CN108998495A - 一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法 - Google Patents

一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，与以往方法不同，可为癌症患者提供精准个体化治疗选药。本发明通过控制肿瘤细胞培养液中两性霉素B和所述庆大霉素的浓度，可以提高肿瘤细胞的成活率，有效维持细胞形态促进肿瘤细胞对营养物质的吸收。通过控制肿瘤细胞培养液中胰岛素与生长因子EGF的浓度，可以提高肿瘤细胞的生长速率，并提高细胞活性，可以得到大量的高活性肿瘤细胞，同时使用该比例的胰岛素和生长因子可以降低胎牛血清的使用量，由于胎牛血清价格比较昂贵，使用量减少有利于节约资源，并且使用本发明培养的细胞用于药物筛选测定的用药的半数抑制浓度(IC50)误差小，可以减少检测次数。

Description

一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法。
背景技术
乳腺癌是中国妇女最常见的恶性肿瘤，发病率高，严重威胁着妇女的健康。乳腺癌是一种全身性疾病，即使早期也有少量的乳腺癌细胞转移到身体其它器官，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，″三阴乳腺癌乳腺癌″特指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性的乳腺癌患者，占乳腺癌15-20％，其特点是复发性高，转移早和预后差等临床特点，目前其主要治疗包括局部治疗(手术和放疗)和全身治疗(化疗)为主。但由于肿瘤的异质性很高，其疗效和预后一直欠佳，FDA和CFDA尚未有推荐的靶向药物用于三阴性乳腺癌的辅助治疗，新辅助治疗或者解救治疗。但仍有一些靶向药物和免疫药物正在进行和III期临床试验。我们应用ROHS高通个体化用药筛选，重编程类器官高通量药物筛选ROHS(Reprogramed organoid Based High-throughputscreening，是用特殊方法将患者自己的肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来，在实验室保真扩增，生成大量微小肿瘤进行药物筛选的一种高通量药效检测技术，实现肿瘤患者的精准个体化治疗，这一技术有别于基因检测的技术，应用范围更广泛，可用于早中晚期及基因检测找不到靶向药物的肿瘤患者。为改善肿瘤患者的治疗效果带来新的希望。
随着对肿瘤细胞凋亡机制的深入研究，药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前肿瘤治疗的重要途径之一。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平或细胞水平的试验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏、快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。
据有关报道，20世纪90年代初期，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，一年内仅能筛选7.5万个样品。而在1997年高通量筛选发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选100万个样品。到1999年，由于高通量筛选的进一步完善，每天的筛选量就高达10万种化合物。
高通量药物筛选可以分成四部分：药物筛选模型、高容量的样品库、自动化工作站和高效率的数据处理系统，其中药物筛选模型是关键，高容量的样品库是药物筛选的先决条件。
随着高通量药物筛选的发展，将其运用于癌症药物的筛选可以加快药物筛选时间，减少人力物力，进而减轻患者的病痛，在短时间内发现可以有效治疗的药物，例如中国专利申请201510829192.1公开了一种抗包虫药物的高通量筛选方法，其具体公开了一种利用小鼠继发性细粒棘球蚴生发层细胞进行抗包虫药物的高通量筛选方法。采用的方案是：用细粒棘球蚴原头节感染实验小鼠，建立包虫病继发感染模型8-10个月后，剖检病鼠取出其体内棘球蚴囊，分离生发层细胞并建立细胞系。调整该细胞浓度并于96孔培养板中进行铺板，利用药物作用后细胞活性变化及细胞内源物质释放情况对药物作用效果进行评价，本发明极大地降低了药物筛选周期，不仅待测药物的用量少，而且提高了筛选精确度，降低了筛选成本。
又如，中国专利申请200610130108.8中公开了应用乳腺癌转移相关基因芯片建立筛选抗乳腺癌转移药物的方法，该方法包括：首先在抗乳腺癌转移药物作用下，通过流式细胞仪观察候选抗癌药物作用下，通过流式细胞仪观察候选抗癌药物抑制高转移倾向的乳腺癌LM-MCF-7细胞增殖的有限浓度，通过″伤口愈合″实验初步筛选出该药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移的作用；然后，应用建立的″乳腺癌转移相关基因芯片″，在基因水平上观察乳腺癌相关基因表达谱的变化，反向推测抗乳腺癌转移药物的作用和作用的靶基因，有利于揭示其分子机制。但是该方法涉及基因层次，检测较为复杂。
综上，由于当今社会各种化学物质的使用以及环境污染导致癌症的的发病率越来越高，乳腺癌称为女性最常见的恶性肿瘤之一，如何有效快速的选出治疗乳腺癌的药物提高治疗效果成为肿瘤药物研究的一项重要课题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，具体包括如下步骤：
(1)乳腺癌细胞的获得：从新鲜手术或者穿刺标本获取乳腺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的乳腺癌细胞。
(2)乳腺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)乳腺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中得到的乳腺癌重编程类器官分散，贴壁培养得到贴壁细胞；
(4)药物筛选：将步骤(3)中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选。
上述步骤(1)中所述的消化是：用消化酶消化，然后用为乳腺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液；所述消化酶由225单位/mL的胶原酶/透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成。
上述步骤(2)中所述的培养是：将步骤(1)中得到的分散肿瘤细胞置于肿瘤细胞培养液中在37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到肿瘤细胞株；
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
