CN109576356A

CN109576356A - 一种单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法

Info

Publication number: CN109576356A
Application number: CN201810691765.2A
Authority: CN
Inventors: 赵永祥; 薛志刚; 阳诺; 钟莉娉
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明公开了一种利用单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法，包括以下步骤：（1）提取肿瘤淋巴管内皮细胞；（2）分离单细胞并进行裂解；（3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；（4）以cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化，进行Tagmentation反应，完成cDNA测序文库构建；（5）对构建的cDNA文库进行高通量测序；（6）测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤淋巴管内皮细胞特异性的标记分子。

Description

一种单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法。

背景技术

淋巴道转移是恶性肿瘤转移的重要途径之一，而肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是肿瘤发生淋巴道转移的重要界面。

肿瘤相关淋巴管内皮细胞是位于肿瘤组织及周边组织淋巴管腔面的一层单层扁平内皮细胞，是肿瘤淋巴管的主要构成单元。淋巴管转移是恶性肿瘤难以根治和高病死率的重要原因。淋巴管内皮细胞在肿瘤发生、发展、复发、转移以及耐药方面起重要作用，是肿瘤治疗的良好靶点，是提高肿瘤治疗效果的一种有效方法。

因此，若能不断发现肿瘤相关淋巴管内皮细胞的特异性标记分子及调控因子，从分子水平探讨肿瘤细胞与其相关淋巴管内皮细胞之间的相互作用，可为深刻揭示肿瘤转移的机制提供更有效的科学依据，同时也能为临床早期阻断淋巴道转移提供新思路和新方法。

我们利用单细胞测序技术在肿瘤相关淋巴管内皮细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mRNA水平上分析寻找肿瘤相关淋巴管内皮细胞的特异性标记分子，为肿瘤的靶向治疗提供新靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法，包括以下步骤：

1）提取肿瘤淋巴管内皮细胞；

2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；

3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；

4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，从mRNA水平上分析寻找肿瘤淋巴管内皮细胞的特异性标记分子。

以上所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的淋巴管内皮细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

通过利用单细胞测序技术，将从肿瘤组织中提取的淋巴管内皮细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法。

附图说明

图1为纯化后的淋巴管内皮细胞。

图2为淋巴管内皮细胞的鉴定。

图3为淋巴管内皮细胞的成管实验鉴定。

具体实施方式

下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

1.应用自创的提取方法获得高质量的肿瘤淋巴管内皮细胞。

2.准备肿瘤淋巴管内皮细胞单细胞样品。分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解。

3.对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国Thermo Fisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对步骤3）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA。

4.以cDNA为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序，使用美国Illumina公司的Nextera XT试剂盒，按照说明书对步骤4）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序。

5.通过生物信息学分析寻找肿瘤淋巴管内皮细胞特异性的标记分子。

实施例1

本实施例选择小鼠（Balb/c）CT26移植瘤模型为实验材料，对其肿瘤淋巴管内皮细胞进行了单细胞转录组的测序。

1.获取肿瘤组织中的淋巴管内皮细胞：

1）肿瘤淋巴管内皮细胞的提取方法：

S1）用眼科剪剪碎肿瘤组织得到肿瘤单细胞；

S2）分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤淋巴管内皮细胞。

实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

2）单细胞的制备

取2只4-5周龄Balb/c小鼠，每只于右侧腋下皮下接种CT26细胞，待肿瘤平均体积长至约1.5×1×1cm³时，得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%（体积百分比浓度）的乙醇水溶液中3-5 min，得到消毒后的小鼠；在超净工作台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤，小心剥离得到肿瘤组织，做到小鼠不出血。

用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织并在0.01M PBS中浸泡2min后将其取出，用PBS冲洗，冲洗3次,得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织，在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.01M PBS，保持该肿瘤组织处于湿润状态，得到剪碎的肿瘤组织。向上述盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中胶原酶Ⅰ溶液，用剪过头的1 ml枪头吹散肿瘤组织，得到胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物。

（1）涡旋：将盛有胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物的50ml离心管在震荡器上进行震荡3min，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物放培养箱中消化30min，每5min拿出涡旋一次

（2）用完全培养基终止胶原酶，静置2min,离心300g（rcf）, 10min,PBS洗2次。

（3）将细胞悬液过钼将得到的细胞放冰上敷抗体：10⁷ cell + 100μLbuffer +10μL抗体，避光，摇匀，放2-8℃冰箱，敷10min。

（4）10⁷cell + 2mlbuffer洗涤, 300g（rcf） 10min（可选：再洗一遍.）。

（5）离心后每10⁷cell加80μLbuffer，每10⁷cell加20μL磁珠混匀，在2 – 8℃冰箱孵育15min.

