CN111118106A - 一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la-10a及其应用 - Google Patents

一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la-10a及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，包含利用DNA荧光标记物及流式细胞仪给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植的方法。本发明在体外做筛选模型试验时考虑到以下几点：（1）在胃中极酸环境下的生存能力；（2）在体外菌株本身或者其代谢产物对HP繁殖抑制能力；（3）抑制或者减轻HP菌株在胃粘膜上定植的能力。本发明在体外建立起能直接评估能抑制HP定植的方法，对本发明菌株的实际应用具有重大的意义。本发明筛选出了一种抑制幽门螺杆菌的嗜酸乳杆菌LA‑10A，试验表明可以减轻或者预防幽门螺杆菌感染。该菌株可以制备功能性食品或者药物组合物。

Description

一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，特别涉及嗜酸乳杆菌。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobactor pylori，HP)是引起慢性胃炎、十二指肠炎和胃溃疡的主要病因，并且也是胃癌和胃淋巴瘤发生的一个主要危险因素。世界上有超过50％的人群感染HP[1]，但是只有约15％的人群会导致疾病的发生。造成这种结果的原因除了与宿主本身的遗传易感性、环境因素相关外还与所感染菌株的毒力相关[2]。随着现代生物分子技术的发展，人们已经发现具有不同毒力的HP菌株，而传统的3联或4联疗法(PPI加2或3种抗生素)对不同毒力的HP的菌株根除率不同，有10％-25％的患者可能第一次根除失败[3]。根除失败不仅对患者的生活和心理产生极大的影响，而且极易产生耐药菌。同时，对很多感染低毒力菌株的HP阳性患者来说，由于症状轻微，采用抗生素治疗带来的副作用还有可能超越因感染低毒力HP菌株所造成的影响。对感染HP菌株的患者来说，最好能提供一种几乎没有副作用、又能长期控制或者根除HP的新疗法具有很现实的意义。。因此，“以菌治菌”的微生态疗法提供了新的思路。很多动物试验已经表明，HP可以在无菌小鼠的胃内定植并引起胃粘膜炎症反应，而在喂养了益生菌的小鼠体内，HP的定植受到了明显的抑制[4]。在另一项动物试验中，应用益生菌的培养上清液，也取得了类似的效果[5]。另外，在人体试验中发现，如果在体外被证明对HP有抑制作用的乳酸菌培养上清液在体内也能部分长期抑制人类HP感染[6]。因此，筛选特定的能够在体外抑制HP的菌株就有可能对人体的HP感染取得类似的效果。现在已经有很多利用乳酸菌作为菌源，利用乳酸菌或者其代谢产物来调整肠道菌群，抑制包括HP、大肠杆菌、肠道致病菌的研究和专利，例如专利CN1796540A和专利1982437A，但这些专利并没有建立起针对抑制HP菌株的有效方法。专利CN102174450A公布了专门针对HP的植物乳杆菌菌株的筛选方法，但是针对体内抑制HP菌株最重要的菌株胃粘膜定植能力的抑制采用的是不完全而且是间接的测定尿素酶活力来评估的方法。而乳酸菌作为一类人类有着几千年食用历史的菌群，无疑是筛选抗HP菌株的对人体安全性和亲和力都极好的菌源。
参考文献：
[1].WHO.International agency for research on cancermonographs.PJ.1994；61:177-220
[2].Isogaih,et al.Prevention of helicobacter pylori infection inaccociation with other bacteria[J].Microbial Immunol,1997,41(4):361-365
[3].Livero JJ,Graham DY.Gastric adaption to nonsteroidal anti-inflammatory drugs in man.Scand J Gastroenterol,1992,27:879-885
[4].The European Helicobacter Pylori Study Group.Current Europeanconcepts in the management of Helicobacter Pylori infection.The Maastrichtconsensus report.Gut1997；41:8-13
[5].Deltenre M,Ntounda R,Jonas C,et al.Eradication of HelicobacterPylori:why does it fail？Ital J Gastronterol Hepatol,1998:30(suppl.3):S326-8
[6].Nord CE,Heirndal A,Kager L,et al.Antimicrobial induced alterationof the human oropharyngeal and intestinal microflora.Scand J infect Dis,1986,49:64-72
发明内容
由于即使是同一菌种的不同菌株在生理功能和代谢表型上都有可能存在巨大的差异，本发明要筛选能够在体内抑制HP的菌株。本发明在体外做筛选模型试验时考虑到以下几点：(1)在胃中极酸环境下的生存能力；(2)在体外菌株本身或者其代谢产物对HP繁殖抑制能力；(3)抑制或者减轻HP菌株在胃粘膜上定植的能力。这3个能力中，第3个能力是常常被忽略但却是极重要的能力。因为，HP菌株之所以能够在胃中生存的最重要原因就是其能定植在胃粘膜上产生“氨云”中和胃酸，如果HP不能定植在胃粘膜上，那么其最终也会被胃酸“杀死”。本发明在体外建立起能直接评估能抑制HP定植的方法，对本发明菌株的实际应用具有重大的意义。
本发明给出了更加系统的筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，尤其利用DNA荧光标记物及流式细胞仪(FC)给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除HP在胃粘膜细胞上的定植的方法。
本发明筛选出了的一株具备优良益生特性可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A。
根据本发明的其中一方面，提供了一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，该筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法包含利用DNA荧光标记物及流式细胞仪给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植的方法。
根据本发明的其中一方面，提供了一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，该利用DNA荧光标记物及流式细胞仪给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植的方法利用DNA荧光染色剂SYTO9染色法来对粘附的细胞进行绝对数值的计数。
根据本发明的其中一方面，提供了一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，该筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法包含步骤如下:
步骤(1)：SGC7901细胞的培养；
步骤(2)：SGC7901细胞用于粘附试验时的处理方法：取对数生长期的SGC7901细胞，用胰蛋白酶消化，用含胎牛血清的高糖RPMI1640培养基调整细胞密度，接种于12孔板，培养至形成单层的SGC7901细胞，轻轻将多余的SGC7901培养液倒掉，再用PBS缓冲液清洗贴壁细胞，待用；
步骤(3)：HP菌株菌悬液的制备；
步骤(4)：嗜酸乳杆菌LA-10A菌悬液的制备；
步骤(5)：染色及流式细胞仪测定嗜酸乳杆菌LA-10A和HP菌株数量的方法：将步骤(3)和步骤(4)得到的菌悬液各取2mL，加入3μLSYTO9绿色荧光染料，再避光环境下反应15min。然后取0.1mL荧光标定的菌悬液，用流式细胞仪测定细菌数量，测定时，样品由侧向角SSC和FL1通道检测细菌的数量。可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植。
步骤(6)：嗜酸乳杆菌LA-10A对胃粘膜粘附能力的试验方法：取2mL按步骤(5)的方法染色的LA-10A菌悬液，离心，去上清，加入1.5mLPBS重悬菌泥，然后将重悬菌泥加入到步骤(2)准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的LA-10A菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，"上述细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的嗜酸乳杆菌LA-10A的个数，以步骤(5)测定的LA-10A原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得嗜酸乳杆菌LA-10A对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