在一个优选实施方案中，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1；优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-11∶1；再优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-10∶1。
上述成分中完全DMEM(含4-10％的胎牛血清)表示：胎牛血清与完全DMEM的体积百分比为4-10％。
上述步骤(3)中所述的培养是：将步骤(2)中得到的乳腺癌重编程类器官用消化酶进行消化，然后用肿瘤选择性培养液稀释后过夜培养；所述消化酶为0.05％胰酶-EDTA。
所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
在一个优选实施方案中，所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶10-20；优选地，所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶12-18；再优选地，所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶14-16。
上述成分中RPMI 1640培养基(含2-5％胎牛血清)表示：胎牛血清与RPMI1640培养基的体积百分比为2-5％。
具体来说，本发明的技术方案是：一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，具体操作步骤为：
(1)获取乳腺癌细胞：将获得的乳腺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，然后用消化酶消化，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶/透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为乳腺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的乳腺癌细胞；
(2)乳腺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)乳腺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的乳腺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁培养过夜，即得贴壁的乳腺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的乳腺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
在一个优选实施方案中，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1；优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-11∶1；再优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-10∶1。
上述成分中完全DMEM(含4-10％的胎牛血清)表示：胎牛血清与完全DMEM的体积百分比为4-10％。
步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
在一个优选实施方案中，所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶10-20；优选地，所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶12-18；再优选地，所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶14-16。
上述成分中RPMI 1640培养基(含2-5％胎牛血清)表示：胎牛血清与RPMI 1640培养基的体积百分比为2-5％。
本发明的有益效果是：
1、本发明公开使用本发明提供的肿瘤细胞培养液对肿瘤细胞进行培养，通过控制两性霉素B和所述庆大霉素的浓度，可以提高肿瘤细胞的成活率，有效维持细胞形态促进肿瘤细胞对营养物质的吸收。
2、本发明公开使用本发明提供的肿瘤细胞培养液对肿瘤细胞进行培养，通过控制胰岛素与生长因子EGF的浓度，可以提高肿瘤细胞的生长速率，并提高细胞活性，可以得到大量的高活性肿瘤细胞，同时使用该比例的胰岛素和生长因子可以降低胎牛血清的使用量，由于胎牛血清价格比较昂贵，使用量减少有利于节约资源。
3、本发明在实施过程中使用肿瘤选择性培养液对肿瘤细胞株进行稀释处理，并控制肿瘤选择性培养液中胰岛素与转铁蛋白的浓度之比为1∶10-20，进行过夜培养得到生存状况良好的贴壁细胞，从而可以进一步提高药物筛选的准确性。
4、用本发明提供的药物筛选方法，可用于筛选对患者最为有效，副作用小的传统的化疗药物和靶向药物。
附图说明
图1为靶向药剂量反应曲线
图1：——3奥拉帕尼；——8克唑替尼；——9拉帕替尼；——10奥希替尼；——22阿法替尼；——24依维莫司。
图2为非靶向药剂量反应曲线
图2：——1多西他赛；——3奥拉帕尼；——4长春瑞滨；——5阿那曲唑；——11奥希替尼；——12紫杉醇；——13卡铂；——14阿霉素；——15他莫西芬；——16吡柔比星。
图3为联合用药剂量反应曲线
图3：——2顺铂+紫杉醇；——6表阿霉素+环磷酰胺；——7表阿霉素+紫杉醇；——17阿霉素+氟尿嘧啶；——18阿霉素+紫杉醇+环磷酰胺；——19阿霉素+环磷酰胺；——20阿霉素+紫杉醇；——21顺铂+紫杉醇+依托泊苷；——23顺铂+拉帕替尼。
图4药物相对药效剂量反应曲线
图4：——6表阿霉素+环磷酰胺；——7表阿霉素+紫杉醇；——8克唑替尼；——14阿霉素；——16吡柔比星；——17阿霉素+氟尿嘧啶；——18阿霉素+紫杉醇+环磷酰胺；——19阿霉素+环磷酰胺；——20阿霉素+紫杉醇；——22阿法替尼。
图5试验用药物剂量反应曲线
图5：——1多西他赛；——2顺铂+紫杉醇；——3奥拉帕尼；——4长春瑞滨；——5阿那曲唑；——6表阿霉素+环磷酰胺；——7表阿霉素+紫杉醇；——8克唑替尼；——9拉帕替尼；——10奥希替尼；——11氟唯斯群；——12紫杉醇；——13卡铂；——14阿霉素；——15他莫西芬；——16吡柔比星；——17阿霉素+氟尿嘧啶；——18阿霉素+紫杉醇+环磷酰胺；——19阿霉素+环磷酰胺；——20阿霉素+紫杉醇；——21顺铂+紫杉醇+依托泊苷；——22阿法替尼；——23顺铂+拉帕替尼；——24依维莫司。
具体技术方案
以下实施例中提到的乳腺癌细胞取自宁夏银川、上海、张家口、北京、山西等地的乳腺癌患者体内，术中冰冻病理报告证实为乳腺癌。
第一组实施例
实施例1一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
具体包括如下步骤：
