ES2680022T3 - Fragmentos peptídicos para inducir la síntesis de proteínas de la matriz extracelular - Google Patents

Fragmentos peptídicos para inducir la síntesis de proteínas de la matriz extracelular Download PDF

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Abstract

Un tetrapéptido que comprende la SEQ. ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) para su uso como medicamento.

Description

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DESCRIPCION
Fragmentos peptídicos para inducir la síntesis de proteínas de la matriz extracelular Campo de la invención
La invención se refiere a tetrapéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) con el motivo de aminoácidos PxxP para su uso como medicamento. En particular, la invención se refiere a péptidos activos que estimulan la producción de proteínas de la matriz extracelular y potencian el cierre de la herida de la monocapa de células epiteliales de piel humana herida por arañazos. Las composiciones peptídicas pueden usarse en formulaciones para reparar la piel dañada o para mantener la piel sana.
Antecedentes de la invención
El envejecimiento cutáneo se ve habitualmente como la formación de arrugas y la cicatrización de heridas deteriorada. Una herida se define como una ruptura de la integridad epitelial de la piel. La cicatrización normal de heridas implica una serie compleja y dinámica pero magníficamente orquestada de acontecimientos que conducen a la reparación de los tejidos lesionados. El componente más grande de la piel normal es la matriz extracelular (MEC), una matriz similar a un gel producida por las células que rodea. La MEC se compone de dos clases principales que incluyen proteínas estructurales fibrosas y proteoglicanos. Se sabe que los cambios en la composición y el estado reticulado de la MEC se asocian al envejecimiento y a una gama de trastornos cutáneos adquiridos y hereditarios. Está bien documentado que la MEC no solo proporciona soporte estructural, sino que también influye en el comportamiento celular, tal como la diferenciación y la proliferación. Además, cada vez más investigaciones indican que los componentes de la matriz pueden ser una fuente de señales celulares para facilitar la proliferación y migración de las células epiteliales y, por tanto, para potenciar la cicatrización de las heridas.
La clase más grande de moléculas fibrosas de la MEC es la familia del colágeno, que incluye al menos 16 tipos diferentes de colágeno. El colágeno en la matriz dérmica se compone principalmente de los colágenos de tipo I (8085 %) y de tipo III (8-11 %), ambos son colágenos fibrilares o en forma de bastón. La resistencia a la tracción de la piel se debe principalmente a estas moléculas de colágeno fibrilar, que se autoensamblan en microfibrillas en una disposición de cabeza a cola y lateral de lado a lado escalonada. Las moléculas de colágeno se entrecruzan con las moléculas de colágeno adyacentes, creando resistencia y estabilidad adicionales en las fibras de colágeno. El daño a la red de colágeno (por ejemplo, por enzimas o destrucción física) o su colapso total, provoca que se produzca la cicatrización por reparación.
Se han notificado diversos péptidos bioactivos que estimulan la producción de proteínas de la MEC tanto en la bibliografía científica como en las patentes expedidas. Históricamente, los péptidos se han aislado de fuentes naturales y recientemente han sido objeto de estudios de relación estructura-función. Los péptidos naturales también han servido como puntos de partida para el diseño de análogos de péptidos sintéticos.
Las secuencias específicas dentro de proteínas de la MEC pueden estimular elementos útiles en la piel, tales como colágeno de tipo I, colágeno de tipo III y fibronectina (Katayama et al., J. Biol. Chem. 288: 99419944 (1983)). Katayama et al. identificaron el pentapéptido, KTTKS (SEQ ID NO: 17), dentro del propéptido carboxiterminal (restos 197-241) del colágeno de tipo I. El propéptido se escinde durante la producción de la proteína de colágeno madura. El propéptido escindido puede participar en la regulación de la producción de colágeno a través de un mecanismo de retroalimentación de biosíntesis, desempeñando el segmento KTTKS una función activa. Maquart et al. (J Soc. Biol. 193: 423-28 (1999)) notificaron que los péptidos GHK y CNYYSNS también estimulan la síntesis de MEC. Estas secuencias pueden liberarse durante la renovación de la MEC, indicando de este modo la necesidad de reparar la MEC. Las secuencias peptídicas cortas liberadas mediante cualquiera de los dos mecanismos con frecuencia se denominan "matricinas" (Maquart et al., J. Soc. Biol. 193: 423-28 (1999)).
El documento EP0858808 desvela péptidos, preferentemente el tetrapéptido que comprende la secuencia Gly-Pro- Ala-Gly, que presentan un efecto quimiotáctico hacia los fibroblastos y se usan en el tratamiento de heridas.
Aunque existe una serie de péptidos naturales y sintéticos, existe la necesidad de péptidos biológicamente activos mejorados y métodos para su uso.
Sumario de la invención
Un tetrapéptido de la invención comprende la SEQ ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) para su uso como un medicamento. Se desvelan tetrapéptidos que se caracterizan por el motivo de secuencia de aminoácidos GxxG o PxxP, donde los restos de G (glicina) y P (prolina) se mantienen y x es un aminoácido variable. Los tetrapéptidos derivan de secuencias que aparecen múltiples veces a lo largo de la secuencia primaria de la proteína de la MEC, colágeno de tipo IV. Las secuencias desveladas inducen la producción de todas las formas de colágeno más que las secuencias peptídicas conocidas anteriormente, incluyendo KTTKS, comercializadas con la marca comercial MATRIXYL™ de SEDERMA SAS (Francia). Además, una composición que comprende una combinación de diversas
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secuencias de repetición múltiple desencadena una respuesta de producción de colágeno aún mayor. Pueden esperarse beneficios adicionales de las combinaciones de péptidos presentes en diversas proteínas de la MEC.
La producción de una combinación específica de tetrapéptidos para la reconstrucción de la MEC puede ser prohibitiva en términos de costes comerciales. Se desvela un medio relativamente simple y rentable de producir una combinación diversa de tetrapéptidos biológicamente activos. Mediante la producción de una biblioteca combinatoria de tetrapéptidos con el motivo GxxG o PxxP, puede generarse diversos tetrapéptidos biológicamente activos en la misma ejecución de fabricación (por ejemplo, GEPG, GPEG, GPPG y GEEG). La combinación de tetrapéptidos puede inducir más formación de proteínas de la MEC que los péptidos individuales. Las composiciones que comprenden los tetrapéptidos desvelados, solos o en combinación, son útiles en mercados de cuidado de la piel incluyendo, pero no limitados a, aquellos que abordan la formación de arrugas, la tonificación, la firmeza o la flacidez de la piel. La estimulación del colágeno mediante los tetrapéptidos desvelados puede mejorar significativamente la salud y el aspecto de la piel dañada y envejecida.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 es la SEQ ID NO: 45 que es la secuencia de aminoácidos del Colágeno IV que ilustra las apariciones de tetrapéptidos GxxG. Todas las secuencias en negrita están subrayadas y las secuencias solapadas están doblemente subrayadas.
La FIG. 2 es la sEq ID NO: 46 que es la secuencia de aminoácidos del Colágeno III que ilustra las apariciones de activos de desplazamiento del marco de lectura PGPR y GAGP. Todas las secuencias activas de desplazamiento del marco de lectura están en negrita y subrayadas y las secuencias GxxG que aparecen a un desplazamiento del marco de lectura de distancia están doblemente subrayadas.
La FIG. 3 es también la SEQ ID NO: 45, la secuencia de aminoácidos del Colágeno IV, que ilustra las apariciones del tetrapéptido PGPP.
Descripción detallada de la invención
La invención en general se refiere a tetrapéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) que estimulan la producción de proteínas de la MEC y modulan la cicatrización de heridas y a usos de dichos tetrapéptidos.
Péptidos
Una realización de la divulgación se refiere a un tetrapéptido aislado que comprende el motivo GxxG o PxxP. En esta realización, se mantiene la G (glicina) o la P (prolina) y x es un aminoácido variable. El péptido puede ser, en general, cualquier péptido que pertenezca a la descripción anterior y, más preferentemente, es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 16.
Otra realización de la divulgación se refiere a un tetrapéptido aislado que comprende el motivo GxPG, donde x es P en cualquiera de las dos posiciones variables o en ambas. En esta realización, la G (glicina) y la P (prolina) se mantienen y x es una variable El péptido, en general, puede ser cualquier péptido que pertenezca a la descripción anterior y, más preferentemente, es la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, la sEq ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
Otra realización de la divulgación se refiere a un tetrapéptido aislado que comprende el motivo GExG. En esta realización, la G (glicina) y el E (ácido glutámico) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede ser, en general, cualquier péptido que pertenezca a la descripción anterior y, más preferentemente, es la SEQ Id NO: 5 o la SEQ ID NO: 8.
