CN104195099A

CN104195099A - 一种人类结肠癌细胞外基质体外模型及其制备方法

Info

Publication number: CN104195099A
Application number: CN201410436867.1A
Authority: CN
Inventors: 赵博; 王振军
Original assignee: Beijing Chaoyang Hospital
Current assignee: Beijing Chaoyang Hospital
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明提供一种人类结肠癌细胞外基质体外模型及其制备方法，该模型为冻干、无菌、无细胞毒性物质残留的多孔膜状，其完全去除细胞成分、并完整保留细胞外基质的成分和结构。制备方法包括：取离体4小时以内的人类结肠癌或直肠癌组织，前置处理；在恒温摇床中采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液灭菌；在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中使用5～100mmol/L氢氧化钠溶液清洗30～90min进行脱细胞；将材料放于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥成型；在无菌的状态下完成包装。该方法得到的人类结肠癌细胞外基质体外模型将结直肠癌细胞外基质分离出来单独研究，构建出结直肠癌微环境和EMT研究的理想体外和动物体内模型。

Description

一种人类结肠癌细胞外基质体外模型及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学基础研究技术领域，具体涉及一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，以及利用该制备方法得到的人类结肠癌细胞外基质体外模型。

背景技术

恶性肿瘤不仅仅是基因突变造成的肿瘤细胞自主性的增殖或克隆，而是肿瘤细胞、间质细胞等多种不同类型的细胞成分与特殊的微环境之间相互作用、相互影响的复杂的发展过程，针对肿瘤细胞本身的研究并不能完全揭示肿瘤的发生发展机制。肿瘤微环境是一个复杂的综合系统，由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、间质细胞、各种肽类因子(生长因子，趋化因子，细胞因子，抗体)及其代谢物组成，控制着肿瘤细胞与间质细胞之间、细胞与ECM之间的复杂的相互作用。在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤微环境也在发生阶段性的变化，表现为细胞外基质成分的改变，出现活化的成纤维细胞，微血管密度增加和炎症细胞数量增多等，肿瘤细胞通过上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)机制对微环境的改变进行应答，失去上皮细胞特征获得间质细胞特征，从而获得侵袭性，实现侵润和转移。近年来，肿瘤微环境和上皮间质转化成为肿瘤研究领域最受关注的两个焦点问题。揭示肿瘤微环境和EMT的分子机制对于阐明肿瘤发生发展机制以及寻找新的治疗靶点具有重要的科学意义。

ECM构成了细胞外微环境的主要部分。它是由多种不溶性细胞外大分子按一定比例和结构建成的复杂的有机的统一整体。它是细胞的生存及活动的场所，具有连接、支持、保水、抗压、保护等物理学功能，并且可以通过整合素或其他细胞表面受体与细胞直接发生作用，调节细胞的生长、代谢、功能、迁移、增殖和分化，进而调整整个组织器官功能。

研究显示，不同的组织，不同的发育阶段，不同的病理情况下ECM的组成、结构和物理学特性均存在显著差异。近年来，对乳腺癌、卵巢癌等实体肿瘤的研究提示，在肿瘤的发生发展过程中，ECM发生了类似胚胎发育时的重塑过程，并且，这种重塑过程和肿瘤形成同时发生。ECM重塑表现在ECM的分子组成、结构和物理学特性等方面的改变。在乳腺癌中，I型胶原、FN、骨粘连蛋白(secreted protein,acidic and rich incysteine，SPARC)等ECM分子的表达增高；特别值得关注的是，某些仅在胚胎发育时期表达的ECM蛋白，如细胞粘合素C(tenascin-C，TNC)在肿瘤进展期又重新表达。TNC是一种多功能蛋白，在正常成人组织中低水平表达，在胚胎发育、伤口愈合和肿瘤组织中表达上调。ECM的张力和硬度也对其功能具有重要影响，可以调节上皮细胞的生长、分化和迁移。多项研究显示，乳腺癌ECM中胶原组成和结构发生改变，导致了ECM的硬度增加。Paszek MJ等比较了乳腺癌组织和正常乳腺组织ECM硬度的差异，发现乳腺癌的进展伴随着ECM硬度的增加，减少ECM的硬度可以减轻乳腺癌的恶性程度。Levental等的研究显示，乳腺癌组织中胶原纤维变直并和肿瘤边缘垂直，与正常组织存在明显差异，其中Ⅰ型胶原表达显著增加，交联程度显著提高。

