CN114525231B - 一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents
一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用，所述抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23546，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的嗜酸乳杆菌能抑制各种幽门螺杆菌亚型的生长增殖，以及抑制幽门螺杆菌对胃上皮细胞的粘附作用，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用。
背景技术
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是一种呈S型或弧形弯曲的革兰氏阴性杆菌。国内外研究表明，细胞毒素相关基因（cagA）及空泡毒素基因（vacA）是HP重要的致病基因，也是造成慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃MALT淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。
幽门螺杆菌能够在人体胃部定植和致病主要有两个方面原因，一方面幽门螺杆菌具有尿素酶活性，尿素酶能够分解尿素产生氨气，中和胃酸，能够在细菌周围形成一个中性的微环境，使其能够在胃部极酸的环境中成活。另一方面HP是单极多鞭毛生物，带鞘鞭毛能够赋予HP动力，使其能够穿透胃黏膜的粘液层，从而定植于胃中。HP在全球的感染率高达50%左右，HP感染一定会导致胃粘膜炎症反应。临床一般使用标准三联疗法（PPI+两种抗生素）或四联疗法（PPI+两种抗生素+铋剂）进行7D-10D的HP根除治疗，由于抗生素的滥用，导致HP对抗生素耐药性的增加，进而造成HP治疗周期长、复发率高，且铋剂具有神经毒性，限制了老人和儿童的使用。其次，抗生素的治疗会导致胃内微生态的平衡遭到破坏，也为HP复发提供了机会。
流行病研究显示HP感染和胃病发生率并不成正比，只有当消化道微生态平衡受到破坏，HP才会成为致病菌。当机体受到慢性病、癌症、手术或者辐射影响，或是不合理应用抗生素导致胃肠道菌群失衡。HP就会成为优势菌，大量繁殖从而致病。
因此，仍需要发展一种治疗方式，既不会破坏肠道有益菌群，同时，对人体也不会产生不利影响，以提高幽门螺杆菌的治疗效果。有研究表明，一些益生菌具有抗幽门螺杆菌的功效，为治疗由幽门螺杆菌引起的疾病提供了新思路。然而，一方面，现有技术中的菌株及其制剂抗幽门螺杆菌的效果有限；另一方面，据文献报道，不同地区引起胃肠疾病的幽门螺杆菌致病基因具有较大差异，对于其主要致病基因胞毒素相关基因（cagA+）HP具有抑制效果的菌株报道较多，但这些菌株对其他基因亚型的幽门螺杆菌的抑制作用尚不清楚。
因此，如何提供一种能够对多种基因亚型的幽门螺杆菌均有抑制作用，且抑制效果好的的菌株及其制剂，成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌，所述抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23546，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述幽门螺杆菌的基因亚型包括cag A或vac A。
优选地，所述幽门螺杆菌的基因亚型包括cagA+、cagA-、vacA sla/m2、vacA sla/mlb-m2或vacA sla/mlb。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌的培养方法，所述培养方法包括将嗜酸乳杆菌接种于MRS培养基上进行培养，所述培养的温度为32-40℃，例如32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
优选地，所述培养在pH为4-5的条件下进行，具体pH值例如4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5等。
优选地，所述培养的时间为16-24 h，例如16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22h、23 h、24 h等。
第三方面，本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的菌剂，所述抗幽门螺杆菌感染的菌剂包括如第一方面所述的抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌Lp05，所述植物乳杆菌Lp05命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23547，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌Lp05的活菌数之比为(1-4):(1-2)。
