CN104017071A - 用于诱导细胞外基质蛋白合成的肽片段 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了短链的具有生物活性的四肽，包括序列GxxG和PxxP，其中G(甘氨酸)和P(脯氨酸)是保守的，x是可变的氨基酸。所述肽可以单独的或组合的方式使用来刺激皮肤中细胞外基质蛋白的产生。本发明还公开了一种快速的、低成本的生产四肽的异质制剂的方法。
Description
本申请是国际申请日为2007年6月12日、国际申请号为PCT/US2007/013748、进入国家阶段的申请号为200780021825.X、发明名称为“用于诱导细胞外基质蛋白合成的肽片段”的PCT申请的分案申请。
本申请请求2006年6月13日提交的申请号为60/813,284的美国临时申请的优先权，该文献内容在此全文引入作为参考。
技术领域
本发明涉及氨基酸基序为GxxG或PxxP的四肽，其中G(甘氨酸)和P(脯氨酸)是保守的(maintained)，x是可变的氨基酸。本发明还涉及移码活性四肽，其是ECM蛋白中的GxxG或者PxxP四肽移动一位(frame)得到的四肽序列。特别的，本发明涉及GxxG、PxxP、或者移码活性肽，这些肽刺激细胞外基质蛋白的产生并且促进擦伤的人类皮肤单层上皮细胞的伤口愈合。本发明的肽类组合物可用于修复皮肤损伤或保持皮肤健康的制剂。
背景技术
皮肤老化通常表现为皱纹的形成与伤口愈合能力的削弱。伤口定义为皮肤的上皮完整性的破坏。正常的伤口愈合过程包括复杂的、动态的、但是经过精确安排的一系列导致损伤组织修复的事件。普通皮肤中最多的组分是细胞外基质(ECM)，一种由其所包围的细胞产生的胶状基质。ECM由两种主要类别组成，包括纤维结构蛋白与蛋白多糖。目前已知ECM的成分和交联状态的改变与老化以及大量的获得性或遗传性皮肤失调都有关系。人们也已经证明ECM不仅具有结构支撑的作用，还能影响诸如分化和增殖的细胞行为。同样，越来越多的研究表明其基质的组分可能是细胞信号源，能够促进上皮细胞增殖和移动，从而加快伤口愈合。
最多的一类纤维ECM分子是胶原蛋白家族，其包括至少16种不同类型的胶原蛋白。皮肤基质中的胶原蛋白主要由I型(80-85％)和III型(8-11％)胶原蛋白组成，二者均为纤维状或杆状的胶原蛋白。皮肤的拉伸强度主要由这些纤维状胶原蛋白分子决定，它们自我组装为头-尾连接的微原纤维，并互相交错地横向并列排布。胶原蛋白分子与相邻的胶原蛋白分子相互交联，进一步加强了胶原蛋白纤维的强度和稳定性。对胶原蛋白网络的损伤(例如，酶或物理损伤等)，或其整体性的破坏，导致了修复治愈的发生。
在科技文献和专利中都报道了刺激产生ECM蛋白的各种具有生物活性的肽类。这些肽以前是从天然资源中分离得到的，最近则成为结构-功能关系学研究的目标。天然的肽类还被作为合成的肽类似物设计的出发点。
ECM蛋白中特定的序列能够刺激皮肤中有用的成分，如I型、III型胶原蛋白，纤维结合蛋白等(Katayama et al.，J.BIOL.CHEM.288：9941-9944(1983))。Katayama等人从I型胶原蛋白前肽的羧端(残基197-241)中鉴定了五肽KTTKS(SEQ ID NO：17)。该前肽被切割于产生成熟的胶原蛋白的时候。切割后的前肽可能通过生物合成反馈机制参与调节胶原蛋白的生产，其中KTTKS肽段起激活作用。Maquart等人(J Soc BIOL.193：423-28(1999))报道了肽GHK和CNYYSNS同样刺激ECM合成。这些序列能够在ECM周转的时候被释放，从而传递需要ECM修复的信号。通过上述任一种机制释放出来的短肽序列通常被称为“马曲金肽(matrikines)”(Maquart et al.，J.Soc.BIOL.193：423-28(1999))。
虽然已经有一定数量的天然或合成肽存在，但是人们仍然需要改进的生物活性肽及其使用方法。
发明内容
本发明公开了特征为氨基酸序列基序GxxG或PxxP的四肽，其中G(甘氨酸)和P(脯氨酸)残基是保守的，x是可变的氨基酸。该四肽来源于ECM蛋白一级序列中多次出现的序列，该ECM为IV型胶原蛋白。所披露的序列诱导所有形式的胶原蛋白产生，其诱导能力高于早先已知的肽序列，包括SEDERMA SAS(法国)公司的商标为MATRIXYLTM的KTTKS。更进一步，包含不同的多次重复序列组合的组合物引起了更强烈的胶原蛋白合成应答。可以预期肽类组合物对多种不同的ECM蛋白有额外的优点。
