CN112111433A - 一株具有耐酸耐胆盐活性的植物乳杆菌lzu-j-qa85及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有耐酸耐胆盐活性的植物乳杆菌及应用。本发明提供了一株耐酸耐胆盐的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU‑J‑QA85，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU‑J‑QA85于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61192，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU‑J‑QA85的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU‑J‑QA85具有较强的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，在模拟胃液和肠液中培养后的存活率显著高于鼠李糖乳杆菌LGG；且能够显著抑制肠道致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的活性；同时菌株具有较强的抗氧化活性，能够显著耐受过氧化氢。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有耐酸耐胆盐活性的植物乳杆菌LZU-J-QA85及其应用。
背景技术
植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌，可发酵碳水化合物并且产生大量乳酸，因其优越的发酵性能和多样的功能性，得到广泛的关注，其发酵食品在全球各地食用历史悠久，同时也是公认安全(GRAS)的食用菌种。目前，植物乳杆菌已被广泛地应用到营养保健、发酵食品、生物医药、饲料、畜牧养殖等行业中。植物乳杆菌也是人体胃肠道的益生菌群，代谢可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质，具有调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等作用。其中鼠李糖乳杆菌LGG是益生菌中研究最多、功能性最多的一种益生菌。LGG菌可以定殖在人体内长达两周之久，能有效改善调整人体胃肠道菌群群落，对人体健康非常有益，并且LGG在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道。但是LGG菌的抗氧化活性较弱，且胃肠耐受性较差，不利于在人体胃肠道中定值。
因此非常有必要筛选出一株新的既具有强抑菌效果，胃肠耐受性好，且具有一定抗氧化活性的植物乳杆菌。其中益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。目前应用最为广泛的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌等，可以调整肠道菌群平衡，提高蛋白质和维生素的代谢，产生抗菌素来抑制有害菌群生长，抗肿瘤，增强免疫力，降低血清胆固醇等。其中具有抗氧化活性的益生菌可以通过清除人体内过多的自由基来使人体维持正常状态，发挥抗衰老作用，因此，对于抗氧化活性较强的益生菌的筛选较为关键。
虽然目前已经筛选出了多种具有抗氧化活性的植物乳杆菌，但是，普遍存在抑菌效果差或胃肠不耐受性等缺点。其中，中国专利CN109182162A提供了一种高原植物乳杆菌，具有一定的抗氧化活性，能够有效清除机体内自由基，但是其在肠液中的存活率较低，胃肠耐受性较弱；中国专利CN104789511A提供了一株植物乳杆菌AB-2，具有广谱的抑菌性能，但是对胆盐的耐受性较弱。
本发明从海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品中筛选出了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85，所述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LZU-J-QA85具有良好的抑菌活性和胆盐耐受性，且具有较强的抗氧化活性及抑菌能力，可用于制备调节肠道菌群和抗氧化的药品和保健品。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LZU-J-QA85，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85筛选于海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品中，并于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61192，2020年9月21日检测为存活，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，联系电话020-87137633。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备抑制肠道致病菌药物或药物组合物中的应用。
优选地，所述肠道致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备耐缺氧保健品中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备食品或食品添加剂中的应用。
优选地，所述食品添加剂为抗氧剂。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备抗氧化药物或药物组合物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备耐缺氧保健品中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备动物饲料中的应用。
本发明的有益效果是：①本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumLZU-J-QA85具有良好的胃肠耐受性和胆盐耐受性，在模拟胃液和肠液中培养后的存活率显著高于鼠李糖乳杆菌LGG；②本发明提供的植植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85具有较好的抑菌活性，能够显著抑制肠道致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌；③本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85具有较强的抗氧化活性，能够显著耐受过氧化氢酶。
附图说明
图1不同菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌效果图；
图2菌株LZU-J-QA85的系统发育树；
图3菌株LZU-J-QA85在模拟胃液和肠液中的存活率；
图4菌株LZU-J-QA85在模拟肠液中的存活率；
图5菌株LZU-J-QA85的抗氧化活性结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
在本发明的下述实施例中所用菌株来源如下：
