RU2817419C1 - Способ формирования биопленки lactobacillus fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных поверхностях - Google Patents
Способ формирования биопленки lactobacillus fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных поверхностях Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817419C1 RU2817419C1 RU2023130693A RU2023130693A RU2817419C1 RU 2817419 C1 RU2817419 C1 RU 2817419C1 RU 2023130693 A RU2023130693 A RU 2023130693A RU 2023130693 A RU2023130693 A RU 2023130693A RU 2817419 C1 RU2817419 C1 RU 2817419C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hours
- stage
- medium
- recovered
- periodontal pockets
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 208000005888 Periodontal Pocket Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 title claims description 20
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 title claims description 3
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 title 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- CDUFCUKTJFSWPL-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O CDUFCUKTJFSWPL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000001393 triammonium citrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000011046 triammonium citrate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 14
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 claims description 6
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 abstract description 6
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 abstract description 6
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 abstract description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 abstract 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 abstract 2
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical compound [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 5
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589194 Rhizobium leguminosarum Species 0.000 description 2
- 101000666752 Theionarchaea archaeon (strain DG-70-1) NAD(+) hydrolase TcpA Proteins 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229960001235 gentian violet Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 2
- 101150035739 rosR gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 241000606749 Aggregatibacter actinomycetemcomitans Species 0.000 description 1
- 241000238089 Astacus astacus Species 0.000 description 1
- 206010006326 Breath odour Diseases 0.000 description 1
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000605862 Porphyromonas gingivalis Species 0.000 description 1
- 241001135221 Prevotella intermedia Species 0.000 description 1
- 241000194023 Streptococcus sanguinis Species 0.000 description 1
- 241001135235 Tannerella forsythia Species 0.000 description 1
- 208000009596 Tooth Mobility Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 1
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической микробиологии. Способ включает три этапа: на первом этапе культивируют посевы лактобактерий, выделенные из пародонтальных карманов, на агаре MRS для лактобактерий в течение 24 ч при температуре 37°С; на втором этапе культивируют выделенные изоляты на среде для лактобактерий, содержащей на 1 л питательной среды: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 20 г, глюкоза - 20 г, твин-80 - 1 г, дикалия гидрофосфат - 2 г, ацетат натрия - 5 г, цитрат триаммония - 2 г, сульфат магния - 0,2 г, тетрагидрат сульфата марганца (MnSO4*4H2O) - 0,05 г, мясная вода - остальное до 1 л, рН 6.2, в течение 24 ч при 37°С; на третьем этапе чистые культуры разводят до концентрации 107 КОЕ/мл и инкубируют под пленкой в лунках полистиролового планшета, который помещают в CO2-инкубатор с постоянным составом бескислородной газовой смеси, содержащей 80% азота, 15% водорода, 5% углекислого газа, в течение 3-14 суток при 37°С. Использование изобретения позволяет воссоздать модель биопленок у предполагаемого кандидата в пробиотики полости рта. 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для формирования биопленки Lactobacillus fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных носителях.
Согласно данным литературы, вид L. fermentum с высокой адгезивной способностью выживает в стрессовых условиях полости рта, может формировать агрегаты, микроколонии, а далее и биопленки на поверхностях слизистой оболочки ротовой полости. L. fermentum с высокой адгезивной способностью может ингибировать активность патогенных бактерий, уменьшать взаимодействие между патогенными бактериями и слизистой оболочкой ротовой полости, конкурируя за рецепторы для адгезии эпителиальных клеток, и ингибировать образование биопленок патогенными бактериями [Jamal М., Ahmad W., Andleeb S., Jalil F., Imran M., Nawaz M.A. et al. Bacterial biofilm and associated infections // J. Chin. Med. Assoc. - 2018. - V. 81 (1). - P. 7-11; Barzegari A., Kheyrolahzadeh K., Khatibi S.M.H., Sharifi S., Memar M.Y., Vahed S.Z. The battle of probiotics and their derivatives against biofilms. Infect. Drug. Resistance. - 2020. V. - 13. - P. 659-72; Gou H.-Z., Zhang Y.-L., Ren L.-F., Li Z.-J., Zhang L. How do intestinal probiotics restore the intestinal barrier? // Front. Microbiol. - 2022. - V. 13. P. 929346; Vasiee A., Falah F., Mortazavi S.A. Evaluation of probiotic potential of autochthonous lactobacilli strains isolated from Zabuli yellow kashk, an Iranian dairy product // J. Appl. Microbiol. - 2022. - V. 133. - P. 3201-14]. Таким образом, информация о возможности воссоздания модели биопленок L. fermentum имеет большое значение для медицины и стоматологии, а именно для дальнейших исследований по созданию новых эффективных пробиотиков на основе биопленок для восстановления микробиологического равновесия полости рта при дисбиотических состояниях.