步骤(7)：幽门螺杆菌(HP)对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法：取2mL按步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，离心，去上清，加入1.5mLPBS重悬菌泥，然后将重悬菌泥加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的LA-10A菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得HP对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
步骤(8)：嗜酸乳杆菌LA-10A竞争性抑制幽门螺杆菌(HP)对胃粘膜细胞的粘附能力的试验方法：取1mL按步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，离心，去上清，加入1mLPBS缓冲液重悬菌泥，然后与步骤(4)的方法制得的1mL LA-10A菌悬液混合，然后将混合好的菌悬液加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，用1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得出在有嗜酸乳杆菌LA-10A存在的条件下HP对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
步骤(9)：嗜酸乳杆菌LA-10A阻止幽门螺杆菌HP对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法：按步骤(4)的方法取2mL重悬后的LA-10A菌悬液，加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2条件下培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，用PBS轻轻漂洗一次，再加入2mL按照步骤(5)的方法染色的幽门螺杆菌HP菌悬液，在温度37℃与5％CO2条件下培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，加入1mLPBS轻轻漂洗一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得出在嗜酸乳杆菌LA-10A先粘附于胃粘膜细胞上时阻止HP细胞再粘附于胃黏膜细胞的能力；
步骤(10)：嗜酸乳杆菌LA-10A替换已经粘附于胃粘膜的HP细胞能力的试验方法：取2mL按照步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，加入到步骤(2)准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞，然后加入2mL按步骤(4)准备的LA-10A菌悬液，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可评估当HP率先粘附于胃粘膜细胞时，嗜酸乳杆菌LA-10A可以将多少已经粘附的HP细胞替换下来。
根据本发明的其中一方面，提供了一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，上述筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法还包含：检验嗜酸乳杆菌LA-10A在人工模拟胃酸环境存活的试验、检验液体培养条件下对胃幽门螺杆菌(HP)的增殖以及尿素酶活力抑制作用的试验、检验菌泥、培养液及培养液上清对幽门螺杆菌在固体培养基上生长的抑制作用的试验、检验对预防健康小鼠感染HP菌的能力的试验、检验对已经感染HP小鼠的治疗能力的试验。
根据本发明的其中一方面，提供了一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，上述筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法筛选出一种嗜酸乳杆菌LA-10A，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012。
根据本发明的其中一方面，提供了一种检验菌株抑制幽门螺杆菌菌株的能力的方法，上述任意一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法用于检验菌株抑制幽门螺杆菌菌株的能力。
根据本发明的其中一方面，提供了一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012。
根据本发明的其中一方面，提供了一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A，该可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A来源于自然发酵食品中使用上述任意一种方法筛选而来，具有如下特性：
在pH2.0,添加了胃蛋白酶的模拟胃酸环境中能有效存活4小时；
在液体培养条件下，对幽门螺杆菌的增殖具有抑制作用；
在液体培养条件下，对幽门螺杆菌的尿素酶活力具有抑制作用；
LA-10A菌株及其发酵上清液在对幽门螺杆菌的固体培养具有抑制作用；
在体外，对幽门螺杆菌在胃上皮细胞粘附(定植)能力具有抑制作用；
动物试验表明可以减轻或者预防幽门螺杆菌感染。
根据本发明的其中一方面，提供了一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A应用，该可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012，该可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A用于制备抑制幽门螺旋杆菌的食品、保健品、复配粉和药品。
根据本发明的其中一方面，提供了一种预防或者改善HP感染的症状的制品，该制品为复配粉或含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品，该复方粉含有保藏编号为CCTCC NO:M2019012的可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A，该复方粉可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A含量为108CFU/g～1010CFU/g。
该含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品为将嗜酸乳杆菌LA-10A按照106CFU/mL的接种量接种于牛奶、豆浆粉或含糖果蔬汁，37℃发酵18～72小时，该含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品每mL的嗜酸乳杆菌LA-10A含量大于等于10亿CFU。
根据本发明的一方面，本发明给出了更加系统的筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，尤其利用DNA荧光标记物及流式细胞仪(FC)给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除HP在胃粘膜细胞上的定植的方法。本发明提供了：(1)一种对胃幽门螺杆菌(HP)有抑制作用的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA-10A；(2)该菌株的筛选方法及应用。
附图说明
图1、为本发明其一个实施例中嗜酸乳杆菌菌株形态；
图2、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A在不同pH的人工胃液中的存活量；
图3、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A在液体中对HP的增殖抑制；
图4、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A在液体中对HP的尿素酶活力的抑制；
图5、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A对HP在固体培养基上生长的抑制能力；
图6、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A流式细胞染色标准图；
图7、为本发明其中一个实施例中幽门螺杆(HP)流式细胞染色标准图；
图8、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A及胃幽门螺杆菌自身对胃粘膜细胞粘附能力的比较；
图9、为本发明其中一个实施例中当游离的LA-10A与HP共存时，竞争性抑制HP粘附于胃粘膜细胞的能力；
图10、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A阻止HP细胞粘附于胃粘膜细胞的能力；
图11、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A替换已经粘附于胃粘膜细胞上的HP菌株的能力；
图12、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA-10A预防小鼠感染HP的能力；
图13、为本发明其中一个实施例中嗜酸乳杆菌LA10-10A与其他市售嗜酸乳杆菌同等条件下测试阻止HP粘附试验的结果。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：菌株保藏
本发明涉及一种嗜酸乳杆菌LA-10A，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012.
