CN101748098A - 乳腺癌移植瘤自发转移模型及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳腺癌移植瘤自发转移模型及其应用，属于生物医药领域。该乳腺癌移植瘤自发转移模型为自发转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231亚株，其显著特点为能够表达红色荧光蛋白，注入小鼠体内能够自发形成转移瘤病灶，利用活体动物体内光学成像系统可以检测其分布。将该模型与活体动物体内光学成像系统相结合，能够应用于抗肿瘤转移药物的筛选，为开发新的抗肿瘤转移药物提供一种有效的技术方法。

Description

乳腺癌移植瘤自发转移模型及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体是一种乳腺癌移植瘤自发转移模型及其应用。

背景技术

人类疾病的动物模型是生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模拟性表现的动物疾病材料。恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制尚未完全阐明，治疗效果亦不尽人意。而肿瘤模型，作为实验假说和临床假说的实验基础，可为研究恶性肿瘤的病因学、发展过程和治疗提供特有的条件。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，而转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌转移模型是筛选乳腺癌转移相关基因、探讨肿瘤转移分子机制和评价抑制转移实验性治疗疗效的重要工具。乳腺癌转移模型主要包括自发性转移模型、诱发性转移模型、转基因治疗转移模型和移植性转移模型。移植性转移模型以其操作简单，重复性好和生物学性稳定等优点应用最为广泛。乳腺癌移植性模型按建立方法可分为实验性转移模型和自发性转移模型。

今年来对移植转移模型转移灶的检测有了较大进展，采用活体动物成像技术不但能在肿瘤发生早期探测到各组织器官内的微小转移灶，还可以动态检测肿瘤细胞在动物体内的转移状态。

活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP，Cyt及dyes等)进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据，得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外，这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法，非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点。

发明内容

本发明是为了解决抗肿瘤转移药物的筛选问题，而提供一种乳腺癌移植瘤自发转移模型及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种乳腺癌移植瘤自发转移模型，该模型为自发转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231亚株，含有表达荧光报告基团的红色荧光蛋白。

所述乳腺癌移植瘤自发转移模型的制备方法，是按以下步骤制备的：

a.将表达荧光报告基团的红色荧光蛋白的乳腺癌细胞MDA-MB-231移植到nod/SCID小鼠体内；

b.应用活体动物体内光学成像系统检测小鼠体内红色荧光信号，判断原位移植瘤及转移瘤形成情况；

c.摘除待评估的组织，进行病理检测，验证转移瘤的形成；

d.从组织中分离出转移灶，体外克隆自发转移瘤株细胞。

所述乳腺癌移植瘤自发转移模型在筛选抗肿瘤转移药物中的应用。

所述乳腺癌移植瘤自发转移模型筛选抗肿瘤转移药物的方法，

a.将表达红色荧光蛋白的自发转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231亚株移植到nod/SCID小鼠体内；

b.将候选药物及空白药物对照分别施用于上述小鼠中；

c.应用活体动物体内光学成像系统检测小鼠体内红色荧光蛋白的荧光信号，判断施药组和对照组原位移植瘤及转移瘤的形成情况的差异；

d.摘除施药组和对照组待评估的组织，进行病理检测，验证转移瘤的形成差异。

这样设计的本发明，是将活体动物体内光学成像系统及小鼠乳腺癌移植瘤自发转移模型联合应用，为开发新的抗肿瘤转移药物提供一种有效、可行的技术方法，

附图说明

图1小鼠乳腺癌移植瘤自发转移模型；

图2癌立息(Avolix)抗肿瘤转移作用。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：小鼠乳腺癌移植瘤自发转移模型的建立

一、材料和方法

1.实验动物：nod/SCID小鼠购自北京维通利华公司，鼠龄为4～6周，雌性。饲养条件：在恒温(25～28℃)恒湿(45％～50％)，SPF条件免疫缺陷动物室内。笼具、垫料，饮水和食料均经高压灭菌供动物自由摄入。

2.人乳腺癌细胞系：表达红色荧光蛋白(RFP)的人乳腺癌细胞系RFP-MDA-MB-231为天津肿瘤医院所藏，MDA-MB-231细胞自行构建，常规传代培养，收集细胞，接种于nod/SCID鼠乳腺脂肪垫皮下每点1×10⁷个/0.1ml细胞，生成瘤块后用于原位种植的瘤源，或者鼠尾静脉注射1×10⁶个/ml细胞。

3.应用活体动物体内光学成像系统(美国精诺真

200Series)连续观察检测小鼠体内RFP荧光信号，判断原位移植瘤及转移瘤的形成情况，摘除待评估的一个或多个组织，进行病理检测，进一步验证转移瘤的形成。

4.移植传代：从组织中分离出转移灶，体外克隆原代培养高转移细胞株。将人乳腺癌细胞(RFP-MDA-MB-231)肺转移致瘤灶剪碎，纱网研磨成单细胞，体外37℃培养箱培养。将上述细胞常规传代培养，收集细胞，再接种于SCID鼠乳腺脂肪垫皮下，每点1×10⁷个/ml细胞或者尾静脉注射1×10⁶个/ml细胞。

5.应用活体动物体内光学成像系统(同上)再连续观察检测小鼠体内RFP荧光信号，判断原位移植瘤及转移瘤的形成情况，摘除待评估的一个或多个组织，进行病理检测，进一步验证转移瘤的形成。如此反复10个循环。得到稳定的转移瘤株细胞。