Известен способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae O1 серогруппы на поверхности хитина, включающий использование хитина для формирования биопленки, образуемой клетками V. cholerae, с последующей инкубацией и анализом результатов в ПЦР, отличающийся тем, что в качестве хитина используют пластины речного рака Astacus astacus в количестве 10-15 штук и размером 0,3×0,3 см, которые размещают во флакон емкостью 100 мл, содержащий 30 мл отстоянной речной воды, затем флакон автоклавируют 10 минут при 120°С, а после охлаждения во флакон вносят взвесь культур Vibrio cholerae O1 серогруппы до конечной концентрации 104 м.к./мл, инкубирование проводят в заданные интервалы времени при 10°С и 28°С, анализ результатов образования как простых, так и сложных биопленок V. cholerae проводят в ПЦР с использованием праймеров:
VC 1699-1 GCTTAGCTATTTTTGGGTATAGGTT,
VC 1699-2 CGTTCATTTTTACTCAAACAGTCA
к INDEL-локусу 1699, при этом атоксигенные штаммы ctx- tcpA-формируют ампликон массой 132 п.о., а токсигенные штаммы ctx+ tcpA+ образуют ампликон массой 116 п.о., подтверждая присутствие клеток токсигенного штамма в составе сложной биопленки и способность колонизировать поверхность хитина [Патент РФ №2685878, 2019 г.].
Известен способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента, включающий формирование биопленок на твердом носителе, отличающийся тем, что биопленку создают на покровных стеклах, установленных наклонно под углом 10-12° к вертикальной оси в количестве 8-9 штук, которые помещают между витками пружинообразного приспособления, размещенного внутри емкости объемом 100 мл, затем емкость заполняют экспериментальной средой в объеме 40-50 мл до полного погружения покровных стекол, добавляют в емкость суспензию холерных вибрионов и инкубируют при конечной концентрации холерных вибрионов в n×108 КОЕ/мл с доведением до минимального порога чувствительности 0,1 КОЕ/мл при комнатной температуре [Патент РФ №2559546, 2015 г.].
Описанные способы не позволяют воссоздать модель биопленок в анаэробных условиях и потому не могут быть использованы для L. fermentum, как у предполагаемого кандидата в пробиотики полости рта.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ формирования смешанной биопленки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro, включающий три этапа, причем на первом этапе на подложку из полимерных материалов в замкнутой емкости вносят бактериальную взвесь чистой культуры Streptococcus sanguinis, на втором - Fusobacterium nucleatum, на третьем - Porphyromonas gingivalis, или Aggregatibacter actinomycetemcomitans, или Tannerella forsythia, или Prevotella intermedia и культивируют 48 ч, 72 ч, 120 ч соответственно, при этом бактериальную взвесь каждой чистой культуры разводят в 0,1% полужидкой агаризованной среде - сердечно-мозговом бульоне BHI, LIM или АС, содержащей 0,01% менадиона и 0,1%) гемина, до концентрации 106-108 КОЕ/мл, замкнутую емкость помещают в микроанаэростат с постоянным составом бескислородной газовой смеси, состоящей из 80% азота, 10% водорода, 10% углекислого газа, который в свою очередь помещается в шейкер-термостат, обеспечивающий возвратно-поступательные движения в диапазоне 60-120 движений в минуту, при температуре 37°С с получением смешанной биопленки. [Патент РФ №2619169, 2017 г.]. Новизна этого способа состоит в том, что он позволяет при необходимости оценить вклад каждого вида в индукцию медиаторов воспаления, факторов патогенности или резистентности к антибиотикам. Недостатком прототипа является использование дорогостоящих коммерческих сред, кроме этого, не показана его эффективность при исследовании клинического материала.
Задачей изобретения является разработка достоверного и доступного способа формирования биопленки L. fermentum, выделенных из пародонтальных карманов.
Технический результат - получение биопленки L. fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных носителях.