(1)获取乳腺癌细胞：将获得的乳腺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，切成1mm大小，然后用4mL的消化酶消化2小时，每毫升消化酶含225单位胶原酶/透明质酸酶和13单位分散酶，然后用为乳腺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的乳腺癌细胞；
(2)乳腺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养3周得到微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)乳腺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的乳腺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释，过夜培养过夜，即得贴壁的乳腺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的乳腺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
本实施例1中在实施过程中使用本发明提供的肿瘤培养液以及选择性肿瘤培养液，肿瘤培养液中两性霉素B和氢化可的松的浓度比为8.33∶1，不在本发明优选浓度范围内；并控制肿瘤选择性培养液中胰岛素和转铁蛋白的浓度比为1∶24，不在本发明公开范围内，肿瘤培养液中加含10％的胎牛血清，肿瘤选择性培养液中加含5％的胎牛血清，对肿瘤细胞进行了3周的培养得到了生长性能好的贴壁乳腺癌细胞，可以满足药物筛选的要求。
实施例2一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
具体操作步骤为：
(1)获取乳腺癌细胞：将获得的乳腺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，切成2mm大小，然后用5mL的消化酶消化3小时，每毫升消化酶含225单位胶原酶/透明质酸酶和13单位分散酶，然后用为乳腺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的乳腺癌细胞；
(2)乳腺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2周得到微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)乳腺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的乳腺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释后培养过夜，即得贴壁的乳腺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的乳腺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
实施例2中使用本发明优选的实施方案，控制肿瘤培养液中两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9.25∶1，在本发明公开浓度范围内；并控制肿瘤选择性培养液中胰岛素和转铁蛋白的浓度比为1∶18.3在本发明公开范围内，意外的发现使用该培养液可以在减少培养液中的胎牛血清的含量(肿瘤培养液中加含6％的胎牛血清，肿瘤选择性培养液中加含3％的胎牛血清)的情况下依然可以在较短的时间内培养出符合要求的肿瘤细胞，并且肿瘤细胞的各种性能都比较好，可以适用于药物筛选。
实施例3一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
具体操作步骤为：
(1)获取乳腺癌细胞：将获得的乳腺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，切成2mm大小，然后用5mL的消化酶消化2.5小时，每毫升消化酶含225单位胶原酶/透明质酸酶和13单位分散酶，然后用为乳腺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的乳腺癌细胞；
(2)乳腺癌细胞的培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2.5周得到微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)贴壁细胞的培养：将步骤(2)中培养得到的乳腺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释后培养过夜，即得贴壁的乳腺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的乳腺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
实施例3中同样使用了本发明优选的实施方案，控制肿瘤培养液中两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9.33∶1，在本发明公开浓度范围内；并控制肿瘤选择性培养液中胰岛素和转铁蛋白的浓度比为1∶12在本发明公开范围内，但是由于培养基中各成分含量的增加意外的发现使用该培养液可以在减少培养液中的胎牛血清的含量(肿瘤培养液中加含8％的胎牛血清，肿瘤选择性培养液中加含3％的胎牛血清)的情况下依然可以在较短的时间内培养出符合要求的肿瘤细胞，并且肿瘤细胞的各种性能都比较好，可以适用于药物筛选。
为了证明本申请提供的肿瘤细胞培养液具有好的培养效果，每个实施例取100份乳腺癌肿瘤细胞，分别使用上述实施例1-3的培养方法进行肿瘤细胞培养，监测细胞培养情况。
第二组实施例
实施例4一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为8％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量4％。
实施例5一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为6％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量3％。
实施例6一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为4％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
实施例7一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例2的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为5％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
