CN117264859A - 一种原核表达系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原核表达系统及其制备方法和应用。所述原核表达系统包括表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1以及密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的原核细胞。本发明在原核表达体系中共表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1，P4HB和P4HA1针对重组胶原蛋白，能够对胶原蛋白中的脯氨酸进行羟基化修饰，即能够使原核细胞具备对氨基酸链上的脯氨酸进行翻译后羟基化修饰的能力，表达出更准确的重组胶原蛋白；共表达7种稀有密码子，使原核细胞获得翻译这些密码子对应氨基酸的能力，提高蛋白的表达量，具备广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种原核表达系统及其制备方法和应用。
背景技术
生物体内的许多蛋白质的含量都非常少，为了获得大量的目标蛋白，人们通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到某个宿主细胞，使其大量表达。这种将克隆化基因插入合适载体后导入宿主细胞用于表达大量蛋白质的方法一般称为蛋白质表达技术。蛋白质表达技术在蛋白质纯化、定位，蛋白质的结构域分析及蛋白质的体外功能分析等方面都有应用。
按照宿主细胞来划分，蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。原核表达系统包括大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等。真核表达系统有酵母菌表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物细胞表达系统。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、更易于生长和控制、实验技术相对简单、成本廉价、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择等优点。例如CN112029788A公开一种利用原核表达系统表达纯化多肽的方法，所述方法为：将多肽单元的C端加上肠激酶酶切位点，N端加上组氨酸标签，获得重组多肽单元；然后从N端到C端依次将若干个重组多肽单元串联，获得重组蛋白的氨基酸序列；将重组蛋白的编码基因导入大肠杆菌，构建重组大肠杆菌；重组大肠杆菌诱导表达后，湿菌体用缓冲液重悬破碎后，提取重组蛋白；重组蛋白采用肠激酶处理后，获得多个多肽单元。
但原核表达系统缺乏蛋白修饰功能，表达出来的蛋白没有经过修饰，不一定具有天然的活性，不适于生产真核外源蛋白，此外，如大肠杆菌中，缺少7种真核表达蛋白具有的稀有密码子对应的转运RNA，如果目标蛋白中大量存在由这些密码子翻译的氨基酸，则难以表达出全长蛋白，或表达量很低。
综上所述，开发具备一定蛋白修饰功能、且能高效表达多种蛋白的原核表达系统具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种原核表达系统及其制备方法和应用，本发明对原核系统进行遗传改造，显著增强其蛋白修饰功能，拓展其可表达蛋白的种类，并提高表达量。
与现有技术相比，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种原核表达系统，所述原核表达系统包括表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1以及密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的原核细胞。
本发明对原核系统进行遗传改造，通过在原核表达体系中共表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1的方式，P4HB和P4HA1针对重组胶原蛋白，能够对胶原蛋白中的脯氨酸进行羟基化修饰，即能够使原核细胞具备对氨基酸链上的脯氨酸进行翻译后羟基化修饰的能力，表达出更准确的重组胶原蛋白；通过在原核表达体系中共表达7种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG)的方式，使原核细胞获得翻译这些密码子对应氨基酸的能力，提高蛋白的表达量，具备广阔的应用前景。
可以理解，本领域通用的用于蛋白表达的原核细胞均适用于本发明。
可选地，所述原核细胞包括大肠杆菌，所述大肠杆菌可选自等，不作特殊限制。
可以理解，本领域公知的脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1，以及密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA均适用于本发明的原核表达系统，不作特殊限制。
优选地，所述P4HB的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
优选地，所述P4HA1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地，所述密码子AUA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地，所述密码子AGG的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列。
优选地，所述密码子AGA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列。
优选地，所述密码子CUA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
优选地，所述密码子CCC的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。
优选地，所述密码子GGA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
优选地，所述密码子CGG的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
SEQ ID NO.1：