Предлагаемый способ проводят в три этапа: на первом - культивируют посевы лактобактерий, выделенных из пародонтальных карманов на агаре MRS для лактобактерий, на втором - культивируют выделенные изоляты на среде для лактобактерий, содержащей на 1 л питательной среды: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 20 г, глюкоза - 20 г, твин-80 - 1 г, дикалия гидрофосфат - 2 г, ацетат натрия - 5 г, цитрат триаммония - 2 г, сульфат магния - 0,2 г, тетрагидрат сульфата марганца (MnSO4*4H2O) - 0,05 г, мясная вода - остальное до 1 л, рН 6.2, в течение 24 ч при 37°С. На третьем этапе чистые культуры разводят до концентрации 107 КОЕ/мл и инкубируют под пленкой в лунках полистиролового планшета, который помещают в CO2-инкубатор с постоянным составом бескислородной газовой смеси, содержащий 80% - азота, 15% - водорода, 5% - углекислого газа, в течение 3-14 суток при 37°С.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 представлен вид колоний L. fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на агаре MRS для лактобактерий; на фиг. 2 - результат масс-спектрометрии чистых культур L. fermentum; на фиг. 3 - анализ изменений в относительной биомассе биопленок изолятов L. fermentum на 3, 7, 14 сутки.
Предлагаемый способ формирования биопленки L. fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных носителях осуществляется следующим образом:
Первый этап. Для получения накопительной культуры клинический материал (содержимое пародонта) засеивают на агар MRS для лактобактерий [HiMedia Laboratories Pvt. Limited: [Электронный ресурс]. URL: https://himedialabs.ru. Дата обращения: 13.11.2023], инкубируют в течение 24 ч при температуре 37°С (фигура 1). Идентификацию до рода и вида проводят с помощью метода масс-спектрометрии (автоматической системы идентификации микроорганизмов по принципу MALDI-TOF) (Autof MS 2600, Китай) (фигура 2).
Второй этап: Выделенные изоляты L. fermentum культивируют в течение 24 ч при температуре 37°С на среде для лактобактерий, содержащей на 1 л питательной среды: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 20 г, глюкоза - 20 г, твин-80 - 1 г, дикалия гидрофосфат - 2 г, ацетат натрия - 5 г, цитрат триаммония - 2 г, сульфат магния - 0,2 г, тетрагидрат сульфата марганца (MnSO4*4H2O) - 0,05 г, мясная вода - остальное до 1 л, рН 6.2.
Третий этап: суспензии суточных чистых культур L. fermentum, выращенных на среде для лактобактерий, разводят до концентрации 107 КОЕ/мл. В лунки полистиролового 48-луночного планшета вносят по 300 мкл полученной разведенной бактериальной суспензии. Планшет накрывают крышкой, заворачивают пленкой Parafilm («Amcor», США) и инкубируют в CO2-инкубаторе HF-100 (Heal Force, КНР) с постоянным составом бескислородной газовой смеси, содержащей 80% - азота, 15% - водорода, 5% - углекислого газа, в течение 3-14 суток при 37°С.
Пример №1 Пациент А., 35 лет. Диагноз: хронический генерализованный пародонтит средней степени в стадии обострения. Жалобы на подвижность зубов, запах изо рта, кровоточивость десен при чистке зубов.
Забор содержимого пародонта производился при помощи стерильных бумажных штифтов Absorbent Paper Points (МЕТА BIOMED, Южная Корея) (размер №25 по ISO). Стерильным пинцетом штифт вводили в наиболее глубокие участки пародонтальных карманов на 15 секунд, затем немедленно помещали в стерильные пробирки типа Eppendorf 1,5 мл объема с тиогликолевой средой (HiMedia, Индия). В дальнейшем в соответствии с предлагаемым нами способом культивирование содержимого пародонта осуществляли на агаре MRS для лактобактерий, затем проводили идентификацию до вида с помощью метода масс-спектрометрии (Autof MS 2600, Китай), после чего выделенные изоляты культивировали на среде для лактобактерий, содержащей на 1 л питательной среды: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 20 г, глюкозу - 20 г, твин-80 - 1 г, дикалия гидрофосфат - 2 г, ацетат натрия - 5 г, цитрат триаммония - 2 г, сульфат магния - 0,2 г, тетрагидрат сульфата марганца (MnSO4*4H2O) - 0,05 г, мясная вода - остальное до 1 л, рН 6.2, в течение 24 ч при 37°С, суспензии чистых культур изолятов 1,2 L. fermentum разводили до концентрации 107 КОЕ/мл и культивировали под пленкой в лунках полистиролового планшета, который помещали в CO2-инкубатор с постоянным составом бескислородной газовой смеси, содержащей 80% - азота, 15%) - водорода, 5% - углекислого газа, в течение 3-14 суток при 37°С.
