CN107421791A - 一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，属生物医药技术领域。本发明的制备方法，通过将实体瘤组织制成小块，利用肿瘤直径大小，使用多孔筛截留的方式，获得大小均一的肿瘤微组织，可以用于肿瘤组织的培养及药物评价。此方法制备的肿瘤组织，大小可控，使用便利，可以标准化用于后续操作。本发明解决了肿瘤组织体外培养不易标准化的问题，同时所使用肿瘤组织，未经过体外消化分散，保留了肿瘤组织的成分和性状，保证了肿瘤组织的效能。
Description
技术领域
本发明涉及体外肿瘤组织培养领域，具体涉及一种肿瘤微组织的制备方法。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病，已经成为影响我国居民健康的主要的死亡原因之一。世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球人口80亿，癌症新发病例将达到2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为新世纪人类的第一杀手,并成为全球最大的公共卫生问题之一。因此，采取有效的手段治疗癌症就显得极其重要了。
现有许多类型癌症的预后仍然非常差，迫切需要开发新的治疗方案，这就需要对肿瘤进行深入的研究。但是，如何在体外有效的开展肿瘤研究的工作仍是医药领域的一大挑战。现有技术往往通过酶消化法分离的肿瘤细胞，体外增殖后再进行试验。但对细胞本身损伤较大，常规的原代肿瘤细胞脱离体内环境后，在体外最初培养的24小时后，大部分细胞都会逐渐死亡飘浮，能够贴壁生长的细胞占极少比例。传统的原代肿瘤细胞培养操作复杂，耗时较长，样品易污染，灵敏度较低，最关键是体外扩增本身具有细胞选择作用，得到的细胞无法代表体内真实细胞组成。
原代肿瘤样本的获得极其珍贵，其保留原代肿瘤微环境和基本特性。依靠这种模型可以深入探究肿瘤发生机制及发现潜在治疗靶点，同时还可以帮助预测患者对治疗药物可能产生的反应。可以用于在体外培养及药物测试，还有用于接种到动物体内继续培养以获取近似患者的信息。但是肿瘤组织的性状和质地决定了其在体外不易处理，操作完全靠肉眼判断，具有较大随机性，为后续研究带来了较大的误差，影响了获得数据的可靠性。这制约了肿瘤组织体外研究的开展。因此，需要一个能够简便、快捷、高效、低成本的方法能够制备大小均一的，能够标准化的肿瘤微组织，这在肿瘤生物学研究及医药研发中将具有极大的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种大小均一、标准化的肿瘤微组织制备方法。本发明的培养物可用于癌症研究、癌症治疗和癌症诊断。本发明的方法和培养物非常适合以高通量形式使用。例如，本发明的培养物在用于筛选抗癌剂的方法中和在用于试验抗癌剂效力的方法中是有用的。
该标准化体外肿瘤微组织的制备方法，包括以下步骤，
步骤一、肿瘤组织的处理：制备实体瘤组织，肿瘤取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，挑选活力较好的部位。将其置于添加抗生素的PBS中进行处理，同时抗生素的使用，可以有效去除肿瘤组织的细菌，获得无菌的肿瘤组织材料；
步骤二、肿瘤微组织的制备：将步骤一制备所得的肿瘤组织材料剪碎，剪碎的肿瘤组织转移至离心管，离心并小心去上清，获得目标大小的肿瘤微组织；
步骤三、将步骤二制备所获得的肿瘤微组织通过较大规格的多孔筛1；收集滤过的肿瘤微组织；
步骤四、将步骤三制备所获得的肿瘤微组织通过较小规格的多孔筛2；收集未滤过的肿瘤微组织。
步骤五、收获标准化肿瘤微组织。
上述的肿瘤微组织的制备方法中，抗生素为青霉素类、头孢菌素类、链霉素、庆大霉素、红霉素和白霉素的一种或两种或多种混合。
上述的肿瘤微组织的制备方法中，目标大小肿瘤组织的大小为0.1-3mm。
上述的肿瘤微组织的制备方法中，较大规格的多孔筛1，其规格为孔径0.1-3mm。
上述的肿瘤微组织的制备方法中，较小规格的多孔筛2，其规格为孔径0.1-3mm。
上述的肿瘤微组织的制备方法中，较小规格的多孔筛2的孔径小于较大规格的多孔筛1的孔径。
上述的肿瘤微组织的制备方法中，标准化肿瘤微组织的直径，小于多孔筛1的孔径，大于多孔筛2的孔径。
上述的肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述肿瘤微组织为肺癌、肾癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、原髓细胞白血病和结肠癌等实体瘤中的任一种。
上述肿瘤微组织的制备方法中，肿瘤微组织大小差异可控在50μm内。