6.检测项目：

(1)病理学检测：将摘除待评估的一个或多个组织经10％中性甲醛固定，石蜡切片，常规苏木素一伊红(HE)染色，进行病理学观察肿瘤传代过程中的转移特点。

(2)透射电镜观察：常规方法制备标本，使用JEOL SC-100电子显微镜进行透射电镜观察，并比较原代与晚代的细胞形态学变化及与转移的关系特点。

(3)DNA倍体分析：取移植瘤块，研磨成单细胞后乙醇固定12h，PI(Coulter产品)染色后，以人外周血淋巴细胞做对照，流式细胞仪检测细胞周期分布，并根据下列公式计算出DNA倍体数。

二、结果

1.各代移植瘤生长特性及转移的观察：原代移植瘤的荷瘤小鼠的移植瘤呈圆形或椭圆形，表面多数无完整的包膜形成，肿瘤周围毛细血管丰富，早期质地较硬，晚期时移植瘤中央发黑，瘤体中心坏死。取其肺转移癌灶，仍以原代移植的方法作传代、筛选，现已传至18代。随着其肺转移灶癌细胞在SCID鼠体内不断筛选，其移植瘤潜伏期、肿瘤生长周期及肺转移率都在不断变化。如表1所示，肿瘤移植成功率平均在90％以上，原代的移植瘤平均潜伏期为(20±5)d，8代以后潜伏期逐渐减少为(15±2)d，10代以后为(12±2)d，且趋于稳定，见表1。

表1各代小鼠移植瘤观察表

代数	小鼠只数	移植成功率(％)	肺转移率(％)	潜伏期(d)
					原123456789101518	6666666644444	1006683958383917510091100100100	28464272537871807472969095	20±520±5------15±2-12±2-12±2

2.形态学检查：(1)移植瘤形态学特征：光镜观察：镜下可见癌细胞排列成小条索，小团块状，在间质中呈浸润性生长，癌细胞体积大，胞浆丰富，核大深染，核仁清楚，各代无明显差别。电镜观察：晚代与原代相比，细胞核严重变形，可见核仁及深入的核内馅，核异染色质凝集成团，有大型核仁占核面积1/2强，类圆型，核内窗孔大部分消失。胞浆细胞器分布不均一，粗面内质网均圆泡化，线粒体数目少，大小不一，有未成熟小型的线粒体。

3.体内光学成像：如图1所示，在小鼠的乳腺原位皮下及肺中均可监测到肿瘤细胞的荧光显像。

实施例2：应用乳腺癌移植瘤自发转移模型筛选抗肿瘤转移药物的方法。

1.将实施例1所述表达RFP的高转移人乳腺癌细胞系MDA-MB-231瘤株细胞，接种于SCID鼠乳腺脂肪垫皮下每点1×10⁷个/ml细胞，或者尾静脉注射。

2.接种后3天给予候选的抗肿瘤转移的化合物，并给予空白对照。

3.应用活体动物体内光学成像系统连续观察检测小鼠体内RFP荧光信号，判断原位移植瘤及转移瘤的形成情况，摘除待评估的一个或多个组织，进行病理检测，进一步验证是否存在转移瘤。

通过活体成像系统能够准确观察药物抗肿瘤转移作用的效果，即小鼠体内其他脏器是否有RFP荧光信号存在。

实施例3：活体动物体内光学成像系统监测Avolix抗肿瘤转移作用

一、材料和方法

1.将实施例1、2所述表达RFP的高转移人乳腺癌细胞系MDA-MB-231瘤株细胞，接种于SCID鼠乳腺脂肪垫皮下每点1×10⁷个/ml细胞，或者尾静脉注射。

2.接种后3天给予不同配伍组合的癌立息(Avolix)，给药方案如下：

第一组：癌立息30ng/kg；第二组：对照盐水加DMSO；第三组：Avolix30ng/kg加紫杉醇(Taxol)15ng/kg；第四组：Taxol15ng/kg加DMSO；第五组：Avolix50ng/kg加Taxol 10ng/kg

3.应用活体动物体内光学成像系统(同上)连续观察检测小鼠体内RFP荧光信号，并测量直径，摘除待评估的一个或多个组织，进行病理检测，进一步确证转移瘤的存在。

二、结果

如图2所见，单用癌立息对转移瘤的生长具有明显的抑制作用，联合使用紫杉醇效果更为明显，说明癌立息能够明显地协同紫杉醇的抑瘤作用。

Claims (4)

1.一种乳腺癌移植瘤自发转移模型，其特征在于该模型为自发转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231亚株，含有表达荧光报告基团的红色荧光蛋白。

2.权利要求1所述乳腺癌移植瘤自发转移模型的制备方法，是按以下步骤制备的：

a.将表达荧光报告基团的红色荧光蛋白的乳腺癌细胞MDA-MB-231移植到nod/SCID小鼠体内；

b.应用活体动物体内光学成像系统检测小鼠体内红色荧光信号，判断原位移植瘤及转移瘤形成情况；

c.摘除待评估的组织，进行病理检测，验证转移瘤的形成；

d.从组织中分离出转移灶，体外克隆自发转移瘤株细胞。

3.权利要求1所述乳腺癌移植瘤自发转移模型在筛选抗肿瘤转移药物中的应用。

4.权利要求1所述乳腺癌移植瘤自发转移模型筛选抗肿瘤转移药物的方法，其特征在于：

a.将表达红色荧光蛋白的自发转移的乳腺癌细胞MDA-MB-231亚株移植到nod/SCID小鼠体内；

b.将候选药物及空白药物对照分别施用于上述小鼠中；

c.应用活体动物体内光学成像系统检测小鼠体内红色荧光蛋白的荧光信号，判断施药组和对照组原位移植瘤及转移瘤的形成情况的差异；

d.摘除施药组和对照组待评估的组织，进行病理检测，验证转移瘤的形成差异。

Images