目前的研究认为，在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞、间质细胞通过自分泌或者旁分泌方式释放多种蛋白酶，特别是金属基质蛋白酶(MMPs)的水解作用是导致的ECM重构的主要原因，细胞通过整合素信号通路粘附并水解ECM成分，肿瘤相关纤维母细胞进一步合成新的ECM分子。另一方面，ECM的重构也会作用于肿瘤细胞，Levental KR等认为，ECM硬度的增加会影响整合素的表达，通过整合素向细胞传递信号，促进肿瘤进展。最新的研究提示，ECM重构可能是肿瘤上皮间质转化(EMT)的重要诱导机制。Sume等的体外实验研究显示，FN–EDA的表达可以诱导TGFβ信号通路，进而诱发EMT的发生。Mathias RA等通过对MDCK细胞EMT相关的分泌型蛋白组学分析，发现IV型胶原和laminin5的表达下调，诱发了RAS诱导的EMT过程。在肿瘤发生过程中,EMT是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的关键分子事件。通过EMT，肿瘤细胞由具有极性的上皮细胞形态转变为失去极性，具有高迁移能力间质细胞形态，从而实现局部浸润和远处转移。E-钙黏蛋白(E-cadherin,Ecad)用于维持正常细胞间连接的稳定性，其表达水平与EMT的发生以及肿瘤的侵袭能力呈负相关，是EMT的关键分子，可以作为EMT的分子标志。EMT过程涉及TGF-β-Smad、Ras/Raf/MAPK、P38MAPK、Src激酶、Rho激酶、PI3K、Wnt/β-catenin等多种信号通路。研究表明,表皮生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等生长因子以及Twist、Snail、Slug、NF2κB等多种转录因子具有诱导EMT的作用。

到目前为止，所有的ECM相关研究均是通过对肿瘤组织中相关基因或蛋白的表达水平的研究，或者采用肿瘤细胞在加入ECM成分的三维培养环境中的体外实验研究，存在很大的片面性：1.没有将ECM分离出来单独研究，不能摆脱细胞或者肽类因子等其他因素的干扰，故不能真实反映ECM的变化特征；2.由于无法真实的模拟体内ECM，基于体外培养环境的研究并不能确切的反映组织内ECM对细胞的作用。因此，目前对肿瘤ECM的研究结果，还远远不能揭示肿瘤ECM重构的特点、过程及其对细胞的作用。EMT的研究也存在相似的不足：在肿瘤组织中，EMT的发生在时间和空间上均呈暂时性和偶然性发生，常规病理学分析无法检测EMT。目前大多数探索性研究来自于对EpH4/EpRas、NMuMG、MDCK、MCF-10A和LIM1863等永生化细胞系基于二维或三维培养环境的体外研究，同样，这些研究也不能真实反映体内情况。因此，建立理想的肿瘤ECM体外模型对于深入揭示ECM对肿瘤细胞、间质细胞的作用，揭示肿瘤细胞EMT分子机制具有至关重要的意义。但是，到目前为止，还没有一项研究能够构建出真实反映ECM的体外模型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，该制备方法得到的人类结肠癌细胞外基质体外模型将结直肠癌细胞外基质分离出来单独研究，构建出结直肠癌微环境和EMT研究的理想体外和动物体内模型，可根据不同研究的需要进行细胞学和动物体内实验，对于揭示结直肠癌发生发展机制具有重要的科学意义；并且，有可能鉴定出针对肿瘤微环境和EMT的新的分子靶点。

本发明所采用的技术方案为：

一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)结肠癌组织标本的前置处理：取离体4小时以内的人类结肠癌或直肠癌组织(手术切除的肿瘤组织)，使用纯水冲洗3遍；

(2)灭菌：采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液法灭菌，该步骤在恒温摇床中进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％，灭菌时间为1～2h，摇床振荡频率为30～600rpm，温度范围为4～40℃，然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5um/s以下时终止；

(3)脱细胞：在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，在清洗槽中注入氢氧化钠溶液，开启清洗器，清洗时间为30～90min，氢氧化钠溶液浓度为5～100mmol/L，然后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液，开启清洗器，清洗时间为10～30min，PBS清洗重复2～5次，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5um/s以下时终止；