Otra realización de la divulgación se refiere a un tetrapéptido aislado que comprende el motivo PGxP. En esta realización, la P (prolina) y la G (glicina) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede ser, en general, cualquier péptido que pertenezca a la descripción anterior y, más preferentemente, es la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16.
Otra realización de la divulgación se refiere a un tetrapéptido aislado que comprende el motivo PExP. En esta realización, la P (prolina) y el E (ácido glutámico) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede ser, en general, cualquier péptido que pertenezca a la descripción anterior y, más preferentemente, es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 9.
Otra realización de la divulgación se refiere a un tetrapéptido activo de desplazamiento del marco de lectura. En esta realización, el tetrapéptido aparece a un desplazamiento del marco de lectura desde un tetrapéptido GxxG o PxxP en una proteína de la MEC. El péptido puede ser, en general, cualquier péptido que se encuentre dentro de la descripción anterior y, más preferentemente, es la SEQ ID NO: 4 o la sEq ID NO: 6.
Cada uno de los péptidos descritos anteriormente pueden comprender aminoácidos D o L. Los péptidos pueden
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comprender todos los aminoácidos D o todos los aminoácidos L. Los péptidos pueden tener un extremo C de ácido (-CO2H) o, preferentemente, un extremo C de amida (-CONH2, -CONHR o -CONR2). Los péptidos pueden aumentarse adicionalmente o modificarse ya sea química o enzimáticamente. Por ejemplo, los péptidos pueden estar amidados (-NH2) en el extremo C, que puede hacer que el tetrapéptido sea menos susceptible a la degradación por proteasas y puede aumentar su solubilidad en comparación con las formas de ácido libre. Los péptidos también pueden estar lipidados, lo que puede proporcionar una penetración potenciada en la piel.
Los péptidos descritos anteriormente pueden contener los siguientes aminoácidos: R (arginina), L (leucina), P (prolina), F (fenilalanina), Q (glutamina), E (ácido glutámico), I (isoleucina), K (lisina), S (serina), V (valina), A (alanina), N (asparragina), D (ácido aspártico), T (treonina), Y (tirosina) y G (glicina). Los péptidos descritos anteriormente no incluyen los siguientes: M (metionina), C (cisteína), H (histidina) o W (triptófano). En consecuencia, en una realización, x no se selecciona entre M (metionina), C (cisteína), H (histidina) o W (triptófano).
Métodos de uso
Una realización adicional de la divulgación se refiere a métodos de uso de los péptidos descritos anteriormente. Los métodos de uso pueden implicar el uso de un único péptido o pueden implicar el uso de dos o más péptidos en combinación.
Una realización de la divulgación es un método de promoción de la reparación de la piel dañada y el mantenimiento de la piel sana usando tetrapéptidos que estimulan la producción de proteínas de la MEC. El método en general se refiere a poner en contacto células dérmicas (cutáneas) con una composición que contiene el péptido. Las composiciones pueden ser un aerosol, emulsión, líquido, loción, crema, pasta, pomada, espuma u otra formulación farmacéuticamente aceptable. En general, una formulación farmacéuticamente aceptable incluiría cualquier vehículo aceptable adecuado para su uso sobre la piel humana, por ejemplo, un vehículo cosméticamente aceptable y un vehículo dermatológicamente aceptable. Las composiciones pueden contener otros agentes biológicamente activos tales como retinoides u otros péptidos. Las composiciones pueden contener vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La etapa de puesta en contacto puede realizarse in vivo, in situ, in vitro o mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia. Más preferentemente, la etapa de puesta en contacto ha de realizarse por vía tópica a una concentración suficiente para provocar una respuesta estimuladora. La concentración del péptido en la composición puede ser de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml y de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. La etapa de puesta en contacto puede realizarse en un mamífero, un gato, un perro, una vaca, un caballo, un cerdo o un ser humano. Una composición preferida para promover la producción de proteína de la MEC comprende la SEQ ID NO: 8; más preferentemente, la composición comprende la SEQ ID NO: 8 en una mezcla heterogénea con al menos otro tetrapéptido. En una realización más preferida, los tetrapéptidos individuales en la composición provocarían una producción sostenida de colágeno durante un período de al menos 48 horas.
Una realización adicional de la divulgación se refiere a un método para promover la cicatrización de heridas de la piel dañada por envejecimiento normal, enfermedad, lesión, traumatismo o por cirugía u otros procedimientos médicos. El método puede comprender administrar a la herida de un animal una composición, en el que la composición comprende cualquiera de los péptidos descritos anteriormente, individualmente o en combinación. Las composiciones pueden ser un líquido, loción, crema, pasta, pomada, espuma o cualquier otra formulación farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones pueden contener otros agentes biológicamente activos tales como agentes antimicrobianos o factores de crecimiento. Las composiciones también pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos tales como injertos de tejido, productos de cultivo tisular, oxígeno o apósitos. La concentración del péptido en la composición puede ser de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml y de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. La composición puede administrarse a la herida por vía tópica. El animal en general puede ser cualquier tipo de animal y preferentemente es un mamífero y, más preferentemente, es un ser humano, vaca, caballo, gato, perro, cerdo, cabra u oveja. Una composición preferida para aplicaciones de cicatrización de heridas en las que se promueve la producción de proteína de la MEC comprende la SEQ ID NO: 8; más preferentemente, la composición comprende la SEQ ID NO: 8 en una mezcla heterogénea con al menos otro tetrapéptido. En una realización más preferida, los tetrapéptidos individuales en la composición provocarían una producción sostenida de colágeno durante un período de al menos 48 horas.
Una realización adicional de la divulgación se refiere a un método para reducir la retracción cicatricial de la piel dañada por envejecimiento normal, enfermedad, lesión, traumatismo o por cirugía u otros procedimientos médicos. El método puede comprender administrar a la herida de un animal una composición, en el que la composición comprende cualquiera de los péptidos descritos anteriormente, individualmente o en combinación. Las composiciones pueden ser un líquido, loción, crema, pasta, pomada, espuma u otra formulación farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener vehículos o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones pueden contener otros agentes biológicamente activos tales como agentes antimicrobianos o factores de crecimiento. Las composiciones también pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos tales como injertos de tejido, productos de cultivo tisular, oxígeno o apósitos. La concentración del péptido en la
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composición puede ser de aproximadamente 0,01 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml y de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. La composición puede administrarse a la herida por vía tópica. El animal en general puede ser cualquier tipo de animal y preferentemente es un mamífero y, más preferentemente, es un ser humano, vaca, caballo, gato, perro, cerdo, cabra u oveja. Una composición preferida para aplicaciones de cicatrización de heridas en la que se promueve la producción de proteína de la MEC comprende la SEQ ID NO: 8; más preferentemente, la composición comprende la SEQ ID NO: 8 en una mezcla heterogénea con al menos otro tetrapéptido. En una realización mucho más preferida, los tetrapéptidos individuales en la composición provocarían una producción sostenida de colágeno durante un período de al menos 48 horas.
Una realización adicional de la divulgación se refiere a un método para producir los tetrapéptidos desvelados en combinación. Los péptidos pueden producirse usando cualquier método conocido por los expertos en la materia, tales como los desvelados en Merrifield, R.B., Solid Phase Peptide Synthesis I., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963); Carpino, L.A. et al., [(9-Fluorenylmethyl)Oxy] Carbonyl (Fmoc) Amino Acid Chlorides: Synthesis, Characterization, And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides, J. Org. Chem. 37: 51: 3732-3734; Merrifield, R.B. et al., Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, Anal. Chem. 38: 19Q51914 (1966); o Kent, S.B.H. et al., High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, en: Peptides 1984 (Ragnarsson U., ed.) Almqvist and Wiksell Int., Estocolmo (Suecia), páginas 185-188. Preferentemente, los péptidos se producirán mediante una máquina capaz de añadir secuencialmente aminoácidos a una cadena peptídica en crecimiento. Sin embargo, los péptidos también pueden fabricarse usando una metodología de fase en solución convencional.
