CN117535164A - 一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基及发酵工艺 - Google Patents
一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基及发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基及发酵工艺，属于生物发酵技术领域。本发明替换常用BSM培养中H3PO4、KOH，用更安全的无机盐取代，尽可能减少钾盐用量，用更安全的钠盐替代；采用本发明的培养基，并对种子液的OD值、接种量进行调整，采用优化后的甲醇流加工艺，发酵生产重组胶原蛋白，最终发酵液经钾离子检测仪测定钾离子浓度明显降低，使得产品更安全；本发明的发酵方法提高了蛋白表达量，同时减少了发酵过程中蛋白的降解；诱导周期由最初120h，缩短至52h，降低了发酵能耗成本，降低了发酵过程染菌风险；为企业创造了巨大经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基及发酵工艺，属于生物发酵技术领域。
背景技术
近年来，毕赤酵母大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，如结构相对简单遗传背景清楚、有启动能力强且调控严格的启动子AOX1、不含内毒素和其他有害物质、有真核细胞的翻译后修饰功能、可以实现胞内和胞外分泌表达两种形式、外源基因一般整合到染色体上遗传稳定性高等。但目前培养过程中还存在一些问题，例如生长周期较长、生产效率低、发酵能耗高等缺点。
目前，毕赤酵母高密度发酵普遍使用Invitrogen公司提供的BSM+PTM1的组合培养基，该类培养基需要使用大量的无机盐原料，成本较高，H3PO4和KOH作为强酸和强碱在生产过程中不光对生产人员带来安全隐患，还会腐蚀设备，同时企业需要设置危化品库，大大增加了生产成本。并且，发酵终端产品如果用于医药、医疗器械和化妆品，该培养基大量使用钾盐，而K+在生物制品或生物药中的残留使得使用者会产生刺痛感或过敏反应，引起皮肤瘙痒、红肿、荨麻疹等过敏症状，甚至残留量大的情况下对心脏产生一定影响，同时各原料用量大，培养周期长致使成本很高。公开号CN103923846A公开了一种巴斯德毕赤酵母培养基，虽然该培养基中不含KOH和H3PO4，接种量5％，发酵周期216小时，菌体湿重高达56％，蛋白表达量达16g/L上清，但是仍然使用了大量的钾盐作为替代，并且在终端产品中不可能100％去除，带来安全隐患。同时发酵周期长，能耗高，且菌体湿重过高，蛋白得率低。
微生物生长繁殖一般分四个阶段：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。毕赤酵母发酵过程中，一方面种子液OD值直接影响菌体活力和发酵周期，OD值过低会导致发酵过程迟缓期变长。OD值过高菌体活力不足，凋亡较多，产生大量代谢副产物，影响菌的活力和目的蛋白表达。目前大部分发酵工艺为控制种子液OD介于2-8间，加甘油培养菌体，然后甲醇诱导表达目的蛋白。种子液OD值控制在2-8间，适用于摇瓶发酵，而作为高密度大规模发酵已明显不适用，菌体生长迟缓期拉长，导致发酵周期变长。
另一方面，巴斯德毕赤酵母，是一种兼性厌氧微生物，在有氧条件下将糖类转化成二氧化碳和水，在无氧条件下将糖类转化成酒精和二氧化碳。它是甲醇营养型菌，能够利用甲醇作为唯一碳源和能源。甲醇不仅作用于毕赤酵母的甲醇代谢途径，也会造成甲醇胁迫使细胞甲醇中毒，导致外源蛋白表达量较低。甲醇诱导方式目前分三种：低甲醇浓度-高溶氧、高甲醇浓度-低溶氧、甲醇周期诱导，但是这些诱导方式中也存在一定的弊端，如：低甲醇浓度-高溶氧诱导方式，在诱导期碳源不足，菌体处于半饥饿状态，生长缓慢发酵周期长，毕赤酵母产能得不到较好释放，影响目的蛋白产量；高甲醇浓度-低溶氧诱导方式，在不通纯氧的情况下，溶氧处在较低的水平，而甲醇代谢是一个高耗氧的过程，长期维持此状态会导致细胞内甲醇浓度过高，从而造成细胞甲醇中毒，导致外源蛋白表达量较低；甲醇周期诱导诱导发酵时间长，目的蛋白产量低。
因此解决在高密度菌体发酵的条件下，提高目的产物高效高质表达的同时，降低生产成本，避免生产过程和终端产品潜在的安全问题，可以为企业创造巨大经济价值。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，本发明提供一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基及发酵工艺。
为达到上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基，所述培养基包括如下组分：
NH4H2PO4 11.9～47.6g/L、NaH2PO4 2.515～10.06g/L、CaSO4.2H2O 0.295～1.18g/L、K2SO4 2.275～18.2g/L、MgSO4.7H2O 3.725～14.9g/L、甘油10-40g/L、PTM1溶液0.5-5.0mL/L。
优选地，所述培养基组分包括：NH4H2PO4 47.6g/L、NaH2PO4 2.515g/L、CaSO4.2H2O0.295g/L、K2SO4 2.275g/L、MgSO4.7H2O 3.725g/L、甘油40g/L、PTM1溶液0.45mL/L。
优选的，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母，优选的，所述毕赤酵母包括巴斯德毕赤酵母野生型菌株或经过改造的含有外源基因的重组工程菌株，更优选的，所述巴毕赤酵母为表达天然Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母SMD1168、或毕赤酵母GS115、X33、KM71。
本发明还提供一种重组胶原蛋白生产发酵工艺，包括如下步骤：