菌株TS(L)-12、LZU-J-QA85、QA-X-3、GL-5、LX-I-1、GG-V-7均分离于来自青海果洛地区的牧民家自制发酵乳制品；鼠李糖乳杆菌菌株LGG作为阳性对照菌株，购自北纳创联生物技术有限公司(菌种编号为BNCC 136673)；指示菌大肠杆菌(BNCC 336902)、金黄色葡萄球菌(BNCC 186335)、白色念珠菌(BNCC 176009)购自北纳创联生物技术有限公司；植物乳杆菌GL-5为实验室前期分离获得的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GL-5，于2019年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.18988(具体参见专利申请202010100157.7)。
其他实验材料和仪器如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1植物乳杆菌的分离与活性检测
1.1分离
取来自海拔4000m以上的青海果洛地区牧民家自制的发酵乳制品0.5g左右，用PBS分别稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8的浓度梯度，各个浓度吸100μL到加有碳酸钙的改良型MRS固体培养基上涂布均匀，每一浓度两个重复。放置于37℃恒温培养箱内培养48h后观察菌落以及透明圈产生的情况，便于进一步分离纯化。
1.2纯化培养
从以上培养的浓度梯度中选择一合适的梯度，挑选边界清晰可见并均有透明圈的单菌落15-25个，挑选出来的菌落采用划线法在新制的MRS固体培养基上传代培养24-48h，再次划线培养，此步骤共重复三次，以获得单克隆菌株。此菌株通过MRS液体培养基培养24h后，获得包括TS(L)-12、LZU-J-QA85、QA-X-3、GL-5、LX-I-1、GG-V-7在内的10株菌株，并将将上述菌液于50％甘油中保存。
1.3菌株活性筛选
1.3.1抑菌活性
取50％甘油中保存的上述菌液按2％接种量接种到1.5ml的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到2ml装有MRS液体培养基的EP管中并置于37℃恒温培养箱中培养18h进行二代培养后放4℃备用；
本实施例所用的指示菌株分别是大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和白色念珠菌(Candida albicans)，将指示菌分别用LB培养基和营养肉汤培养基培养15h，用麦氏比浊法将每个指示菌的浓度调至1-3×108DFU/mL，放4℃冰箱备用。
将已培养18h的乳酸菌培养液500g离心10min，取上清备用。取100μL已活化指示菌，调整指示菌的浓度为1.5×108CFU/mL，在相应的培养基上进行涂板，涂布后培养皿置于超净工作台半敞开10min，在固体培养基摆好的牛津杯中加如上述保存的种子菌液上清液200μL，平稳放在37℃培养18h，观察测量每种菌液的抑菌圈直径，平行做三组实验。
抑菌实验表明，上述菌株中的TS(L)-12、LZU-J-QA85、QA-X-3、GL-5、LX-I-1、GG-V-7对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌作用，结果如图1所示，菌株TS(L)-12、LZU-J-QA85、QA-X-3、GL-5、LX-I-1、GG-V-7对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径分别为1.25cm、2.60cm、1.50cm、2.25cm、1.85cm、0.85cm，对大肠杆菌的抑菌圈分别为0.20cm、2.00cm、0.55cm、1.93cm、1.40cm、0.93cm，其中菌株LZU-J-QA85对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有显著的抑菌效果，抑菌圈分别高达2.60cm和2.00cm。而且上述菌株TS(L)-12、LZU-J-QA85、QA-X-3、GL-5、LX-I-1、GG-V-7中只有菌株LZU-J-QA85对白色念珠菌也具有一定的抑菌效果，抑菌圈为0.7cm。
实施例2菌株LZU-J-QA85的鉴定与保藏
2.1菌株LZU-J-QA85的16S rRNA的序列分析
选取实施例1中抑菌活性较好的菌株LZU-J-QA85，提取基因组DNA，使用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增：
上游引物为，27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；
下游引物为；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
PCR扩增体系；
50μL反应总体系包含：2×Mix Taq，25μL；Primers(10μM)：上游引物(Forward)，2.0μL，下游引物(Reverse)，2.0μL；DNA模板(100ng/μL)，2.0μL；ddH2O，19μL。
PCR反应条件：
预变性：94℃，4min；94℃变性，1min；55℃复性，1min；72℃延伸，1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。
反应在Bio-Rad iCycler Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)仪器上进行。扩增产物送交上海生工生物科技有限公司进行测序。测序结果提交到GenBank数据库。
菌株LZU-J-QA85的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库，利用BLAST搜索同源性较高的序列，用CLUSTAL X 1.81和MEGA 6.0软件进行序列的比对分析并建立系统发育树(图2所示)。可知该菌株隶属于乳杆菌属(Lactobacillus)，初步确定该菌为植物乳杆菌LZU-J-QA85。
2.2菌株初步鉴定与保藏
挑取单克隆菌株LZU-J-QA85通过革兰氏染色及过氧化氢产气实验初步证明是植物乳杆菌LZU-J-QA85，命名为Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85，于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61192，并于2020年9月21日检测为存活，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，联系电话020-87137633。
实施例3菌株LZU-J-QA85对模拟胃液和肠液的耐受性
模拟胃液配置：配制pH值为7.4的PBS缓冲液，加入适量的稀盐酸调pH值为3.0，定容至100ml，再称取1.0g胃蛋白酶加入其中，0.22μm滤膜过滤，备用。
模拟肠液配置：配制pH值为8.0的PBS缓冲液，定容至100ml，称取0.3g猪胆盐，1.0g胰蛋白酶，融入其中，0.22μm滤膜过滤，备用。
菌液配置：取50％甘油中保存的菌株LZU-J-QA85，以及对照菌株植物乳杆菌菌株GL-5和LGG，分别按2％接种量接种到1.5ml的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到5ml的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培5养箱中培养18h进行二代培养。18h后6000r/min离心10min，弃去上清，沉淀的菌体用同弃去的上清等体积的生理盐水洗涤两次后制成菌悬液，备用。