生产特定组合的用于ECM修复的四肽会使得成本过高，难以进行商业应用。公开了一种相对简单廉价的方法，即生产生物活性四肽的不同的混合物。通过生产基序GxxG和PxxP的四肽的组合库，我们可以在一次生产流程中得到不同的生物活性四肽(例如，GEPQ、GPEG、GPPG和GEEG)。四肽组合物相对于单一肽能够诱导更多的ECM蛋白合成。包含所公开的单一或混合形式的四肽的组合物能够被用于皮肤护理行业，包括但不限于针对皮肤褶皱、肤色调节、皮肤紧致或皮肤松弛等。所公开的四肽刺激合成胶原蛋白能够有效地改善受损皮肤和老化皮肤的健康和形态。
附图说明
图1是SEQ ID NO：45，为IV型胶原蛋白氨基酸序列，表明GxxG四肽的存在。所有粗体序列标有单下划线，重叠序列标有双下划线。
图2是SEQ ID NO：46，为III型胶原蛋白氨基酸序列，表明移码(frameshift)活性PGPR和GAGP的存在。所有移码活性序列标记为粗体，加单下划线，发生一个移码(one frmae shift away)的GxxG序列标有双下划线。
图3同样是SEQ ID NO：45，为IV型胶原蛋白氨基酸序列，表明PGPP四肽的存在。
具体实施方式
本发明主要针对刺激ECM蛋白产生并调节伤口愈合的四肽，以及它们的应用。
肽
本发明的一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序GxxG或PxxP。在这个实施方式中，G(甘氨酸)或P(脯氨酸)是保守的，x是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NQ：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NQ：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NQ：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NQ：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。
本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序GxPG，其中在两个可变位点之一或两者上，x是P。在这个实施方式中，G(甘氨酸)和P(脯氨酸)是保守的，x是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。
本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序GExG。在这个实施方式中，G(甘氨酸)和E(谷氨酸)是保守的，x是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8。
本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序PGxP。在这个实施方式中，P(脯氨酸)和G(甘氨酸)是保守的，x是可变的氨基酸。一般地，本发明所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16。
本发明的另一个实施方式是一种分离的四肽，包括基序PExP。在这个实施方式中，P(脯氨酸)和E(谷氨酸)是保守的，x是可变的氨基酸。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9。
本发明的另一个实施方式是一种移码活性四肽。在这个实施方式中，所述四肽在ECM蛋白中GxxG或PxxP四肽的基础上发生一个移码。一般地，所述的肽可以是落入上述范围的任何一种肽，更加优选的是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