毕赤酵母发酵种子液接种到本发明所述的发酵培养基后开始发酵培养，培养至甲醇适应阶段，甘油流加结束后停止补加甘油，待发酵液中甘油消耗完溶氧快速反弹后，开始流加甲醇，0-1h甲醇流加速度3-5mL/h，1-2h甲醇流加速度5-7mL/h，3h时一次性加入5-7mL甲醇后停止补加甲醇；在甲醇诱导阶段，等罐内甲醇消耗完溶氧反弹，开始流加甲醇，前24h控制罐内甲醇浓度0.3-0.6％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间仍控制罐内甲醇浓度0.3-0.6％。
其中，所述的种子液的OD值为2～35，接种量为5～15％。
优选的，所述的种子液OD值为10-35，更优选为25，种子液接种量为15％。
所述发酵培养至甘油培养阶段，待发酵8～11h后，流加50％(W/V)浓度的甘油，使发酵液中菌OD值增长至200～240时甘油流加结束。
所述甲醇适应阶段流加甲醇0-1h甲醇流加速度4mL/h，1-2h甲醇流加速度6mL/h，3h时一次性加入6mL甲醇后停止补加甲醇。
所述甲醇诱导阶段前24h控制罐内甲醇浓度0.5％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间仍控制罐内甲醇浓度0.5％。
所述种子液由巴斯德毕赤酵母野生型菌株或经过改造的含有外源基因的重组工程菌株得到，优选的，由表达天然Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母SMD1168得到、或采用毕赤酵母GS115、X33、KM71等。
优选的，所述发酵培养基灭菌，接种前调节发酵罐内转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水配调节pH，控制发酵pH＝5.0；然后先接入0.9mL PTM1，然后再接种种子液。
本发明的发酵工艺中，甲醇适应阶段加上甲醇诱导阶段共用时长51～53h。并且降低了成本，减少了安全隐患，缩短发酵时间，提高了蛋白的产量和纯度。
本发明的有益效果：
(1)本发明的毕赤酵母发酵培养基中，替换了H3PO4、KOH，用更安全的无机盐取代，减少了生产过程中的安全隐患，且生产车间不需要再设危化品库；极大降低了无机盐用量，减少了原料成本。本发明的发酵培养基尽可能减少钾盐用量，用更安全的钠盐替代，最终发酵液经钾离子检测仪测定钾离子浓度由3300ppm减少至260ppm，使得产品更安全。
(2)本发明的发酵工艺中，将种子液培养至对数期移种，增加了菌的活力，缩短了发酵周期，提高表达量。本发明发酵工艺过程中，提高了接种量，种子液中含有大量胞外水解酶类，有利于基质的利用，并且生产菌在整个发酵罐内迅速占优势，从而减少杂菌生长的机会，缩短了发酵周期。
(3)本发明中，采用优化后的甲醇流加工艺，在甲醇适应阶段缓慢流加甲醇，造成碳源不足，酵母菌处饥饿状态大量消耗在甘油培养阶段累积的代谢副产物使得细胞活力增强。甲醇适应后期一次性补入一定量甲醇，加快细胞内过氧化物酶体生成，使得酵母细胞内快速利用甲醇。在甲醇诱导阶段采用高甲醇浓度诱导24h-停补甲醇1h-甲醇浓度诱导24h诱导方式。采用高甲醇浓度可让毕赤酵母快速生长和表达，中间停补1h既可解除高甲醇浓度带来的甲醇胁迫，又可消耗大量代谢副产物，使得酵母细胞活力增加，表达量提高，发酵周期缩短。
(4)经本发明的整个完整发酵工艺优化后，蛋白表达量由最初8.7g/L提高至23.1g/L。蛋白表达量翻了近2倍。诱导周期由最初120h，缩短至52h，降低了发酵能耗成本，降低了发酵过程染菌风险。为企业创造了巨大经济价值。
附图说明
图1为现有的BSM培养基和本发明的改良BSM培养基发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
图2改良BSM培养基、1/4改良BSM培养基、1/2改良BSM培养基、3/4改良BSM培养基发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
图3为本发明的改良BSM培养基、本发明优选的发酵培养基发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
图4为实施例4中不同种子液OD值条件下发酵生产的胶原蛋白产量的曲线图。
图5为实施例4中不同种子液OD值条件下发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
图6为实施例5中不同种子液接种量条件下发酵生产的胶原蛋白产量的曲线图。
图7为实施例5中不同种子液接种量条件下发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
图8为实施例6中不同培养基不同诱导方法发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
图9为常规培养基+本发明优化方法、本发明发酵培养基+常规方法、本发明发酵培养基+本发明优化方法、常规培养基+常规方法发酵生产的胶原蛋白的电泳图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
本发明中所涉及的各培养基或其他试剂材料等，如无特殊说明均为常规配制或购买得到。
具体实施例中所用菌种为毕赤酵母基因工程菌(专利公开号为CN103102407B，且该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.7189，保藏日期：2013年1月21日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：巴斯德比赤酵母Pichia pastoris)。
PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl220.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存。
