KR20220044373A

KR20220044373A - 미생물총 치료를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20220044373A
Application number: KR1020227009899A
Authority: KR
Inventors: 다비드 바람; 다비드 다부쉬; 라헬 디아만트
Original assignee: 마이바이오틱스 파마 엘티디.
Priority date: 2016-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2022-04-07
Also published as: AU2017271491A1; JP2019516750A; BR112018074283A2; US11679136B2; IL263218A; KR20190019087A; KR102380134B1; JP7198087B2; EP3463403A4; US11123383B2; CN109562132A; RU2018141320A3; IL294171A; CN109562132B; RU2018141320A; US20210330720A1; SG11201810428PA; WO2017203533A1; US20190083550A1; MX2018014419A

Abstract

본 발명은 성장 및/또는 증식 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 미생물 무리와 유사성이 높은 복수의 박테리아 속을 포함한다.

Description

미생물총 치료를 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITION AND METHODS FOR MICROBIOTA THERAPY}

본 발명은, 발명의 일부 구현예로서, 복수의 박테리아 속을 포함하는 조성물, 및 예컨대 장내세균총 불균형(dysbiosis)의 치료를 위한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.

위장관에는 풍부하고 다양한 미생물 군집이 있다. 그것은 다양한 종류의 박테리아를 포함하여 여러 상이한 종 또는 유기체의 군집을 위한 환경 또는 적소를 제공하는 복잡한 시스템이다. 정상적인 미생물 무리는 또한 피부, 손톱, 눈, 경구 및 상부 기도 및 비뇨생식관에 서식한다.

건강한 미생물총은 광범위한 병원체에 대한 내성, 필수 영양소 생합성 및 흡수, 및 건강한 소화관 상피 및 적절하게 조절된 전신 면역을 유지하는 면역 자극을 비롯하여 숙주에 다수의 이점을 제공하는 박테리아 군집화가 요구된다. '장내세균총 불균형' 또는 붕괴된 공생 환경에서, 미생물총 기능이 상실되거나 어지럽혀져 병원체에 대한 감수성 증가, 대사 프로파일의 변경, 또는 국소 또는 전신 염증 또는 자가 면역을 초래할 수 있는 전염증 신호의 유도를 일으킬 수 있다. 따라서, 미생물 무리 및 구체적으로 장내 미생물총은 소화관의 다양한 병원성 감염을 포함하나 이에 제한되지 않고, 많은 질환 및 장애의 발병에 중요한 역할을 한다.

장내세균총 불균형, 비만, 감염, 결장염, 염증성 장 질환 (예컨대 크론병), 자가면역 질환 및 암 면역요법과 같은 만성 장애를 포함하는 다양한 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법이 계속해서 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 그것의 일부 구현예에서, 복수의 박테리아 속의 조성물에 관한 것으로, 상기 복수의 박테리아 속은 미생물총의 기원 집단과 유사성이 높다.

일 양태에 따르면, 본 발명은 성장 및/또는 증식 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과(bacterial family)의 공동-배양물을 포함하는 합성 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복수의 박테리아 속 및 복수의 입자를 포함하는 합성 조성물을 제공하는 것으로, 상기 복수의 박테리아 속은 (i) 성장 및/또는 증식 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물이며, (ii) 미생물총 집단과 적어도 30 % 유사성을 갖는다.

일부 구현예에 따르면, 복수의 박테리아 속의 적어도 일부는 미생물총 집단으로부터 유래된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 미생물총 집단은 사전-결정된 표적화된 미생물총 집단이다.

일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 호기성 박테리아 중 적어도 하나 또는 호기성 박테리아의 서브셋(subset) 및 혐기성 박테리아 중 적어도 하나 또는 혐기성 박테리아의 서브셋을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 생물막 형태로 박테리아 중 적어도 하나의 박테리아 서브셋 및 플랑크톤 박테리아의 적어도 하나의 박테리아 서브셋을 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 사전-결정된 표적화된 미생물총 집단과 적어도 30 % 유사성을 갖는 복수의 박테리아 속을 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 미생물총 기원 집단과 적어도 30 % 유사성을 갖는 복수의 박테리아 속을 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 상기 미생물총 집단은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 장내 미생물총, 타액 미생물총, 피부 미생물총, 구강 미생물총, 기관지 미생물총, 질 미생물총, 토양 미생물총, 또는 이들의 혼합물.

일부 구현예에 따르면, 상기 복수의 박테리아 속은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 샘플로부터 유래된다: 배설물 샘플, 타액 샘플, 피부 샘플, 구강 샘플, 기관지 샘플, 질 샘플, 토양 샘플, 또는 이들의 혼합물.

일부 구현예에 따르면, 상기 미생물총 집단은 적어도 하나의 기원으로부터 유래된다.

*일부 구현예에 따르면, 상기 복수의 박테리아 속은 하나 이상의 건강한 포유동물, 동물 공여체, 박테리아 균주, 저장된 미생물총 샘플, 박테리아 콜로니, 플랑크톤 샘플 및 생물막으로부터 유래된다.

일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 복수의 입자를 추가로 포함한다.

일부 구현예에 따르면, 각각의 입자는 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물을 포함한다.

또 다른 양태에 따르면, 본 명세서에 기재된 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

일부 구현예에 따르면, 상기 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제는 안정화제, 보존제, 킬레이트제, 점도 개질제, 완충제, 및 pH 조정제 중 하나 이상으로부터 선택된다.

일부 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 직장, 정맥내, 비경구, 점막, 비강 또는 경구 투여를 위해 제형화된다.

일부 구현예에 따르면, 상기 약제는 장내세균총 불균형의 치료에 사용된다.

또 다른 양태에 따르면, 질환 또는 장애의 치료가 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 질환 또는 장애는 장내세균총 불균형이다.

또 다른 양태에 따르면, 성장 및/또는 증식 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물을 포함하는 조성물을 수득하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a. 적어도 하나의 기원으로부터의 미생물총을 포함하는 복수의 박테리아 속을 제공하는 단계;

b. 상기 복수의 박테리아 속을 현탁시켜 박테리아 속 용액을 얻는 단계;

c. 상기 복수의 박테리아 속 용액을 여과하여 상기 복수의 박테리아 속을 포함하는 여액을 수득하는 단계;

d. 상기 여액을 복수의 입자와 인큐베이션하고, 상기 복수의 박테리아 속을 상기 복수의 입자에 부착시키는 단계;

e. (d)의 복수의 박테리아 속을 복수의 박테리아 용액 서브셋(subset)으로 분할하는 단계;

f. 각각의 박테리아 용액 서브셋을 성장 배지에서 그리고 개별 서브셋의 증식에 적합한 증식 조건 하에 배양하는 단계;

g. 상기 성장 배지를 제거하고, 개별 서브셋을 다시 결합시키는 단계;

그렇게 함으로써 성장 및/또는 증식 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물을 포함하는 조성물을 수득하는 단계.

일부 구현예에 따르면, 상기 증식 조건은 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 호기성, 혐기성, 및 미호기성(microaerophilic) 조건. 일부 구현예에 따르면, 상기 증식 조건은 유동, 진탕 및 정적 조건으로부터 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 증식 조건은 습한 조건 및 저습도 조건으로부터 선택된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 적용되는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질이 아래에 기재되어 있다. 충돌이 있는 경우에, 정의를 포함하는 본 특허 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적이며, 반드시 제한하려는 것은 아니다.