Se ha observado que la adición de una mezcla de aminoácidos libres en lugar de mezclas de péptidos homogéneas durante la síntesis de la cadena peptídica da como resultado la incorporación variada de aminoácidos libres de manera que se obtiene una combinación de péptidos como resultado de las reacciones de síntesis. La frecuencia de incorporación relativa de un aminoácido particular incluido en una mezcla de dos o más aminoácidos añadidos durante la síntesis puede ajustarse. El ajuste se hace posible mediante la modificación de la relación de un aminoácido libre que se vuelve disponible durante el proceso de síntesis con respecto a los otros aminoácidos de la mezcla (esto se denomina mezcla isocinética).
Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas desveladas en los ejemplos a continuación representan técnicas que el inventor descubrió que funcionan bien en la práctica de la invención y, por tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su puesta en práctica.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación de secuencias tetrapeptídicas de repetición en colágeno
Una proporción relativamente alta de secuencias repetidas de tetrapéptidos de colágeno IV tiene el motivo GxxG (donde x es cualquier aminoácido). Una serie de éstas se muestran in situ como parte de la secuencia completa de colágeno IV ilustrada en la Figura 1 como la SEQ ID NO: 45. El colágeno IV se examinó en primer lugar debido a su función de interactuar con otros componentes especializados de la MEC (véase Gregory Schultz et al., 2005). Existen once secuencias con el motivo GxxG en el colágeno IV que aparecen más de diez veces (GxxG donde xx está representado por: vp, ek, fp, lp, pp, sp, ep, ip, pk, qp y tp). De estas secuencias tetrapeptídicas, ocho de once secuencias contienen prolina en la posición 3, dos de once secuencias contienen P en la posición 2, una de once secuencias contiene prolina en las posiciones 2 y 3 y una de once secuencias no contiene prolina. Las secuencias desveladas se denominan REPLIKINES™. "REPLIKINE" se define como una secuencia corta dentro de las proteínas de la MEC que aparece múltiples veces (es decir, se replica). Esta secuencia puede estar presente en una proteína de la MEC (por ejemplo, colágeno IV). Preferentemente, la secuencia está presente en múltiples proteínas de la MEC (por ejemplo, todos los colágenos, elastina, laminina, etc.). La presencia de la secuencia en múltiples proteínas de la MEC aumenta la probabilidad de que el fragmento pueda ser capaz de promover la síntesis o reparación de la MEC.
Las once secuencias GxxG que aparecen en el colágeno IV enumeradas anteriormente se resaltan en la secuencia de colágeno IV humano ilustrada en la Figura 1. En esta figura, todas las secuencias en negrita están subrayadas y las secuencias solapadas están doblemente subrayadas. Todas menos una de estas secuencias también aparecen en los colágenos I, II, III y V. Este hecho contribuye a la capacidad de los péptidos desvelados para estimular la producción de todos los tipos de colágeno, en particular cuando los péptidos se usan en combinación. La Tabla 1 muestra la frecuencia de varias repeticiones tetrapeptídicas en proteínas de la MEC. Las secuencias en negrita en la Tabla 1 son aquellas que aparecen en el colágeno IV diez o más veces.
5
10
15
20
25
Tabla 1: Frecuencia de tetrapéptidos en proteínas de la MEC
SEQ. ID NO
Secuencia Colágeno I Colágeno II Colágeno III Colágeno IV Colágeno V Elastina Precursor de elastina
19
GAAG 10 5 7 2 4 5
20
GAKG 3 4 3 5 5
21
GAPG 13 21 25 6 9
22
GDKG 2 2 4 9 3
23
GDRG 2 5 2 4 1
8
GEKG 3 5 4 22 15
5
GEPG 11 15 10 11 4
24
GERG 10 11 14 6 7
2
GFPC 4 8 6 22 5 1 1
25
GIPQ 2 2 6 14 6 5 5
26
GKDG 1 4 5 2 2
27
GKJPG 2 3 3 4 1
28
GLKG 2 1 1 5 4
29
GLPG 15 10 9 42 15 1 1 -
30
GNPG 3 5 3 2 1
31
GPAG 16 20 20 3 6
32
GPKG 3 11 4 12 9
7
GPPG 33 40 40 46 43
33
GPQG 7 11 9 7 5
34
GPRG 11 13 10 4 7
35
GPSG 10 11 5 1 5
36
GPTG 4 3 2 2 6
'37
GPVG 9 3 3 2 5
38
GQPG 3 4 6 12 7
39
GRDG 4 2 3 3
40
GRPG 3 3 4 2 5
3
GSPG 4 6 21 16 3
41
GTPG 3 4 2 11 2
42
GVKG 1 3 2 3 1
43
GVPG 1 3 10 1 14 15
44
GYPG 1 1 1 4 2
Como también es evidente a partir de una revisión de la secuencia del colágeno IV, la SEQ ID NO: 45, también hay muchas apariciones de secuencias que tienen el motivo PxxP. Por ejemplo, la secuencia PGPP aparece no menos de quince veces como se ilustra en la Figura 3. Por tanto, esta secuencia desvelada también se denomina REPLIKINE™. Preferentemente, esta secuencia está presente en múltiples proteínas de la MEC (por ejemplo, todos los colágenos, elastina, laminina, etc.) ya que la presencia de esta secuencia en múltiples proteínas de la MEC aumenta la probabilidad de que el fragmento pueda ser capaz de promover la síntesis o reparación de la MEC. Las quince secuencias de PGPP que aparecen en el colágeno IV enumeradas anteriormente están resaltadas y subrayadas en la secuencia del colágeno IV humano ilustrada en la Figura 3.
Ejemplo 2: Identificación de activos de desplazamiento del marco de lectura
Además de la proporción relativamente alta de secuencias de repetición tetrapeptídicas de colágeno IV con el motivo GxxG, se han identificado otras secuencias tetrapeptídicas que presentan un desplazamiento del marco de lectura de aminoácidos de distancia desde una secuencia tetrapeptídica GxxG o PxxP. Estas secuencias pueden repetirse o aparecer solo una vez dentro de una proteína de la MEC y pueden estar ubicadas a una posición de aminoácido de distancia de una secuencia tetrapeptídica QxxG o PxxP como se describe en el presente documento. Estas secuencias tetrapeptídicas se denominan activos de desplazamiento del marco de lectura. Dichos activos de desplazamiento del marco de lectura pueden contener, en consecuencia, una G o una P ya sea en la segunda o en la tercera posición, dependiendo de la dirección del desplazamiento del marco de lectura. Se ha reconocido adicionalmente que los activos de desplazamiento del marco de lectura pueden combinarse con otras secuencias tetrapeptídicas desveladas en la presente solicitud formando una combikine. Un ejemplo de dicha combikine es H06 y H15.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Un ejemplo de un activo de desplazamiento del marco de lectura es GAGP o H12 (SEQ ID NO: 6). H12 (GAGP) aparece a un desplazamiento de resto (o marco de lectura) del tetrapéptido de GxxG GGAG en el Colágeno III (SEQ ID NO: 46) como se ilustra en la Figura 2. En esta figura, todas las secuencias activas de desplazamiento del marco de lectura están en negrita y subrayadas y las secuencias de GxxG que aparecen a un desplazamiento del marco de lectura de distancia están doblemente subrayadas. Además, como se muestra en la Tabla 5, este tetrapéptido (GAGP) consigue buenos resultados para la producción de colágeno a las 48 horas. Otro ejemplo es la secuencia PGPR, que es H10 (SEQ ID NO: 4) que aparece once veces en los Colágenos I-IV. Como aparece múltiples veces en una proteína de la MEC individual, este tetrapéptido se consideraría adicionalmente REPLIKINE. La Figura 2 (SEQ ID NO: 46) ilustra varios casos de este tetrapéptido con cada desplazamiento del marco de lectura que se produce desde el tetrapéptido de GxxG GPRG. Este activo de desplazamiento del marco de lectura particular aparece en múltiples proteínas de la MEC y, por tanto, aumenta la probabilidad de que el fragmento pueda ser capaz de promover la síntesis o reparación de la MEC.
