CN108685946A - 一种提高结肠癌pdx模型成功率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学领域，涉及动物模型的建立方法，具体涉及人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法。本发明针对现有结肠癌建立模型成功率低、不稳定的缺陷，建模前使用前列腺素E2预处理小鼠，将离体的患者的原位肿瘤接种到免疫缺陷小鼠（Balb/c或NOD/SCID）体内制作临床前肿瘤模型，提供了一种能够提高结肠癌PDX模型成功率的方法，尤其是一种高浸润、高转移、稳定的人结肠癌移植瘤小鼠模型的制备方法。本发明对结肠癌临床前期评估、治疗和预后观察具有重要的价值。

Description

一种提高结肠癌PDX模型成功率的方法

技术领域

本发明涉及医学领域，涉及动物模型的建立方法，具体涉及人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法。

背景技术

结肠癌是一种胃肠外科常见的恶性消化道肿瘤，发病率及病死率均较高。2010年，我国结直肠癌新病发生率在男性中占第5位（23.38%），女性中占第3位（18.30%），死亡率分别占11.39%和8.64%，且随着年龄的增长而升高。为研究发现新药的特异性靶点和准确预测疗效，肿瘤动物模型研究不可或缺。

目前用于临床前研究的动物肿瘤模型主要有三种：转基因模型（geneticallyengineered models，GEMs），细胞系来源的移植模型和患者来源的瘤块或细胞移植模型（patient-derived xenografts，PDX）。GEMs常涉及相应目标化合物临床前评估的高度特异性靶分子，但是，疗效的评价会受到肿瘤生长延迟和GEMs仅能代表单一靶肿瘤模型这一客观事实的影响。由于小鼠与人类基因和各种生物学特性的差异较大，鼠源肿瘤动物模型在临床和药物开发的应用和价值受到限制。动物肿瘤移植模型是目前应用最多的模型，即用人源肿瘤组织或细胞移植到动物体内所形成的肿瘤动物模型。PDX是将患者的原位肿瘤接种到免疫缺陷小鼠（Balb/c或NOD/SCID）体内用于制作临床前肿瘤模型，其优势在于可以在小鼠体内维持肿瘤的分子学、基因学及病理组织学的异质性。

结肠癌组织移植前冷冻保存，能使其保持新鲜肿瘤的组织学和基因学状态，与细胞株产生的小鼠模型相比, PDX模型能更好地反映原发病人的病理特性以及基因表达，因此可以更准确地预测临床疗效，是现阶段以及未来进行肿瘤研究和新药开发不可或缺的工具。

基于现有技术的结肠癌小鼠模型制备周期长、成功率低、模型不稳定等缺陷，本申请的发明人拟对小鼠结肠癌模型的制备方法进行改进，提供一种提高结肠癌PDX模型成功率的方法。

与本发明相关的现有技术有，

1.陈万青，张思维，曾红梅 等。中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J]. 中国肿瘤.2014,23(1):1-10.

2.Garber K. From human to mouse and back: ‘tumorgraft’ models surge inpopularity.J Natl Cancer Inst2009;101:6–8

3.Peterson JK, Houghton PJ. Integrating pharmacology and in vivo cancermodels in preclinical and clinical drug development.Eur J Cancer2004;40:837–844.

4.Linnebacher, M. et al.Cryopreservation of human colorectal carcinomasprior to xenografting. BMC Cancer 10, 362 (2010).

5.Cree IA, Glaysher S, Harvey AL. Efficacy of anti-cancer agents in celllines versus human primary tumour tissue. Curr Opin Pharmacol 2010;10:375–9.

6.Fichtner I, Slisow W, Gill J, Becker M, Elbe B, Hillebrand T, et al.Anticancer drug response and expression of molecular markers inearly-passagexenotransplanted colon carcinomas. Eur J Cancer. 2004;40:298–307.