본 발명의 일부 구현예는 수반되는 도면들을 참조하여 단지 예로서 본 명세서에 기재된다. 이제 도면을 상세하게 특정 참조로 하여, 보여주는 세부 사항은 예시적인 것이며 본 발명의 구현예의 예시적인 논의를 위한 것임이 강조된다. 이와 관련하여, 설명은 도면과 함께 본 발명의 구현예가 실시될 수 있는 방법을 당해 분야의 숙련가에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은, 비제한적인 예로서, 미생물총 조성물을 수득하는 단계를 나타내는 순서도이다.
도 2는 하기 조건에서 배양된 박테리아의 상대 분포를 나타낸다: 병 1. 호기성 액체 배설물; 병 2. 호기성 TSB; 병 3. 호기성 RCM; 병 4. 호기성 배설물 여액; 병 5. 혐기성 액체 배설물; 병 6. 혐기성 TSB; 병 7. 혐기성 RCM; 병 8. 혐기성 배설물 여액; 결과는 각각의 조건 (병)의 미생물 군집의 16s rRNA 분석에 기초한 가중된 UniFrac 거리의 주좌표 분석 (Principal Coordinate Analysis; PCoA)을 기반으로 한다. 주좌표에 의해 설명된 변동률은 축에 표시된다.
도 3은 최초 토양 미생물총과 비교하여 상이한 샘플의 유사성 백분율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 상이한 조건에서 성장한 토양 미생물총 및 인간 구강 미생물총의 탈경향 대응 분석 (detrended correspondence analysis; DCA) 배열 분석(ordination analysis)에 의한 박테리아 속을 보여주는 플롯이다.
도 5는 상이한 조건에서 성장한 토양 및 인간 구강 미생물총으로부터의 다차원 척도법 (multidimensional scaling; MDS) 배열 분석의 결과를 보여주는 플롯이다.
도 6은 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 균주 및 이들의 혼합물(mix)의 박테리아 성장을 소규모로 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 및 비피도박테리움 균주 및 이들의 혼합물의 박테리아 성장을 중간 규모로 보여주는 막대 그래프이다.
도 8a-8b는 상이한 유형의 접종물: 생물막으로부터 탈착된 박테리아 (도 8a) 또는 기질 접종물 (도 8b)에 따른 박테리아 성장을 보여주는 막대 그래프이다.
도 9는 중간 스케일 조건에서 박테리아 세포 수에 의한 박테리아 내산성(acid resistance)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 가변 농도의 카르베니실린에서 박테리아 세포 수에 의한 항생제에 대한 박테리아 균주 내성을 보여주는 막대 그래프이다.

본 발명은 복수의 박테리아 속을 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물 무리와 유사성이 높은 복수의 박테리아 속을 포함한다.

추가 구현예에서, 본 발명은 박테리아 속의 공동-배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 박테리아 속의 공동-배양물은 미생물 무리와 유사성이 높다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "미생물총" 또는 "미생물 무리"는 미생물 (비제한적으로 환경 적소에 존재하는 것으로 발견되거나, 구성하거나 또는 공지된 박테리아, 진균 예컨대 효모)의 집합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 미생물 무리는 건강한 대상체의 환경 적소에 존재하는 것으로 발견되거나 알려진 미생물의 집합체이다. 환경 적소의 비-제한적인 예는 소화관, 피부, 타액, 경구 및 상부 기도 및 비뇨생식관을 포함한다. 환경 적소의 추가의 비-제한적인 예는 토양, 지하수, 및 개빙 구역(open water)를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 미생물 무리는 공통 기원 (즉, 유사한 환경 적소로부터 유래됨)을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 미생물 무리는 공통 표적을 갖는다. 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 다양한 박테리아를 얻을 수 있으며, 표적화된 환경 적소와 동일성 또는 유사성이 높은 합성 조성물을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물총 표적화된- 환경 적소와 적어도 30 %의 유사성을 갖는 복수의 박테리아 속을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 조성물의 박테리아 속은 공통 기원 (예를 들어, 예정된 환경 적소)의 미생물 무리 또는 지정된 박테리아 공동-배양물과 유사하도록 박테리아 공동-배양물의 합성 어셈블리이다.

일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아의 공동-배양물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50개의 뚜렷이 다른 박테리아의 공동-배양물을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 뚜렷이 다른 박테리아는 상이한 과에서 유래하는 박테리아이다. 일 구현예에서, 상기 뚜렷이 다른 박테리아는 상이한 속에서 유래하는 박테리아이다. 용어 "뚜렷이 다른"은 성장 및/또는 증식 조건이 상이한 박테리아를 지칭한다. 일 구현예에서, 상이한 성장 및/또는 증식 조건은 적어도 2가지의 최적 조건으로, 제1 조건은 제1 박테리아의 실질적으로 최적의 성장 증식 및 배양을 가능하게 하며, 제2 조건은 제2 박테리아의 실질적으로 최적의 성장 증식 및 배양을 가능하게 한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 공동-배양물은 호기성 박테리아 중 적어도 하나 또는 호기성 박테리아의 서브셋을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 공동-배양물은 혐기성 박테리아 중 적어도 하나 또는 혐기성 박테리아의 서브셋을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 공동-배양물은 호기성 박테리아 중 적어도 하나 또는 호기성 박테리아의 서브셋 및 혐기성 박테리아 중 적어도 하나 또는 혐기성 박테리아의 서브셋을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 공동-배양물은 생물막 형태의 박테리아 중 적어도 하나 또는 생물막 형태의 박테리아의 서브셋을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 공동-배양물은 플랑크톤 박테리아 중 적어도 하나 또는 플랑크톤 박테리아의 서브셋을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아 공동-배양물은 생물막 형태의 박테리아 중 적어도 하나 또는 생물막 형태의 박테리아의 서브셋 및 플랑크톤 박테리아 중 적어도 하나 또는 플랑크톤 박테리아의 서브셋을 포함한다.

일부 구현예에서, 공동-배양물의 적어도 일부는 영양공생 관계(syntrophic relationship)에 있다.

하기 본 명세서에서 실증된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 처리 하에 형성된 조성물은 소화관 박테리아 속과 높은 유사성을 나타냈다 (예를 들어, 통상적으로 공지된 소화관 박테리아 속과 90 %가 넘는 유사성). 또한, 본 명세서에 기재된 조성물은 토양 세균총(bacterial flora)과 높은 유사성을 나타냈다 (토양 샘플과 30 %가 넘는 유사성). 또한, 본 명세서에 기재된 조성물은 경구 세균총과 높은 유사성을 나타냈다 (구강 샘플과 30 %가 넘는 유사성).

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 합성 조성물이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "합성"은 적어도 2가지의 상이한 성장 배지 및 증식 조건 하에 시험관내에서 성장한 박테리아 조성물을 지칭한다.

일부 구현예에서, 상기 미생물총은 장내 미생물총이다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총은 구강 미생물총이다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총은 타액에서 얻어진다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총은 기관지 미생물총이다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총은 피부 미생물총이다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총은 질 미생물총이다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총은 토양 미생물총이다.

일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 대상체 (예컨대 인간)로부터 유래된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 복수의 박테리아 속은 하기로부터 선택된 하나 이상의 샘플로부터 유래된다: 배설물 샘플, 타액 샘플, 구강 샘플, 기관지 샘플, 피부 샘플, 및 질 샘플. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 배설물 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 타액 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 구강 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 기관지 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 피부 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 질 샘플로부터 유래된다.

상기 박테리아 속은 단일 샘플 또는 복수의 샘플로부터 유래될 수 있다. 상기 박테리아 속의 적어도 일부는 동물 외의 샘플로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 토양으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 식물 물질(plant matter)로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 토양 미생물총 조성물은 농업용이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물 및 농업적으로 허용가능한 캐리어가 제공된다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총 조성물은 원하는 식물 특성을 향상시키는데 유용하다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총 조성물은 식물 성장을 향상 또는 개선시키는데 유용하다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총 조성물은 살충제 분해에 유용하다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총 조성물은 토양 비옥도를 개선시킨다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총 조성물은 질소 사이클링에서의 미생물의 중추적 역할로 인해 질소 고정, 탈질화 및 질산화를 중재하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 오염되지 않은 토양 또는 물 샘플로부터 얻어진다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 환경 적소와 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 97 %, 적어도 99 %의 유사성 (그 사이의 임의의 값 포함)을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물총의 기원 집단과 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 97 %, 적어도 99 %의 유사성 (그 사이의 임의의 값 포함)을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 표적 미생물총 집단과 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 97 %, 적어도 99 %의 유사성 (그 사이의 임의의 값 포함)을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 장내 미생물총 집단과 적어도 70 %의 유사성을 포함한다. 표 8은 장내 미생물총의 비-제한적인 예를 열거한다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 토양 미생물총 집단과 적어도 25 %의 유사성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 토양 미생물총 집단과 적어도 30 %의 유사성을 포함한다. 표 9는 장내 미생물총의 비-제한적인 예를 열거한다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 타액 미생물총 집단과 적어도 25 %의 유사성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 타액 미생물총 집단과 적어도 30 %의 유사성을 포함한다. 표 11은 장내 미생물총의 비-제한적인 예를 열거한다.