Ejemplo 3: Identificación de secuencias de repetición que estimulan la producción de colágeno
Se sintetizaron varias secuencias identificadas en los Ejemplos 1 y 2 usando química peptídica convencional y se sometieron a ensayo para la estimulación de colágeno a partir de fibroblastos dérmicos. Los péptidos sintetizados se amidaron en el extremo C, lo que volvió a los tetrapéptidos menos susceptibles a la degradación por proteasas y aumentó su solubilidad en comparación con las formas de ácido libre. Se incubaron fibroblastos dérmicos humanos en placas de 96 pocillos a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 y 48 horas en 150 gl de medio de cultivo celular completo (Cascade Biologics, Portland, OR; N.° de Cat. M-106-500), complementado con Complemento de Crecimiento Pobre en Suero (Cascade Biologics, Portland, OR; N.° de Cat. S-003-10) que contenía péptidos de la muestra a una concentración peptídica final de 50 gg/ml. Cada pocillo se sembró con 10.000 células. Después de la incubación, se recuperaron muestras de medio de 100 gl de cada pocillo y se sometieron a ensayo para determinar la producción de colágeno.
Los ensayos fueron realizados por Tebu-bio Laboratories (Francia) usando el Kit de Ensayo de Colágeno SIRCOL™ (Biocolor Assays, Reino Unido) siguiendo el protocolo del fabricante. El Ensayo de Colágeno SIRCOL™ es un método cuantitativo de unión a colorante diseñado para el análisis de colágenos solubles liberados en el medio de cultivo por células de mamíferos durante el cultivo in vitro. El colágeno de las muestras sometidas a ensayo se une al colorante aniónico SIRCOL™. Los complejos de colágeno-colorante se separan por precipitación de la solución y se sedimentan por centrifugación. El sedimento de colágeno-colorante recuperado se disolvió en una solución alcalina antes de las mediciones de absorbancia. Se tomaron medidas por duplicado a las 24 y 48 horas de dos muestras separadas. Las cuatro mediciones para cada muestra se promediaron. Se midió la absorbancia de blancos de reactivo, patrones de colágeno y muestras a 560 nm. La absorbancia del blanco de reactivo se restó de la absorbancia de cada muestra a las 24 y 48 horas.
Se usaron dos conjuntos de datos separados para generar dos curvas de calibración de colágeno. La primera curva de calibración se generó con el fin de calcular la cantidad de colágeno en las muestras H6 (combinación de las SEQ ID NO: 1-4), H7-H14 (SEQ ID NO: 1-8, respectivamente) y H15 (combinación de las SEQ ID NO: 5-8). La segunda curva de calibración se generó para calcular la cantidad de colágeno en las muestras H16 (SEQ ID NO: 9), H21-23 (SEQ ID NO: 1012, respectivamente), H25-26 (SEQ ID NO: 13-14, respectivamente) o H29-3Q (SEQ ID NO: 15-16, respectivamente), H32 (SEQ ID NO: 17), H33 (combinación de las SEQ ID NO: 9-12), H34 (combinación de las SEQ ID NO: 11-14), H35 (combinación de las SEQ ID NO: 13-16), H36 (combinación de las SEQ ID NO: 1, 6, 5, 8), H37 (SEQ ID NO: 17) y H38 (SEQ ID NO: 8). A partir de las mediciones de absorbancia se creó la representación de Abs560nm de los patrones de colágeno conocidos frente a las concentraciones respectivas de los patrones de colágeno (en microgramos). Se realizó una serie de ensayos en cada punto temporal. Con respecto a cada conjunto de datos, se usó la misma curva de calibración para las muestras tomadas a las 24 y 48 horas (Tablas 2A y 2B). En consecuencia, se prepararon diferentes curvas de calibración inmediatamente antes de realizar cada serie de ensayos.
Tabla 2A: Curva de calibración para someter a ensayo la producción de colágeno por los péptidos H6-H15
Patrones de colágeno (gg)
Ensayo de 24 h de A560nm Ensayo de 48 h de A560nm
0
0,00 0,00
5
0,08 0,10
10
0,11 0,15
25
0,32 0,35
50
0,66 0,65
Tabla 2B: Curva de calibración para someter a ensayo la producción de colágeno por los péptidos H16, H21- 23, H25-26 y H29-38_____________________________________________________________
Patrones de colágeno (gg)
Ensayo de A560nm fecha 1 Ensayo de A560nm fecha 2
0
0,00 0,00
5
10
15
20
25
5
0,12 0,09
10
0,14 0,15
25
0,48 0,42
50
0,88 0,80
Se realizó una regresión lineal a partir de la representación de los valores de Abs560nm frente a las concentraciones de los respectivos patrones de colágeno usando MICROSOFT EXCEL™. La regresión dio como resultado una línea descrita por la fórmula y = 0,013x para ambos tiempos de incubación indicados en la Tabla 2A. Como los resultados fueron idénticos, solo se usó el período de tiempo de 24 horas para las curvas de calibración de la segunda serie. La fórmula de la línea obtenida en la fecha de ensayo 1 y la fecha de ensayo 2 de la segunda serie de muestras fue y = 0,0178x e y = 0,0162x, respectivamente. El péptido LL-37 (SEQ ID NO: 18) se usó como control positivo ya que se ha informado ampliamente que tiene un impacto sobre la cicatrización de heridas en el hombre (Heilbom et al., The Cathelicidin Anti-Microbial Peptide LL-37 Is Involved In The Re-Epithelialization Of Human Skin Wounds And Is Lacking In Chronic Ulcer Epithelium, J. Invest. Dermato. 120: 379-89 (2003)). El límite de detección del ensayo definido por el fabricante es de 2,5 gg.
La cantidad total de colágeno producida en las muestras que contenían péptidos se calculó a partir de los valores de absorbancia promediados tomados a las 24 horas (Tabla 3A) y 48 horas (Tabla 3B) usando la ecuación lineal derivada de la curva de calibración. La cantidad total de colágeno producida en las muestras que contenían los péptidos H16 (SEQ ID NO: 9), H21-23 (SEQ ID NO: 10-12, respectivamente), H25-26 (SEQ ID NO: 13-14, respectivamente) o H29-30 (SeQ ID NO: 15-16, respectivamente), h32 (SEQ ID NO: 17), H33 (combinación de las SEQ ID NO: 9-12), H34 (combinación de las SEQ ID NO: 11-14), H35 (combinación de las SEQ ID NO: 13-16), H36 (combinación de las SEQ ID NO: 1, 6, 5, 8), H37 (SEQ ID NO: 17) y H38 (SEQ ID NO: 8) se calculó a partir de los valores de absorbancia tomados a las 24 horas (Tabla 4A) y a las 48 horas (Tabla 4B) usando la ecuación lineal derivada de la curva de calibración. Estos valores se compararon con el péptido LL37 (SEQ ID NO: 18), un péptido conocido por estimular el colágeno. En cada tabla, las muestras marcadas por un asterisco (*) pueden no ser significativas ya que el límite de detección del ensayo es de 2,5 gg.
Tabla 3A: Mediciones de absorbancia y cuantificación de colágeno en las muestras de ensayo H6-H15 a las
24 horas.
SEQ ID NO
Péptidos A560nm Promedio Promedio menos blanco Colágeno (gg)
18
LL37 0,102 0,136 0,12 0,04 3,0
-
H6 0,084 0,140 0,11 0,03 2,5
1
H7 0,098 0,063 0,08 0,00 O o *
2
H8 0,122 0,078 0,10 0,02 1,5*
3
H9 0,147 0,104 0,13 0,05 3,5
4
H10 0,103 0,146 0,12 0,04 3,4
5
H11 0,110 0,168 0,14 0,06 4,5
6
H12 0,063 0,101 0,08 0,00 0,2*
7
H13 0,114 0,093 0,10 0,02 1,8*
8
H14 0,115 0,122 0,12 0,04 3,0
-
H15 0,132 0,093 0,11 0,03 2,5
-
Blanco 0,074 0,076 0,08 0,00 0,0
Tabla 3B: Mediciones de absorbancia y cuantificación del colágeno en las muestras de ensayo H6-H15 a las
48 horas.
SEQ ID NO
Péptidos A560nm Promedio Promedio menos blanco Colágeno (gg)
18
LL37 0,262 0,113 0,19 0,07 5,2
-
H6 0,086 0,189 0,14 0,02 1,3*
1
H7 0,192 0,189 0,19 0,07 5,4
2
H8 0,137 0,126 0,13 0,01 0,9*
3
H9 0,117 0,061 0,09 0,00 0,0*
4
H10 0,136 0,085 0,11 0,00 0,0*
5
H11 0,113 0,181 0,15 0,03 2,1*
6
H12 0,106 0,231 0,17 0,05 3,7
7
H13 0,100 0,145 0,12 0,00 0,2*
8
H14 0,132 0,176 0,15 0,03 2,6
-
H15 0,177 0,174 0,18 0,06 4,3
Blanco 0,120 0,115 0,12 0,00 0,0
Tabla 4A: Mediciones de absorbancia y cuantificación del colágeno en las muestras de ensayo H16, H21-23,
H25-26 o H29-38 a las 24 horas.