上述(1-4)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、3.2、3.5、3.7、4等。
上述(1-2) 中的具体数值例如1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌或如第二方面所述的抗幽门螺杆菌感染的菌剂在制备食品、保健品或药品中的应用，所述药品为预防和/或缓解由幽门螺杆菌引发的胃肠疾病的药品。
优选地，所述胃肠疾病包括胃炎、肠炎、消化性溃疡或消化不良。
优选地，在所述食品、保健品或药品中，所述抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌的活菌数不低于1×108 CFU/g，例如1×108 CFU/g、2×108 CFU/g、5×108 CFU/g、7×108 CFU/g、1×109 CFU/g、5×109 CFU/g、1×1010 CFU/g等。
第五方面，本发明提供一种发酵乳，所述发酵乳的制备原料包括如第一方面所述的抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌和/或如第三方面所述的抗幽门螺杆菌感染的菌剂、牛奶、聚葡萄糖和白砂糖。
优选地，所述发酵乳的制备原料以重量份数计包括抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌0.01-0.06份、牛奶45-50份、聚葡萄糖0.5-0.8份、白砂糖3-6份、乳化稳定剂0.2-0.6份和甜味剂0.005-0.015份。
优选地，所述乳化稳定剂包括羧甲基纤维素钠、藻酸钠或刺槐豆胶中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如羧甲基纤维素钠和藻酸钠的组合、藻酸钠和刺槐豆胶的组合、羧甲基纤维素钠和刺槐豆胶的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述甜味剂包括阿斯巴甜、安赛蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、木糖醇、赤藓糖醇或甜菊糖苷中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如三氯蔗糖和木糖醇的组合、甜蜜素和三氯蔗糖的组合、阿斯巴甜和安赛蜜的组合等，其他任意的组合方式均可。
上述0.01-0.06份中的具体数值例如0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份、0.06份等。
上述45-50份中的具体数值例如45份、46份、47份、48份、49份、50份等。
上述0.5-0.8份中的具体数值例如0.5份、0.55份、0.6份、0.65份、0.7份、0.75份、0.8份等。
上述3-6份中的具体数值例如3份、3.5份、4份、4.5份、5份、5.5份、6份等。
上述0.2-0.6份中的具体数值例如0.2份、0.25份、0.3份、0.35份、0.4份、0.45份、0.5份、0.55份、0.6份等。
上述0.005-0.015份中的具体数值例如0.005份、0.006份、0.007份、0.008份、0.009份、0.01份、0.011份、0.012份、0.013份、0.014份、0.015份等。
第六方面，本发明提供一种固体饮料，所述固体饮料的制备原料包括如第一方面所述的抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌和/或如第三方面所述的抗幽门螺杆菌感染的菌剂、菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖、果粉和柠檬酸。
优选地，所述固体饮料以重量份数计包括嗜酸乳杆菌1-6份、菊粉20-40份、低聚半乳糖5-10份、低聚果糖5-10份、果粉20-40份和柠檬酸0.2-0.8份。
上述1-6份中的具体数值例如1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份、5.5份、6份等。
上述20-40份中的具体数值例如20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份、31份、32份、33份、34份、35份、36份、37份、38份、39份、40份等。
上述5-10份中的具体数值例如5份、5.5份、6份、6.5份、7份、7.5份、8份、8.5份、9份、9.5份、10份等。