实施例8一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例2的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为4％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
实施例9一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例3的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为6％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量3％。
实施例10一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例3的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为5％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
实施例11一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
与实施例3的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为4％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
为了进一步证明本申请提供的肿瘤细胞培养液具有好的培养效果，每个实施例取100份乳腺癌肿瘤细胞，分别使用上述实施例4-11的培养方法进行肿瘤细胞培养，监测细胞培养情况。
根据上述测试数据可以看出，当细胞培养液中营养成分即两性霉素B和氢化可的松以及胰岛素和转铁蛋白的浓度比在本发明优选范围内时，适当减少胎牛血清的含量培养细胞的成功率不会出现明显降低，细胞依然可以保持其原有的形态，但是当营养成分的浓度比不在本发明优选范围内时，细胞培养的成功率会降低，培养得到的细胞无法保持原有形态，从经济上考虑本发明提供的培养液经济环保，节约资源。
试验例药物筛选试验
用上述实施例1-3中培养的肿瘤细胞进行乳腺癌肿瘤药物筛选
1、筛选用药种类
2、筛选用药的半数抑制浓度(IC50)
半数抑制浓度是指抑制效果为50％时所对应的药物浓度，半数抑制是用来衡量药物灵敏度的指标，半数抑制浓度的值越低，说明药物的起效浓度越低，对肿瘤细胞的杀伤力越强。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)乳腺癌细胞的获得：从新鲜手术或者穿刺标本获取乳腺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的乳腺癌细胞。
(2)乳腺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)乳腺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中得到的乳腺癌重编程类器官分散，贴壁培养得到贴壁细胞；
(4)药物筛选：将步骤(3)中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选。
2.根据权利要求1所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(1)中所述的消化是：用消化酶消化，然后用为肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液。
3.根据权利要求2所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：所述消化酶由225单位/mL的胶原酶/透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成。
4.根据权利要求1所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(2)中所述的扩增培养是：将步骤(1)中得到的分散肿瘤细胞置于肿瘤细胞培养液中在37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到肿瘤细胞株。
5.根据权利要求4所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
6.根据权利要求5所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1。
7.根据权利要求1所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：步骤(3)中所述的贴壁培养是：将步骤(2)中得到的乳腺癌重编程类器官用消化酶进行消化，然后用肿瘤选择性培养液稀释后过夜培养；所述消化酶为0.05％胰酶-EDTA。
8.根据权利要求7所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
9.根据权利要求8所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：所述的肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与所述的转铁蛋白的浓度之比为1∶10-20。
10.根据权利要求1-9任一项所述的抗乳腺癌药物的高通量筛选方法，其特征在于：具体操作步骤为：
(1)获取乳腺癌细胞：将获得的乳腺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，用消化酶消化，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶/透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为乳腺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的乳腺癌细胞；
(2)乳腺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的乳腺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到微小肿瘤，即得到乳腺癌重编程类器官；
(3)乳腺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的乳腺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁培养过夜，即得贴壁的乳腺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的乳腺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
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