SEQ ID NO
Péptidos A560nm Promedio Promedio menos blanco Colágeno (qg)
9
H16 0,133 0,137 0,14 0,06 3,1
10
H21 0,129 0,119 0,12 0,04 2,5
11
H22 0,192 0,085 0,14 0,06 3,3
12
H23 0,090 0,073 0,08 0,00 0,1*
13
H25 0,129 0,076 0,10 0,02 1,3*
14
H26 0,114 0,149 0,13 0,05 2,9
15
H29 0,111 0,063 0,09 0,01 0,4*
16
H30 0,099 0,092 0,10 0,02 0,9*
17
H32 (cristales y toxicidad celular) 0,087 0,055 0,07 -0,01 i O en *
-
H33 0,086 0,125 0,11 0,03 1,4*
-
H34 0,117 0,120 0,12 0,04 2,2*
-
H35 0,103 0,090 0,10 0,02 0,9*
-
H36 0,105 0,128 0,12 0,04 2,1*
17
H37 0,099 0,100 0,10 0,02 1,1*
8
H38 0,103 0,159 0,13 0,05 2,9
-
Blanco 0,072 0,086 0,08 0,00 0,0
5 Tabla 4B: Mediciones de la absorbancia y cuantificación del colágeno en las muestras de ensayo H16, H21- _______________________________23, H25-26 o H29-38 a las 48 horas._______________________________
SEQ ID NO
Péptidos A560nm Promedio Promedio menos blanco Colágeno (qg)
9
H16 0,065 0,064 0,06 0,00 0,3*
10
H21 0,089 0,126 0,11 0,05 2,9
11
H22 0,102 0,087 0,09 0,03 2,1*
12
H23 0,093 0,082 0,09 0,03 1,7*
13
H25 0,059 0,084 0,07 0,01 0,7*
14
H26 0,081 0,153 0,12 0,06 3,5
15
H29 0-09 0,094 0,086 0,03 1,9*
16
H30 0,083 0,101 0,09 0,03 2,0*
17
H32 (cristales y toxicidad celular) 0,088 0,072 0,08 0,02 1,2*
-
H33 0,096 0,092 0,09 0,03 2,1*
-
H34 0,076 0,155 0,12 0,06 3,4
-
H35 0,120 0,074 0,10 0,04 2,3*
-
H36 0,154 0,082 0,12 0,06 3,6
17
H37 0,078 0,114 0,10 0,04 2,2*
8
H38 0,123 0,089 0,11 0,05 2,8
-
Blanco 0,106 0,0106 0,06 0,00 0,0
Debido a que los tamaños de muestra fueron de 100 ql, la concentración de colágeno producida en cada muestra en microgramos por mililitro se determinó multiplicando la cantidad de colágeno detectada por diez. Los resultados de 10 todas las muestras analizadas se resumen en la Tabla 5.
5
10
15
20
25
Tabla 5: Síntesis de colágeno inducida por péptidos
Colágeno producido (pg/ml)
SEQ ID NO
Nombre Secuencia primaria [Péptido] (pg/ml) 24 horas 48 horas
1
H07 PEGP 50 0 54
2
H08 GFPG 50 15 9
3
H09 GSPG 50 35 0
4
H10 PGPR 50 34 0
-
H06 H7, H8, H9, H10 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4) 50 25 13
5
H11 GEPG 50 45 21
6
H12 GAGP 50 2 37
7
H13 GPPG 50 18 2
8
H14 GEKG 50 30 26
8
H38 GEKG 0.3 29 28
-
H15 H11, H12, H13, H14 (SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8) 50 25 43
9
H16 PEKP 50 31 3
10
H21 PKQP 50 25 29
11
H22 PGQP 50 33 21
12
H23 PGTP 50 1 17
13
H25 PMGP 50 13 7
14
H26 PGPP 50 29 35
15
H29 PQGP 50 4 19
16
H30 PGNP 50 9 20
17
H32 KTTKS (péptido SEDERMA™) 50 na 12
17
H37 KTTKS (péptido SEDERMA™) 0,3 11 22
'
H33 H16, H21, H22, H23 (SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12) 50 14 21
-
H34 H22, H23, H25, H26 (SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14) 50 22 34
-
H35 H25, H26, H29, H30 (SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16) 50 9 23
-
H36 H7, H12, H11, H14 (SEQ ID NO: 1, 6, 5, 8) 50 21 36
18
LL37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRID FLRNLVPRTES 50 30 52
Todos los tetrapéptidos sometidos a ensayo estimularon la producción de colágeno soluble. De las secuencias sometidas a ensayo, los tetrapéptidos GxxG con un ácido glutámico en la posición 2 estimulan mejor el colágeno en ambos puntos temporales de 24 y 48 horas. Estas secuencias son H11 (GePG, SEQ ID NO: 5), H14 (GEKG, SEQ ID NO: 8) y H38 (GEKG; SEQ ID NO: 8). Los péptidos se detectaron inicialmente usando una concentración de péptido de 50 pg/ml. Para estudiar la concentración eficaz para estimular la producción de colágeno, H14 (SEQ ID NO: 8) también se sometió a ensayo a 0,3 pg/ml como H38. Como se muestra en la Tabla 5, la estimulación de colágeno inducida por H38 no disminuyó a la concentración más baja, lo que indica que la concentración estimulante máxima de la SEQ ID NO: 8 es igual o inferior a 0,3 pg/ml.
Para someter a ensayo su eficacia, la SEQ ID NO: 8 (H14 y H38) se comparó con el péptido, LL37, (SEQ ID NO: 18) que se sabe que estimula la producción de colágeno. Basándose en la cantidad de colágeno liberada por los fibroblastos en respuesta a LL37, se consideró que 25 pg/ml era una cantidad de colágeno significativa liberada debido al contacto con un tetrapéptido. La SEQ ID NO: 8 indujo aproximadamente la misma cantidad de colágeno que LL37 (SEQ ID NO: 18) a las 24 horas. De forma importante, el colágeno producido como resultado del contacto con la SEQ ID NO: 8 se mantuvo sustancialmente durante al menos 48 horas. La SEQ ID NO: 8 también se comparó con un péptido líder para el cuidado de la piel que se sabe que estimula la producción de colágeno, KTTKS (SEQ ID NO: 17) (Katayama et al., J. Biol. Chem., 288: 9941-9944 (1983)). kTtKS es un ingrediente en el producto MATRIXYL™ (SEDERMA SAS, Francia). La SEQ ID NO: 8 estimuló más producción de colágeno que el péptido KTTKS (SEQ ID NO: 17) (Tabla 5) a las 24 y 48 horas.
Ejemplo 4: Identificación de combinaciones de péptidos que potencian sinérgicamente la estimulación de colágeno - COMBIKINES
Las poblaciones heterogéneas de tetrapéptidos activos pueden estimular la producción de colágeno a un nivel más alto que las muestras homogéneas de tetrapéptidos. Los componentes de la composición heterogénea se
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denominan COMBIKINES™. Las COMBIKINES son un grupo de REPLIKINES combinadas para producir un efecto mayor o más amplio sobre uno o más tipos celulares diana. Los péptidos H11 (SEQ ID NO: 5), H12 (SEQ ID NO: 6), H13 (SEQ ID NO: 7) y H14 (SEQ ID NO: 8) se combinaron a una concentración final de 50 gg/ml y se sometieron a ensayo usando el mismo protocolo que para los péptidos individuales. Como se esperaba, el resultado obtenido en el punto temporal de 24 horas fue igual a la media de las puntuaciones de inducción individuales. La combinación de péptidos a las 48 horas, sin embargo, indujo colágeno a un nivel de 43 gg/ml. Sorprendentemente, esta cantidad fue muy superior a la media prevista (21 gg/ml) de los cuatro péptidos individuales (véase la Tabla 5). Por tanto, combinaciones específicas de péptidos pueden estimular la producción de colágeno en mayor grado que los péptidos individuales en la misma concentración. Adicionalmente, tetrapéptidos de diversas fuentes de MEC tales como colágeno, laminina y elastina pueden producir una inducción potenciada de diversas proteínas de la MEC (véanse las Tablas 1 y 5).