种子培养基YPG：酵母粉10g/L；蛋白胨20g/L；甘油10g/L。
实施例1：
用NH4H2PO4、KH2PO4取代85％H3PO4(浓磷酸)、KOH，更改现有BSM培养基配方，使配方中各离子浓度不变。将现有的BSM和改良的BSM培养基进行对比试验。
(1)现有BSM培养基：85％H3PO4 26.7mL/L、CaSO4·2H2O 0.93g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
(2)改良的BSM培养基：NH4H2PO4 47.6g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4·2H2O 1.18g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以现有BSM培养基和改良的BSM培养基分别进行酵母发酵生产胶原蛋白，采用相同的发酵条件、采用常规的发酵工艺进行发酵：
种子液制备：工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，至OD600值为4。
5L罐装液量2L的培养基，接种前调节发酵罐中转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5％(V/V)接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L 50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％(W/V)甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。
经检测，诱导120h后，现有BSM培养基发酵得到的发酵液OD值为312，菌体湿重为360g/L，发酵上清胶原蛋白含量为10.4g/L；本发明改良的BSM培养基发酵得到的发酵液OD值为320，湿重为354g/L，发酵上清胶原蛋白含量为10.9g/L。结果可见，改良BSM培养基与现有的BSM培养基发酵目的蛋白表达量相近，发酵过程中采用本发明改良的BSM培养基可以达到预期效果。
现有的BSM和本发明改良的BSM培养基发酵生产的胶原蛋白的电泳图如图1所示。
实施例2：
基础盐培养基BSM在低pH值条件下处于溶解状态，但在高pH值条件下易产生盐沉淀。高盐还会抑制酵母菌的生长和代谢活动，所以在生产时一般使用低浓度的盐或优化后的培养基(夏姗等，毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展，《生物技术通讯》，2013年，第24卷(第1期)，110)将本发明改良的BSM各组分按比例配成1/4、1/2、3/4、1进行实验。
种子液制备：工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，至OD600值为2-8。
(1)1/4改良BSM培养基：NH4H2PO4 11.9/L、KH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 4.55g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以该培养基发酵生产胶原蛋白：
5L罐装液量2L的改良BSM，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为2～8的种子液按5％(V/V)接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％(W/V)甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为312，湿重为332g/L，发酵上清胶原蛋白含量为8.7g/L。
(2)1/2改良BSM培养基：NH4H2PO4 23.8/L、KH2PO4 5.03g/L、CaSO4·2H2O 0.59g/L、K2SO4 9.1g/L、MgSO4·7H2O 7.45g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以该培养基发酵生产胶原蛋白：
5L罐装液量2L的改良BSM，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为2～8的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为317，湿重为340g/L，发酵上清胶原蛋白含量为9.3g/L。
(3)3/4改良BSM培养基：NH4H2PO4 35.7/L、KH2PO4 7.545g/L、CaSO4·2H2O 0.885g/L、K2SO4 13.65g/L、MgSO4·7H2O 11.175g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以该培养基发酵生产胶原蛋白：
5L罐装液量2L的改良BSM，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为2～8的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为322，湿重为345g/L，发酵上清胶原蛋白含量为10.2g/L。
(4)改良BSM培养基：NH4H2PO4 47.6g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4·2H2O 1.18g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以该培养基发酵生产胶原蛋白：
5L罐装液量2L的改良BSM，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为2～8的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为321，湿重为343g/L，发酵上清胶原蛋白含量为10.7g/L。