实施例2：本发明嗜酸乳杆菌LA-10A特性
具有如下特性：
2.1在pH2.0,添加了胃蛋白酶的模拟胃酸环境中能有效存活4小时；
2.2在液体培养条件下，对幽门螺杆菌的增殖具有抑制作用；
2.3在液体培养条件下，对幽门螺杆菌的尿素酶活力具有抑制作用；
2.4 LA-10A菌株及其发酵上清液在对幽门螺杆菌的固体培养具有抑制作用；
2.5在体外，对幽门螺杆菌在胃上皮细胞粘附(定植)能力具有抑制作用；
2.6试验表明可以减轻或者预防幽门螺杆菌感染。
3、本发明还涉及嗜酸乳杆菌LA-10A的用途，其特征在于制备功能性食品或者药物组合物。
下面将对以上述的嗜酸乳杆菌LA-10A的性质进行详细的描述(涉及菌株筛选方法各项能力检测)：
本发明的嗜酸乳杆菌LA-10A是本公司从马奶、自然发酵食品中筛选出来的，菌株命名为嗜酸乳杆菌LA-10A，此菌株革兰氏染色阳性，呈单个的短杆或者2-3连杆，(如图1所示)在不同的生长条件下，菌体大小会有变化，经16S rDNA鉴定为嗜酸乳杆菌。
实施例3：菌株筛选/检测
本发明用来进行测试的幽门螺杆菌菌株为模式菌株HpSS1
2.本专利将会用到以下的培养基和溶液，其制备方法如下：
2.1改良MRS液体培养基：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母膏5克、磷酸氢二氨2克、葡萄糖20克、吐温-80 1.0mL、乙酸钠5克、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.25克、蒸馏水1000mL、pH6.2～6.5；使用前高温灭菌。
2.2改良MRS固体培养基：在改良MRS液体培养基的基础上加入18克琼脂。
2.3人工胃液：将过滤除菌的胃蛋白酶用无菌的0.5％NaCl溶液溶解，使胃蛋白酶终浓度为3g/L，并用浓盐酸分别调节pH至2.0、2.5、3.0。
2.4 skirrow氏培养基：蛋白胨15克、胰蛋白胨2.5克、酵母浸膏5.0克、氯化钠5.0克、蒸馏水1000mL、pH自然；在应用时再加入8％脱纤维羊血。
2.5 skirrow氏选择性培养基：在skirrow氏培养基的基础上加入万古霉素10mg/L、头孢磺啶5mg/L、磺胺增效剂(TMP)5mg/L、二性霉素5mg/L；在应用时再加入8％脱纤维羊血。
2.6 skirrow氏固体培养基：在skirrow氏培养基或者skirrow氏选择性培养基的基础上加15克琼脂；
2.7 skirrow氏培养基采用高温灭菌，抗生素及脱纤维羊血采用过滤除菌。
3.嗜酸乳杆菌LA-10A在人工模拟胃酸环境中可以有效存活4小时
3.1将从自然发酵泡菜、马奶、以及发酵果蔬汁、酸奶中初步筛选出来的10余种细菌(包含嗜酸乳杆菌)接种在改良MRS液体培养基中，37℃静置培养16小时，传代培养2-3次后，待观测到培养基底部有明显的菌泥沉淀后，离心收集菌泥，将菌泥重新悬浮在PBS缓冲溶液中，调整菌浓约为1*1010CFU/mL接至装有200ml人工胃液的三角瓶中，在37℃下分别静置培养0h、2h、4h、6h，梯度稀释后倾注至改良MRS平板并计算活菌数。重复3次，求平均值。
3.2在上述方法的基础上，以0小时的活菌量为对照，以静置培养2小时、4小时、6小时后的活菌量为试验组，以“试验组活菌量/对照组活菌量”作为存活率计算方式，挑选存活率＞40％的菌株作为潜力菌株进行下一步试验。
3.3其中，嗜酸乳杆菌LA-10A在pH2.0的人工胃酸中处理4小时的存活率为45％，pH2.5的人工胃液中处理4小时的存活率＞80％(见图2)，具备优秀的耐胃酸能力。
4、嗜酸乳杆菌LA-10A在液体培养条件下对胃幽门螺杆菌(HP)的增殖以及尿素酶活力具有显著的抑制作用。
4.1 HP菌株的培养条件：在由5％O2、10％CO2和85％N2组成的微氧环境中，37℃培养。
4.2嗜酸乳杆菌LA-10A的培养条件：在37℃厌氧、静置培养。
4.3 HP菌株的培养：将HP菌株接种于skirrows选择性平板传代2次后，再接种于无菌skirrows液体选择性培养基中，培养72小时后，以10000rpm的转速，4℃离心4分钟，收集菌泥，菌泥用PBS缓冲液洗涤2次，然后用无菌skirrows液体培养基重悬菌泥，调节重悬液OD600的吸光度值为0.35±0.05(对应的细胞浓度约为108个/mL)；
4.4将步骤4.3调整好浓度的HP菌悬液分出均匀的4份，每份2mL；
4.5将嗜酸乳杆菌LA-10A菌株接种于无菌MRS液体培养基，培养15～30小时，观测到培养基底部有明显的菌泥沉淀后，以10000rpm的转速离心4分钟，收集菌泥，菌泥用PBS缓冲液洗涤2次，然后再用无菌的MRS液体培养基重悬菌泥，调节重悬液OD600的吸光度值为10±1(对应的细胞浓度约为108个/mL)；
4.6将步骤4.5调整好浓度的LA-10A菌悬液梯度稀释10倍和100倍，将原液、10倍稀释液、100倍稀释液各取2mL与步骤4.4制备的HP菌悬液等比例混合作为试验组，以步骤4.4制备的菌悬液+2mLskirrows液体培养基混合作为对照；
4.7将步骤4.6得到的混合液在HP菌株的培养条件下分别培养4、8、12、16小时，然后对各混合液的HP进行计数和尿素酶活力测定；
4.8 HP计数的方法为：取步骤4.7所得的混合培养液1mL，适当稀释后接种于skirrows选择性固体培养基，在微氧环境下37℃培养72小时，观测HP的生长情况并计数HP的菌落形成单位(CFU/mL)；
4.9 HP尿素酶活性测定：采用比色法测定尿素酶活性。将步骤4.7得到的混合培养液取50μL加入到5mL反应液中(反应液由1g/mL的尿素和850μg/mL的酚红组成)，室温反应1小时，然后利用分光光度计在550nm处测定其吸光度值，以吸光度值的大小来表征其尿素酶活力的大小。
4.10试验结果表明，与对照相比，当胃幽门螺杆菌与108CFU/mL的嗜酸乳杆菌LA-10A共培养16小时，其活菌计数仅有对照的60％(图3)，尿素酶活力下降了约42％(图4)。说明本发明所用的嗜酸乳杆菌LA-10A可以在体外抑制胃幽门螺杆菌的增殖和尿素酶活力，这种抑制能力与嗜酸乳杆菌LA-10A的数量密切相关，添加的嗜酸乳杆菌LA-10A越多，则抑制能力越强。当添加的嗜酸乳杆菌LA-10A数量较低时，胃幽门螺杆菌的繁殖能力和尿素酶活性可能在共培养8小时后得到维持或者增长，因此将嗜酸乳杆菌LA-10A应用于抑制胃幽门螺杆菌时，必须添加足够的数量。