(4)成型：将材料放于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25～50℃，保温0.5～4小时，升温至15℃，保温4～12小时，升温至15℃，保温0.5～4小时，升温至25℃，保温4小时；

(5)包装灭菌：在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成后采用环氧乙烷进行灭菌。

所述步骤(2)中过氧乙酸的体积百分含量为0.1％，灭菌时间为1h。

所述步骤(2)中摇床振荡频率为100～300rpm，进一步优选为200rpm。

所述步骤(3)中氢氧化钠的清洗时间为60min，氢氧化钠溶液浓度为5～20mmol/L、进一步优选为10mmol/L。

所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的清洗时间为20min。

所述步骤(3)中清洗槽振荡频率为100～300rpm，超声波频率为20～80KHZ。

所述步骤(3)中清洗槽振荡频率为200rpm，超声波频率为20～50KHZ(进一步优选为35～50KHZ，最优为45KHZ)。

所述步骤(4)中预先设计的冻干流程为：预冻至-25℃，保温2小时，升温至15℃，保温8小时，升温15℃，保温2小时，升温至25℃，保温4小时。

利用上述人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法得到的人类结肠癌细胞外基质体外模型，为冻干、无菌、无细胞毒性物质残留的多孔膜状，其完全去除细胞成分、并完整保留细胞外基质的成分和结构。

本发明中注射用水的使用标准依照国家药典中规定。

本发明中所述的清洗槽可振荡的超声波清洗机是将传统超声波清洗机的清洗槽与机械震荡器相结合，使清洗槽能够在超声波清洗的同时发生机械震荡，实现了机械振荡与超声波清洗同时联合发挥作用。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

本发明病毒灭活采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液结合摇床，脱细胞采用低浓度氢氧化钠溶液结合机械振荡和超声波清洗，提高了病毒灭活、脱细胞工艺的效率，大大降低了工艺耗时，简化了工艺流程，整个制备过程仅使用过氧乙酸-乙醇、氢氧化钠两种溶液，并且浓度均远远低于现有的制备技术，使制备的材料完全去除了细胞成分，完整保留了细胞外基质的成分和结构，无细胞毒性物质残留；并且，在成型工艺中通过采用特殊的冻干流程，保留天然ECM三维结构，孔隙不压缩，适合于进行多种细胞学和动物体内实验。应用脱细胞结直肠癌细胞外基质作为结肠癌细胞系或间质细胞的三维培养环境，能够更真实地模拟体内肿瘤ECM与癌细胞或间质细胞的相互关系，可以深入揭示ECM对细胞的作用机制。

附图说明

图1所示的是本发明实施例3中的光学显微镜图；

图2所示的是本发明实施例3中的扫描电镜图；

图3所示的是本发明实施例3中的透射电镜图；

图4所示的是本发明实施例3中的Masson染色图；

图5所示的是本发明实施例5中的光学显微镜图；

图6所示的是本发明实施例5中的电镜图；

图7所示的是本发明实施例5中的细胞划痕实验图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备

1.结肠癌组织标本的前置处理

收集I～IV期结直肠癌标本及相应正常组织各30例，具体的病例资料信息如表1所示。取1cm×1cm×1cm大小的新鲜结肠癌组织，使用纯水冲洗3遍。所述的新鲜组织是指手术切除的肿瘤组织，离体4小时以内。

2.灭菌

采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液法灭菌，该步骤在恒温摇床中进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.1％，灭菌时间为1h，摇床振荡频率为200rpm，温度范围为4～40℃，然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5um/s以下时终止。该步骤中磷酸盐缓冲液的配制方法为称7.9gNaCl、0.2gKCl、0.24gKH₂PO₄、1.8gK₂HPO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，然后加蒸馏水定容至1L。

2.脱细胞

该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，在清洗槽中注入氢氧化钠溶液，开启清洗器，清洗时间为60min，氢氧化钠溶液浓度为10mmol/L，然后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液，开启清洗器，清洗时间为20min，PBS清洗重复2～5次，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5um/s以下时终止。该步骤中清洗槽振荡频率为200rpm，超声波频率为45KHZ。该步骤中磷酸盐缓冲液的配制方法同步骤2。

3.成型

该将已用注射用水清洗洁净的产品放于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25℃，保温2h，升温至15℃，保温8h，升温至15℃，保温2h，升温至25℃，保温4小时。