4种不同盐浓度的培养基在菌体密度上均无明显差异，但图2中的SDS-PAGE蛋白胶上可以看出改良BSM培养基、1/2改良BSM培养基、3/4改良BSM培养基蛋白表达量相对较多，并且蛋白几乎无降解。
实施例3：
关于毕赤酵母对所表达目标蛋白的降解，有研究认为，其中一个重要原因是氮源的缺乏，氮源在很大程度上作为水解的底物起到了竞争性抑制的作用(孙战胜等，重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制，《北京化工大学学报》，2004年，第31卷(第4期)，9-10)。所以该实施例中将1/4BSM培养基中NH4H2PO4浓度提高至47.6g/L进行实验。
还有研究显示一定量的钠离子不会对酵母细胞生长有影响，钾离子在细胞有氧呼吸中起着巨大作用(孙廷宏等.几种无机离子对啤酒酵母生理代谢的影响及发酵过程的产酸机制[J].大连工业大学学报,2002,21(1):29-32.)。但由于钾离子的存在可能会产生过敏反应，因此本发明中将改良培养基中KH2PO4替换成NaH2PO4，同时减少K2SO4使用量进行实验。
最终形成本发明优选的BSM培养基，也称为发酵培养基，配方为：NH4H2PO4 47.6g/L、NaH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO4 2.275g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。将发酵培养基和改良BSM培养基，在相同发酵条件下进行对比发酵试验。
种子液制备：工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶，220rpm、30℃，培养18-35h，至OD600＝4。
(1)改良BSM培养基：NH4H2PO4 47.6g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4·2H2O 1.18g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以该培养基发酵生产胶原蛋白：
5L罐装液量2L的改良BSM，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为330，湿重为354g/L，发酵上清胶原蛋白含量为11.2g/L，经检测最终发酵液中钾离子浓度为3300ppm。
(2)发酵培养基：NH4H2PO4 47.6g/L、NaH2PO4 2.515g/L、CaSO4·2H2O 0.295g/L、K2SO42.275g/L、MgSO4·7H2O 3.725g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。
以该培养基发酵生产胶原蛋白：
5L罐装液量2L的改良BSM，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导110h后，发酵液OD值为331，湿重为357g/L，发酵上清胶原蛋白含量为14.9g/L，经检测最终发酵液中钾离子浓度为260ppm。
同时，对2种培养基发酵效果对比结果如下表：
表1.改良BSM培养基与发酵培养基发酵效果对比
两种培养基在菌体密度和蛋白表达量上无差异，并且极大减少了最终发酵液中钾离子含量(图3)。
实施例4：
常规的发酵工艺中，种子液OD值一般控制在2～8之间处于对数生长初期，提高种子液OD值可以提高菌种活力，缩短发酵周期。但OD值过高，菌种活力也会下降影响产量。以实施例3中本发明的发酵培养基进行发酵，同时将种子液的OD值调整为5、15、25、35进行试验。
工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，制备得到种子液。
(1)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，再将制备好的OD值为5的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为327，湿重为341g/L，发酵上清胶原蛋白含量为11.1g/L。
(2)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为15的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为337，湿重为357g/L，发酵上清胶原蛋白含量为12.5g/L。
(3)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为340，湿重为360g/L，发酵上清胶原蛋白含量为13.4g/L。
(4)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为35的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为345，湿重为372g/L，发酵上清胶原蛋白含量为12.1g/L。
结果发现，种子液OD值控制在5-35时，均可进行发酵并得到较高蛋白产量，但是优选10-35时，蛋白产量更高；更优的，控制种子液OD值为25时，目的蛋白表达量最高，同时诱导时间可以缩短至104h时达到最大产量，同时增加了产量，缩短了发酵周期(图4、图5所示)。
实施例5：
该实施例中以5％、10％、15％三种接种量，以实施例3中本发明的发酵培养基进行发酵，考察发酵周期及目的蛋白表达量情况。
工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，直至得到OD600＝25的种子液。
(1)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导104h后，发酵液OD值为337，湿重为356g/L，发酵上清胶原蛋白含量为12.7g/L。