上述0.2-0.8份中的具体数值例如0.2份、0.25份、0.3份、0.35份、0.4份、0.45份、0.5份、0.55份、0.6份、0.65份、0.7份、0.75份、0.8份等。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选到一种嗜酸乳杆菌，其耐胃酸能力好，能抑制各种幽门螺杆菌亚型的生长增殖、抑制幽门螺杆菌对胃上皮细胞的粘附作用、可显著降低不同亚型幽门螺杆菌的定植、并降低不同亚型幽门螺杆菌引起的炎症反应，为根除幽门螺杆菌创造了条件。本发明提供的嗜酸乳杆菌相较于现有技术中的其他菌株，如嗜酸乳杆菌LA85、植物乳杆菌Lp90、植物乳杆菌Lp05等，具有更好的抑制幽门螺杆菌的功效，可用于制备预防和/或缓解由幽门螺杆菌感染引发的胃肠疾病的药品，且所述药品不会引起不良反应或造成病原菌的耐药性，具有重要的应用价值。
附图说明
图1是实施例1的嗜酸乳杆菌对幽门螺杆菌细胞粘附力的影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例涉及的培养基如下：
MRS固体培养基（g/L）：蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、葡萄糖10g/L、乳糖10 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、K2HPO4•3H2O 2 g/L、MgSO4•7H2O 0.1g/L、MnSO4•H2O 0.05 g/L、吐温-80 1 g/L、琼脂20 g/L。
MRS液体培养基（g/L）：蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、葡萄糖10g/L、乳糖10 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、K2HPO4•3H2O 2 g/L、MgSO4•7H2O 0.1g/L、MnSO4•H2O 0.05 g/L、吐温-80 1 g/L。
幽门螺杆菌来源自中山医院，通过抽提各菌株DNA，用特定引物对各菌株cag A基因、vac A基因信号序列（s）及中间区等位基因（m）行PCR检测。从而得到cag A及vac A基因亚型，包括cag A+、cag A-、vacA sla/m2、vacA sla/mlb-m2和vacA sla/mlb。cag A基因3’区的引物、vac A基因信号序列及中间区等位基因的引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
下述实施例中涉及的HP菌悬液的制备方法如下：
HP菌株在哥伦比亚固体培养基划线，置于三气培养箱中（37℃，O2 5%，CO2 10%，N2 85%，湿度95%）培养，活化两代后，用无菌生理盐水制成菌悬液，用麦氏比浊管定量为6.0×108CFU/mL。
GES-1细胞购自中国科学院上海细胞库。
哥伦比亚培养基购自英国OXOID公司。
PBS购自Thermo公司。
雄性SPF级Balb/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。
实施例1
本实施例提供一种抗幽门螺杆菌的嗜酸乳杆菌，命名为LA05，其分离筛选方法如下：
抗幽门螺杆菌的嗜酸乳杆菌LA05筛选自广西巴马瑶族自治县的健康长寿老人粪便样本中。
选取粪便样本，混匀样本加到4.5 mL，使用质量浓度为0.9%的无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基上，在37℃培养48 h后，挑取典型菌落后至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落至MRS液体培养基中增菌培养，30%甘油保藏，筛选出一株胃肠液耐受能力（人工模拟）和抗幽门螺杆菌能力最好的单菌株，得到嗜酸乳杆菌LA05。
对筛选到的嗜酸乳杆菌LA05进行分子生物学鉴定，其16S rDNA序列（SEQ ID No:1）如下：
GCCGTCGGGTGCTATACTGCAGTCGAGCGAGCTGAACCAACAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAGGAGCCGTCTAAGTCAGTCAGTTG。
实施例2
测试实施例1的嗜酸乳杆菌的耐胃酸能力。
将嗜酸乳杆菌划线于MRS固体培养基中，37℃厌氧培养24 h，挑取单菌落于MRS液体培养基中培养24 h，活化两代，按2%（v/v）接种量，接种于MRS液体培养基中培养24 h，7000 g离心10 min，收集菌泥，将菌泥重悬于PBS缓冲溶液中，制备重悬液，麦氏比浊管调浓度为1.0×1010 CFU/mL，取10 mL分别接种于100 mL pH为2.5和3.0的人工胃液（以质量分数计，人工胃液中含有0.20%的NaCl以及0.30%的胃蛋白酶，使用HCl调节pH）中，在37℃下静置0 h和4 h，梯度稀释至MRS固体培养基中计数，并计算其存活率，存活率（%）=N1/N0×100%，其中，N1：人工胃液处理4 h后的活菌数；N0：0 h的活菌数。