일부 구현예에서, 상기 미생물총 집단은 적어도 하나의 기원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총 집단은 복수의 기원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총 집단은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5개의 기원으로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100개의 박테리아 과 (그 사이의 임의의 값 포함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 미생물총 집단은 적어도 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100개의 박테리아 속 (그 사이의 임의의 값 포함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 박테리아 속의 적어도 하나의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 복수의 사전-결정된 박테리아 균주를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "사전-결정된"은 특정 요구에 따라서 선택된 박테리아 균주를 포함하는 맞춤 제작 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, 사전-결정된 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 다양한 성장 배지 및 증식 조건을 사용하여 상기 미생물총을 배양함으로써 지정될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 표 8, 9 또는 11에 열거된 미생물총 집단과 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 45 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %, 적어도 95 %의 유사성을 포함한다.

일부 구현예에서, 복수의 소화관 박테리아 속 조성물은 표 8의 목록과 적어도 70 %의 유사성을 갖는다.

일부 구현예에서, 복수의 토양 박테리아 과 조성물은 표 9의 목록과 적어도 30 %의 유사성을 갖는다.

일부 구현예에서, 복수의 경구 박테리아 과 조성물은 표 11의 목록과 적어도 30 %의 유사성을 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 악티노박테리아(Actinobacteria), 아케아(Archea), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 데이노코쿠스-테르무스(Deinococcus-Thermus), 피르미쿠테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 렌티스파에라에(Lentisphaerae), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 시네르기스테테스(Synergistetes), 테네리쿠테스(Tenericutes), 및 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아의 박테리아 공동-배양물을 포함한다.

일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 건강한 포유동물로부터 얻어진다. 일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 동물 공여체로부터 얻어진다. 일 구현예에서, 상기 공여체는 그것의 건강 상황 및 영양 습관에 대해 스크리닝될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 박테리아 균주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 저장된 박테리아 균주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 동결된 박테리아 균주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 동결된 생물막으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 동결건조된 박테리아 균주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 프로바이오틱 균주(probiotic strain)이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로바이오틱"은 다른 미생물, 특히 유익한 특성을 갖는 미생물 (예컨대 장내 세균총의 미생물)의 성장을 또한 자극할 수 있는 유익한 또는 필수 박테리아 균주를 지칭한다. 일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 저장된 미생물총 샘플로부터 유래된다. 일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 박테리아 콜로니로부터 유래된다.

일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속의 적어도 일부는 생물막으로부터 유래된다. 일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속의 적어도 일부는 플랑크톤 샘플로부터 유래된다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 복수의 입자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 입자는 생물막 형성을 위해 조정되거나, 구성되거나 또는 생물막 형성에 적합하다. 일부 구현예에 따르면, 상기 복수의 입자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유형의 입자를 포함한다: 종자 (예를 들어, 패션 프루트, 니젤라(nigella) 및 석류 종자), 분쇄된 종자, 알갱이, 벤토나이트 점토 입자를 포함하는 입자, 모래 입자, 백점토 입자, 셀룰로스 섬유를 포함하는 입자, 셀룰로스 입자 (예를 들어, 미세결정성 셀룰로스 (MCC)), 인산제2칼슘 입자 (DCP), 아가로스 비드 및 이들의 임의의 조합. 일 구현예에서, 하나 이상의 입자는 다공성이다.

일부 구현예에서, 상기 복수의 입자는 합성 스캐폴드이다.

일부 구현예에서, 상기 종자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 석류 종자, 및 패션 프루트 종자. 일부 구현예에서, 상기 종자는 분쇄된다.

일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 5 미크론 내지 1 cm의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 5 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 10 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 15 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 20 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 30 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 40 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 50 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 60 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 70 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 80 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 90 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 100 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 200 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 300 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 400 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 500 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 600 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 700 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 800 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 900 미크론이다. 일부 구현예에서, 상기 입자는 직경이 1 cm이다.

비제한적인 예로서 본 발명의 조성물을 수득하는 방법을 설명하는 도 1을 참조한다. 우선, 복수의 박테리아 속 (예를 들어, 적어도 하나의 표적 또는 기원 집단으로부터의 미생물총)을 포함하는 샘플을 제공하고 (단계 200); 후속적으로, 상기 복수의 박테리아 속을 현탁시켜 박테리아 속 용액을 얻는다 (단계 220). 상기 박테리아 샘플은 여전히 박테리아의 자연 환경을 유지하고, 적어도 하나의 박테리아의 성장에 적합한 PBS와 같은 임의의 용액으로 희석될 수 있다. 희석은 적어도 하나의 박테리아 속의 성장에 적합한 임의의 범위, 예컨대 1 gr 샘플:1 mL 용액 - 1 g 샘플 -10 L 용액, 1 gr 샘플:10 mL 용액- 1 g 샘플 -5 L 용액, 또는 1 gr 샘플:10 mL 용액 - 1 g 샘플 -1 L 용액의 범위일 수 있다.

상기 미생물총을 포함하는 복수의 박테리아 속을 함유하는 여액을 얻기 위해 상기 복수의 박테리아 속 용액을 여과할 수 있다 (단계 240). 상기 여액은, 복수의 박테리아 속의 적어도 일부가 복수의 입자에 부착되도록 하는 조건 하에 복수의 입자와 인큐베이션될 수 있다 (단계 260).

복수의 입자에 부착된 복수의 박테리아 속은 이어서 (생물막의 성장을 유도하기 위해) 복수의 입자 서브셋(subset)으로 분할된다 (단계 280). 대안적으로, (플랑크톤 박테리아의 성장을 유도하기 위해) 입자가 없는 박테리아 용액 (단계 220 또는 240의 용액)으로부터 적어도 하나의 서브셋이 취해진다. 이후, 배양 단계가 뒤따르며, 여기서 각각의 개별 서브셋은 제1 기간 동안 개별 서브셋에 고유한 성장 배지 및 증식 조건에서 배양되며 (단계 300); 이어서, 제1 배지가 제거되고, 제2 배양 단계가 뒤따르며, 여기서 개별 서브셋은 제2 기간 동안 성장 배지 및 증식 조건에서 배양되며 (단계 320); 이어서, 제2 성장 배지가 제거되고, 개별 서브셋은 배합되어 본 발명의 조성물을 형성한다 (단계 340).