VAKGFKGKALVVNVPHTEDRVLEFFGITKASLPAIVLVDMSGGSSMKKYPYDGASDDAAAITAHVSGVFEGKVKATLKSEEPSPADTAGDVVVLKGKSFNELVMDNEKDVLVEFYAPWCGHCKKLAPVYDELGAMYKDNENIVIAKMDSTANEIDVPGVDVKGFPTLYFFPGKDKKAVKYEGGREVEDFVDYLKKNAHNDAKHTEL。
SEQ ID NO.2：
MPFLIWLDDLEVSYMTGEDYMWATADWLDPQASMLATAADEQHMPSKEYNYRVAMEEPDIPQGFRFVGPTRAEAEAALPPQGQSPSTTFQARRFDEELQAYLEDNRVCNSSTCRTTPSAAGHKVGTLLRQHRGRNCSKARPRQSKLALHEAAEEICPEDN STQAKQPVAL LDLVEGALRQ。
SEQ ID NO.3：
gcatccatggctgaatggttaaagcgcccaactcataattggcgaattcgtaggttcaattcctactggatgca。
SEQ ID NO.4：
ttcttattagtttaatggtagaacaagatattcctaatatcctaatctaagttcgagtcttaggtaagaaa。
SEQ ID NO.5：
gcgtccatcgtctaatggataggacaggggtcttctaaacctccggtataggttcaaatcctattggacgta。
SEQ ID NO.6：
gccgccatggtgaaattggtagacacgctgctcttaggaagcagtgctagggcatctcggttcgaatccgagtggcggca。
SEQ ID NO.7：
cggagcatggcgcagcttggtagcgtgccatcttggggtgatggaggtcgcaggttcaaatcctgctgctccga。
SEQ ID NO.8：
tgctcttctagtatattaattacaattgacttccaatctctaaaatctggtgtaactccagagatgagcaa。
SEQ ID NO.9：
gggttggtagctcagtggatcagagaccatggtcccggaccatgaagtcaagggttcgaatccctcctagccca。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的原核表达系统的制备方法，所述制备方法包括：
分别将脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1的编码序列以及密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的编码序列插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入原核细胞，得到所述原核表达系统。
优选地，所述P4HB的编码序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
优选地，所述P4HA1的编码序列包括SEQ ID NO.11所示的序列。
SEQ ID NO.10：
gtggcgaaaggctttaaaggcaaagcgctggtggtgaacgtgccgcataccgaagatcgcgtgctggaattttttggcattaccaaagcgagcctgccggcgattgtgctggtggatatgagcggcggcagcagcatgaaaaaatatccgtatgatggcgcgagcgatgatgcggcggcgattaccgcgcatgtgagcggcgtgtttgaaggcaaagtgaaagcgaccctgaaaagcgaagaaccgagcccggcggataccgcgggcgatgtggtggtgctgaaaggcaaaagctttaacgaactggtgatggataacgaaaaagatgtgctggtggaattttatgcgccgtggtgcggccattgcaaaaaactggcgccggtgtatgatgaactgggcgcgatgtataaagataacgaaaacattgtgattgcgaaaatggatagcaccgcgaacgaaattgatgtgccgggcgtggatgtgaaaggctttccgaccctgtatttttttccgggcaaagataaaaaagcggtgaaatatgaaggcggccgcgaagtggaagattttgtggattatctgaaaaaaaacgcgcataacgatgcgaaacataccgaactg。
SEQ ID NO.11：
atgccgtttctgatttggctggatgatctggaagtgagctatatgaccggcgaagattatatgtgggcgaccgcggattggctggatccgcaggcgagcatgctggcgaccgcggcggatgaacagcatatgccgagcaaagaatataactatcgcgtggcgatggaagaaccggatattccgcagggctttcgctttgtgggcccgacccgcgcggaagcggaagcggcgctgccgccgcagggccagagcccgagcaccacctttcaggcgcgccgctttgatgaagaactgcaggcgtatctggaagataaccgcgtgtgcaacagcagcacctgccgcaccaccccgagcgcggcgggccataaagtgggcaccctgctgcgccagcatcgcggccgcaactgcagcaaagcgcgcccgcgccagagcaaactggcgctgcatgaagcggcggaagaaatttgcccggaagataacagcacccaggcgaaacagccggtggcgctgctggatctggtggaaggcgcgctgcgccag。
优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌。
第三方面，本发明提供第一方面所述的原核表达系统在生产蛋白中的应用。
第四方面，本发明提供一种生产蛋白的方法，所述方法包括：
将目标蛋白的编码序列插入表达载体中，得到重组载体，将所述重组载体导入第一方面所述的原核表达系统中，进行培养以及纯化处理，得到所述目标蛋白。
可选地，所述目标蛋白包括胶原蛋白。