4.包装灭菌

在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成后采用环氧乙烷进行灭菌。

表1患者病理资料

实施例2：实施例1所制备的脱细胞结肠癌细胞外基质的孔隙率检测

采用压汞法测定材料的孔隙率。结果：孔隙率不低于85％。

实施例3：实施例1所制备的脱细胞结肠癌细胞外基质的组织学检测

1)光学显微镜观察：方法：石蜡包膜后的材料行苏木精—伊红染色，倒置相差显微镜观察。结果：无细胞和细胞碎片残留，胶原纤维保存完好，并且随着结肠癌分期的增加，结肠癌细胞外基质胶原纤维的含量增加，密度增高，分布紊乱，如图1所示。

2)超微结构观察。结果：材料呈多孔结构，孔径均匀，平均孔径大小为200um，孔隙率大于85％，并且随着结肠癌分期的增加，结肠癌细胞外基质的孔隙率增大，表面粗糙度增加，如图2、图3所示。

3)Masson染色观察胶原纤维构型特征。结果：随着结肠癌分期的增加，结肠癌细胞外基质的胶原含量增多，密度增大，如图4所示。

实施例4：实施例1所制备的脱细胞结肠癌细胞外基质的细胞毒性检测

方法：按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质:含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003(《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》)中规定的试验方法进行试验。结果：细胞毒性反应小于或等于1级。

实施例5：实施例1所制备的结肠癌细胞外基质模型在细胞学实验中的应用

将实施例1所制备的结肠癌细胞外基质模型与人类结肠癌细胞系(HT29)共培养。采用倒置显微镜和电镜观察观察组织学和超微结构特征；MTT法分析细胞生长曲线；划痕实验检测细胞迁移能力。

结果：培养1天后肿瘤细胞呈单个存在，3天后肿瘤细胞逐渐增多；培养5天后肿瘤细胞增多呈巢状分布，但分布仍主要位于基质表面；培养7天后癌细胞潜入基质内部并形成癌巢，显示组织相容性好，如图5所示。

正常大肠细胞外基质超微结构显示细胞形态呈类圆形，被纤维包裹，限制其发生转移；I期结肠癌细胞外基质与HT29细胞共培养后细胞呈类圆形，表面微绒毛较多；II期结肠癌细胞外基质与HT29细胞共培养后细胞形态发生变化，逐渐由类圆形变为梭形；III期结肠癌细胞外基质与HT29细胞共培养后细胞数目增多并出现融合，更多的细胞形态呈梭形，并出现丝状伪足；IV期结肠癌细胞外基质与HT29细胞共培养后细胞密集处细胞间连接紧密，丝状伪足末端膨大呈“吸盘”样结构，如图6所示。

细胞划痕实验结果显示：结肠癌细胞外基质与HT29细胞共培养后，细胞的迁移能力增加，其迁移能力的强弱与肿瘤分期相关，随着肿瘤分期的增加，其迁移能力更强，提示IV期细胞外基质的结构构型更易于细胞发生转移，如图7所示。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合医学制备领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)结肠癌组织标本的前置处理：取离体4小时以内的人类结肠癌或直肠癌组织，使用纯水冲洗3遍；

2.根据权利要求1所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中过氧乙酸的体积百分含量为0.1％，灭菌时间为1h。

3.根据权利要求1所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中摇床振荡频率为100～300rpm。

4.根据权利要求1所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中氢氧化钠的清洗时间为60min，氢氧化钠溶液浓度为5～20mmol/L。

5.根据权利要求1所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的清洗时间为20min。

6.根据权利要求1所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中清洗槽振荡频率为100～300rpm，超声波频率为20～80KHZ。

7.根据权利要求6所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中清洗槽振荡频率为200rpm，超声波频率为20～50KHZ。

8.根据权利要求1所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中预先设计的冻干流程为：预冻至-25℃，保温2小时，升温至15℃，保温8小时，升温至15℃，保温2小时，升温至25℃，保温4小时。

9.一种通过权利要求1-8中任一权利要求所述的一种人类结肠癌细胞外基质体外模型的制备方法得到的人类结肠癌细胞外基质体外模型，其特征在于：为冻干、无菌、无细胞毒性物质残留的多孔膜状，其完全去除细胞成分、并完整保留细胞外基质的成分和结构。