上述一种肽可以含有D型或L型氨基酸。所述肽可以含有所有的D型或L型氨基酸。这些肽可以具有酸性的C末端(-CO2H)或者，优选的，具有氨基的C末端(-CONH2，-CONHR或者-CQNR2)。这些肽也可以被进一步增加或修饰，不论是采用化学法还是酶法。例如，这些肽可以被C末端酰胺化(-NH2)，与游离的酸性形式相比，使其对蛋白酶降解更加不敏感并提高它们的溶解度。这些肽也可以被脂化，其可以提供增强的皮肤渗透力。
上述肽可以含有以下氨基酸：R(精氨酸)、L(亮氨酸)、P(脯氨酸)、F(苯丙氨酸)、Q(谷氨酰胺)、E(谷氨酸)、I(异亮氨酸)、K(赖氨酸)、S(丝氨酸)、V(缬氨酸)、A(丙氨酸)、N(天冬酰胺)、D(天冬氨酸)、T(苏氨酸)、Y(酪氨酸)以及G(甘氨酸)。上述肽不包含下列的M(甲硫氨酸)、C(半胱氨酸)、H(组氨酸)或者W(色氨酸)。因此，在一个实施方式中，x不是选自(甲硫氨酸)、C(半胱氨酸)、H(组氨酸)或W(色氨酸)。
使用方法
本发明的另一个实施方式是关于使用上述肽类的方法。使用方法可以包括使用单一的肽，或者可以包括组合地使用两种或两种以上的肽。
本发明的一个实施方式是一种使用刺激ECM蛋白产生的四肽来促进皮肤损伤修复和保持皮肤健康的方法。一般地，该方法涉及用含有所述肽的组合物接触上皮(皮肤)细胞。该组合物可以是气雾剂、乳剂、液体(liquid)、洗液、霜剂、糊剂、软膏剂、泡沫或其他药物学上可接受的制剂。通常，药物学上可接受的制剂包括任何适用于人体皮肤上的可接受的载体，例如，化妆上可接受的载体和皮肤治疗上可接受的载体。该组合物可以含有其他生物活性试剂，例如视黄醇类或其他肽类。该组合物可以含有药学上可接受的载体或辅剂。上述接触的步骤可以在体内、原位、体外进行，或采用本领域技术人员已知的任何方法。最优选的，该接触步骤是在体表以足够引发刺激响应的浓度来进行的。组合物中肽的浓度可以是约0.01μg／mL到约100μg／mL，约0.1μg／mL到约50μg／mL，以及约0.1μg／mL到约1μg／mL。接触步骤可以对哺乳动物，如猫、狗、牛、马、猪或人进行。优选的促进ECM蛋白产生的组合物包括SEQ ID NO：8；更加优选的，该组合物包含处在与至少一种其他四肽的异质混合物中的SEQ IDNO：8。在最优选的实施方式中，组合物中的单独的四肽能够使得胶原蛋白持续产生超过至少48小时。
本发明另外的一个实施方式涉及一种促进皮肤创口愈合的方法，该皮肤损伤是由正常的衰老、疾病、伤害、外伤、或者经过手术或其他医疗过程所引起的。该方法可以包括对动物的伤口施用一种组合物，其中该组合物包括上述任何一种肽，单一组分的或混合的。该组合物可以是液体、洗液、霜剂、糊剂、软膏剂、泡沫或其他药物学上可接受的制剂。该组合物可以含有药物学上可接受的载体或辅剂。该组合物可以含有其他生物活性试剂，例如抗微生物剂或生长因子。该组合物还可以与其他治疗剂合用，如组织移植物、组织培养产物、氧气或敷料等。组合物中肽的浓度可以是约0.01μg／mL到约100μg／mL，约0.1μg／mL到约50μg／mL，约0.1μg／mL到约1μg／mL。该组合物可用于体表伤口给药。所述的动物通常可以是任何种类的动物，优选哺乳动物，更加优选的是人类、牛、马、猫、狗、猪、山羊或绵羊。优选的，能够促进ECM蛋白合成的、用于伤口愈合的组合物包括SEQ ID NO：8；更加优选的，该组合物包含处在与至少一种其他四肽的异质混合物中的SEQ ID NO：8。在最优选的实施方式中，组合物中的单独的四肽能够使得胶原蛋白持续产生超过至少48小时。
本发明另外的一个实施方式涉及一种缩小皮肤上的疤痕的方法，该皮肤损伤是由正常的衰老、疾病、伤害、外伤、或者经过手术或其他医疗过程所引起的。该方法可以包括对动物的伤口施用一种组合物，其中该组合物包括上述任何一种肽，单一组分的或混合的。该组合物可以是液体、洗液、霜剂、糊剂、软膏剂、泡沫或其他药物学上可接受的制剂。该组合物可以含有药物学上可接受的载体或辅剂。该组合物可以含有其他生物活性试剂，例如抗微生物剂或生长因子。该组合物还可以与其他治疗剂合用，如组织移植物、组织培养产物、氧气或敷料等。组合物中肽的浓度可以是约0.01μg／mL到约100μg／mL，约0.1μg／mL到约50μg／mL，约0.1μg／mL到约1μg/mL。该组合物可用于体表伤口给药。所述的动物通常可以是任何种类的动物，优选哺乳动物，更加优选的是人、牛、马、猫、狗、猪、山羊或绵羊。优选的，能够促进ECM蛋白合成的、用于伤口愈合的组合物包括SEQ ID NO：8；更加优选的，该组合物包含处在与至少一种其他四肽的异质混合物中的SEQ ID NO：8。在最优选的实施方式中，组合物中的单独的四肽能够使得胶原蛋白持续产生超过至少48小时。