7.Fiebig HH, Maier A, Burger AM. Clonogenic assay with established humantumour xenografts: correlation of in vitro to in vivo activity as a basis foranticancer drug discovery. Eur J Cancer 2004;40:802–20.

8.Hidalgo M, Bruckheimer E, Rajeshkumar NV, Garrido-Laguna I, De OliveiraE, Rubio-Viqueira B, et al. A pilot clinical study of treatment guidedbypersonalized tumorgrafts in patients with advanced cancer. Mol Cancer Ther2011;10:1311–6.

9.Krumbach R, Sch€uler J, Hofmann M, Giesemann T, Fiebig H-H,Beckers T.Primary resistance to cetuximab in a panel of patientderived tumour xenograftmodels: activation of MET as one mechanis for drug resistance. Eur J Cancer2011;47:1231–43.

10.Rubio-Viqueira B, Hidalgo M. Direct in vivo xenograft tumor model forpredicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin PharmacolTher 2008;85:217–21.

11.Bertotti A, Migliardi G, Galimi F, Sassi F, Torti D, Isella C, et al.A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ('xenopatients') identifies HER2 as an effective therapeutic target incetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov 2011;1:508–23.

12.DeRose YS, Wang G, Lin YC, Bernard PS, Buys SS, Ebbert MT, et al.Tumorgrafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumorpathology, growth, metastasis and disease outcomes.Nat Med 2011;17:1514–20.

13.李伟忠，王晓燕，丁彦青.塞来昔布抑制Tca8113释放PEG2及与COX-2、VEGF-C mRNA表达的相关性研究[J].南方医科大学学报，2009，29（3）：196-199.。

发明内容

本发明的目的在于，解决现有技术存在的技术问题：针对现有结肠癌建立模型成功率低、不稳定的缺陷，提供一种提高结肠癌PDX模型成功率的方法，尤其是一种高浸润、高转移、稳定的人结肠癌移植瘤小鼠模型的制备方法。

本发明的一种提高结肠癌PDX模型成功率的方法，其特征在于，使用前列腺素E2预处理小鼠。

具体的，本发明的目的通过下述技术方案实现：

（1）临床筛选，获取肿瘤标本；

（2）肿瘤标本的处理：标本取出后用9‰次氯酸钠消毒处理后转入含有适量人体组织培养液RPMI-1640的50ml离心管中，并置于冰上运送至动物中心；

（3）将标本放入含有少量RPMI-1640组织培养液的100mm培养皿中，并分成两部分，用于移植的标本切成小块，加盖放于冰上；

（4）小鼠分为两组，提前一天实验组接种前用药物处理，对照组接种前用生理盐水处理，后将用于移植的标本经70%酒精消毒后移植到裸小鼠右侧背部近腋部皮下，压迫伤口，无出血，每组8只小鼠（4-6周龄）；

（5）令小鼠自然生长并观察，每周检测两组小鼠的各种指标，8周后对比两组的成瘤情况。

本发明步骤（4）中，所述的药物是前列腺素E2，采用的前列腺素E2能促进细胞的增殖、分化，以及能促进肿瘤血管的形成，抑制肿瘤细胞凋亡，本发明的一个实施例中，以10μg/（kg.d）的剂量进行皮下注射。

本发明步骤（4）中，所用的注射针为20号套管针。

本发明中，采用人结肠癌组织直接移植至裸小鼠皮下，经前列腺素E2处理后成瘤稳定，成瘤率大幅提高，并未发现明显转移。

本发明利用人结肠癌组织建立了结肠癌移植瘤模型，保存了原代人体肿瘤组织的特性，用前列腺素E2处理后，小鼠的成瘤率明显提高，可用于药物筛选，并为进一步的研究打下基础。