可选地，所述胶原蛋白的核苷酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
SEQ ID NO.12：
gggcctcaaggtattgctggacagcgtggtgtggtcggcctgcctggtcagagaggagagagaggcttccctggtcttcctggcccctctggtgaacctggcaaacaaggtccctctggagcaagtggtgaacgtggtccccctggtcccatgggcccccctggattggctggaccccctggtgaatctggacgtgagggggctcctggtgccgaaggttcccctggacgagacggttctcctggcgccaagggtgaccgtggtgagaccggccccgctggaccccctggtgctcctggtgctcctggtgcccctggccccgttggccctgctggcaagagtggtgatcgtggtgagactggtcctgctggtcccgccggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaaggattacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccggtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggccccaggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgctggtactcctggtctgcaaggaatgcctggacctggtccttgctgtggtggttaa。
优选地，分离纯化方法采用盐析、色谱层析、亲和层析、酸碱沉淀、膜分离中的一种或几种的组合。
与现有技术相比
本发明对原核系统进行遗传改造，在原核表达体系中共表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1，P4HB和P4HA1针对重组胶原蛋白，能够对胶原蛋白中的脯氨酸进行羟基化修饰，即能够使原核细胞具备对氨基酸链上的脯氨酸进行翻译后羟基化修饰的能力，表达出更准确的重组胶原蛋白；共表达7种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG)，使原核细胞获得翻译这些密码子对应氨基酸的能力，提高蛋白的表达量，具备广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例4中SDS-PAGE结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明具体实施例中，以生产重组胶原蛋白(核酸序列如SEQ ID NO.12所示)为例，验证本发明原核表达系统。
实施例1
本实施例构建胶原蛋白及P4HB和P4HA1共表达载体。
胶原蛋白(SEQ ID NO.12)及P4HB(SEQ ID NO.10)和P4HA1(SEQ ID NO.11)的编码基因通过全基因合成的方式合成，并依次直接连接在表达载体pET28a的酶切位点NdeⅠ和BamHⅠ之间，得到重组表达载体pET28a-COL-P4HB-P4HA1。
实施例2
本实施例构建密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的表达载体。
AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的核酸序列SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.9通过全基因合成的方式合成，并依次直接连接在表达载体pUC57上，得到重组载体pUC57-tRNA。
重组表达载体pGro7-tRNA的构建，将各tRNA插入到pGro7载体的阿拉伯糖启动子后。
(1)引物设计：根据RF克隆(无限制克隆)的引物设计原则设计整体tRNA片段扩增引物F1和R1。
(2)以合成的含有tRNA基因的质粒(pUC57-tRNA)为模板，用上述扩增引物进行tRNA目的基因的扩增，利用DNA回收纯化试剂盒(TIANGEN)回收PCR产物，即tRNA基因片段(含7个tRNA)。
PCR扩增体系如表1。
表1
| 试剂 | 用量 |
| PrimeSTAR HS(premix) | 25μL |
| F1(10μM) | 1μL |
| R1(10μM) | 1μL |
| pUC57-tRNA | 1μL(约10ng) |
| ddH2O | 22μL |
PCR扩增程序如表2。
表2
(3)RF线性扩增构建载体pGro7-tRNA：以pGro7空质粒(TaKaRa)为模板，上述回收产物为引物进行第二轮PCR线性扩增，PCR体系如表3。
表3
反应程序如表4。
表4
扩增结束后的DNA片段进行DpnⅠ酶切处理，以消化反应体系中少量的模板质粒，酶切体系如表5，条件为：37摄氏度1h，16℃过夜，酶切后的产物直接按氯化钙法转化至大肠杆菌DH5α菌株，挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，并送测序比对结果一致，提取质粒即得重组表达质粒pGro7-tRNA。
表5
| 试剂 | 用量(μL) |
| 10×Buffer | 2 |
| Dpn Ⅰ酶 | 1 |
| DNA | 17 |
实施例3
本实施例构建原核表达系统。
将实施例1和实施例2制备的重组表达质粒pET28a-COL-P4HB-P4HA1和pGro7-tRNA按摩尔比1:1的比例混合，通过氯化钙法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布于含有卡那和氯霉素抗性的LB平板，长出阳性转化子。即为最终的能够表达胶原蛋白的原核表达系统BL21-COL-P4HB-P4HA1-tRNA。
此外，只利用pET28a-COL-P4HB-P4HA1进行转化得到原核表达系统BL21-COL-P4HB-P4HA1，作为后续对照。
实施例4
本实施例利用实施例3所构建的原核表达系统生产重组胶原蛋白。
(1)种子液准备：在超净工作台分别挑取实施例3中转化平板上单菌落接种于10mL的LB液体培养基中(Cm+和Kan+)，于37℃、200rpm恒温摇床培养12h作为种子液。