Для проверки эффективности способа, сформировавшиеся на 3, 7, 14 сутки биопленки окрашивали генцианвиолетом («Агат-Мед», Россия), с последующим элюированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом. Результаты изменений в относительной биомассе бипленок выделенных изолятов L. fermentum, учитывали спектрофотометрически путем измерения оптической плотности спиртового экстракта при длине волны 590 нм с использованием прибора Enspire Model 2300 Multilabel Microplate Reader («Perkin Elmer», США) (таблица, фигура 3) [Вершинина З.Р., Чубукова О.В., Никоноров Ю.М., Хакимова Л.Р., Лавина А.М., Каримова Л.Р., Баймиев Ан.X., Баймиев А.X. Влияние сверхэкспрессии гена rosR на образование биопленок бактериями Rhizobium leguminosarum // Микробиология. - 2021. - Т. 90, №2. - С. 191-203.].
Пример №2 Пациент Ш., 42 лет. Диагноз: хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести. Жалобы на отечность и гиперемию десен, кровоточивость при чистке зубов.
Забор содержимого пародонта производился при помощи стерильных бумажных штифтов Absorbent Paper Points (МЕТА BIOMED, Южная Корея) (размер №25 по ISO). Стерильным пинцетом штифт вводили в наиболее глубокие участки пародонтальных карманов на 15 секунд, затем немедленно помещали в стерильные пробирки типа Eppendorf 1,5 мл объема с тиогликолевой средой (HiMedia, Индия). В дальнейшем в соответствии с предлагаемым нами способом культивирование содержимого пародонта осуществляли на агаре MRS для лактобактерий, затем проводили идентификацию до вида с помощью метода масс-спектрометрии (Autof MS 2600, Китай), после чего выделенные изоляты культивировали на среде для лактобактерий, содержащей на 1 л питательной среды: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 20 г, глюкозу - 20 г, твин-80 - 1 г, дикалия гидрофосфат - 2 г, ацетат натрия - 5 г, цитрат триаммония - 2 г, сульфат магния - 0,2 г, тетрагидрат сульфата марганца (MnSO4*4H2O) - 0,05 г, мясная вода - остальное до 1 л, рН 6.2, в течение 24 ч при 37°С, суспензии чистых культур изолятов 1,2 L. fermentum разводили до концентрации 107 КОЕ/мл и культивировали под пленкой в лунках полистиролового планшета, который помещали в CO2-инкубатор с постоянным составом бескислородной газовой смеси, содержащей 80% - азота, 15%) - водорода, 5% - углекислого газа, в течение 3-14 суток при 37°С.
Для проверки эффективности способа, сформировавшиеся на 3, 7, 14 сутки биопленки окрашивали генцианвиолетом («Агат-Мед», Россия), с последующим элюированием связавшегося с биопленками красителя этиловым спиртом. Результаты изменений в относительной биомассе биопленок выделенных изолятов L. fermentum, учитывали спектрофотометрически путем измерения оптической плотности спиртового экстракта при длине волны 590 нм с использованием прибора Enspire Model 2300 Multilabel Microplate Reader («Perkin Elmer», США) (таблица, фигура 3) [Вершинина З.Р., Чубукова О.В., Никоноров Ю.М., Хакимова Л.Р., Лавина А.М., Каримова Л.Р., Баймиев Ан.X., Баймиев А.X. Влияние сверхэкспрессии гена rosR на образование биопленок бактериями Rhizobium leguminosarum // Микробиология. - 2021. - Т. 90, №2. - С. 191-203.].
Таким образом, предлагаемый нами способ формирования биопленок видом L. fermentum, выделенным из пародонтальных карманов, на инертных поверхностях продемонстрировал свою эффективность при исследовании клинического материала.