本发明的进一步的实施方式是关于组合地产生所公开的四肽的方法。所述肽可以采用本领域技术人员已知的任何方法进行合成，例如采用下列文献中披露的方法：Merrifield，R.B.，Solid Phase Peptide Synthesis I.，J.AM.CHEM.SOC.85：2149-2154(1963)；Carpino，L.A.et al.，[(9-Fluorenylmethyl)Oxy]Carbonyl(Fmoc)Amino Acid Chlorides：Synthesis，Characterization，And Application To TheRapid Synthesis Of Short Peptides，J.ORG CHEM.37：51：3732-3734；Merrifield，R.B.et al.，Instrument For Automated Synthesis Of Peptides，ANAL.CHEM.38：1905-1914(1966)；或者Kent，S.B.H.et al.，High Yield Chemical Synthesis Of BiologicallyActive Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design，IN：PEPTIDES1984(Ragnarsson U.，ed.)Almqvist and Wiksell Int.，Stockholm(Sweden)，pp.185-188，所有上述文献在此被全文引入作为参考。优选的，通过能够按顺序将氨基酸添加到生长的肽链上的机制来生产所述肽。然而，这些肽也可以采用标准的液相制备方法进行合成。
人们已经观察到在肽链合成的过程中添加游离氨基酸的混合物而不是同源的肽的混合物，引起了游离氨基酸的可变的掺合，从而合成反应产生了肽的组合。在合成期间添加的两种或更多种氨基酸的混合物中所包括的特定氨基酸的相对掺合频率可以被调节。调节是通过改变合成过程中可用的游离氨基酸相对于其他氨基酸在混合物(称为等动力混合物(isokinetic mixture))中的比例来实现的。
提供了以下实施例来说明本发明的优选的实施方式。本领域技术人员应当理解，下述实施例中公开的技术方案表明发明人所发现的技术方案在本发明的实践中良好地实施，因而可以被认为构成了本发明的实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据当前的公开内容应当理解，对于所公开的特定实施方式可以进行很多修改，并且仍然能够得到相似或类似的结果，而不背离本发明的精神及范围。
实施例
实施例1：胶原蛋白中重复的四肽序列的鉴定
IV型胶原蛋白中比例相对较高的四肽重复序列含有基序GxxG(其中x是任何氨基酸)。其中的一些作为附图1中SEQ ID NO：45所示全长IV型胶原蛋白的部分来原位地示出。首先选择IV型胶原蛋白进行研究是考虑到它与其它专门化的ECM组分的相互作用(参见Gregory Schultz et al.，2005)。IV型胶原蛋白中有11个重复出现了10次以上的具有GxxG基序的序列(GxxG中的xx有vp、ek、fp、lp、pp、sp、ep、ip、pk、qp和tp)。在这些四肽序列中，11个序列中的8个在其第3位上含有脯氨酸，2个在第2位上含有P，1个在第2、3位上含有脯氨酸，还有1个序列中没有脯氨酸。所公开的序列称为REPLIKINESTM。“REPLIKINE”被定义为ECM蛋白中多次出现的短序列(即，是重复的)。该序列可以是在一个ECM蛋白中出现(例如，IV型胶原蛋白)。优选的，该序列在多种ECM蛋白质中出现(例如，所有的胶原蛋白，弹性蛋白，层粘连蛋白，等等)。该序列在多种ECM蛋白中的存在增加了该片段能够促进ECM蛋白合成或修复的可能性。
以上列出的IV型胶原蛋白中的11个GxxG序列在图1所示的人IV型胶原蛋白中被重点标明。在该图中，所有粗体序列标有单下划线，重叠序列标有双下划线。除了一个序列以外，这些序列还出现于I、II、III、V型胶原蛋白中。这一事实促进了所公开的肽刺激所有类型胶原蛋白产生的能力，尤其是当这些肽被组合使用的时候。表1给出了几个四肽重复在ECM蛋白中的频率。表1中的粗体序列是在IV型胶原蛋白中出现10次或以上的。