附图说明

图1、小鼠体重变化趋势图。

图2、肿瘤的生长曲线图。

图3、结肠癌小鼠成瘤率图。

图4、小鼠成瘤体积比较图。

具体实施方式

通过以下实施例用以进一步理解本发明，并不以任何方式限制本发明。

下述实施例和实验所用的材料及仪器如下：

离体的人结肠癌组织来源于复旦大学附属肿瘤医院一手术患者，SPF级BALB/c-nu/nu裸小鼠8只一批，共计16只，体重27±0.25g，由同济大学实验动物中心提供，RPMI-1640培养基，生理盐水250ml*3袋（百特医药有限公司），9‰次氯酸钠消毒液，70%酒精，胎牛血清（杭州四季青公司），SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司），眼科剪，无菌培养皿，手术刀，20号套管针，度量尺，数码相机（NIKON）

实施例1 建立人结肠癌移植瘤小鼠模型

1、标本采集

入选标准：新发结肠癌患者，病理学诊断明确；患者临床资料完善；签署知情同意书；

收集患者基本临床资料，如年龄、性别、TNM分期等、治疗前基本资料包括肿瘤标志物水平、血常规、生化、影像学检查结果等、治疗资料包括用药方案、不良反应等、随访资料包括治疗效果、生存期等，上述资料在研究过程中将同时进行，并建立患者资料数据库；

通过手术切除标本、穿刺活检标本收集离体的患者肿瘤组织，不附带其他组织；组织标本的大小对建立的模型的成功率至关重要，在条件允许的情况下得到尽可能多的组织标本；

2、肿瘤标本处理

标本取出后，用9‰的次氯酸钠进行消毒，后放入盛有适量人体组织培养液RPMI-1640的50ml无菌离心管中，培养液完全没过标本，并把离心管置于冰上以保持组织的活性；在12小时内将标本运送至动物中心，放入100mm培养皿内，内有少量新鲜RPMI-1640， 分成两部分；用于动物移植的标本切碎至小于2×2mm的小块，加盖放在冰上(实验室超净台内)，另一部分放入10%NBF(neutral buffered formalin，4% formaldehyd)，并于24 至48 小时后转入70%酒精（常温，试验台上）；

3、将4-6周龄小鼠分成两组，每组8只，接种前一天，对照组尾皮下注射生理盐水，实验组皮下注射注射前列腺素E2，剂量为10μg/（kg.d）。

4、携带肿瘤标本进入动物房，70%酒精消毒后，移植到裸小鼠右侧背部近腋部皮下，压迫伤口，无出血。令小鼠自然生长并观察，每周检测两组小鼠的各种指标，8周后对比两组的成瘤情况。

5、实验结果显示

经药物处理的人结肠癌小鼠移植瘤成功率87.5%显著高于较对照组62.5%，其瘤灶容易剥离，同周围组织的分界明显，分离的肿瘤表面尚光滑，呈多个结节状突起，整体呈粉红色，质地较韧。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述实施例并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种提高结肠癌PDX模型成功率的方法，其特征在于，使用前列腺素E2预处理小鼠；

其包括步骤：

（1）临床筛选，获取肿瘤标本；

（2）肿瘤标本的处理：标本取出后用次氯酸钠消毒后转入含有适量人体组织培养液RPMI-1640的50ml离心管中，并置于冰上运送至动物中心；

（3）将标本放入含有少量RPMI-1640的100mm培养皿中，并分成两部分，用于移植的标本切成小块，加盖放于冰上；

（4）4-6周龄小鼠分为两组，每组8只，实验组接种前用药物处理，对照组接种前用生理盐水处理，后将用于移植的标本经70%酒精消毒后移植到裸小鼠右侧背部近腋部皮下，压迫伤口，无出血；

（5）令小鼠自然生长并观察，每周检测两组小鼠的各种指标，8周后对比两组的成瘤情况。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的筛选标准为新发结肠癌患者，患者临床资料完善，并签署知情同意书。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4中）所述的药物是前列腺素E2，处理方式为皮下注射。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）所用的注射针为20号套管针。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）所检测的小鼠指标包括小鼠的体重、小鼠的成瘤率、小鼠所成瘤的体积。