5、嗜酸乳杆菌LA-10A菌泥、LA-10A培养液及培养液上清对幽门螺杆菌在固体培养基上生长的抑制
5.1将嗜酸乳杆菌LA-10A菌株接种于无菌MRS液体培养基，培养15～30小时，观测到培养基底部用明显的菌泥沉淀后，摇匀，取2mL发酵液待用。其余发酵液以10000rpm的转速离心4分钟，收集菌泥和上清液。菌泥用PBS缓冲液洗涤2次，然后再用无菌的PBS缓冲液等体积重悬菌泥，上清液直接收集待用；
5.2将HP菌株接种于skirrows选择性平板传代2次后，再接种于无菌skirrows液体培养基中，培养72小时后，以10000rpm的转速，4℃离心4分钟，收集菌泥，菌泥用PBS缓冲液洗涤2次，然后用PBS缓冲液重悬菌泥，调节重悬液OD600的吸光度值为15±0.05(对应的细胞浓度约为1010个/mL)；
5.3将步骤5.2所得的HP菌泥重悬液取2mL放置于无菌平板中央，然后倾注skirrows固体培养基，摇晃混合均匀。待固体培养基凝固后，在固体培养基上打6个0.5cm的小孔，每个小孔用琼脂封底；
5.4将步骤5.1所得的发酵液、菌泥重悬液、上清注入步骤3所得的平板小孔内(每个试验项目做2个平行)，液面与skirrows固体培养基倾注表面齐平，然后将平板放入微氧环境(5％O2、10％CO2和85％N2)中培养72小时，测量平板小孔周围的抑菌圈，根据抑菌圈大小来判断LA-10A菌泥、发酵液和上清液对幽门螺杆菌的抑制效果。
5.5试验结果表明，嗜酸乳杆菌LA-10A的发酵液、无菌上清液、菌泥重悬液均能有效抑制HP生长的作用，但无菌上清液和菌泥重悬液的抑制能力较LA-10A发酵液弱，LA-10A的菌泥重悬液其抑制HP生长的能力较LA-10A发酵液低约61％，比LA-10A的无菌上清液低约46％，说明嗜酸乳杆菌LA-10A的抑菌能力是菌体本身及其代谢产物的综合，两者共同作用时能得到LA-10A对HP的最大抑制作用(图5)。
6、嗜酸乳杆菌LA-10A对胃幽门螺杆菌(HP)在胃上皮细胞粘附能力的抑制试验：
本发明用胃腺癌细胞SGC7901模拟胃粘膜上皮细胞，嗜酸乳杆菌LA-10A抑制幽门螺杆菌在胃上皮细胞粘附能力的试验共由5个试验组成：(1)、嗜酸乳杆菌LA-10A自身对胃粘膜上皮细胞的粘附能力测试；(2)HP自身对胃粘膜上皮细胞的粘附能力测试；(3)当嗜酸乳杆菌LA-10A与HP共存时，对HP粘附到胃粘膜上皮细胞的竞争性抑制作用；(4)当HP细胞先粘附到胃粘膜上时，嗜酸乳杆菌LA-10A对其的替代作用；(5)当嗜酸乳杆菌LA-10A先粘附到胃粘膜上时，其对HP细胞再粘附到胃粘膜细胞上的阻止作用。为了保证这些试验在同一条件下进行，对SGC7901细胞采用标准化的培养方法，试验所用的嗜酸乳杆菌LA-10A菌悬液以及HP菌悬液均采用同一摇瓶，同一稀释方法的不同均匀等份来进行。为评估粘附效果，本发明创造性的利用了流式细胞仪的特性，利用DNA荧光染色剂SYTO9染色法来对粘附的细胞进行绝对数值的计数。SYTO9染色剂可以穿过死/活细胞的细胞膜结合到细菌的DNA或者RNA上，一旦结合其与DNA/RNA结合，其荧光强度将极大增强，而且在经过3小时后，其荧光强度仍可保留80％以上。本发明创造性的将荧光染色与流式细胞仪结合，可以评估粘附于胃粘膜细胞上的细菌的绝对数量，让评估结果更加可信。
可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植。
试验步骤如下：
(1)SGC7901细胞的培养：将SGC7901细胞复苏后，用含10％胎牛血清的高糖RPMI1640培养基培养SGC7901细胞，培养温度37℃，培养环境含5％二氧化碳，2-3天传代一次，传代3次后用于细胞试验；
(2)SGC7901细胞用于粘附试验时的处理方法：取对数生长期的SGC7901细胞，用含0.02％EDTA的胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的高糖RPMI1640培养基调整细胞密度至105个/mL，接种于12孔板，每孔接种量1.6mL，培养至形成单层的SGC7901细胞，轻轻将多余的SGC7901培养液倒掉，再用PBS缓冲液清洗贴壁细胞2次，待用；
(3)HP菌株的培养：将HP菌株接种于skirrows选择性平板传代2次后，再接种于无菌skirrows液体选择性培养基中，在微氧环境中培养72小时后，以10000rpm的转速，4℃离心4分钟，收集菌泥，菌泥用PBS缓冲液洗涤2次，然后用PBS缓冲液重悬菌泥，调节重悬液OD600的吸光度值为0.35±0.05(对应的细胞浓度约为108个/mL)，待用；
(4)嗜酸乳杆菌LA-10A的培养：将嗜酸乳杆菌LA-10A菌株接种于无菌MRS液体培养基，37℃静置培养15～30小时，观测到培养基底部用明显的菌泥沉淀后，以10000rpm的转速离心4分钟，收集菌泥，菌泥用PBS缓冲液洗涤2次，然后再用无菌的MRS液体培养基重悬菌泥，调节重悬液OD600的吸光度值为10±1(对应的细胞浓度约为108个/mL)，待用；
(5)流式细胞仪测定嗜酸乳杆菌LA-10A和HP菌株数量的方法：将步骤(3)和步骤(4)得到的菌悬液各取2mL，加入3μLSYTO9绿色荧光染料，再避光环境下反应15min。然后取0.1mL荧光标定的菌悬液，用流式细胞仪测定细菌数量。测定时，样品由侧向角SSC和FL1通道检测细菌的数量(图6和图7)。
(6)嗜酸乳杆菌LA-10A对胃粘膜粘附能力的试验方法：取2mL按步骤(5)的方法染色的LA-10A菌悬液，离心，去上清，加入1.5mLPBS重悬菌泥，然后将重悬菌泥加入到步骤(2)准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的LA-10A菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的嗜酸乳杆菌LA-10A的个数，以步骤(5)测定的LA-10A原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得嗜酸乳杆菌LA-10A对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