表1：ECM蛋白中四肽的频率
在考察IV型胶原蛋白序列SEQ ID NO：45时，同样很明显的是，具有PxxP基序的序列也有很多出现。例如，序列PGPP出现了不少于15次，如图3所示。因此，这一公开的序列同样被称为REPLIKINETM。优选的，这个序列在多种ECM蛋白质中出现(例如，所有的胶原蛋白，弹性蛋白，层粘连蛋白，等等)，这一序列在多种ECM蛋白中的存在增加了该片段能够促进ECM蛋白合成或修复的可能性。以上列出的IV型胶原蛋白中出现的15个PGPP序列在图3所示的人IV型胶原蛋白中被重点标明并加有下划线。
实施例2：移码活性的鉴定
除了具有基序GxxG的IV型胶原蛋白四肽重复序列的相对高的比例外，鉴定出相对于GxxG或PxxP四肽序列发生一个氨基酸移码的其它四肽序列。这些序列可以是ECM蛋白中重复出现的，或只出现了一次的，位于距离在此描述的GxxG或PxxP四肽序列一个氨基酸的位置。这些四肽序列被称为移码活性物。因而这些移码活性物可以根据移码方向的不同而在其第2位或第3位上含有G或P。进一步认识到的是，移码活性物可以与本申请中披露的其它四肽序列组合，形成"combikine"。这种″combikine"的一个例子是H06和H15。
移码活性物的一个例子是GAGP或H12(SEQ ID NO：6)。H12(GAGP)在III型胶原蛋白(SEQ ID NQ：46)中相对于GxxG四肽GGAG发生了一个残基(或读框)的移位，如图2所示。在该图中，所有移码活性序列标记为粗体，加单下划线，发生一个移码的GxxG序列标有双下划线。此外，如表5所示，该四肽(GAGP)在48小时的胶原蛋白生产中取得了很好的结果。另一个例子是序列PGPR，即H10(SEQ ID NQ：4)，其在I-IV型胶原蛋白中出现了11次。由于其在个别的ECM蛋白中多次出现，该四肽进一步被认为是REPLIKINE。图2(SEQID NO：46)给出了该四肽的几个例子，每个都是相对于GxxG四肽GPRG发生了一个移码。这个特别的移码活性物在多种ECM蛋白中存在，从而增加了该片段能够促进ECM蛋白合成或修复的可能性。
实施例3：刺激胶原蛋白产生的重复序列的鉴定
采用标准的肽化学技术合成了实施例1和2中鉴定的一些序列，并分析了其对皮肤成纤维细胞中胶原蛋白的刺激作用。这些合成的肽可以被C末端酰胺化，与游离的酸性形式相比，使其对蛋白酶降解更加不敏感并提高了它们的溶解度。人皮肤成纤维细胞被孵育于96孔板上，培养条件是37℃和5％的CO2，24和48小时，150μL完全细胞培养基(Cascade Biologics，Portland，OR；Cat.No.M-106-500)，并补充低血清生长添加物(Caseade Biologics，Portland，OR；Cat.No.S-003-10)，其中含有最终肽浓度为50μg／mL的样品肽。每个孔接种10,000个细胞。孵育后，从每个孔中取样100μL培养基，检测胶原蛋白的合成。
上述检测在Tebu生物实验室(法国)进行，使用SIRCOLTM胶原蛋白分析试剂盒(Biocolor Assays，UK)，按照厂家的方案进行操作。SIRCOLTM胶原蛋白分析是一种定量的染料结合的方法，用于分析体外培养期间哺乳动物细胞向培养基中分泌的可溶性胶原蛋白。受测样品的胶原蛋白与阴离子SIRCOLTM染料进行结合，胶原蛋白-染料复合物从溶液中沉淀出来，通过离心来团粒化。得到的胶原蛋白-染料团粒被溶解于碱性溶液，之后进行吸光度测定。对24和48小时的两个独立样品进行了两份测定。每个样品的四次检测结果进行了平均。在560nm处测量了试剂空白对照、胶原蛋白标准样品、以及样品的吸光度。从24和48小时的每个样品的吸光度中减去试剂空白试验的吸光度。