（6）洗：每10⁷细胞加2 mLbuffer，300g（rcf）10min洗后加500μLbuffer混匀，选择合适的柱子（LS，10⁸）将柱子放架子上。LS型柱子用3mlbuffer润柱子，将细胞悬液加到柱子里过柱,滴完再分别洗3遍（LS柱子每次3ml）。

（7）收集细胞:拿下架子上LS柱加5mlbuffer快速打出。（可选）再次过柱（提高纯度）

（8）二次分选提高纯度：加剪切磁珠：每1ml的细胞重悬液中加20μLmuttisortrealasereagent混匀，4℃孵育10min剪切后细胞10⁷细胞加2mlbuffer 300g 10min离心进入第二次磁珠分选环节（第（3）步开始）

将上述肿瘤淋巴管内皮细胞进行培养，培养条件为：EGM2内皮细胞培养基（Lonza公司，货号 CC-4147）。得到贴壁的肿瘤淋巴管内皮细胞（参看附图1所示）。

2.肿瘤淋巴管内皮细胞的鉴定

1)肿瘤血管内皮细胞LYVE-1和Podoplanin的表达水平检测

免疫荧光检测（参看附图2所示）

2) 肿瘤淋巴管内皮细胞的成管实验

S1)实验的前一天，将Matrigel放于4℃融化（不能放于室温，凝固之后不可以再用）。灭菌的10μl枪头，μ-Slide Angiogenesis冷藏备用。

S2) 开始实验时，从冰箱中取出冷藏的枪头和μ-Slide，在μ-Slide每个孔中加入10μL Matrigel。加入胶时注意保持枪头垂直于孔中间位置，Matrigel一直保持放在冰上。

S3)加入胶后，将μ-Slide放入合适大小的培养皿中，培养皿中加入吸满水的吸水纸，以防止μ-Slide中水分蒸发。将整个培养皿放入培养箱中，放置30分钟使胶凝固。

S4)在胶凝固的过程中，可以开始准备细胞悬液，细胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×105 cell/mL。