(2)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵PH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按10％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导104h后，发酵液OD值为337，湿重为356g/L，发酵上清胶原蛋白含量为13.8g/L。
(3)5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按15％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导104h后，发酵液OD值为341，湿重为370g/L，发酵上清胶原蛋白含量为14.7g/L。
经分析发现，种子液接种量在5-15％均可获得较高产量的目的蛋白，优选的，接种量在10-15％时，产量更高，更优选的，种子液接种量在15％时，诱导88h即可达到最大表达量，同时可以提高目的蛋白表达量，缩短发酵周期(图6、图7所示)。
实施例6：
以实施例3中本发明的发酵培养基、以实施例4-5优化的OD值和接种量进行发酵，按照常规甲醇诱导方法和本发明优化的方法进行对比，考察发酵周期及目的蛋白表达量情况。
(1)采用现有的常规BSM培养基、常规甲醇诱导方法：
5L罐装液量2L的BSM培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按15％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L 50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导104h后，发酵液OD值为334，湿重为357g/L，发酵上清胶原蛋白含量为13.7g/L。
(2)采用本发明优选的发酵培养基、常规甲醇诱导方法：
5L罐装液量2L的发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按15％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L 50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导104h后，发酵液OD值为339，湿重为368g/L，发酵上清胶原蛋白含量为17.5/L。
(3)采用本发明优选的发酵培养基、本发明优选的甲醇诱导方法：
5L罐装液量2L的本发明发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25，种子液按15％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，甲醇适应阶段，溶氧快速反弹，0-1h甲醇流加速度4mL/h，1-2h甲醇流加速度6mL/h，3h时一次性加入6mL甲醇后停止补加甲醇。甲醇诱导阶段：停补甲醇，等罐内甲醇消耗完溶氧反弹，开始流加甲醇，前24h控制罐内甲醇浓度0.5％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间仍控制罐内甲醇浓度0.5％。期间调节转速和压缩空气通量，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。诱导70h，就进入蛋白产量平台期，即可放罐，此时发酵液OD值为361，湿重为402g/L，发酵上清胶原蛋白含量为23.1g/L，显著提高了目的蛋白表达量。
采用常规BSM培养、本发明的发酵培养基，选择常规发酵方法和本发明优化的发酵方法进行胶原蛋白的生产的胶原蛋白电泳图如图8所示。
实施例7：
采用常规培养基本发明优化发酵方法、本发明的培养基常规发酵方法、本发明的培养基本发明优化的发酵方法、常规培养基常规发酵方法进行对比，考察本发明培养基和本发明发酵工艺对蛋白产量和钾离子浓度的影响。种子液的制备同其他实施例。
(1)采用常规培养基、本发明优化发酵方法：
5L罐装液量2L的BSM培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按15％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，甲醇适应阶段，溶氧快速反弹，0-1h甲醇流加速度4mL/h，1-2h甲醇流加速度6mL/h，3h时一次性加入6mL甲醇后停止补加甲醇。甲醇诱导阶段：停补甲醇，等罐内甲醇消耗完溶氧反弹，开始流加甲醇，前24h控制罐内甲醇浓度0.5％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间仍控制罐内甲醇浓度0.5％。期间调节转速和压缩空气通量，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。诱导100h，就进入蛋白产量平台期，即可放罐，此时发酵液OD值为335，湿重为361g/L，发酵上清胶原蛋白含量为14.1g/L，钾离子浓度为3240ppm。
(2)本发明优选的发酵培养基，常规发酵方法：
5L罐装液量2L的本发明发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L 50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导110h后，发酵液OD值为330，湿重为355g/L，发酵上清胶原蛋白含量为15.5g/L，钾离子浓度为250ppm。
(3)本发明优选的发酵培养基，本发明优化的发酵方法：