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 호기성 조건 (산소의 존재)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 혐기성 조건 (유리 또는 결합된 산소 부재)을 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 미호기성 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 에어리프트 발효조(airlift fermenter)를 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 생물막 성장 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 정적 조건 (박테리아에 가해지는 전단력이 없도록 흔들림 없이, 매질의 어떠한 흐름 없이)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 플랑크톤 성장 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 유동 조건 (부착된 박테리아가 전단력을 받도록 표면에 부착된 박테리아와 관련된 배지 유동)을 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14 또는 적어도 15 ml/hr의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 최대 30, 최대 25, 최대 20, 최대 19, 최대 18, 최대 17, 최대 16, 최대 15, 최대 14, 최대 13, 최대 12, 최대 11 또는 최대 10 ml/hr의 유량을 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 5 내지 약 10 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 6 내지 약 10 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 7 내지 약 10 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 8 내지 약 10 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 6 내지 약 12 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 7 내지 약 12 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 8 내지 약 12 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 9 내지 약 12 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 10 내지 약 12 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 10 내지 약 14 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 11 내지 약 14 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 12 내지 약 14 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 12 내지 약 15 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 15 내지 약 20 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 15 내지 약 18 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 17 내지 약 20 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 20 내지 약 23 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 22 내지 약 25 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 25 내지 약 30 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 10 내지 약 20 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 5 내지 약 15 ml/hr 범위의 유량을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 15 내지 약 30 ml/hr 범위의 유량을 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 진탕 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 틸트 진탕기(tilt shaker)에 의한 진탕을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300, 350, 400, 450, 500 rpm, 또는 그 사이의 임의의 값에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 100 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 150 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 180 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 230 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 240 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 250 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 260 rpm에서 진탕하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 30분 동안 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15 시간 또는 그 사이의 임의의 값의 시간 동안 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 밤새 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 일 동안 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 1 일 동안 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 4 일 동안 진탕하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 7 일 동안 진탕하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15 시간 또는 그 사이의 임의의 값의 시간이다. 일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 밤새이다. 일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 일이다. 일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 일이다. 일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 적어도 1 일이다. 일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 적어도 4 일이다. 일부 구현예에서, 상기 증식 조건의 인큐베이션 시간은 적어도 7 일이다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 기원 조직에서 알려진 pH 구배를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 6.6 내지 약 7.5 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 5.6 내지 약 7.9 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 4.5 내지 약 8 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 4.0 내지 약 7.0 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 3.0 내지 약 4.5 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 7.0 내지 약 7.5 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 7.0 내지 약 7.4 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 5.5 초과의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 3.0 내지 약 10.0 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 5.5 내지 약 7.5 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 pH를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 위장관에서 pH 의존적 표적 방출을 위해 구성된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 장에서 발견되는 pH에서 적어도 하나의 박테리아 균주를 방출시키도록 구성된다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 투여 후 적어도 5일 동안 매일 1 그램당 적어도 약 2×10² 내지 약 2×10¹⁰ 박테리아의 범위로 소화관에 집락화될 수 있다.

일부 구현예에서, 포유동물 미생물총을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도이다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 약 15 ℃ 내지 약 25 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도이다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 15 ℃ 내지 약 20 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 30 ℃ 내지 약 37 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 40 ℃ 내지 약 55 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 50 ℃ 내지 약 60 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 5 ℃ 내지 약 37 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 토양 미생물총을 위한 증식 조건은 약 30 ℃ 내지 약 75 ℃ 사이의 범위 또는 그 사이의 임의의 값의 온도이다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 30 ℃의 온도를 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 37 ℃의 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 습한 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 저-습도 조건을 포함한다.

일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 자외선 (UV) 노출을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 적어도 하나의 증식 조건은 2-3 % w/v와 같은 높은 NaCl 농도의 존재를 포함한다.

일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 혐기성 조건을 포함한다. 용어 "혐기성 조건"은 5 ppm (백만분율) 미만의 산소, 바람직하게는 0.5 ppm 미만의 산소, 및 더 바람직하게는 0.1 ppm 미만의 산소를 함유하는 대기를 지칭한다. 임의의 적합한 방법은 원하는 혐기성 조건 또는 대기를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 정적 및 혐기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 정적 및 호기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 유동 및 혐기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 유동 및 호기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 6.6-7.5 범위의 pH 및 정적 및 혐기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 6.6-7.5 범위의 pH 및 유동 및 혐기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 6.6-7.5 범위의 pH 및 진탕 및 혐기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 6.6-7.5 범위의 pH 및 진탕 및 호기성 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 진탕 및 플랑크톤 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 진탕 및 생물막 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 30 ℃에서의 진탕 및 생물막 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 37 ℃에서의 진탕 및 생물막 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 30 ℃에서의 진탕 및 플랑크톤 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 37 ℃에서의 진탕 및 플랑크톤 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 15-25 ℃에서의 진탕 및 플랑크톤 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 15-25 ℃에서의 진탕 및 생물막 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 30 ℃에서의 호기성 및 생물막 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 37 ℃에서의 호기성 및 생물막 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 30 ℃에서의 호기성 및 플랑크톤 성장 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 단일 서브셋을 위한 증식 조건은 약 37 ℃에서의 호기성 및 플랑크톤 성장 조건을 포함한다.

일부 구현예에서, 기원 미생물총을 염수에 현탁시키고 (단계 220), 불필요한 고형물의 적어도 일부를 제거하기 위해 배양 전에 여과할 수 있다 (단계 240). 일부 구현예에서, 상기 기원 미생물총을 포함하는 샘플을 예컨대 병원체를 제거하기 위해 멸균할 수 있다 (단계 240).

일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 항생제, 박테리오파아지, 경쟁하는 박테리아 또는 특정 집단의 성장을 감소시켜 더 많은 속을 성장시키거나 생물막과 같은 다른 특징 능력을 향상시키는 임의의 다른 방법으로 배양될 수 있다 (도 1의 단계 300 또는 260). 일부 구현예에서, 상기 복수의 박테리아 속은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 대한 특정한 항생제 예컨대 페니실린, 또는 구체적으로 카복시페니실린 (예를 들어, 카르베니실린)과 함께 배양될 수 있다 (도 1의 단계 300 또는 260). 당해 분야의 숙련가는 특정 박테리아에 대해 사용될 항생제의 특정 유형 및 용량을 결정할 수 있다.

일부 구현예에서, 각각의 개별 서브셋에 대한 성장 배지 및 증식 조건을 변경하는 것은 반복적인 단계일 수 있다 (도 1의 단계 340: 단계 320 및 300). 일부 구현예에서, 입자의 복수의 서브셋은 배양 후 결합된다 (도 1의 단계 360). 일부 구현예에서, 입자의 복수의 서브셋은 특정 포뮬러에 대해 배양 후 결합되지 않는다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 새로운 배양을 위한 개시제 (입자를 재-접종)와 같이, 확장 단계를 추가로 거칠 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결시켜 저장된다 (단계 380). 일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결건조시켜 저장된다 (단계 380). 일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결건조를 위한 건조 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, 동결건조를 위한 건조 완충액은 더 긴 저장 수명 및 수송을 위해 예를 들어, 10 % 수크로스, 단백질, 탈지유, 말토스, 만노스, 등 (비제한적인 방식으로)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 환자에게 전달되기 전에 분말 또는 동등물로 동결 또는 동결 건조시킨 것의 재구성을 위해 합성 액체와 배합된 미생물총을 포함한다.

성장 배지는 임의의 공지된 또는 상업적으로 입수가능한 성장 배지일 수 있거나, 또는 달리 특정 박테리아 균주의 성장 및 증식을 제공하도록 합성될 수 있다. 성장 배지의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 트립신 대두 액체배지 (Tryptic soy broth; TSB), 로버트슨의 쿡드 미트(Robertson's Cooked Meat), 보강된 클로스트리듐 배지 (Reinforced clostridium medium; RCM) 액체배지, 영양 액체배지, 용원성 액체배지 (Lysogeny broth; LB), 1/4 LB, 심장즙 액체배지(Heart infusion broth), 윌킨스-찰그렌 액체배지(Wilkins-Chalgren broth), 브루셀라 액체배지(Brucella broth), 밀기울, 뇌심장즙 한천 (Brain heart infusion agar; BHI1), M9 최소 배지 또는 0.2X BHI, 장내 미생물총 배지 (Gut Microbiota Medium; GMM), 콜롬비아 혈액 한천 (Columbia blood agar; CBA), 초콜릿 한천 (Chocolate agar; CHOC), 트립신 대두 한천 (TSY), 까다로운 혐기성 생물 한천 (Fastidious anaerobe agar; FAA), 쿡드 미트 한천 (BEEF), 비피도박테리움 선택 배지 (Bifidobacterium Selective Media; BSM), 페닐에틸 알코올 한천 (Phenylethyl alcohol agar; PEA), 악티노마이세스 단리 한천 (Actinomyces isolation agar; AIA), 콜리스틴 날라딕스산 한천 (Colistin naladixic acid agar; CNA), 맥케이 한천 (McKay agar; MK), 만니톨 슬랫 한천 (Mannitol slat agar; MSA), 디 맨 로고사 샤프 한천 (de Man Rogosa Sharpe agar; MRS), 박테로이데스 담즙 에스쿨린 한천 (Bacteroides bile esculin agar; BBE), 데옥시콜레이트 한천 (Deoxycholate agar; DOC), 맥콘키 한천 (MacConkey agar; MAC), 및 카나마이신 반코마이신 레이크드 혈액 한천 (Kanamycin vancomycin laked blood agar; KVLB).