结果表明，实施例1的嗜酸乳杆菌在pH 2.0的人工胃液中处理4小时后存活率为70%，在pH 2.5的人工胃液中处理4小时的存活率大于85%，说明其具备优秀的耐酸特性。
实施例3
测试实施例1的嗜酸乳杆菌对不同亚型幽门螺杆菌生长的抑制作用
将嗜酸乳杆菌划线于MRS固体培养基中，37℃厌氧培养24 h，挑取单菌落于MRS液体培养基中培养24 h，活化两代，按2%（v/v）接种量，接种于MRS液体培养基中培养24 h，麦氏比浊管调浓度为1.0×109 CFU/mL，7000 g离心10 min得上清液，上清液经0.22 μm无菌膜过滤，得嗜酸乳杆菌上清液。分别取100 μL cagA+、cagA-、vacA sla/m2、vacA sla/mlb-m2、vacA sla/mlb的不同亚型的HP菌悬液滴加到90 mm的哥伦比亚血平板上，用无菌棉签涂抹均匀，使用无菌牛津杯在平板上打孔，孔深5 mm，直径5 mm，向孔内加入100 μL嗜酸乳杆菌上清液，同时以PBS缓冲液作为阴性对照，以MRS液体培养基作为空白对照，注意不得溢出，37℃恒温培养72 h。测定平板上抑菌圈直径大小，测定结果如表1所示。
表1
由表1结果可知，MRS液体培养基对幽门螺杆菌无抑菌圈，而嗜酸乳杆菌上清液对cagA+、cagA-、vacA sla/m2、vacA sla/mlb-m2、vacA sla/mlb的不同亚型幽门螺杆菌均具有良好的抑菌效果，其中对主要基因型cagA+和vacA sla/m2抑菌效果最为明显，抑菌圈直径分别为23.61±0.31和25.72±0.23，表明实施例1的嗜酸乳杆菌具有显著的抑制不同亚型幽门螺杆菌生长的作用。
实施例4
测试实施例1的嗜酸乳杆菌对幽门螺杆菌细胞粘附力的影响
调整GES-1细胞浓度为1×104/mL，添加至96孔板中，在37℃、5%CO2的条件下培养24h，待GES-1细胞处于贴壁状态后，用PBS洗涤GES-1细胞3次，得洗涤后的GES-1细胞（空白组）。
用无菌生理盐水稀释HP菌悬液至浓度为2×107 CFU/mL，取1 mL添加至洗涤后的GES-1细胞中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养2 h后，用PBS洗涤3次，将未吸附的幽门螺杆菌清洗干净，得到幽门螺杆菌感染的GES-1细胞（HP组）。
在幽门螺杆菌感染的GES-1细胞中加入10 μL嗜酸乳杆菌重悬液（按实施例2重悬液制备方法制备，麦氏比浊管调浓度为2.0×109 CFU/mL），在37℃、5%CO2的培养箱中培养2h，得到经嗜酸乳杆菌处理的幽门螺杆菌感染的GES-1细胞（嗜酸乳杆菌后处理组）。
将10 μL 2.0×109 CFU/mL的嗜酸乳杆菌重悬液加入洗涤后的GES-1细胞中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养2 h，PBS洗涤3次，洗去未吸附的嗜酸乳杆菌，得到洗涤后的经嗜酸乳杆菌处理的GES-1细胞。用无菌生理盐水稀释HP菌悬液至浓度为2×107 CFU/mL，取1mL添加至洗涤后的经嗜酸乳杆菌处理的GES-1细胞中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养2 h后，用PBS洗涤3次，将未吸附的幽门螺杆菌清洗干净，得到经嗜酸乳杆菌处理的感染幽门螺杆菌的GES-1细胞（嗜酸乳杆菌前处理组）。
各孔用PBS液洗涤5次后，在各组细胞中分别加入200 μL尿素酚红试剂，并于37℃、5%CO2的培养箱中培养2 h，得到培养液，通过酶标仪测定不同组的培养液在波长550 nm处的吸光度。测定结果见图1。
HP粘附率=（嗜酸乳杆菌处理组的OD值-空白组的OD值）/（HP组的OD值-空白组的OD值）×100%
设定HP组的粘附率为100%，由图1可知，与HP组相比，嗜酸乳杆菌前处理组和嗜酸乳杆菌后处理组的HP粘附率均显著下降，说明实施例1的嗜酸乳杆菌对于HP具有竞争性抑制作用，进而表明，实施例1的嗜酸乳杆菌能够有效预防并降低幽门螺杆菌对胃粘膜细胞的定植能力。
实施例5
测试实施例1的嗜酸乳杆菌对感染幽门螺杆菌的小鼠的改善作用
选取55只6-8周龄雄性SPF级Balb/c小鼠，随机分为11组，分别为空白组、HP模型组（包括cagA+、cagA-、vacA sla/m2、vacA sla/mlb-m2、vacA sla/mlb的不同亚型HP）、嗜酸乳杆菌干预HP组（包括cagA+、cagA-、vacA sla/m2、vacA sla/mlb-m2、vacA sla/mlb的不同亚型HP），每组5只小鼠。造模期间，除空白组外，其余小鼠灌胃HP菌悬液（5×107 CFU/天），连续10天。同时嗜酸乳杆菌干预HP组的小鼠还灌胃嗜酸乳杆菌悬液（5×109 CFU/天），连续10天。
测试一：干预10天后处死小鼠，剪取小鼠胃组织，参照悉尼分级系统，将胃粘膜组织HE染色后进行切片，并进行胃HP感染分级，HP呈深红色，背景红色。对感染后各小鼠的胃粘膜组织进行观察，并统计红点数。少于2个红点为（-），2-10个红点为（+），10-50个红点为（++），多于50个红点为（+++），结果见表2。