使用两套独立的数据集计算得到了两个胶原蛋白标准样品的标准曲线。产生第一个标准曲线用于计算样品H6(SEQ ID NO：1-4的组合)、H7-H14(分别为SEQ ID NO：1-8)和H15(SEQ ID NO：5-8的组合)中的胶原蛋白数量。产生第二个校正曲线用于计算下列样品中胶原蛋白数量：H16(SEQ ID NO：9)、H21-23(分别为SEQ ID NO：10-12)、H25-26(分别为SEQ ID NO：13-14)、或者H29-30(分别为SEQ ID NO：15-16)、H32(SEQ ID NO：17)、H33(SEQ ID NO：9-12的组合)、H34(SEQ ID NO：11-14的组合)、H35(SEQ ID NO：13-16的组合)、H36(SEQ ID NO：1、6、5、8的组合)、H37(SEQ ID NO：17)和H38(SEQ IDNO：8)；每次进行一系列的吸光度测定时绘制曲线，标定已知胶原蛋白标准样品的Abs560nm相对于其各自的浓度(微克)。对于每个24和48小时采样的数据组均采用相同的标准曲线(表2A和2B)。因此，在进行每次分析前都要做出不同的标准曲线。
表2A：用于测定肽H6-H15的胶原蛋白产生的标准曲线
表2B：用于测定肽H16、H21-23、H25-26和H29-38的胶原蛋白产生的标准曲线
使用MICROSOFT EXCELTM做了关于Abs560nm值相对于各自的胶原蛋白标准样品浓度的线性回归分析。对于表2A中的两个孵育时间，回归分析产生了方程y=0.013x描述的直线。由于结果相同，因此对于第二套标准曲线仅采用24小时的结果。所得到的第二套样品的分析日期1和分析日期2的线性分析方程分别是y=0.0178x和y=0.0162x。肽LL-37(SEQ ID NO：18)被用作阳性对照，因为它已经被广泛报道能够影响人的创口愈合。(Heilbom et al.TheCathelicidin Anti-Microbial Peptide LL-37Is Involved In The Re-Epithehalization OfHuman Skin Wounds And Is Lacking In Chronic Ulcer Epithelium，J.Invest.Dermato.120：379-89(2003))。生产商规定的检测限度是2.5μg。
含肽样品中产生的胶原蛋白的总量通过24小时(表3A)和48小时(表3B)的平均吸光度计算得出，计算使用根据标准曲线得出的线性方程。含下述肽类的样品中产生的胶原蛋白的总量通过24小时(表4A)和48小时(表4B)的平均吸光度计算得出，计算使用根据标准曲线得出的线性方程：H16(SEQID NO：9)、H21-23(分别为SEQ ID NO：10-12)、H25-26(分别为SEQ IDNO：13-14)、或者H29-30(分别为SEQ ID NO：15-16)、H32(SEQ ID NO：17)、H33(SEQ ID NO：9-12的组合)、H34(SEQ ID NO：11-14的组合)、H35(SEQ IDNO：13-16的组合)、H36(SEQ ID NO：1、6、5、8的组合)、H37(SEQ ID NO：17)和H38(SEQ ID NO：8)。这些数值与已知刺激胶原蛋白的肽LL37(SEQ IDNO：18)进行了对比。在每个表中，用星号(*)标出的样品可能没有显著的意义，因为分析检测限度是2.5μg。
表3A：24小时测试样品H6-H15中胶原蛋白的吸光度检测和定量分析。
表3B：48小时测试样品H6-H15中胶原蛋白的吸光度检测和定量分析。
表4A：24小时测试样品H16、H21-23、H25-26或H29-38中胶原蛋白的吸光度检测和定量分析。
表4B：48小时测试样品H16、H21-23、H25-26或H29-38中胶原蛋白的吸光度检测和定量分析。
由于样品体积为100μL，每个样品中产生的胶原蛋白的浓度按照毫克／毫升通过所测得的胶原蛋白数量乘10来确定。表5归纳了所有检测样品的结果。
表5：肽诱导的胶原蛋白合成
所有被检测的四肽都刺激可溶性胶原蛋白的产生。在所检测的序列中，在第2位上含有谷氨酸的GxxG四肽在24和48小时的时间点都最大程度地刺激了胶原蛋白的合成。这些序列是H11(GEPG；SEQ ID NO：5)、H14(GEKG；SEQ ID NQ：8)和H38(GEKG；SEQ ID NO：8)。使用50μg／mL的肽浓度初步筛选所述肽。为了考察有效刺激胶原蛋白产生的浓度，还检测了0.3μg／mL的H14(SEQID NO：8)和H38。如表5所示，H38诱导的胶原蛋白刺激在较低浓度下也没有消失，表明SEQ ID NO：8的最大刺激浓度为0.3μg／mL或更低。