Ejemplo 5: Fabricación de COMBIKINE rentable para potenciar la estimulación de la producción de colágeno
El alto coste de la síntesis de péptidos limita la posibilidad de producir composiciones heterogéneas de péptidos bioactivos. La presente invención mitiga en gran medida esta limitación. Debido a que las secuencias desveladas actualmente tienen una característica común (por ejemplo, una glicina o prolina en ambos extremos), puede sintetizarse una gama de tetrapéptidos variados en las posiciones 2 y 3 en una sola ejecución de fabricación. Los péptidos sintéticos pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica. (Benoiton, N., Chemistry of Peptide Synthesis, CRC (2005)). Durante la fabricación de los péptidos, se añaden mezclas de aminoácidos en lugar de muestras homogéneas. La química para determinar las relaciones correctas de concentraciones de aminoácidos añadidas en las posiciones mixtas para obtener la relación deseada de péptidos resultantes se ha descrito anteriormente (Greenbaum et al., Molecular and Cellular Proteomics 1: 60-68, 2002; Krstenansky et al., Letters in Drug Design and Discovery 1: 6-13, 2004). Usando esta metodología, puede hacerse una biblioteca de péptidos heterogéneos por casi el mismo coste que el de la síntesis de un péptido.
La aplicación de este proceso de fabricación permite la producción rentable de combikines bioactivas. Esto es posible gracias a la composición única de los tetrapéptidos desvelados. Las mezclas de tetrapéptidos son más adecuadas para la incorporación en formulaciones de uso tópico que los péptidos más largos. Debido a su longitud, los tetrapéptidos tienen ventajas prácticas y químicas sobre los péptidos más largos, incluyendo las siguientes: incorporación y disolución más fácil en formulaciones, mayor permeabilidad de la piel y los poros y mayores rendimientos de producción con métodos más fáciles de fabricación de combinaciones de péptidos. Aunque no es necesario, las formulaciones ideales de tetrapéptidos, solos o en combinación, son formulaciones que mantienen una producción significativa de colágeno a las 24 horas y hasta a las 48 horas. Más preferentemente, las formulaciones inducirían la síntesis de MEC durante todo el período de 48 horas de manera que se produzca más colágeno en 48 horas que en 24 horas. Aunque dentro del alcance de la presente invención, los tetrapéptidos que promueven la producción de proteínas de la MEC a las 24 horas, pero que muestran una producción disminuida a las 48 horas, se favorecen menos. A este respecto, la Tabla 6 muestra los resultados de los péptidos desvelados actualmente. Los péptidos preferidos están en negrita.
Tabla 6: Péptidos desvelados
SEQ ID NO
Péptidos Colágeno liberado (gg/ml) 24 h Colágeno liberado (gg/ml) 48 h Liberación de colágeno significativa a las 24 h y las 48 h Aumento de la liberación de colágeno a las 48 h frente a las 24 h Disminución de la liberación de colágeno a las 48 h frente a las 24 h
18
LL37 30 52 V V
-
H6 25 13
1
H7 0 54 V
2
H8 15 9
3
H9 35 0 V
4
H10 34 0 V
5
H11 45 21 V
6
H12 2 37 V
7
H13 18 2
8
H14 30 26 V
8
H38 29 28 V
-
H15 25 43 V V
9
H16 31 3 V
10
H21 25 29 V
11
H22 33 21 V
12
H23 1 17 V
5
10
15
20
25
30
35
40
13
H25 13 7 V
14
H26 29 35 V
15
H29 4 19 V
16
H30 9 20 V
17
H32 (cristales y toxicidad celular) NA 12
17
H37 11 22 V
-
H33 14 21 V
-
H34 22 34 V
-
H35 9 23 V
-
H36 21 36 V
Ejemplo 6: Los estimuladores de colágeno también sirven como moléculas multiefectoras que potencian el cierre de heridas de células epiteliales cutáneas
Los colágenos son componentes clave de todas las fases de la cicatrización de heridas. La estimulación de la producción de colágeno refleja que se ha producido daño a la red de colágeno (por ejemplo, por enzimas o destrucción física). De hecho, el colapso total de la red de colágeno provoca que tenga lugar la cicatrización. Por tanto, un estimulador de colágeno también puede servir como molécula multiefectora orquestando cierta remodelación de la matriz y potenciando la cicatrización de heridas.
Se realizaron experimentos de cicatrización de heridas en monocapas de células epiteliales de piel humana (CRL- 2592) colocadas en placas de 12 pocillos. Las células se privaron de suero durante 24 horas antes de la experimentación. Se hirieron monocapas confluentes de CRL-2592 usando una punta de pipeta P200 (200 |jl). Las heridas se lavaron y se documentaron mediante imagen antes del tratamiento con péptido. Los péptidos se añadieron a una concentración final de 20 a 40 jg/ml. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C, 5 % de CO2 y 92 % de humedad, excepto cuando se estaban capturando las imágenes durante un corto período de tiempo a temperatura ambiente. El cierre de la herida se siguió en los puntos temporales de 6 horas y l0 horas. Se usaron heridas tratadas con PBS como controles negativos con fines comparativos.
Tabla 7: Efecto de péptidos sobre el cierre de heridas epiteliales de piel humana in vitro
0 h 6 h 10 h
Compuesto PBS-1 PBS-2
Tamaño H* 36 52 Tamaño H 29 42 % de cierre 19,40 % 19,20 % Tamaño H 21 30 % de cierre 41,70 % 42,30 %
SEQ ID NO: 14
25 12 52 % 2,75 89 %
SEQ ID NO: 5
48 39 19 % 30 37,50 %
* Tamaño H: tamaño de la herida (arbitrario)
El cierre de la herida de la monocapa in vitro es el resultado de la migración celular, que es importante en muchos procesos biológicos, tales como la embriogénesis, la angiogénesis, las reacciones inflamatorias y la reparación de heridas. Se cree que estos procesos están regulados por interacciones con otras células, citocinas y proteínas de la MEC. Como se muestra en la Tabla 7, la SEQ ID NO: 14 induce significativamente el cierre de la herida en comparación con los efectos del PBS solo. Dicha actividad es específica de péptido, así como específica de tipo celular puesto que la SEQ ID NO: 14 no induce el cierre de la herida en una monocapa de fibroblastos de piel humana (datos no mostrados). La SEQ ID NO: 5 también es un inductor de colágeno, pero no potencia el cierre de la herida ni la migración de células epiteliales en gran medida en comparación con los efectos del PBS solo. El hecho de que la SEQ ID NO: 14 indujera la migración celular o el cierre de heridas de manera específica para las células epiteliales cutáneas (es decir, no recluta fibroblastos) puede añadir una ventaja al uso de este péptido para el cuidado de la piel, puesto que se cree que el reclutamiento de gran número de fibroblastos activos a un sitio de herida da como resultado una deposición en exceso y una contracción de tejido que da como resultado la retracción cicatricial.
Todas las composiciones o métodos desvelados y reivindicados en el presente documento pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas de los métodos descritos en el presente documento. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden sustituirse por los agentes descritos en el
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45
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60
presente documento aunque se conseguirían los mismos resultados o similares.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Harris, Scott M.
Falla, Timothy J.