本发明制备了一个标准化的肿瘤微组织。以此样本进行药物评价，均一性更好，获得的数据更具可比性，降低因为肿瘤大小不一导致的生物学差异。
可以用于肿瘤的生物学研究及后续医药评价的应用。本发明与现有方法相比，解决了肿瘤样本处理无法标准化的问题，考虑到样本均一性的问题，更利于相互比较，而且操作简单快捷低成本，可以大量制备。
附图说明
图1本发明技术流程示意图；a肿瘤微组织初次过滤示意图；b肿瘤微组织二次过滤示意图；c肿瘤微组织截留收获示意图。
其中：1大尺寸肿瘤微组织，2大规格多孔筛，3大尺寸肿瘤微组织，4大尺寸肿瘤微组织，5小规格多孔筛，6培养皿。
图2肿瘤微组织表征图。
图3肿瘤微组织尺寸定量统计图a未经标准化制备的肿瘤微组织尺寸统计图，b本发明的肿瘤微组织尺寸统计图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
将实体瘤肿瘤(乳腺癌)病人术后分离的肿瘤组织在最短时间内进入无菌环境中进行处理。切取非坏死部位的肿瘤样本，取出标本后立即浸入4℃预冷的装有PBS的无菌小瓶中，并在3小时内送抵实验室。其中PBS中含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素；在生物安全柜内，将肿瘤样本转移至100mm细胞培养皿内，用1×PBS 10mL冲洗三次，将血细胞清洗掉，剥离肿瘤标本表面的结缔组织、纤维和脂肪，处理后的肿瘤组织转移至一新的100mm培养皿内，滴加0.5mL PBS，用无菌手术刀片，手术剪和手术镊将肿瘤组织分割为直径小于1mm3的碎块；切碎的肿瘤组织转移至50mL离心管，用台式离心机，500转/分钟，离心2分钟；然后用移液器小心移除离心管内上清，将所获得的肿瘤微组织通过孔径1200μm的多孔筛，如图1a所示；收集滤过的肿瘤微组织，再通过800μm的多孔筛，如图1b所示；收集未滤过的肿瘤微组织，如图1c及图2所示。
使用显微镜对通过多孔筛过滤之前和之后的肿瘤微组织的直径进行测定，以400μm为区间，进行区间分布统计，结果如图3所示。未经多孔筛过滤之前，肿瘤微组织的直径大小分布较广，在各个区间均有，以此样本进行实验，相互误差较大，样本间不具可比性，无法进行评价。而经过滤制备之后，肿瘤微组织的直径大小分布集中，基本都在800-1200μm之间，具有很好的均一性，相互可以进行比较，是标准化的肿瘤微组织，可以在后续的实验中进行相关评价和研究。
Claims (8)
1.一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一、肿瘤组织的处理：肿瘤取材时尽量避免用退变组织，挑选活力较好的部位，将其置于添加抗生素的PBS中进行处理，去除肿瘤组织的细菌，获得无菌的肿瘤组织材料；
步骤二、肿瘤微组织的制备：将步骤一制备所得的肿瘤组织材料剪碎，剪碎的肿瘤组织转移至离心管，离心并小心去上清，获得目标大小的肿瘤微组织；
步骤三、将步骤二制备所获得的肿瘤微组织通过较大规格的多孔筛1；收集滤过的肿瘤微组织；
步骤四、将步骤三制备所获得的肿瘤微组织通过较小规格的多孔筛2；收集未滤过的肿瘤微组织；
步骤五、收获标准化肿瘤微组织。
2.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类、链霉素、庆大霉素、红霉素和白霉素的一种或两种或多种混合。
3.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述目标大小肿瘤组织的大小为0.1-3mm。
4.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述较大规格的多孔筛1，其规格为孔径0.1-3mm。
5.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述较小规格的多孔筛2，其规格为孔径0.1-3mm。
6.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：较小规格的多孔筛2孔径规格小于较大规格的多孔筛1。
7.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述制备的标准化肿瘤微组织的直径，小于多孔筛1的孔径，大于多孔筛2的孔径。
8.如权利要求1所述的一种标准化体外肿瘤微组织的制备方法，其特征在于：所述肿瘤微组织为选自肺癌、肾癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、原髓细胞白血病和结肠癌等实体瘤中的任一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20171201 |