Claims (1)
- Способ формирования биопленки Lactobacillus fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, включающий культивирование сначала на питательной среде, затем в аппарате для культивирования микроорганизмов в анаэробных условиях с бескислородной газовой смесью, содержащей 80% азота, водород и углекислый газ, отличающийся тем, что проводят культивирование содержимого пародонта на агаре MRS для лактобактерий в течение 24 ч при температуре 37°С, после чего выделенные изоляты культивируют на среде для лактобактерий, содержащей на 1 л питательной среды: пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 20 г, глюкоза – 20 г, твин-80 – 1 г, дикалия гидрофосфат – 2 г, ацетат натрия – 5 г, цитрат триаммония – 2 г, сульфат магния – 0,2 г, тетрагидрат сульфата марганца (MnSO4*4H2O) – 0,05 г, мясная вода – остальное до 1 л, рН 6.2, в течение 24 ч при 37°С, после чего чистые культуры разводят до концентрации 107 КОЕ/мл и культивируют под пленкой в лунках полистиролового планшета, который помещают в аппарат для культивирования микроорганизмов, в качестве которого используют CO2-инкубатор, содержащий 15% водорода, 5% углекислого газа, в течение 3-14 суток при 37°С.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2817419C1 true RU2817419C1 (ru) | 2024-04-16 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2559546C1 (ru) * | 2014-05-29 | 2015-08-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента и устройство для его осуществления |
| RU2619169C1 (ru) * | 2015-11-20 | 2017-05-12 | Виктор Николаевич Царев | Способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2559546C1 (ru) * | 2014-05-29 | 2015-08-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ моделирования образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента и устройство для его осуществления |
| RU2619169C1 (ru) * | 2015-11-20 | 2017-05-12 | Виктор Николаевич Царев | Способ формирования смешанной биоплёнки пародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JAMAL M., et al. Bacterial biofilm and associated infections, J. Chin. Med. Assoc., 2018, v. 81 (1), p. 7-11. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lin et al. | Effect of probiotic lactobacilli on the growth of Streptococcus mutans and multispecies biofilms isolated from children with active caries | |
| JP3653277B2 (ja) | ラクトバチルス菌株、該菌株の組成物および該菌株の使用法 | |
| Slots | Selective medium for isolation of Actinobacillus actinomycetemcomitans | |
| Hamada et al. | Production and properties of bacteriocins (mutacins) from Streptococcus mutans | |
| Duerden et al. | The characterization of clinically important gram negative anaerobic bacilli by conventional bacteriological tests | |
| CN110257297A (zh) | 一株分离的用于促进口腔健康的副干酪乳杆菌pc-01及其应用 | |
| Andrews | Acinetobacter bacteriocin typing | |
| Zhou et al. | Supragingival microbes | |
| Wade | Non-culturable bacteria in complex commensal populations | |
| Burnett et al. | Bacteriologic studies of the advancing dentinal lesion | |
| EP0540897B1 (en) | Method for the culture of microorganisms of the genera helicobacter, campylobacter and arcobacter employing culture media comprising cyclodextrins, methylcellulose or mixtures thereof | |
| Al-Mudallal et al. | Isolation and identification of mutan's streptococci bacteria from human dental plaque samples | |
| JP6658265B2 (ja) | インビトロバイオフィルムモデルの製造方法、ならびに評価方法及び口腔用組成物を選定する方法 | |
| RU2817419C1 (ru) | Способ формирования биопленки lactobacillus fermentum, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных поверхностях | |
| Mossel et al. | Quality control of solid culture media: A comparison of the classic and the so‐called ecometric technique | |
| RU2819447C1 (ru) | Способ формирования биопленки lactobacillus casei, выделенных из пародонтальных карманов, на инертных поверхностях | |
| CN116694535A (zh) | 一种戊糖乳杆菌w19及其应用 | |
| Brown et al. | Description of Corynebacterium tuberculostearicum sp. nov., a leprosy-derived Corynebacterium | |
| Holmberg | Isolation and identification of gram-positive rods in human dental plaque | |
| CN115820450A (zh) | 一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的植物乳植杆菌及其应用 | |
| Holm et al. | Improved selective culture media for Actinobacillus actinomycetemcomitans and Haemophilus aphrophilus | |
| MAEDA | Anaerobic, gram-positive, pleomorphic rods in human gingival crevice | |
| CN115717113B (zh) | 一株副干酪乳酪杆菌及其在预防或治疗口腔疾病中的应用 | |
| Piccolomini et al. | Laboratory and clinical comparison of preservation media and transport conditions for survival of Actinobacillus actinomycetemcomitans | |
| KR100786364B1 (ko) | 신규한 면역활성능이 있는 락토바실러스 파라카제이ｂｆｉ４６과 락토바실러스 파라카제이 ａｆｊ８８ 균주 |