일부 구현예에서, 상기 성장 배지는 트립신 대두 액체배지 (TSB), 로버트슨의 쿡드 미트, 보강된 클로스트리듐 배지 (RCM) 액체배지, 영양 액체배지, 용원성 액체배지 (LB), 1/4 LB, 심장즙 액체배지, 윌킨스-찰그렌 액체배지, 브루셀라 액체배지, 뇌-심장즙 배지 (BHI), 밀기울, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 특정 박테리아 속 또는 집단을 농축시키기 위한 특정 성장 배지, 예를 들어, 비제한적으로, 락토바실러스의 농축을 위한 디 맨, 로고사 및 샤프 (MRS) 한천이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 성장 배지는 건조된 성장할 수 없는(uknviable) 생물막을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 성장 배지는 또한 표면으로 박테리아의 부착을 촉진하거나 생물막의 생성을 촉진시키는 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 성장 배지는 항생제, 박테리오파아지, 경쟁하는 박테리아 또는 특정 집단을 감소시켜 더 많은 속을 성장시키는 임의의 다른 방법으로 박테리아 증식을 감소시키는 물질을 또한 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 환자에서 하나 이상의 병원성 박테리아 종의 성장을 예방한다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 환자에서 하나 이상의 병원성 박테리아 종을 사멸시킨다.

일부 구현예에서, 본 발명은 복수의 박테리아 속으로부터 단리된 박테리아 속의 적어도 하나의 집단을 포함하는, 조성물 및 방법을 제공한다. 당해 분야의 숙련가는 16S 리보솜 RNA의 서열분석 또는 특정 DNA 프로브의 검출에 의해 본 발명의 조성물의 박테리아 성분을 결정할 수 있다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 기원으로부터의 미생물총은 우선 바이러스, 기생충, 등과 같은 생물학적 위험에 대해 처리된다.

본 발명의 구현예의 또 다른 양태에 따르면, 그것의 구현예의 약제학적 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어가 제공된다.

*일부 구현예에서, 상기 조성물은 그것을 필요로 하는 대상체에서 본 명세서 도처에 기재된 임의의 질환, 의학적 상태, 또는 장애와 관련된 의학적 상태를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 그 자체로서 또는 약제학적 조성물의 일부로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상기 조성물을 투여함으로써 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 염증성 장 질환, 만성 피로 증후군, 소장 박테리아 과성장 증후군, 비만, 암, 박테리아 질증, 결장염, 당뇨병, 우울증, 변비, 등을 비-제한적인 방식으로 치료하기 위해 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적 조성물"은 본 명세서에 기재된 조성물과 다른 화학적 성분 예컨대 생리적으로 적합한 캐리어 및 부형제와의 제제를 지칭한다. 상기 캐리어는 약제학적 조성물이 환자에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액, 등으로 제형화될 수 있게 한다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체로 화합물의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다. 본 명세서에서, 용어 "부형제" 및 "약제학적으로 허용가능한 제제"는 상호교환적으로 사용되며, 비제한적으로 하기로부터 선택된 조성물의 투여를 더 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 적어도 하나의 불활성 서브스턴스를 지칭한다: 안정화제, 보존제, 킬레이트제, 점도 개질제, 완충제, 및 pH 조정제. 적합한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 직장, 경점막, 특히 경비, 장내, 또는 근육내, 피하, 및 수질내 주사를 포함하는 비경구 전달, 뿐만 아니라 척추강내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 심장내, 비강내, 또는 안구내 주사를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 직장 투여를 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 경구 투여를 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 국부 투여를 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 상기 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에서 잘 알려진 과정에 의해, 예를 들면, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다.

일반

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ± 10 %를 지칭한다.

용어들 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 및 이들의 콘주게이트(conjugate)는 "비제한적으로 포함하는"을 의미한다. 용어 "구성된(consisting of)"은 "포함하고 제한된(including and limited to)"을 의미한다. 용어 "본질적으로 구성된"은 추가 성분, 단계 및/또는 부분이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적 및 신규한 특징을 실질적으로 변경시키지 않는 경우에만 조성물, 방법 또는 구조가 추가 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있음을 의미한다.

단어 "예시적인"은 "예, 사례 또는 실례로서 사용되는 것"을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. "예시적인"으로 기재된 임의의 구현예는 반드시 다른 구현예에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되지 않으며 및/또는 다른 구현예로부터의 특징의 포함을 배제하는 것은 아니다.

단어 "선택적으로"는 "일부 구현예에서 제공되며, 다른 구현예에서 제공되지지 않음"을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 본 발명의 임의의 특정 구현예는 그와 같은 특징이 상충되지 않는 한 복수의 "선택적인" 특징을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 맥락상 달리 분명히 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.

본원 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷으로의 기재는 단지 편의성 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하며, 발명의 범위를 융통성 없이 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.

수치 범위가 본 명세서에서 나타날 때마다, 나타낸 범위 내의 임의의 인용된 숫자 (분수 또는 정수)가 포함되는 것을 의미한다. 어구 제1 표시 수와 제2 표시 수 사이의 "범위인/범위이다" 및 제1 표시 수 "내지" 제2 표시 수 "범위인/범위이다"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 제1 및 제2 표시 수 및 그 사이의 모든 분수 및 정수가 포함되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "방법"은, 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야 종사자에게 공지된 또는 상기 종사자에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발되는, 비제한적으로, 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하는 소정의 과제를 완수하기 위한 방식, 수단, 기술, 및 절차를 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 병태를 없애거나, 실질적으로 억제하거나, 이의 진행을 늦추거나 역전시키는 것, 병태의 임상적 또는 미학적 증상을 실질적으로 완화시키는 것 또는 병태의 임상적 또는 미학적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.

"A, B, 및 C, 등 중 적어도 하나"와 유사한 협약이 사용되는 경우에, 일반적으로 그와 같은 구성은 당해 분야의 숙련가가 그 협약을 이해할 것이라는 의미에서 의도된다 (예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 비제한적으로 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께, 등을 갖는 시스템을 포함할 것이다). 설명, 청구항 또는 도면에서 2 개 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 이원적인 단어 및/또는 어구는 그 용어 중 하나, 그 용어 중 어느 하나, 또는 그 용어 둘 모두를 포함할 가능성을 고려하도록 이해되어야 한다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

간결하게 하기 위해, 별개의 구현예와 관련하여 기재된 본 발명의 어떤 특징은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있음이 인정된다. 반대로, 간결하게 하기 위해, 단일 구현예와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기재된 구현예에 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 구현예와 관련하여 기재된 어떤 특징은 그 구현예가 이들 요소 없이는 작동하지 않는 한, 이들 구현예의 본질적인 특징으로 간주되어서는 안된다.

위에서 기술되고, 하기 청구항 부문에서 청구된 바와 같이 본 발명의 다양한 구현예 및 양태는 하기 실시예에서 실험적 근거를 마련한다.

실시예

이제, 상기 설명과 함께, 본 발명을 비제한적인 방식으로 설명하는 하기 실시예를 참조한다.