(7)幽门螺杆菌(HP)对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法：取2mL按步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，离心，去上清，加入1.5mLPBS重悬菌泥，然后将重悬菌泥加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的LA-10A菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得HP对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
(8)嗜酸乳杆菌LA-10A竞争性抑制幽门螺杆菌(HP)对胃粘膜细胞的粘附能力的试验方法：取1mL按步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，离心，去上清，加入1mLPBS缓冲液重悬菌泥，然后与步骤(4)的方法制得的1mL LA-10A菌悬液混合，然后将混合好的菌悬液加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，用1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得出在有嗜酸乳杆菌LA-10A存在的条件下HP对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
(9)嗜酸乳杆菌LA-10A阻止幽门螺杆菌HP对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法：按步骤(4)的方法取2mL重悬后的LA-10A菌悬液，加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2条件下培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，用PBS轻轻漂洗一次，再加入2mL按照步骤(5)的方法染色的幽门螺杆菌HP菌悬液，在温度37℃与5％CO2条件下培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，加入1mLPBS轻轻漂洗一次，然后加入然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得出在嗜酸乳杆菌LA-10A先粘附于胃粘膜细胞上时阻止HP细胞再粘附于胃黏膜细胞的能力。
(10)嗜酸乳杆菌LA-10A替换已经粘附于胃粘膜的HP细胞能力的试验方法：取2mL按照步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，加入到步骤(2)准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞，然后加入2mL按步骤(4)准备的LA-10A菌悬液，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可评估当HP率先粘附于胃粘膜细胞时，嗜酸乳杆菌LA-10A可以将多少已经粘附的HP细胞替换下来。
(11)试验结果表明：
a、当只考虑菌株自身对胃粘膜细胞的粘附能力时，幽门螺杆菌相对于嗜酸乳杆菌LA-10A更容易与胃粘膜细胞粘附，粘附率21％VS 17.3％(图8)。
b、当游离的嗜酸乳杆菌LA-10A和HP菌株共存时，LA-10A可以有效的竞争性抑制HP粘附于胃粘膜细胞上，使得HP对胃粘膜细胞的粘附率与对照(只有HP菌株存在时)下降了约53.3％(见图9)。
c、如果LA-10A先粘附于胃粘膜细胞上，能更加有效的阻止游离的HP再粘附于胃粘膜细胞上，可以让HP粘附于胃粘膜细胞的能力与对照相比下降约80％(图10)。
d、，当HP先粘附于胃粘膜细胞上时，游离的LA-10A也可以减少HP的粘附率，HP的粘附率与对照相比下降了约33.3％(图11)。
以上结果说明，嗜酸乳杆菌LA-10A可以有效的抑制或者减少HP粘附于胃粘膜细胞。这种能力，在LA-10A率先粘附于胃粘膜细胞上是最强，在HP率先粘附于胃粘膜细胞上时最弱。总的来说，如果长期摄入嗜酸乳杆菌LA-10A能够预防或者减轻HP对胃粘膜的粘附定植能力。
7、嗜酸乳杆菌LA-10A对预防健康小鼠感染HP菌的能力
利用4-6周龄无特定病原菌的小鼠，分为两组。对照组每天用正常的无菌饮水，试验组每天给小鼠喂食含嗜酸乳杆菌LA-10A 109CFU/mL的饮水(每天喂水约10mL)，连续喂食15天。然后禁食12小时后，给小鼠灌饲0.5mL碳酸氢钠，然后隔日给所有小鼠灌饲HP菌液0.5mL(109CFU/mL)，每隔48小时灌饲一次，连续4次。在最后一次灌饲HP菌4周后，取小鼠外周血进行抗HP-IgG水平检测，然后处死所有小鼠取胃窦进行快速尿素酶检测，以小鼠的HP感染率为评价指标，结果见图12。
从试验结果可以看出，在没有嗜酸乳杆菌LA-10A干预的情况下，对照组的感染率为100％，而试验组的感染仅为约20％，两者具有显著性差异，说明每天摄入嗜酸乳杆菌LA-10A能有效抵抗HP的感染。
8、嗜酸乳杆菌LA-10A对已经感染HP小鼠的治疗能力
利用4-6周龄无特定病原菌的小鼠，每日给所有小鼠灌饲HP菌，连续7天，检查外周血确认小鼠已经感染HP后，将所有试验小鼠分为两组：对照组和试验组。试验组每天给小鼠喂食含嗜酸乳杆菌LA-10A 109CFU/mL的饮水(每天喂水约10mL)，连续喂食6个月。对照组正常饮食饲喂6个月。然后所有小鼠取外周血进行抗HP-IgG水平检测，然后处死所有小鼠取胃窦进行快速尿素酶检测，以小鼠的HP治愈率以及尿素酶活力为评价指标，结果见表1。
表1：嗜酸乳杆菌LA-10A对已经感染HP的小鼠治疗能力评价
Figure BDA0002328870990000131
备注：“+”表示尿素酶活力低，“+++”表示尿素酶活力高