(2)共表达：将上述种子液按体积比5:100分别转接于2个装液量为200mL培养基/1000mL摇瓶(Cm+和Kan+)，BL21-COL-P4HB-P4HA1-tRNA接种于1号，pET28a-COL-P4HB-P4HA1接种于2号，其中，1号摇瓶在接种前加入终浓度为2mg/mL的阿拉伯糖溶液，诱导tRNA表达，置于37℃、220rpm恒温摇床培养2h后，测定菌液OD600值在0.8时，向1号和2号摇瓶分别加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，诱导胶原蛋白表达，继续培养5h。诱导结束后，测菌液OD600值，于4℃条件下8000rpm离心7min，收集得到菌体。将菌体破碎后上清液跑SDS-PAGE，如图1所示，均在24KDa左右出现条带，且BL21-COL-P4HB-P4HA1-tRNA的条带颜色更深(泳道1)，表明胶原蛋白含量更高，说明本发明共表达7种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG)，使原核细胞获得翻译这些密码子对应氨基酸的能力，提高蛋白的表达量。
按10OD/mL的比例加入PBS缓冲液对菌体完全悬浮，彻底悬浮后的菌体置于高压破碎仪下破碎细胞；破碎完毕后，经4℃、8000rpm离心45min获得破碎后的上清和沉淀；收集上清样品，即为粗蛋白表达液，上清样品经0.22μm滤膜过滤得柱前样品。
取30mL粗蛋白表达液调pH至6.0，以GE公司capto S1mL预装柱为纯化介质，进行粗纯化，粗纯化的样品在经分子筛分离。对纯化后的胶原进行氨基酸组成分析，利用BCA法，采用蛋白浓度测定试剂盒(Thermo Fisher)测定超滤浓缩后蛋白质浓度，取10mg蛋白样品，加入5mL浓度为6M的盐酸于水解管中，抽真空并充入氮气，置于110℃烘箱水解24h，水解后待水解管冷却至25摄氏度，用ddH2O定容至25mL，取2mL氮吹干燥(加入少量ddH2O重复干燥2次)，最后加入1mL pH 2.2、0.02M的盐酸缓冲液重悬，0.45μm滤膜过滤，采用日立L8900氨基酸自动分析仪(日立有限公司，日本)检测。结果显示该重组胶原中含有羟脯氨酸，表明本发明通过共表达胶原蛋白基因及脯氨酸羟化酶基因，成功的实现了重组胶原的羟化。
综上所述，本发明对原核系统进行遗传改造，在原核表达体系中共表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1，P4HB和P4HA1针对重组胶原蛋白，能够对胶原蛋白中的脯氨酸进行羟基化修饰，即能够使原核细胞具备对氨基酸链上的脯氨酸进行翻译后羟基化修饰的能力，表达出更准确的重组胶原蛋白；共表达7种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG)，使原核细胞获得翻译这些密码子对应氨基酸的能力，提高蛋白的表达量，具备广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种原核表达系统，其特征在于，所述原核表达系统包括表达脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1以及密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的原核细胞。
2.根据权利要求1所述的原核表达系统，其特征在于，所述原核细胞包括大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的原核表达系统，其特征在于，所述P4HB的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
优选地，所述P4HA1的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的原核表达系统，其特征在于，所述密码子AUA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；
优选地，所述密码子AGG的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；
优选地，所述密码子AGA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列；
优选地，所述密码子CUA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；
优选地，所述密码子CCC的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列；
优选地，所述密码子GGA的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列；
优选地，所述密码子CGG的转运RNA的核酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
5.一种权利要求1-4任一项所述的原核表达系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
分别将脯氨酰羟化酶功能性亚基P4HB和P4HA1的编码序列以及密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA和CGG的转运RNA的编码序列插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入原核细胞，得到所述原核表达系统。
6.根据权利要求5所述的原核表达系统的制备方法，其特征在于，所述P4HB的编码序列包括SEQ ID NO.10所示的序列；
优选地，所述P4HA1的编码序列包括SEQ ID NO.11所示的序列。
7.根据权利要求5或6所述的原核表达系统的制备方法，其特征在于，所述原核细胞包括大肠杆菌。
8.权利要求1-4任一项所述的原核表达系统在生产蛋白中的应用。
9.一种生产蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
将目标蛋白的编码序列插入表达载体中，得到重组载体，将所述重组载体导入权利要求1-4任一项所述的原核表达系统中，进行培养以及纯化处理，得到所述目标蛋白。
10.根据权利要求9所述的生产蛋白的方法，其特征在于，所述目标蛋白包括胶原蛋白；
优选地，所述胶原蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.12所示的序列。
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