실시예 1

입자에서 배설물-유래 박테리아의 배양

100 gr의 신선한 배설물을 블렌더에서 600 ml 염수 용액과 혼합하였다. 상기 혼합물을 스트레이너(strainer)를 통해 1회 여과한 다음 거즈 패드를 통해 2회 더 여과했다. 여액의 작은 일부를 -20 ℃에서 유지시켰다. 동등량의 석류 종자, 패션 프루트 종자 및 인산제2칼슘 (DCP) 니젤라를 함유하는 입자 혼합물을 제조하였다.

10 g의 상기 혼합물을, 60 ml의 여과된 신선한 배설물을 각각 함유하는 8개의 병에 주입했다. 4개의 병은 37 ℃에서 호기성 조건에서 인큐베이션하였고 (병 1-4), 나머지 4개의 병은 37 ℃에서 7 일 동안 혐기성 조건에서 인큐베이션하였다 (병 5-8).

병 처리:

병 1 및 5:

인큐베이션 7 일 후 배설물 액체를 꺼내고, 매트릭스를 부드럽게 2회 세정하였다 (25 ml 멸균된 PBSX1로 1회 그리고 10 ml 멸균된 PBSX1로 다시 세정). 상기 병을 30 초 동안 3 회 와동시키고, 상기 액체로부터의 샘플을 취해 16S 리보솜 RNA (rRNA)를 서열분석했다.

병 2 및 6:

인큐베이션 7 일 후, 60 ml 트립신 대두 액체배지 (TSB)를 첨가하고, 병을 7 일 더 인큐베이션하였다. 성장 배지를 꺼내고, 매트릭스를 부드럽게 2회 세정하였다 (25 ml 멸균된 PBSX1로 1회 그리고 10 ml 멸균된 PBSX1로 다시 세정). 상기 병을 30 초 동안 3 회 와동시키고, 상기 액체로부터의 샘플을 취해 16S rRNA 서열분석을 했다.

병 3 및 7:

인큐베이션 7 일 후, 60 ml의 보강된 클로스트리듐 배지 (RCM) 액체배지를 첨가하고, 병을 7 일 더 인큐베이션하였다. 성장 배지를 꺼내고, 매트릭스를 부드럽게 2회 세정하였다 (25 ml 멸균된 PBSX1로 1회 그리고 10 ml 멸균된 PBSX1로 다시 세정). 상기 병을 30 초 동안 3 회 와동시키고, 상기 액체로부터의 샘플을 취해 16S rRNA 서열분석을 했다.

병 4 및 8:

인큐베이션 7 일 후, 60 ml 멸균된 배설물 (0.2 μm의 필터를 통해 여과된 배설물 여액) 액체배지를 첨가하고, 병을 7 일 더 인큐베이션 하였다. 성장 배지를 꺼내고, 매트릭스를 부드럽게 2회 세정하였다 (25 ml 멸균된 PBSX1로 1회 그리고 10 ml 멸균된 PBSX1로 다시 세정). 상기 병을 30 초 동안 3 회 와동시키고, 상기 액체로부터의 샘플을 취해 16S rRNA 서열분석을 했다.

서열분석 준비:

각각의 병으로부터 2 ml 샘플 (제2 세정 및 와동 후)을 14000 rpm에서 2 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 100 μl의 멸균 PBSX1을 상기 샘플에 첨가하고, 각각의 샘플로부터 DNA를 정제하였다.

유동으로 박테리아 성장:

상기 프로토콜에 따라 배설물 박테리아를 입자와 정적 성장시킨 후, 상기 입자를 혐기성 조건 또는 호기성 조건에서 7 일 동안 10-12 ml/시간의 유량으로 병 1 및 5로부터 성장 배지의 조합 (상기 열거됨)을 포함하는 유리 칼럼으로 옮겼다. 샘플을 취하고, PBSX1로 세정하고, 서열분석하였다.

개시 물질 (배설물 샘플) 및 본 발명의 일부 구현예에 따라 배양된 조성물에 존재하지만, 배설물 샘플에 존재하는 다양한 계통발생적 수준에서 미생물의 정량화를 포함하는 결과를 표 1-7에 나타내었다.

'+' 기호는 특정 병에 있는 속의 존재를 나타낸다. 배설물에 존재하는 31개의 속 중에서, 단지 2개의 속만이 어떤 병에도 나타나지 않았다. 이것은 다양한 병의 조합 후 최초 배설물 샘플과 93%의 유사성을 나타낸다.

*

'+' 기호는 특정 병에 있는 속의 존재를 나타낸다. 최초 배설물에 나타난 68개의 속 중에서, 단지 4개의 속만이 어떤 병에도 나타나지 않았다. 이것은 최초 배설물 샘플과 94%의 유사성을 나타낸다.

실시예 2

기원 미생물총으로서 토양을 사용하는 입자상의 생물막 성장

신선한 토양 샘플을 수득하고, 혼합하였다. 작은 부분을 서열분석으로 전송하였다 (최초 샘플). 나머지를 PBSX1에서 혼합하고, 25 ml를 석류, 패션 프루트, DCP 및 MCC 입자를 포함하는 멸균 매트릭스 2 gr을 함유하는 샘플 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 100 rpm으로 밤새 진탕시키면서 PBSX1에서 생물막으로 성장시켰다. 인큐베이션 1 일 후, 샘플의 일부를 서열분석하였다 (토양 생물막 1 - B1). 나머지를 뇌-심장즙 배지 (BHI), LB, 1/4 LB 및 브루셀라 액체배지를 포함하는 4 가지 상이한 합성 성장 배지 (각각의 튜브에 1개씩)와 인큐베이션하였다. 상기 튜브를 100 rpm에서의 2 시간 진탕을 포함하여 4일 동안 생물막으로 성장시켰지만, 나머지 시간에는 상기 튜브는 정적 상태에 있었다. 성장 배지를 매일 교체하였다. 모든 튜브로부터의 생물막을 다시 배합하고, 서열분석하였다 (토양 생물막 5 - B5).

대조군으로서, 토양 박테리아를 매트릭스 없이 플랑크톤 성장 조건 하에 튜브에서 성장시켰다. 토양 박테리아가 포함된 튜브를 PBSX1에 넣고 230 rpm으로 밤새 진탕시켰다. 인큐베이션 1 일 후, 소량의 액체를 서열분석하였다 (토양 플랑크톤 1 - P1). 나머지를 원심분리하고, 박테리아 펠릿을 BHI, LB, ¼ LB 및 브루셀라 액체배지를 포함하는 4 가지 상이한 합성 성장 배지로 분할하였다. 상기 튜브를 230 rpm에서 일정하게 진탕시키면서 4일 더 플랑크톤 조건에서 성장시켰다. 성장 배지를 매일 교체하였다. 모든 튜브로부터의 생물막을 다시 배합하고, 서열분석하였다 (토양 플랑크톤 5 - P5).

결과

서열 분석 결과는 표 9 및 도 3에 주어진다. 최초 토양 미생물총은 154개의 박테리아 과를 포함하였다. 43개의 박테리아 과는 B1 생물막 샘플에서 확인되었으므로 기원 미생물총과 28 %의 유사성을 나타냈다. 상응하는 플랑크톤 샘플 (P1)은 25 개의 박테리아 과를 함유하므로 기원 미생물총과 16 %의 유사성을 나타냈다.

토양 박테리아는 일반적으로 활성, 휴면 및 비-생존의 3개의 상태로 나뉜다. 당해 분야에 따르면, 토양 중의 활성 박테리아는 이상적인 조건 하에 약 0.1 내지 약 50 %로 다양하다. 따라서, 샘플이 50 % 활성 세포를 갖는다고 가정하면, 유사성의 조정된 비율은 약 56 %에 이른다.