5L罐装液量2L的本发明发酵培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为25的种子液按15％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，甲醇适应阶段，溶氧快速反弹，0-1h甲醇流加速度4mL/h，1-2h甲醇流加速度6mL/h，3h时一次性加入6mL甲醇后停止补加甲醇。甲醇诱导阶段：停补甲醇，等罐内甲醇消耗完溶氧反弹，开始流加甲醇，前24h控制罐内甲醇浓度0.5％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间仍控制罐内甲醇浓度0.5％。期间调节转速和压缩空气通量，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。诱导70h，就进入蛋白产量平台期，即可放罐，此时发酵液OD值为365，湿重为408g/L，发酵上清胶原蛋白含量为23.5g/L，钾离子浓度为200ppm。
(4)采用常规BSM培养基，常规发酵方法：
5L罐装液量2L的BSM培养基，接种前调节转速300rpm，通气量4L/min(2vvm)，温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH＝5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5％接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70％，开始流加50％甘油(每流加1L 50％甘油，补加6mL的PTM1)至菌体OD值为220，停止补加50％甘油。甘油耗尽后开始流加甲醇(每流加1L甲醇，补加12mL的PTM1)，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20％，每4小时取次样测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。经检测，诱导120h后，发酵液OD值为297，湿重为324g/L，发酵上清胶原蛋白含量为10.3g/L，钾离子浓度为4050ppm。
表2.本发明优选的培养基和本发明优化方法与现有培养基和现有方法发酵效果对比
经验证，本发明优选的发酵工艺，可极大提高目的蛋白产量。
更优选的，采用本发明的发酵工艺，包括培养基、种子液OD、接种量的优化和甲醇补料方式的优化，是一个完整的重组胶原蛋白生产方法，达到了降低原料成本，缩短发酵时间，提高目的蛋白表达量，减少目的蛋白降解的目的，从而实现降低生产成本的目标。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种适用于重组胶原蛋白生产的毕赤酵母发酵培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：
NH4H2PO4 11.9～47.6g/L、NaH2PO4 2.515～10.06g/L、CaSO4.2H2O 0.295～1.18g/L、K2SO4 2.275～18.2g/L、MgSO4.7H2O 3.725～14.9g/L、甘油10～40g/L、PTM1溶液0.5～5.0mL/L。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述培养基组分包括：
NH4H2PO4 47.6g/L、NaH2PO4 2.515g/L、CaSO4.2H2O 0.295g/L、K2SO4 2.275g/L、MgSO4.7H2O 3.725g/L、甘油40g/L、PTM1溶液0.45mL/L。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母。
4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，所述毕赤酵母包括巴斯德毕赤酵母野生型菌株或经过改造的含有外源基因的重组工程菌株。
5.根据权利要求3或4所述的发酵培养基，其特征在于，所述巴毕赤酵母为表达天然Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母SMD1168、或毕赤酵母GS115、X33、KM71。
6.一种重组胶原蛋白生产发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：
毕赤酵母发酵种子液接种到权利要求1-5任一项所述的发酵培养基后开始发酵培养，培养至甲醇适应阶段，甘油流加结束后停止补加甘油，待发酵液中甘油消耗完溶氧快速反弹后，开始流加甲醇，0-1h甲醇流加速度3-5mL/h，1-2h甲醇流加速度5-7mL/h，3h时一次性加入5-7mL甲醇后停止补加甲醇；在甲醇诱导阶段，等罐内甲醇消耗完溶氧反弹，开始流加甲醇，前24h控制罐内甲醇浓度0.3-0.6％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间仍控制罐内甲醇浓度0.3-0.6％。
7.根据权利要求6所述的发酵工艺，其特征在于，所述种子液OD值为2～35，接种量为5～15％。
8.根据权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，所述种子液OD值为10-35，接种量为10-15％；优选的，所述种子液OD值为25，接种量为15％。
9.根据权利要求6所述的发酵工艺，其特征在于，所述
在甲醇适应阶段，在0-1h甲醇流加速度4mL/h，1-2h甲醇流加速度6mL/h，3h时一次性加入6mL甲醇后停止补加甲醇。
10.根据权利要求6所述的发酵工艺，其特征在于，所述在甲醇诱导阶段，前24h控制罐内甲醇浓度0.5％，然后停补甲醇饥饿1h，后继续流加甲醇24h，期间控制罐内甲醇浓度0.5％。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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