计此试剂盒以使用酶促反应(使用乳酸脱氢酶和谷氨酸盐)定量D-乳酸和L-乳酸二者。通过乳酸氧化所产生的NADH的量与乳酸的起始浓度具有化学计量性。此试剂盒遵循制造商推荐的程序使用。测试的所有菌株都产生了可检测水平的乳酸(表2)。8001-D01-M004(瑞士乳杆菌)菌株产生了最高水平的D-乳酸和L-乳酸(20.9g/L)以及最大量的D-乳酸(13.5)，而BPL5(鼠李糖乳杆菌)菌株产生了最大量的L-乳酸(17.3g/L)和非常少的D-乳酸(0.8g/L)。瑞士乳杆菌菌株和格氏乳杆菌菌株二者都产生了大量的两种乳酸异构体，其中两种菌株产生的D-乳酸都比L-乳酸多。詹氏乳杆菌的8001-D01-M006菌株主要产生D-乳酸(12.4g/L)并且产生非常少的L-乳酸(0.3g/L)。
Figure BDA0003972604950000271
这些结果表明菌株BPL5(鼠李糖乳杆菌；实例6)、8001-D01-M006(詹氏乳杆菌；实例2)、8001-D01-M004(瑞士乳杆菌；实例4)和8018-IN-M001(格氏乳杆菌；实例3)可能是适合在阴道微生物群组合物中使用的材料。
实例7-实例阴道微生物群组合物
可以通过将卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌组合来形成实例阴道微生物群组合物。在至少一些情况下中，詹氏乳杆菌可以是实例2中描述的菌株。在至少一些情况下中，格氏乳杆菌可以是实例3中描述的菌株。在至少一些情况下中，卷曲乳杆菌可以是实例4中描述的菌株。在至少一些情况下中，鼠李糖乳杆菌可以是实例5中描述的菌株。
应当理解的是，在许多方面，本披露仅是说明性的。在不超出本披露范围的情况下，可以在细节上作出改变，特别是在形状、大小和步骤安排方面。在适当的范围内，这可以包括使用在其他实施例中使用的一个示例性实施例的任何特征。当然，本发明的范围以表述所附权利要求的语言来定义。

Claims (22)

1.一种阴道微生物群组合物，其包含：
细菌混合物，该细菌混合物包括卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
2.如权利要求1所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括25％-75％卷曲乳杆菌。
3.如权利要求1-2中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括30％-60％卷曲乳杆菌。
4.如权利要求1-3中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括40％卷曲乳杆菌。
5.如权利要求1-4中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括1％-10％格氏乳杆菌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括2％-8％格氏乳杆菌。
7.如权利要求1-6中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括5％格氏乳杆菌。
8.如权利要求1-7中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括1％-10％詹氏乳杆菌。
9.如权利要求1-8中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括2％-8％詹氏乳杆菌。
10.如权利要求1-9中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括5％詹氏乳杆菌。
11.如权利要求1-10中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括0.1％-5％嗜酸乳杆菌。
12.如权利要求1-11中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括0.1％-5％鼠李糖乳杆菌。
13.如权利要求1-12中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括0.5％-4％鼠李糖乳杆菌。
14.如权利要求1-13中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括1％鼠李糖乳杆菌。
15.如权利要求1-14中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中将该细菌混合物置于胶囊中。
16.如权利要求1-15中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中将该细菌混合物置于栓剂中。
17.如权利要求1-16中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中将该细菌混合物置于可溶性壳中。
18.如权利要求1-16中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括1x105至1x 1015CFU。
19.如权利要求1-16中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括1x106至1x 1012CFU。
20.如权利要求1-16中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括1x107至1x 1010CFU。
21.如权利要求1-20中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该细菌混合物包括冻干的细菌混合物。
22.一种用于治疗感染的方法，该方法包括：
向感染患者施用如权利要求1-20中任一项所述的阴道微生物群组合物，其中该感染包括细菌性阴道病、念珠菌感染、人乳头瘤病毒感染、尿路感染、性传播感染和妇科癌症中的一种或多种。
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