从试验结果可以看出，经过连续6个月的嗜酸乳杆菌LA-10A干预，试验组有约25％的小鼠检测不出HP感染，与对照组相比，HP感染率有显著性差异。而且与对照组相比，试验组胃窦组织的尿素酶活力有明显的降低。说明嗜酸乳杆菌LA-10A对感染了HP的小鼠有一定的治愈能力。
使用上述的筛选/检测方法筛选的嗜酸乳杆菌菌株各项能力高于嗜酸乳杆菌LA-10A也可以用于胃幽门螺杆菌的治疗中。
9、嗜酸乳杆菌LA-10A可以制备成不同的食品或者药品用于对胃幽门螺杆菌的治疗
(1)将嗜酸乳杆菌LA-10A接种于改良MRS培养基培养后，离心，收集菌泥，添加冻干保护剂，真空冷冻干燥制备成冻干粉。冻干粉可以与淀粉、益生元、其他功能性原料复配，制备成1010CFU/g的复配粉，有需求的人群可以通过此复配粉每天摄入1亿～数百亿的嗜酸乳杆菌LA-10A，来预防或者改善HP感染的症状。
(2)可以将嗜酸乳杆菌LA-10A按照106CFU/mL的接种量接种于牛奶、豆浆粉、含糖果蔬汁等，37℃发酵18～72小时，制备成含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品，该类型的饮品每mL的嗜酸乳杆菌LA-10A含可以达到10亿CFU，有需求的人群可以通过饮用此类发酵液每天补充数亿～数百亿的嗜酸乳杆菌LA-10A，用来预防或者改善HP感染的症状。
10、嗜酸乳杆菌LA10-10A与其他市售嗜酸乳杆菌同等条件下测试阻止HP粘附试验
在评估了嗜酸乳杆菌LA-10A对抑制HP菌粘附于胃粘膜细胞能力的试验基础上，采购了3株商业化销售的嗜酸乳杆菌(在此分别以嗜酸乳杆菌A、B、C代替具体的菌株名字)，按照上述嗜酸乳杆菌LA-10A阻止幽门螺杆菌HP对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法，比较了嗜酸乳杆菌LA-10A与3株商业化销售菌株阻止HP粘附的能力。试验结果如图13所示表明，嗜酸乳杆菌LA-10A阻止HP粘附的能力显著大于我们用来对比测试的3株商业化菌株。与测试的商业菌株相比，嗜酸乳杆菌LA-10A使HP的粘附率最高下降了89.4％。最低也下降了51.7％。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

Claims (10)

1.一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，其特征在于，所述筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法包含利用DNA荧光标记物及流式细胞仪给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植的方法。
2.根据权利要求1所述的一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，其特征在于，所述利用DNA荧光标记物及流式细胞仪给出了一种可以直接定性和定量评估所筛选的菌株是否可以抑制或者消除幽门螺杆菌在胃粘膜细胞上的定植的方法利用DNA荧光染色剂SYTO9染色法来对粘附的细胞进行绝对数值的计数。
3.根据权利要求1所述的一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，其特征在于，所述筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法包含步骤如下:
步骤(1)：SGC7901细胞的培养；
步骤(2)：SGC7901细胞用于粘附试验时的处理方法：取对数生长期的SGC7901细胞，用胰蛋白酶消化，用含胎牛血清的高糖RPMI1640培养基调整细胞密度，接种于12孔板，培养至形成单层的SGC7901细胞，轻轻将多余的SGC7901培养液倒掉，再用PBS缓冲液清洗贴壁细胞，待用；
步骤(3)：HP菌株菌悬液的制备；
步骤(4)：嗜酸乳杆菌LA-10A菌悬液的制备；
步骤(5)：染色及流式细胞仪测定嗜酸乳杆菌LA-10A和HP菌株数量的方法：将步骤(3)和步骤(4)得到的菌悬液各取2mL，加入3μLSYTO9绿色荧光染料，再避光环境下反应15min，然后取0.1mL荧光标定的菌悬液，用流式细胞仪测定细菌数量，测定时，样品由侧向角SSC和FL1通道检测细菌的数量；
步骤(6)：嗜酸乳杆菌LA-10A对胃粘膜粘附能力的试验方法：取2mL按步骤(5)的方法染色的LA-10A菌悬液，离心，去上清，加入1.5mLPBS重悬菌泥，然后将重悬菌泥加入到步骤(2)准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的LA-10A菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，"所述细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的嗜酸乳杆菌LA-10A的个数，以步骤(5)测定的LA-10A原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得嗜酸乳杆菌LA-10A对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
步骤(7)：幽门螺杆菌(HP)对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法：取2mL按步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，离心，去上清，加入1.5mLPBS重悬菌泥，然后将重悬菌泥加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的LA-10A菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得HP对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