测试二：处死小鼠后，收集胃部血液，离心得血清，用ELISA法测定血清中IL-6、IL-8（pg/mL）含量，结果见表3。
表2
表3
由表2结果可知，与空白组相比，HP模型组小鼠胃组织受感染的小鼠数明显增加。与HP模型组相比，嗜酸乳杆菌干预HP组小鼠的受感染的小鼠数量及感染程度显著减少，差异有统计学意义，说明实施例1的嗜酸乳杆菌有减轻幽门螺杆菌感染症状的能力。
由表3结果可知，与空白组相比，HP模型组小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-8显著增多。与HP模型组相比，嗜酸乳杆菌干预HP组小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-8显著降低，此结果说明实施例1的嗜酸乳杆菌可减轻小鼠胃部由各亚型幽门螺杆菌引起的炎症反应。
实施例6
比较不同菌株或菌株组合抑制幽门螺杆菌的效果
为进一步体现本发明的嗜酸乳杆菌LA05在抗幽门螺杆菌感染方面的优异效果，本实施例选取现有技术中的嗜酸乳杆菌LA85（保藏编号为CGMCC NO.1.12735）、植物乳杆菌Lp90（保藏编号为CGMCC NO.10453）、植物乳杆菌Lp05进行对比测试，测试方法参照实施例3，其中，幽门螺杆菌选取cagA+型和vacA sla/m2型，HP菌悬液的制备方法同上。并且为探究采用两种菌剂进行复配是否能够进一步提高抗幽门螺杆菌感染的效果，本实施例还将嗜酸乳杆菌LA05分别与植物乳杆菌Lp90和植物乳杆菌Lp05进行复配对比测试，测试方法同上（保证各菌株或菌株组合中的总活菌数相同），结果见表4，表中菌株组合的比例是指两种菌株的活菌数之比。
表4
结果表明，与现有技术中已公开的能够抑制幽门螺杆菌生长的嗜酸乳杆菌LA85和植物乳杆菌Lp90相比，本发明的嗜酸乳杆菌LA05在抑制幽门螺杆菌生长方面效果更好，具有更大的产业化优势。
此外，本发明还发现将本发明的嗜酸乳杆菌LA05与植物乳杆菌Lp05复配后，得到的菌株组合在抑制幽门螺杆菌生长方面与两种菌株单独使用时的效果有所提高，说明两株菌在抑制幽门螺杆菌生长方面具有意料不到的协同增效的作用。
应用例1
本应用例提供一种发酵乳，其制备方法如下：
嗜酸乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48 h，得到单菌落，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18 h进行活化，连续活化两代，得到活化液，将活化液按2%(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18 h，得到菌液，将菌液经7000 g离心10 min，得到菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后用保护剂（10%脱脂乳粉、10%海藻糖、2%蔗糖、2%谷氨酸钠，余量为水）重悬至浓度为1×1010 CFU/mL，得到菌悬液，冻干，得到嗜酸乳杆菌菌粉。
以重量份计，将液体牛奶48份、白砂糖4.5份、嗜酸乳杆菌菌粉0.04份、羧甲基纤维素钠0.4份、聚葡萄糖0.7份、三氯蔗糖0.01份混合，在42℃下发酵5 h，即得。
应用例2
本应用例提供一种固体饮料，其制备方法如下：
将嗜酸乳杆菌菌粉（制备方法同应用例1）4份、菊粉30份、低聚半乳糖80份、低聚果糖70份、果粉30份、柠檬酸0.4份混合均匀，即得。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 微康益生菌（苏州）股份有限公司
<120> 一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用
<130> 2022-4-2
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1464
<212> DNA
<213> 嗜酸乳杆菌
<400> 1
gccgtcgggt gctatactgc agtcgagcga gctgaaccaa cagattcact tcggtgatga 60
cgttgggaac gcgagcggcg gatgggtgag taacacgtgg ggaacctgcc ccatagtctg 120
ggataccact tggaaacagg tgctaatacc ggataagaaa gcagatcgca tgatcagctt 180
ataaaaggcg gcgtaagctg tcgctatggg atggccccgc ggtgcattag ctagttggta 240
gggtaacggc ctaccaaggc aatgatgcat agccgagttg agagactgat cggccacatt 300
gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360
acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaagctct 420
gttgttggtg aagaaggata gaggtagtaa ctggccttta tttgacggta atcaaccaga 480
aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540
gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gaagaataag tctgatgtga aagccctcgg 600
cttaaccgag gaactgcatc ggaaactgtt tttcttgagt gcagaagagg agagtggaac 660
tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctc 720
tctggtctgc aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct aagtgttggg aggtttccgc ctctcagtgc 840
tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag 900
gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960
aaccttacca ggtcttgaca tctagtgcaa tccgtagaga tacggagttc ccttcgggga 1020
cactaagaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080
ccgcaacgag cgcaaccctt gtcattagtt gccagcatta agttgggcac tctaatgaga 1140
ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgac 1200
ctgggctaca cacgtgctac aatggacagt acaacgagga gcaagcctgc gaaggcaagc 1260
gaatctctta aagctgttct cagttcggac tgcagtctgc aactcgactg cacgaagctg 1320
gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380
accgcccgtc acaccatggg agtctgcaat gcccaaagcc ggtggcctaa ccttcgggaa 1440
ggagccgtct aagtcagtca gttg 1464
Claims (4)
1.一种抗幽门螺杆菌感染的菌剂，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌感染的菌剂包括抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌Lp05；
所述抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilusLA05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23546，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述植物乳杆菌Lp05命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp05菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23547，保藏日期为2021年10月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌Lp05的活菌数之比为(1-4):(1-2)。
2.如权利要求1所述的抗幽门螺杆菌感染的菌剂在制备药品中的应用，所述药品为预防和/或缓解由幽门螺杆菌引发的胃肠疾病的药品。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃肠疾病包括胃炎、肠炎、消化性溃疡或消化不良。
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，在所述药品中，所述抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌的活菌数不低于1×108 CFU/g。
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