박테리아 과의 유사성을 비교하기 위해서 배열 분석을 수행하였다. 탈경향 대응 분석 (DCA)은 풍부한 데이터가 있는 생태 데이터 세트에 사용하기 위해 특화된 다변량 배열 모델이다. DCA 분석 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이 플랑크톤 샘플과 비교하여 매트릭스 성장 샘플에서 최초 토양 미생물총의 더 높은 존재비(abundance) 및 유사성을 보여주었다. 상이한 유사성 또는 거리 지수에 근거한 토양 최초 미생물총과 다른 샘플 사이의 유사성 비교를 수행하였다. 브레이-커티스(Bray-Curtis) 및 심슨(Simpson) 지수에서, 2 개의 샘플은 지수 값이 1에 가까울 때 더 가까워진다. 유클리디안 거리(Euclidean distance)에서, 작은 지수 값은 더 큰 근접성을 나타낸다. 이러한 분석 결과는 표 10에 주어진다.

이러한 결과는 분석된 샘플의 거리 매트릭스에 기반한 비-계량적 다차원 척도법 (multidimensional scaling; MDS)과 같은 다른 배열 분석 모델에 의해 뒷받침된다. MDS 분석은 데이터의 본질에 따라 상이한 유사성 지수를 사용하여 수행될 수 있다. MDS 분석은 샘플에 존재하는 종의 수 (OTU), 뿐만 아니라 각각의 종의 상대적 존재비를 고려한 심슨 유사성 지수에 기초하였다. 이 분석은 또한, 도 5에서 나타낸 바와 같이 플랑크톤 샘플과 비교하여 매트릭스 성장 샘플에서 최초 미생물총의 더 높은 존재비 및 유사성을 보여준다.

매트릭스 성장 샘플을 플랑크톤 성장 샘플과 배합함으로써 공급원과 더 높은 비율의 유사성을 포함하는 조성물을 생산하는 것이 가능하다. 이 실험에서 매트릭스 성장 샘플에 존재하는 박테리아 과를 플랑크톤 성장 샘플과 배합하여 공급원과 40 % 유사성을 포함하는 조성물을 수득하였다.

토양 샘플의 일부 (토양 P1, P5 및 B5)에서, 하나의 속은 다른 속보다 실질적으로 더 풍부하다. 예를 들어, B5 샘플에서 클렙시엘라 속의 상대 존재비는 38 %였다. 공동-배양에서 상이한 균주는 자원에 대해 서로 경쟁하기 때문에, 특정 속 또는 과의 백분율을 감소시키면 더 풍부한 다양성을 허용할 수 있다. 항생제, 박테리오파아지, 경쟁하는 박테리아 또는 샘플에서 특정 집단을 감소시켜 더 많은 속이 성장하게 하는 임의의 다른 방법을 사용하는 것은 선택 사항이다.

실시예 3

기원 미생물총으로서 인간 구강 미생물총을 사용한 입자상의 생물막 성장

인간의 구강으로부터 5 개의 스왑(swab)을 채취하고, 하나는 즉시 서열분석으로 전송되고 (최초 샘플), 다른 4개는 석류, 패션 프루트, DCP 및 MCC 입자의 멸균 매트릭스 2 gr 및 BHI, LB, 1/4 LB 및 브루셀라 액체배지를 포함하는 4가지 상이한 성장 배지 (각각의 튜브에 1개씩)를 함유하는 상이한 튜브에 각각 넣었다. 상기 튜브는 100 rpm의 진탕 조건에 밤새 두었다. 다음 날, 배지를 새로 교체하고, 상기 튜브를 또 다른 4일 동안 생물막으로 성장시켰다. 그 다음 모든 샘플로부터 생물막이 있는 매트릭스를 통합하고, 서열분석하였다.

구강 스왑 샘플의 서열 분석 결과 49개의 박테리아 과가 확인되었다. 이들 중에서, 표 11에서 상세히 설명된 바와 같이 최초 미생물총과 35% 유사성에 달하는 17개의 박테리아 과가 성장 생물막 샘플에서 확인되었다.

실시예 4

기원 미생물총으로서 냉동된 샘플을 사용하는 입자상의 생물막 성장

박테리아 군집을 토양 미생물총 및 구강 미생물총 (실시예 2 및 3) 및 개별 균주 또는 2개의 알려진 균주의 혼합물로부터 수득하여 규모 확대 공정의 가능성을 조사하였다.

-20 ℃에서 1 주 동안 저장된 토양 미생물총 및 구강 미생물총 샘플에서 박테리아의 생존력을 확인하였다. 이것은 LB, MRS, RCM, 브루셀라와 같은 상이한 한천 배지에서 이중으로 3 μL의 희석액을 해동하고 플레이팅하여 수행되었다. 플레이트를 실온에서 호기성 및 혐기성 조건 하에 인큐베이션하였다. 스톡으로부터의 L. 플란타룸 및 B. 론굼(B. longum)을 각각 MRS 및 RCM 한천 플레이트에 플레이팅하고, 혐기성 후드에서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 다음 날, 플레이트에서 박테리아 성장을 확인하였다. 플레이트를 실온에서 혐기성 및 호기성 조건 하에 주말 동안 인큐베이션하였다. L. 플란타룸 및 B. 론굼의 몇몇 작은 콜로니를 각각 MRS 및 RCM 액체배지에 첨가하였다. L. 플란타룸을 180 rpm으로 진탕시키면서 호기성 조건으로 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. B. 론굼을 혐기성 후드에서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 각각의 균주 (L. 플란타룸 및 B. 론굼)의 광학 밀도 (OD)를 측정하고, 표 12에 따라, 새로운 멸균 튜브에서 0.1의 최종 OD까지 각각의 균주의 희석을 수행하였다.

샘플을 30 ℃에서 2 시간 동안 100 rpm의 진탕에서 인큐베이션 하였다. 2 시간 후, 상기 튜브를 그것의 각각의 증식 조건 (표 12에 따라)으로 옮겼다.

토양 및 구강 미생물총의 배양 용적 규모 확대를 위해, 각각의 샘플의 하나의 튜브를 500 rpm으로 2 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 튜브마다 10 mL의 PBSX1을 첨가하였다. 상기 튜브를 인큐베이터에서 1분 동안 100 rpm으로 부드럽게 혼합하였다. 각각의 샘플은 80 μm의 진공 필터를 통해 옮겨졌다. 3 개의 샘플로부터의 매트릭스를 조합하고, DNA 서열 분석을 위해 보내졌다.

배양 용적의 규모 확대를 위한 또 다른 접근법은 해동된(defrosted) 매트릭스 입자를 새로운 매트릭스로 이동시킴으로써 시험되었다. 각각의 L. 플란타룸 및 B. 론굼 샘플의 하나의 튜브를 500 rpm으로 2분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 튜브마다 10 mL의 PBSX1을 첨가하였다. 상기 튜브를 100 rpm으로 인큐베이터에서 1분 동안 부드럽게 혼합하였다. 각각의 샘플은 80 μm의 진공 필터를 통해 옮겨졌다. 마지막으로, 1 gr의 매트릭스 입자를 새로운 매트릭스 병으로 옮겼다. 배양 용적의 규모 확대를 위한 또 다른 접근법은 L. 플란타룸 및 B. 론굼 샘플의 생물막 탈착된 박테리아를 이동시킴으로써 시험되었다. 각각의 샘플의 하나의 튜브를 500 rpm으로 2 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 샘플을 10 mL PBSX1로 1 회 세정하고, 여과하였다. 1 mL RCM 액체배지를 첨가하고, 샘플을 30 초간 고속으로 3 회 와동시켰다. 상청액을 새로운 매트릭스로 옮겼다.