步骤(8)：嗜酸乳杆菌LA-10A竞争性抑制幽门螺杆菌(HP)对胃粘膜细胞的粘附能力的试验方法：取1mL按步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，离心，去上清，加入1mLPBS缓冲液重悬菌泥，然后与步骤(4)的方法制得的1mL LA-10A菌悬液混合，然后将混合好的菌悬液加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，用1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞层一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得出在有嗜酸乳杆菌LA-10A存在的条件下HP对胃癌细胞SGC7901的粘附率；
步骤(9)：嗜酸乳杆菌LA-10A阻止幽门螺杆菌HP对胃粘膜细胞粘附能力的试验方法：按步骤(4)的方法取2mL重悬后的LA-10A菌悬液，加入到步骤2准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2条件下培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，用PBS轻轻漂洗一次，再加入2mL按照步骤(5)的方法染色的幽门螺杆菌HP菌悬液，在温度37℃与5％CO2条件下培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，加入1mLPBS轻轻漂洗一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可得出在嗜酸乳杆菌LA-10A先粘附于胃粘膜细胞上时阻止HP细胞再粘附于胃黏膜细胞的能力；
步骤(10)：嗜酸乳杆菌LA-10A替换已经粘附于胃粘膜的HP细胞能力的试验方法：取2mL按照步骤(5)的方法染色的HP菌悬液，加入到步骤(2)准备的12孔板SGC7901单层细胞中，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，再加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞，然后加入2mL按步骤(4)准备的LA-10A菌悬液，在温度37℃与5％CO2的培养箱中培养1小时后，倒出未粘附的菌悬液，加入1mLPBS轻轻漂洗SGC7901细胞一次，然后加入胰蛋白酶、EDTA试剂、PBS缓冲液消化贴壁SGC7901细胞，重新形成2mL菌悬液后，取0.1mL利用流式细胞仪计数被SYTO9染料染色的细胞个数，此"细胞个数x20"即为粘附于SGC7901细胞的幽门螺杆菌HP的个数，以步骤(5)测定的HP原始菌悬液细胞个数作为对照，即可评估当HP率先粘附于胃粘膜细胞时，嗜酸乳杆菌LA-10A可以将多少已经粘附的HP细胞替换下来。
4.根据权利要求2所述的一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，其特征在于，所述筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法还包含：检验嗜酸乳杆菌LA-10A在人工模拟胃酸环境存活的试验、检验液体培养条件下对胃幽门螺杆菌的增殖以及尿素酶活力抑制作用的试验、检验菌泥、培养液及培养液上清对幽门螺杆菌在固体培养基上生长的抑制作用的试验、检验对预防健康小鼠感染HP菌的能力的试验、检验对已经感染HP小鼠的治疗能力的试验。
5.根据权利要求4所述的一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法，其特征在于，所述的一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法筛选出一种嗜酸乳杆菌LA-10A，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012。
6.一种检验菌株抑制幽门螺杆菌菌株的能力的方法，其特征在于权利要求1～4所述的任意一株筛选抑制幽门螺杆菌菌株的方法用于检验菌株抑制幽门螺杆菌菌株的能力。
7.一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012。
8.根据权利要求7所述的一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A，其特征在于，所述可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A来源于自然发酵食品中使用权利要求1～4所述任意一种方法筛选而来，具有如下特性：
在pH2.0,添加了胃蛋白酶的模拟胃酸环境中能有效存活4小时；
在液体培养条件下，对幽门螺杆菌的增殖具有抑制作用；
在液体培养条件下，对幽门螺杆菌的尿素酶活力具有抑制作用；
LA-10A菌株及其发酵上清液在对幽门螺杆菌的固体培养具有抑制作用；
在体外，对幽门螺杆菌在胃上皮细胞粘附(定植)能力具有抑制作用；
动物试验表明可以减轻或者预防幽门螺杆菌感染。
9.一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A应用，其特征在于，所述可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2019012，所述可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A用于制备抑制幽门螺旋杆菌的食品、保健品、复配粉和药品。
10.一种预防或者改善HP感染的症状的制品，其特征在于，所述制品为复配粉或含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品，所述复方粉含有所述保藏编号为CCTCC NO:M2019012的可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A，所述复配粉可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌LA-10A含量为108CFU/g～1010CFU/g；