为了检测SEQ ID NO：8(H14和H38)的效果，将其与LL37(SEQ IDNO：18)进行了对比，后者已知刺激胶原蛋白产生。基于成纤维细胞响应LL37所释放的胶原蛋白的数量，25μg／mL被认为是由于接触四肽而释放的胶原蛋白的显著的数量。SEQ ID NO：8诱导产生的胶原蛋白数量在24小时与LL37(SEQID NO：18)大致相同。重要的是，由于接触SEQ ID NO：8而产生的胶原蛋白基本上维持了至少48小时。还将SEQ ID NQ：8与主要的护肤用肽类KTTKS(SEQID NO：17)进行了对比，后者已知刺激胶原蛋白产生(Katayama et.al.，J.BIOL.CHEM.288：9941-9944(1983))。KTTKS是产品MATRIXYLTM(SEDERMA SAS，法国)中的一种成分。在24小时和48小时，SEQ ID NO：8能够比KTTKS(SEQID NO：17)肽(表5)刺激更多的原蛋白产生。
实施例4：协同地增强胶原蛋白刺激的肽组合的鉴定-COMBIKINES
活性四肽的异质群体比四肽的同质样品以更高的水平刺激胶原蛋白产生。异质组合物的成分被称为COMBIKINESTM。COMBIKINES是一组REPLIKINES，其被组合以针对一种或多种目标细胞类型产生更大的或更广泛的作用。将肽H11(SEQ ID NO：5)、H12(SEQ ID NO：6)、H13(SEQ ID NO：7)和H14(SEQ ID NO：8)组合成终浓度50μg／mL，采用与单一肽类相同的方案进行分析。正如预期的，在24小时时间点获得的结果与单独的诱导分值的平均值相当。然而，在48小时，肽类组合诱导胶原蛋白的水平达到43μg／mL。令人吃惊地是，该数值远远超过预期的四种单独的肽(参见表5)的平均值(21μg／mL)。因此，在相同浓度下，特定的肽组合能够比单一肽类更大程度地刺激胶原蛋白产生。更进一步，来源于不同种类的ECM，如胶原蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白的四肽能够产生多种ECM蛋白的增强的诱导作用(参见表1和表5)。
实施例5：为了增强胶原蛋白生成刺激的低成本的COMBIKINE生产
肽合成的高成本限制了生产生物活性肽类的异质组合物的便利性。本发明很大程度上减少了这种限制。因为本发明公开的序列之间具有共性(例如，在其两端都有甘氨酸或脯氨酸)，所以第2位和第3位发生变化的多种四肽可以在一次生产过程中进行合成。肽的合成可以采用任何一种本领域已知的方法来进行。(Benoiton，N.，Chemistry of Peptide Synthesis，CRC(2005))。在肽的生产期间加入氨基酸的混合物，而不是同质的样品。为了得到产生的肽的期望比例，测定加入到混合位置的合适的氨基酸浓度比例的化学方法之前已有报道(Greeribaum et al.，Molecular and Cellular Proteomics1：60-68，2002；Krstenansky etal.，Letters in Drug Design and Discovery1：6-13，2004；上述两份文献在此全文引入作为参考)。使用该方法，可以花费几乎等同于合成单一的肽的成本来产生异质肽的库。
这种生产过程的应用使得生物活性combikines的低成本生产成为可能。这是由于所披露四肽的特殊组成而成为可能。四肽混合物与更长的肽相比更适用于掺入体表使用的制剂。因为四肽的长度，它们相对更长的肽类具有实用方面的和化学制剂方面的优势，包括：更容易加入和溶解到药剂中，更强的皮肤和毛孔的渗透性，以及更高的产率和更简易的生产肽类组合的方法。尽管不是必要的，理想的四肽制剂，不论是单一的还是组合的，是在24小时直到48小时维持了显著的胶原蛋白生产的制剂。更加优选的，该制剂能够在整个48小时内诱导ECM合成，从而使得到48小时时比24小时产生更多的胶原蛋白。虽然也在本发明的范围内，那些在24小时内能够促进ECM蛋白合成，但是在48小时表现出产量减少的四肽，受到较低的关注。在这个意义上，表6给出了当前公开的肽的结果。优选的肽用粗体标出。
表6：所公开的肽