S5) 从培养箱中取出μ-Slide，每孔加入50μL细胞悬液。

S6)μ-Slide盖上盖子后放入培养箱培养。

S7) 每隔4-6小时记录实验结果。

实验结果显示细胞抱团形成管腔（参看附图3所示）。

3.分离单细胞并进行裂解：

1）以RNaseZap和无DNA的溶液清理工作台及移液枪头；

2）混合以下试剂作为裂解缓冲液：

A）0.2%Triton-X100溶液19μl；

B）40U/μl的RNase抑制剂1μl。

3）向0.2ml的薄壁PCR管中加入1.19μl裂解缓冲液；

4）以最小体积从步骤（2）所得的细胞中分离单细胞，体积一般为0.3μl，加入含裂解缓冲液的PCR管中。

4.对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：

1）混合以下试剂作为引物-dNTP预混液：

A）dNTP（10mM）10μl；

B）Oligo-dT₃₀VN引物（10μM）10μl。

2）混合以下试剂作为逆转录预混液：

A）美国ThermoFisher公司的SuperScript III first-strand缓冲液2μl；

B）美国ThermoFisher公司的SuperScript III reverse transcriptase溶液0.5μl；

C）RNAse抑制剂（40U/μl）0.25μl；

D）DTT溶液（100mM）0.5μl；

E）甜菜碱溶液（5M）2μl；

F）氯化镁溶液（1M）0.06μl；

G）TSO溶液（100μM）0.2μl；

H）ERCC外源RNA标准样溶液0.5μl。

3）在步骤（3）所得的含有细胞和裂解缓冲液的PCR管中加入2μl引物-dNTP预混液；

4）快速涡旋震荡PCR管使溶液充分混合，在室温下以700g离心10s后立即置于冰上；

5）以72℃孵育样品3min，立即放回冰上；

6）在室温下以700g离心10s，收集PCR管底部的液体，将其置于冰上；

7）将逆转录预混液加入单细胞裂解产物中，使用移液器轻轻吹吸几次混匀样品，混匀过程中避免产生气泡；

8）在室温下以700g离心10s，收集PCR管底部的液体；

9）将含样品的PCR管置于PCR仪中，设定程序进行细胞mRNA的逆转录，得到cDNA第一链反应产物，逆转录程序的热循环条件表示在表1中。

表1：逆转录程序的热循环条件

5.以cDNA为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序：

1）混合以下溶液作为PCR混合液：

A）步骤（4）中得到的第一链反应产物10μl；

B）美国Roche Molecular Systems公司的KAPA HiFiHotStartReadyMix溶液12.5μl；

C）ISPCR引物溶液（10μM）0.25μl；

D）无核酸酶水2.25μl。

2）取15μl步骤1）中的PCR混合液加入PCR管中，涡旋震荡使样品混合，在室温下以700g离心10s，收集PCR管底部的液体；

3）将含样品的PCR管置于PCR仪中，设定程序进行细胞cDNA的扩增，程序的热循环条件表示在表2中；

表2：cDNA扩增程序的热循环条件

4）在室温下将美国Beckman Coulter 公司的AMPure XP磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

5）将25μl磁珠加入等体积步骤3）所得到的cDNA扩增产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

6）将96孔板在磁力架上放置5min，待溶液澄清，小心移除上清液；加入200μl的80%乙醇清洗磁珠，孵育30s后将小心移除乙醇，重复2次；

7）完全移除乙醇后，在室温下放置5min，待磁珠表面出现一道裂缝后，加入15μl的EB溶液，用移液器吹吸10次混匀；

8）移除磁力架，室温放置2min；将96孔板再放回磁力架上，放置2分钟，待溶液澄清后，吸取13μl的上清液，移到一个新的0.2ml薄壁PCR管中；

9）使用6%的PAGE凝胶检测cDNA扩增产物的片段大小分布，好的文库应该片段大小应该在500~3000bp之间，没有小于500bp的短片段，而且峰应该出现在1500~2000bp之间；

10）混合以下溶液作为标记预混液：

A）美国Illumina公司的标记DNA缓冲液4μl；

B）美国Illumina公司的标记酶混合液1.67μl；

C）美国Illumina公司的重悬缓冲液1.33μl。

11）取1μl步骤8）中得到的cDNA，加入7μl步骤10）中的标记预混液，在55℃孵育10min，对cDNA进行标记；

12）再加入2μl的美国Illumina公司的NT缓冲液，在室温下孵育5min，完成标记反应；

13）混合以下溶液作为接头连接扩增预混液：

A）美国Roche Molecular Systems公司的KAPA HiFiHotStartReadyMix溶液15μl；

B）美国Illumina公司的Index 1引物溶液2.5μl；

C）美国Illumina公司的Index 2引物溶液2.5μl。

14）向步骤12）中得到的10μl标记产物中加入20μl步骤13）中的接头连接预混液，置于PCR仪中，设定程序进行接头的连接，程序的热循环条件表示在表3中。

表3：接头连接程序的热循环条件

15）在室温下将美国Beckman Coulter 公司的AMPure XP磁珠放置15min，涡旋震荡混匀；

16）将24μl磁珠按照0.8：1的体积比加入步骤13）得到的30μl产物中，用移液器吹吸10次混匀，将溶液转移到96孔板中，在室温下孵育8min；

17）重复步骤6）至步骤8），纯化扩增产物；

18）使用6%的PAGE凝胶和美国Agilent公司的2100 Bioanalyzer检测步骤17）中获得测序文库的片段大小分布，并用美国ThermoFisher公司的Qubit3.0荧光计测量各文库DNA的浓度；

19）根据步骤18）中测得各文库的浓度及所需测序的数据量，计算最终文库混合液中各文库的摩尔比例，按比例将文库混合，使用Qubit3.0荧光计测量，调整终浓度达到5nM；

20）送测序公司进行高通量测序。

选择小鼠（Musmusculus）的肿瘤相关淋巴管内皮细胞为实验材料仅是为了举例，证明此方法可以成功应用于哺乳动物肿瘤相关淋巴管内皮细胞的单细胞转录组测序，但本发明同样可以应用于人类及其他肿瘤相关淋巴管内皮细胞的单细胞转录组测序。

本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。

Claims

1.一种单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取肿瘤淋巴管内皮细胞；

4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤淋巴管内皮细胞特异性的标记分子。

2.根据权利要求1所述单细胞测序筛选淋巴管内皮细胞标记分子的方法，其特征在于：所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的淋巴管内皮细胞进行单细胞测序，从mRNA水平上寻找肿瘤淋巴管内皮细胞特异性的标记分子。