所述含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品为将所述嗜酸乳杆菌LA-10A按照106CFU/mL的接种量接种于牛奶、豆浆粉或含糖果蔬汁，37℃发酵18～72小时，所述含嗜酸乳杆菌LA-10A的饮品每mL的嗜酸乳杆菌LA-10A含量大于等于10亿CFU。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112353822A (zh) * 2020-11-18 2021-02-12 中国药科大学 一种乳酸乳球菌粒子与益生菌在制备抗幽门螺旋杆菌感染药物中的应用
CN113736683A (zh) * 2020-08-03 2021-12-03 郑州大学 一株抑制幽门螺杆菌的嗜热链球菌及其应用
CN113980843A (zh) * 2021-10-26 2022-01-28 广东一元兰欣生物科技有限公司 嗜酸乳杆菌la-03在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用
CN114231449A (zh) * 2021-12-09 2022-03-25 江南大学 一株具有共聚幽门螺杆菌能力的嗜酸乳杆菌及其应用
CN114525231A (zh) * 2022-04-20 2022-05-24 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用
CN114836349A (zh) * 2022-05-13 2022-08-02 江苏新申奥生物科技有限公司 拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la16及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013021239A1 (en) * 2011-08-09 2013-02-14 Compagnie Gervais Danone New strain of l. bulgaricus capable of inhibiting the adhesion of h. pylori strains to epithelial cells
CN111358812A (zh) * 2019-11-28 2020-07-03 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种益生菌固体饮料及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013021239A1 (en) * 2011-08-09 2013-02-14 Compagnie Gervais Danone New strain of l. bulgaricus capable of inhibiting the adhesion of h. pylori strains to epithelial cells
CN103987839A (zh) * 2011-08-09 2014-08-13 热尔韦·达诺尼公司 能够抑制幽门螺杆菌菌株粘附至上皮细胞的新德式乳杆菌保加利亚亚种菌株
CN111358812A (zh) * 2019-11-28 2020-07-03 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种益生菌固体饮料及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赵忠岩等: "抗HP嗜酸乳杆菌与SGC-7901细胞的黏附及其对HP与SGC-7901细胞黏附的抑制效应", 《中国实验诊断学》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736683A (zh) * 2020-08-03 2021-12-03 郑州大学 一株抑制幽门螺杆菌的嗜热链球菌及其应用
CN112353822A (zh) * 2020-11-18 2021-02-12 中国药科大学 一种乳酸乳球菌粒子与益生菌在制备抗幽门螺旋杆菌感染药物中的应用
CN113980843A (zh) * 2021-10-26 2022-01-28 广东一元兰欣生物科技有限公司 嗜酸乳杆菌la-03在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用
CN113980843B (zh) * 2021-10-26 2023-09-08 广东一元兰欣生物科技有限公司 嗜酸乳杆菌la-03在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用
CN114231449A (zh) * 2021-12-09 2022-03-25 江南大学 一株具有共聚幽门螺杆菌能力的嗜酸乳杆菌及其应用
CN114231449B (zh) * 2021-12-09 2023-08-25 江南大学 一株具有共聚幽门螺杆菌能力的嗜酸乳杆菌及其应用
CN114525231A (zh) * 2022-04-20 2022-05-24 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用
CN114525231B (zh) * 2022-04-20 2022-07-22 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种抗幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌及其培养方法与应用
CN114836349A (zh) * 2022-05-13 2022-08-02 江苏新申奥生物科技有限公司 拮抗幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la16及其应用

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