Zhang, Lijuan
<120> FRAGMENTOS PEPTÍDICOS PARA INDUCIR LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
<130> 11181.0034.NPUS00 <150> US 60/813.284
<151 > <160> 46
<170> PatentIn versión 3.4
<210> 1 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H7 <400> 1
Pro Glu Gly Pro 1
<210>2 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H8 <400> 2
Gly Phe Pro Gly 1
<210>3 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H9 <400> 3
Gly Ser Pro Gly 1
<210>4 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H10
<400>4 5
<210>5 <211>4
10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H11 15
<400> 5
20 <210>6
<211>4 <212> PRT <213> Artificial
25 <220>
<223> Péptido sintético H12
<400> 6
30
<210>7 <211>4 <212> PRT
35 <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H13 40 <400> 7
<210>8 45 <211>4
<212> PRT <213> Artificial
<220>
50 <223> Péptido sintético H14
<400> 8
55
<210>9 <211>4 <212> PRT
Pro Gly Pro Arg 1
Gly Glu Pro Gly 1
Gly Ala Gly Pro 1
Gly Pro Pro Gly 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<213> Artificial <220>
<223> Péptido sintético H16 <400>9
Pro Glu Lys Pro 1
<210> 10 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H21 <400> 10
Pro Lys Gly Pro 1
<210> 11 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H22 <400> 11
Pro Gly Gln Pro 1
<210> 12 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H23 <400> 12
Pro Gly Thr Pro 1
<210> 13 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
Pro Met Gly Pro 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210> 14 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H26 <400> 14
Pro Gly Pro Pro 1
<210> 15 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H29 <400> 15
Pro Gln Gly Pro 1
<210> 16 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H30 <400> 16
Pro Gly Asn Pro 1
<210> 17 <211>5 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético H32 <400> 17
Lys Thr Thr Lys Ser 1 5
<210> 18 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys lie Gly Lys Glu 15 10 15
Phe Lys Arg lie Val Gln Arg lie Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro 20 25 30
Arg Thr Glu Ser 35
<210> 19 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 19
Gly Ala Ala Gly 1
<210> 20 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 20
Gly Ala Lys Gly 1
<210> 21 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 21
Gly Ala Pro Gly 1
<210> 22 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 23
Gly Asp Arg Gly 1
<210> 24 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 24
Gly Glu Arg Gly 1
<210> 25 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 25
Gly lie Pro Gly 1
<210> 26 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 26
Gly Lys Asp Gly 1
<210> 27 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Gly Lys Pro Gly 1
<210> 28 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 28
Gly Leu Lys Gly 1
<210> 29 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 29
Gly Leu Pro Gly 1
<210> 30 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 30
Gly Asn Pro Gly 1
<210> 31 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 31
Gly Pro Ala Gly 1
<210> 32 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Péptido sintético <400> 32
Gly Pro Lys Gly 1
<210> 33 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 33
Gly Pro Gln Gly 1
<210> 34 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 34
Gly Pro Arg Gly 1
<210> 35 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 35
Gly Pro Ser Gly 1
<210> 36 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<210> 37 <211>4 <212> PRT <213> Artificial 5
<220>
<223> Péptido sintético <400> 37
10
Gly Pro Val Gly 1
<210> 38 <211>4
15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético
20
<400> 38
Gly Gln Pro Gly 1
25 <210> 39
<211>4 <212> PRT <213> Artificial
30 <220>
<223> Péptido sintético
<400> 39
35
<210> 40 <211>4 <212> PRT
40 <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético 45 <400> 40
<210> 41 50 <211>4
<212> PRT <213> Artificial
<220>
55 <223> Péptido sintético
<400> 41
Gly Arg Asp Gly 1
Gly Arg Pro Gly 1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Gly Thr Pro Gly 1
<210> 42 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 42
Gly Val Lys Gly 1
<210> 43 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 43
Gly Val Pro Gly 1
<210> 44 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Péptido sintético <400> 44
Gly Tyr Pro Gly 1
<210> 45 <211> 1669 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 45

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un tetrapéptido que comprende la SEQ. ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) para su uso como medicamento.
  2. 2. Un tetrapéptido que comprende la SEQ. ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) para su uso como medicamento para el tratamiento de la piel dañada o en el mantenimiento de una piel sana.
  3. 3. Uso de un tetrapéptido que comprende la SEQ. ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) como producto cosmético.
  4. 4. El tetrapéptido de las reivindicaciones 1-2 o el uso de un tetrapéptido de la reivindicación 3, en donde el tetrapéptido está amidado en el extremo carboxi.
  5. 5. Una composición farmacéutica para su uso como medicamento que comprende un tetrapéptido que comprende la SEQ. ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ ID NO: 9 (PEKP) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  6. 6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el tetrapéptido está amidado en el extremo carboxi.
  7. 7. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, en la que el tetrapéptido está presente en una concentración eficaz que varía de aproximadamente 0,01 gg/ml a aproximadamente 100 gg/ml y, más preferentemente, varía de aproximadamente 0,1 gg/ml a aproximadamente 1 gg/ml.
  8. 8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la composición está en forma de un aerosol, una emulsión, un líquido, una loción, una crema, una pasta, una pomada o una espuma.
  9. 9. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para su uso en un tratamiento de cuidado de la piel
  10. 10. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que dicho uso comprende el tratamiento de la piel dañada y dicha piel dañada es resultado de envejecimiento, enfermedad, lesión, traumatismo o cirugía.