涂板试验：取1ml的上述菌悬液分别接种到9ml的上述已备的模拟胃液中，摇匀置于37℃，90r/min的恒温摇床进行培养。按10倍稀释法进行稀释，并选择合适的稀释度进行涂板，每个稀释度重复两个，在1.5h、3h各取0.1ml的进行涂板，37℃恒温培养48h后计菌落数；取1ml上述培养3h的模拟胃液加到9ml的已备好的模拟肠液中，摇匀置于37℃，90r/min的恒温摇床进行培养，在3h、6h、9h时进行涂板，37℃恒温培养48h后计数。
胃液耐受结果如图3所示：结果表明，与阳性LGG菌和菌株GL-5相比，菌株LZU-J-QA85具有较好的胃液耐受性，其中菌株LZU-J-QA85在pH3.0的模拟胃液中培养3h之后，其存活率(菌的存活率＝接种后某时活菌数/初始的活菌数×100％)仍然高达153.79％，显著高于菌株LGG及菌株GL-5在模拟胃液中的存活率，说明菌株LZU-J-QA85具有较高的耐酸性和抗胃蛋白酶的能力，可以在胃液中定值生长。
肠液耐受结果如图4所示：经模拟胃液培养3h后的菌株LZU-J-QA85再经过模拟肠液培养3h后的存活率仍然高达150％，继续培养至6h后菌株LZU-J-QA85的存活率仍然接近100％，显著高于菌株LGG及菌株GL-5的存活率，说明菌株LZU-J-QA85具有较高的耐胆盐的能力，可以在肠液中定值生长。
上述结果表明菌株LZU-J-QA85具有较高的耐酸性和抗胃蛋白酶的能力以及胆盐耐受性，具有良好的胃肠液耐受性，可以在胃液和肠液中定值生长。
实施例4菌株LZU-J-QA85的抗氧化活性
菌株活化：取50％甘油中保存的菌株LZU-J-QA85和对照菌株植物乳杆菌菌株GL-5，分别按2％接种量接种到1.5ml的MRS液体培养基中并置于37℃恒温培养箱中培养10h作为种子菌液用于接下来的实验。种子菌液按2％的接种量接种到2ml装有MRS液体培养基的EP管中并置于37℃恒温培养箱中培养18h进行二代培养后放4℃备用。
菌株培养：配制分别含有3.5mmol/L和4.0mmol/L过氧化氢的MRS培养基，取已活化的菌株LZU-J-QA85和对照菌株植物乳杆菌菌株GL-5，分别按2％的接种量分别接种到7mL的含H2O2(3.5mmol/L和4.0mmol/L)的MRS液体培养基中，37℃培养12h。
过氧化氢耐受性检测：培养12h后，取出试管并混匀，取出3mL的菌悬液加到石英比色皿中，用分光度器在OD600下测各菌悬液的浓度，做记录。
实验结果如图5所示：结果表明，菌株LZU-J-QA85在3.5mmol/L和4.0mmol/L的的H2O2的MRS液体培养基中，37℃，培养12h后的吸光值略高于菌株GL-5，说明菌株LZU-J-QA85和菌株GL-5相当或更强的过氧化氢耐受性和抗氧化能力。
综上，本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85，具有强抑菌活性、胃肠液耐受性和抗氧化活性，可用于制备保健品或药品，具有抗衰老、抗氧化、抑制肠道致病菌以及调节肠道菌群等作用。
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一株具有耐酸耐胆盐活性的植物乳杆菌LZU-J-QA85及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
gggacctcag tggctacctg tgttacgaaa ggttacctcc ccggactttg ggtggtacca 60
actctcctgg ggggacgggc ggtgtgtacc aggcccggga acgtattccc cgtggcatgc 120
tgatccccga ttactaacga ttcccacttc ctggaagcga attgcagcct accatccgaa 180
ctgaaaacgg ctttaagaaa ttaacttgac ctcccggatt cccgactcgt tgtaccgtcc 240
attgtagcac gtgtggagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc 300
ttcctccggt ttggccccgg cagtcttgct agagtgccca actgaatgct ggcaactaac 360
aataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420
accatgcacc acctgtcatt ctgtccccga agggaacgcc taatctctta agttggcaga 480
agatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg taacatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540
cttgtgcggg cccccgtcca ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaagcg 600
gagtgcttaa tgccttagct gcagcactga aggggcggaa accctcccac acttaacact 660
ccttcgttta ccggcatggg actaccaggg tatctaatcc ctggttcgct acccatgact 720
ttcgaggcct cagcgtcagg tacagaacca gaacagccgg ctttcgccac tggtggttcc 780
tccatatatc taacgcattt ccaccggcta caccatggga gttccactgt cctcttctgc 840
actcaagtct cccgagtttc gatgccactt ccttccggta gaccgaaagg gctttctcac 900
tattccagaa tc 912
Claims (9)
1.一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85，所述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum LZU-J-QA85于2020年9月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No:61192。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备抑制肠道致病菌药物或药物组合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备调节肠道菌群保健品中的应用。
5.如权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备食品或食品添加剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品添加剂为抗氧剂。
7.如权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备抗氧化药物或药物组合物中的应用。
8.如权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备耐缺氧保健品中的应用。
9.如权利要求1所述的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum LZU-J-QA85在制备动物饲料中的应用。
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