L. 플란타룸 및 B. 론굼 샘플만의 정량화 및 내산성을 위해, 각각의 샘플의 배지를 제거하고, 튜브당 10 mL의 PBSX1을 첨가하고, 100 rpm의 인큐베이터에서 1 분 동안 부드럽게 혼합하였다. 샘플을 80 μm의 진공 필터로 옮기고, 여과 후 잘 혼합하였다. 각각의 샘플에 5 ml의 pH 2 용액을 첨가하여 pH 2에서의 내산성을 시험하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 5 ml PBSX1로 1회 세정하고, 1 mL의 PBSX1을 첨가하고, 이어서 고속으로 30 초간 3 회 와동시켰다. 각각의 샘플에 5 ml의 pH 7 용액을 첨가하여 pH 7에서의 내산성을 시험하였다. 세포를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 5 ml의 PBSX1로 1회 세정하고, 1 mL의 PBSX1을 첨가하고, 이어서 고속으로 30 초간 3 회 와동시켰다. 장기간 인큐베이션을 위해, 나머지 튜브 (대조군 튜브 포함)를 표 12에 명시된 조건에 따라 인큐베이션하였다.

토양 및 구강 미생물총의 박테리아 성장은 호기성 및 혐기성 증식 조건에서 수행된 각각의 희석에서 상이한 배지에서 관측되었다. 토양 매트릭스 및 토양 플랑크톤 공급원에서 관측된 박테리아 성장은 구강 샘플에서 관측된 것보다 더 높았다 (토양 샘플에서 플레이트 당 평균 400개가 넘는 콜로니 대 구강 샘플에서 110개의 콜로니). 일반적으로 이동과 관련하여, 결과는 소규모 매트릭스에서 중규모 매트릭스로의 양호한 이동을 보여주었다. 소규모에서 24시간의 인큐베이션 후 얻어진 박테리아의 양은 도 6에 요약된다. 인큐베이션 후, 소규모 매트릭스로부터의 접종물을 중규모 매트릭스로 옮겼고, 도 7에서 설명된 바와 같이, 평균적인 박테리아 성장은 개선되었다. 흥미롭게도, 락토바실러스 및 비피도박테리움이 함께 접종되었을 때 박테리아의 유의한 성장이 중규모에서 관측되었다. 또한, 박테리아 이동은 2 가지 유형의 접종: 생물막 또는 생물막 매트릭스로부터 탈착된 박테리아에 따라서 평가되었다. 결과는, 도 8에서 실증된 바와 같이, 매트릭스 접종물이 비피도박테리움 성장에 유리할 수 있음을 나타낸다.

도 9는 중규모 조건에서 내산성 및 박테리아 생존을 나타내었다. 따라서, 박테리아 세포수는 pH 7 또는 pH 2에서 매우 유사하다. 이러한 결과는 이전의 결과와 일치하며, 생물막으로서 박테리아의 pH 내성이 더 높음을 시사한다. 중규모 공정이 박테리아 탈착된 접종물로부터 개시될 때 내산성 시험에서 유의한 차이가 관측되지 않았다.

실시예 5

L. 플란타룸 균주를 새로운 플레이트에서 채취하고, 37 ℃에서 25 mL의 MRS 액체배지 중에서 48 시간 동안 성장시켰다. 15 ml를 밀기울 튜브로, 7 ml를 석류 종자 튜브로 옮기고, 3일 동안 인큐베이션하였다. 표 13은 그램당 박테리아 세포수를 나타낸다.

실시예 6

항생제 내성

L. 플란타룸 균주를 37 ℃에서 200 mL의 25 % MRS 액체배지 및 80 gr의 DCP 입자에서 성장시켰다. 병의 캡에는 병의 바닥까지 가는 2 개의 실리콘 튜우빙이 있었다. 병으로부터의 튜브 중 하나는 2 리터 PVC 병에 연결되었으며, 캡에는 실리콘 튜브를 위한 2개의 아웃팅(outing)이 있다. PVC 병은 1500 ml의 25 % MRS로 채워졌다. 상기 병을 정적 조건 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 그것은 유동 조건 하에 15 rpm의 틸트 진탕기에서 6일 동안 인큐베이션되었다. 하기의 항생제 내성을 시험하기 위해 상이한 농도의 카르베니실린을 첨가하였고: 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 및 256 μg/ml 및 정적 조건 하에 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

결과

도 10은 4 μg/ml의 카르베니실린으로부터 L. 플란타룸 균주의 성장 억제를 설명한다.

본 발명이 그것의 구체적인 구현예와 관련하여 기재되었더라도, 많은 대안, 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것임이 명백하다. 따라서, 첨부된 청구항들의 사상 및 넓은 범위 내에 속하는 그와 같은 모든 대안, 변형 및 변화가 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 참고로 편입되기 위해 구체적으로 및 개별적으로 설명된 것과 동일한 정도로 그 전문이 본 명세서에 참고로 편입된다. 또한, 본원에서 임의의 참조 문헌의 인용 또는 확인은 그와 같은 참조 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 사용될 수 있다는 인정으로 해석되어서는 안된다. 부문 제목이 사용되는 한, 반드시 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims

성장, 증식 또는 이들 둘의 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물을 포함하고 미생물총 기원 집단과 적어도 30% 유사성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 적어도 하나의 기원으로부터의 미생물총을 포함하는 복수의 박테리아 과를 제공하는 단계;
b. 상기 복수의 박테리아 과를 현탁시켜 박테리아 과 용액을 얻는 단계;
c. 상기 복수의 박테리아 과 용액을 여과하여 상기 복수의 박테리아 과를 포함하는 여액을 수득하는 단계;
d. 상기 여액을 하나 이상의 유형의 입자와 인큐베이션하고, 상기 복수의 박테리아 과를 상기 입자에 부착시키는 단계;
e. 상기 입자에 부착된 상기 복수의 박테리아 과를 복수의 박테리아 용액 서브셋(subset)으로 분할하는 단계;
f. 각각의 박테리아 용액 서브셋을 성장 배지에서 그리고 개별 서브셋의 증식에 적합한 증식 조건 하에 배양하는 단계; 및
g. 상기 성장 배지를 제거하고, 개별 서브셋을 다시 결합시키는 단계;를 포함하고,
이로써 성장, 증식 또는 이들 둘의 조건이 상이한 적어도 2개의 뚜렷이 다른 박테리아 과의 공동-배양물을 포함하고 미생물총 기원 집단과 적어도 30% 유사성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 수득하는 방법.
청구항 1에 있어서, 미생물총 기원 집단은 표 1, 2, 8, 9 및 11 중 어느 하나에 나열된 미생물총을 포함하는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 증식 조건은 호기성, 혐기성, 미호기성(microaerophilic), 유동(flow), 진탕, 정적(static), 습한 조건, 저습도 조건 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, e. 단계의 상기 복수의 박테리아 용액 서브셋은 적어도 하나의 플랑크톤 박테리아를 포함하는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 미생물총 기원 집단은 건강한 포유동물, 동물 공여체, 박테리아 균주, 저장된 미생물총 샘플, 박테리아 콜로니, 플랑크톤 샘플, 환경 적소(environmental niche) 및 생물막 중 하나 이상으로부터 유래되는 것인, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 환경 적소는 토양, 지하수, 및 개빙 구역(open waters) 중 어느 하나를 포함하는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 미생물총 기원 집단은 장내 미생물총, 구강 미생물총, 타액 미생물총, 피부 미생물총, 기관지 미생물총, 질 미생물총, 토양 미생물총, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 복수의 박테리아 과는 배설물(fecal) 샘플, 타액 샘플, 피부 샘플, 구강 샘플, 기관지 샘플, 질 샘플, 토양 샘플, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 입자는 셀룰로스 섬유를 포함하는 입자, 셀룰로스 입자, 미세결정성 셀룰로스 (MCC), 인산제2칼슘 입자 (DCP), 종자, 분쇄된 종자, 알갱이, 벤토나이트 점토를 포함하는 입자, 모래 입자, 백점토 입자, 아가로스 비드 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 입자를 포함하는 것인, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 플랑크톤 성장 조건에서 적어도 하나의 박테리아 용액 서브셋을 배양하고; 플랑크톤 성장 조건에서 배양된 상기 적어도 하나의 박테리아 용액 서브셋과 g. 단계의 다시 결합된 개별 서브셋을 다시 결합하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.