  11. 11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicho cuidado de la piel aborda la formación de arrugas, la tonificación, la firmeza y la flacidez de la piel.
  12. 12. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en la que el tetrapéptido estimula la producción de colágeno cuando se aplica a la piel.
  13. 13. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicho uso comprende la administración de la composición a la herida de un animal.
  14. 14. Un método in vitro para estimular la producción de colágeno por una célula, comprendiendo el método exponer una célula a un tetrapéptido que comprende la SEQ. ID NO: 10 (PKGP) o la SEQ iD NO: 9 (PEKP) induciendo de este modo la producción de colágeno por parte de la célula.
  15. 15. El método de la reivindicación 14, en el que la célula es un fibroblasto.
    MGPRLSVWLL LLPAALLLHE EHSRAAAKGG CAGSGCGKCD CHGVKGQKGE RGLFGLQGVI GFPGMQGPEG POGPPGOKGD TGEPGLPGTK GTRGPPGASG YPGNPGLPGI PGODGPPGPP GIPGCMGTKG ERGPLGPPGL PGFAGNPGPP GLPGMKGDPG EILGHVPGML LKGERGFPGI PGTPGPFGLP GLQGPVGPPG FTGFPGPPGP PGPPGEKGOM GLSFQGPKGD KGDOGVSGPP GVPGOAOVOE KGDFATKGEK GQKGEPGFQG MPGVGEKGEP GKPGPRGKPG KDGDKGEKGS PGFPGEPGYP GLIGRQGPQG EKGEAGPPGP PGIVIGTGPL GEKGERGYPG TPGPRGEPGP KGFPGLPGOP GPPGLPVPGQ AGAPGFPGER GEKGDRGFPG TSLPGPSGRD GLPGPPGSPG PBGQPGYTNG IVECQPGPPG DOGPPGIPGO PGFIGSIGEK GQKGESCLXC DIDGYRGPPG PQGPPGEIGF FGOFGAKGDR GX.PGRPGVAG VPGPOGTPGL IGQPGAKGEP GEFYFDLREK GDKGPPGFPG QPGMPGRAGS PGRDGHPGLP GPKGSPGSVG LKGERGPPGG VGFPGSRGDT GPPGPPGYGP AGPIGDKGQA GFPGGPGSPG LPGPKGEPGK IVPLPGPPGA EGLPGSPGFP GPQGDRGFPG TPGRPGX.PGE KGAVGQPGIG FPGPPGPKGV DGLPGDMGPP GTPGRPGFNG LPGNPGVQGQ KGEPGVGLPG LKGLPGLFGI PGTPGEKGSI GVPGVPGEHG AIGPPGLQQI RGEPGPPGLP GSVGSPGVPG XGPPGARGPP GGQGPPGLSG PPGIKGEKGF PGFPGLDMPG PKGDKGAQGL PGITGQSGLP GLFGOOGAPG IPGFPG5KGE MGVMGTPGQF GSPGPVGAPG EPGEKGDHGF PGSSGPRGPP GLKGDKGDVG LPGKPGSMDK VDMGSMKGQK GDQGEKGQIG PIGEKGSRGD PGTPGVPGKD GOAGQPGOPG PKGDPGISGT PGAPGLPGPK GSVGGMGLPG TPGEKGVPGI PGPQGSPGLP GDKGAKGEKG QAGPPGIGIP GLRGEKGDQG IAGFPGSPGE KGEKGSIGIP GMPGSPGLKG SPGSVGYPGS PGLPGEKGDK GEPGLDGIPG VKGEAGLPGT PGPTGPAGQK GEPGSDGIFG SAGEKGBPGI. PGRGFPGFPG AKGDKGSKGE VGFPGLAGSP GXPGSKGEQG FMGPPGPQGQ PGliPGSPGHA TEGPKGDRGP QGQPGLPGLP GPMGPFGLPG IDGVKGDKGFI PGWPGÁPGVP GPKGDPGFQG MPGIGGSPGI TGSKGDMGPP GVPGFQGPKG EFGLQGIKGD QGDQGVPGAK GLPGPPGPPG PYDIIKGEPG LPGPEGPPGL KGLOGLPGPK GOOGVTGLVG IPGPPGIPGF DGAPGQKGEM GPAGPTGPRG FFGPPGPDGL PGSMGPPGTP SVDHGFLVTR HSQTIDDPQC PSGTKILYHG YSLLYVQGNE RAHGQDLGTA GSCLRKFSTM PFLFCNINNV CNFASRNDYS YWLSTPEPMP MSMAPITGEN IRPFISRCAV CEAPAMVMAV MSQTIQIPPC PSGWSSLWIG YSFVMHTSAG AEGSGQALAS PGSCLEEFRS APFIECHGRG TCNYYANAYS FWLATIERSE MFKKPTPSTL KAGELRTHVS RCQVCMRRT
    FIG. 1
    MMSFVQKGSW LLLALLHPTI ILAQQEAVEG GCSHLGQSYA DRDVWKPEPC QICVCDSGSV ECDDIICDDQ ELDCPNPEIP FGECCAVCPQ PPTAPTRPPN GQGPQGPKGD PGPPGIPGRN GDPGIPGQPG SPQSPGPPGI CESCPTGPQN YSPQYDSYDV KSGVAVGGLA GYPGPAGPPG PPGPPGTSGH PGSPGSPGYQ GPPGEPGQAG PSGPPGPPGA IGPSGPAGKD GESGRPGRFG ERGLPGPPGI KGPAGXPGFP GMKGHRGFDG RNGEKGETGA PGLKGENGLP GENGAPGPMG PRGAPGERGR pglpgaagar GNDGARGSDG qpgpfgppgt agfpgspgak GEVGPAGSPG SNGAPGQRGE PGPQGHAGAQ GPPGPPGING SPGGKGEMGP agipgapgeh GARGPPGPAG ANGAPGLRGG AGEPGKNGAK GEPGPRGERG EAGIPGVPGA KGEDGKDGSP GEPGANGLPG AAGERGAPGF RGPAGPNGIP GEKGPAGERG APGPAGPRGA AGEPGRDGVP GGPGMRGMPG SPGGPGSDGK PGPPGSQGES GRPGPPGPSG PRGQPGVMGF PGFKGNDGAP GKNGERGGPG GPGPQGPPGK NGETGPQGPP GPTGPGGDKG DTGPPGPQGL QGLPGTGGPP GENGKPGEPQ PKGDAGAPGA pggkgdagap GERGPPGLAG APGLRGGAGP PGPEGGKGAA GPPGPPGAAG TPGLQGMPGE RGGLGSPGPK GDKGEPGGPG ADGVPGKDGP RGPTGPIGPP GPAGQPGDKG EGGAPGLPGI AGPRGSPGER GETGPPGPAG FPGAPGQNGE PGGKGERGAP GEKGEGGPPG VAGPPGGSGP
    agppgpqgvk gergspggpg aagfpgargl PGPPGSNGNP gppgpsgspg
    KDGPPGPAGN TGAPGSPGVS GPKGDAGQPG EKGSPGAQGP PGAPGPLGIA GITGARGEAG PPGMPGPRGS PGPQGVKGES GKPGANGLSG ERGPPGPQGL PGLAGTAGEP GRDGNPGSDG LPGRDGSPGG KGDRGENGSP GAPGAPGHPG PPGPVQPAGK SGDRGESGPA GPAGAPGPAG SRGAPGPQGP RGDKGETGER GAAGIKGHRG FPGNPGAPGS PGPAGQQGAI GSPGPAGPRG PVGPSGPPGK DGTSGHPGPI GPPGPRGNRG ERGSEGSPGH PGQPGPPGPP GAPGPCCGGV GAAAIAGIGG EKAGGFAPYY GDEPMDFKIN TDEIMTSLKS VNGQIESLIS PDGSRKNPAR NgRDLKFCHP ELKSGEYWVD PNQGCKLDAI KVFCNMETGE TCISANPLNV PRKHWWTDSS AEKKHVWFGE SMDGGFQFSY GNPELPEDVL DVQLAFLRLE SSRASQNXTY HCKN$IAYMD QASGNVKKAL KLMGSNEGEF KAEGNSKFTY TVLEDGCTKH TGEWSKTVFE YRTRKAVRLP IVDIAPYDIG GPDQEFGVDV GPVQFL
    FIG.2
    MGPRLSVWLL LLPAALLLHE EHSRAAAKGG CAGSGCGKCD CHGVKGQKGE RGLPGLQGVI GFPGMQGPEG PQGPPGQKGD TGEPGLPGTK GTRGPPGASG YPGNPGLPGI PGQDGPPGPP GIPGCNGTKG ERGPLGPPGL PGFAGNFGPP GLPGMKGDPG EILGHVPGML LKGERGFPGI PGTPGPPGLP GLQGPVGPPG FTGPPGPPGP PGPPGEKGQM GLSFQGPKGD KGDQGVSGPP GVPGQAQVQE KGDFATKGEK GQKGEPGFQG MPGVGEKGEP GKPGPRGKPG KDGDKGEKGS PGFPGEPGYP GLIGRQGPQG EKGEAGPPGP PGIVIGTGPL GEKGERGYPG TPGPRGEPGP KQFPGLPGQP GPPGLPVPGQ AGAPGFPGER GEKGDRGFPG TSLPGPSGRD GLPGPPGSPG PPGQPGYTNG IVECQPGPPG DQGPPGIPGQ PGFIGEXGEK GQKGESCLIC DIDGYRGPPG PQGPPGEIGF PGQPGAKGDR GLPGRDGVAG VPGPQGTPGL IGQPGAKGEP GEFYFDLRLK GDKGDPGFPG QPGMPGRAGS PGRDGHPGLP GPKGSPGSVG LKGERGPPGG VGFPGSRGDT GPPGPPGYGP AGPIGDKGQA GFPGGPGSPG LPGPKGEPGK IVPLPGPPGA EGLPGSPGFP GPQGDRGFPG TPGRPGLPGE KGAVGQPGIG FPGPPGPKGV DGLPGDMGPP GTPGRPGFNG LPGNPGVQGQ KGEPGVGLPG LKGLPGLPGI PGTPGEKGSI GVPGVPGEHG AIGPPGLQGI RGEPGPPGLP GSVGSPGVPG IGPPGARGPP GGQGPPGLSG PPGIKGEKGF PGFPGLDMPG PKGDKGAQGL PGITGQSGLP GLPGQQGAPG IPGFPGSKGE MGVMGTPGQP GSPGPVGAPG LPGEKGDHGF PGSSGPRGDP GLKGDKGDVG LPGKPGSMDK VDMGSMKGQK GDQGEKGQIG PIGEKGSRGD PGTPGVPGKD GQAGQPGQPG PKGDPGISGT PGAPGLPGPK GSVGGMGLPG TPGEKGVPGI PGPQGSPGLP GDKGAKGEKG QAGPPGIGIP GLRGEKGDQG IAGFPGSPGE KGEKGSIGIP GMPGSPGLKG SPGSVGYPGS PGLPGEKGDK GLPGLDGIPG VKGEAGLPGT PGPTGPAGQK GEPGSDGIPG SAGEKGEPGL PGRGFPGFPG AKGDKGSKGE VGFPGLAGSP GIPGSKGEQG FMGPPGPQGQ PGLPGSPGHA TEGPKGDRGP QGQPGLPGLP GPMGPEGLPG IDGVKGDKGN PGWPGAPGVP GFKGDPGFQG MPGIGGSPGI TGSKGDMGPP GVPGFQGPKG LPGLQGIKGD QGDQGVPGAK GLPGPPGPPG PYDIIKGEPG LPGPEGPPGL KGLQGLPGPK GQQGVTGLVG IPGPPGIPGF DGAPGQKGEM GPAGPTGPRG FPGPPGPDGL PGSMGPPGTP SVDHGFLVTR HSQTIDDPQC PSGTKILYHG YSLLYVQGNE RAHGQDLGTA GSCLRKFSTM PFLFCNINNV CNFASRNDYS YWLSTPEPMP MSMAPITGEN IRPFISRCAV CEAPAMVMAV HSQTIQIPPC PSGWSSLWIG YSFVMHTSAG AEGSGQALAS PGSGLEEFRS APFIECHGRG TCNYYANAYS FWLATIERSE MFKKPTPSTL KAGELRTHVS RCQVCMRRT
    FIG. 3
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