实施例6：胶原蛋白刺激物也作为多效应分子促进皮肤上皮细胞创口愈合
胶原蛋白是创口愈合所有阶段中的关键组分。对胶原蛋白产生的刺激表明损伤已经发生于胶原蛋白网状组织(例如，通过酶或物理方式的破坏)。实际上，胶原蛋白网状组织的整体瓦解在事实上引起了愈合的发生。因此，胶原蛋白刺激物还能够作为多效应分子安排某些基质进行重新构造，并促进创口愈合。
伤口愈合实验是在置于12孔板上的单层人皮肤上皮细胞(CRL-2592)上进行的。实验前对细胞进行24小时的血清饥饿。使用P200(200-μL)吸管头对茂密的单层CRL-2592细胞进行损伤。在使用肽处理前将伤口进行清洗并拍照保存。加入肽至终浓度20到40μg／ml。将细胞培养于37℃，5％CO2以及92％湿度的培养箱中，拍照的时候短时间内置于室温下。在6小时和10小时的时候进行伤口愈合检测。使用PBS处理的伤口作为阴性对照用于比较。
表7：肽在人皮肤上皮细胞体外创口愈合中的作用
体外单细胞层伤口愈合是细胞迁移的结果，后者在很多生物过程中起重要作用，如胚胎发生、血管生成、炎症反应和创伤修复等。这些过程被认为是通过与其他细胞、细胞因子和ECM蛋白的相互作用来调节的。如表7中所示，SEQ ID NO：14与单独的PBS相比显著地诱导了伤口愈合。这种活性是肽特异性的，也是细胞类型特异性的，因为SEQ ID NO：14不能诱导人类皮肤成纤维细胞单细胞层的伤口愈合(数据没有给出)。SEQ ID NO：5也是一种胶原蛋白诱导剂，但是它与单独的PBS的效果相比不能很好地促进伤口愈合或上皮细胞迁移。SEQ ID NO：14以特异于皮肤上皮细胞的方式诱导细胞迁移或伤口愈合(即，不能恢复成纤维细胞)，这一事实为该肽用于皮肤护理增加了优点，因为人们相信伤口位置大量成纤维细胞的征募会导致过量沉淀和组织收缩，导致结疤。
根据目前公开的内容，所有在此公开的和主张的组合物或方法都能够被制备或实施，而不必进行过多的实验。虽然本发明的组合物和方法是通过优选的实施方式来进行描述的，但是本领域技术人员显然可以理解，针对在此描述的所述的组合物和／或方法以及方法中的步骤或其顺序可以进行一些变更，而并不背离本发明的原理、精神和范围。更具体地说，显然可以使用某些化学和生理学上相关的试剂来替代在此描述的试剂，而得到相同或相似的结果。所有这些相似的替代和修饰，对于本领域技术人员而言，都显然应该被认为是落入了本发明的精神、范围和原理中的。
Claims (13)
1.能够诱导细胞外基质蛋白产生的式GxxG的四肽，其中所述四肽包括SEQ ID NO: 5 (GEPG)、SEQ ID NO: 8 (GEKG)或SEQ ID NO: 3 (GSPG)。
2.包括SEQ ID NO: 5 (GEPG)、SEQ ID NO: 8 (GEKG)、SEQ ID NO: 3 (GSPG)、SEQ ID NO: 6 (GAPG)或SEQ ID NO: 7 (GPPG)的四肽在制备用于治疗受损皮肤或保持健康皮肤的药物或化妆品中的用途。
3.权利要求1或2中任一项的四肽，其中所述四肽被羧基末端酰胺化。
4.用于治疗受损皮肤或保持健康皮肤的药物或化妆组合物，其包含权利要求1-3中任一项的四肽、以及药物学上或化妆上可接受的载体。
5.权利要求4的组合物，其中所述四肽以范围从0.01μg/mL到100μg/mL的浓度存在。
6.组合物，其包含四肽SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的混合物。
7.权利要求6的组合物，还包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:6。
8.权利要求4-7中任一项的组合物，其中所述组合物是气雾剂、乳剂、液体、霜剂、糊剂、软膏剂或泡沫的形式。
9.权利要求8的组合物，其中所述液体是洗液形式。
10.权利要求4-9中任一项的组合物，其用于皮肤护理。
11.权利要求10的组合物，其中所述皮肤护理解决皮肤褶皱、肤色调节、皮肤紧致或皮肤松弛。
12.权利要求4-9中任一项的组合物，用于刺激受损皮肤中胶原蛋白产生或保持健康皮肤。
13.权利要求12的组合物，其中所述受损皮肤是衰老、疾病、伤害或手术的结果。
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