CN107475214B

CN107475214B - 一种7-o-糖基转移酶及其编码基因和应用

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Publication number: CN107475214B
Application number: CN201710693708.3A
Authority: CN
Inventors: 王瑛; 杨小满; 陈建军; 曾少华
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2037-08-14
Also published as: CN107475214A

Abstract

本发明公开了一种7‑O‑糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明的7‑O‑糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因7‑O‑糖基转移酶基因EsGT1，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明克隆的7‑O‑糖基转移酶是在淫羊藿苷合成过程中的最后一步的酶，这对于解析淫羊藿苷的合成途径具有重要意义。7‑O‑糖基转移酶能够特异性地催化类黄酮物质(kaempferol)的7‑O‑糖基化反应。

Description

一种7-O-糖基转移酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种7-O-糖基转移酶及其编码基因和应用。

背景技术：

淫羊藿是小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)的多年生草本植物。在中国的药用历史上，淫羊藿属植物的使用非常悠久，2000多年前的《神农本草经》已有记载。在传统中药中，淫羊藿属植物一直以补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效而被使用。以传统药用植物广泛使用为基础，随着对淫羊藿属植物的形态分类、地理分布、质量评价、化学成分及药理作用的研究，淫羊藿属植物表现出了巨大的开发潜力，受到了国内外学者越来越多的重视，也是国际上多年来重点研究的药用植物之一。

《中国药典》中，淫羊藿苷(icariin)的含量是评价淫羊藿药材的主要指标。在主要药用淫羊藿物种中，淫羊藿苷均是黄酮类物质的主要成分(李作洲，徐艳琴，王瑛，黄宏文。淫羊藿属药用植物的研究现状与展望。中草药，2005，36：289-295)。文献研究表明，淫羊藿苷具有多种不同的生物活性，包括骨保护作用、壮阳功能、神经保护作用、心血管保护作用、抗癌活性、抗炎保护作用、免疫保护作用等(Li H,Li Q,Mei Q,Lu T.Pharmacologicaleffects and pharmacokinetic properties of icariin,the major bioactivecomponent in Herba Epimedii.Life Sciences 2015；126:57-68)。对其药理研究发现，其抗癌作用通过多种机制产生，例如细胞凋亡、细胞周期调节、抑制癌细胞发育过程中的血管生成、抑制癌细胞转移及免疫调节等(Tan H-L,Chan K-G,Pusparajah P,Saokaew S,Duangjai A,Lee L-H,Goh B-H.Anti-Cancer properties of the naturally occurringaphrodisiacs:icariin and its derivatives.Frontiers in Pharmacology 2016；7:191)。另外一篇体外单细胞研究发现，淫羊藿苷促进人类神经干细胞的增殖及调节相关基因的表达从而发挥其神经保护作用(Yang P,Guan Y-Q,Li Y-L,Zhang L,Zhang L,LiL.Icariin promotes cell proliferation and regulates gene expression in humanneural stem cells in vitro.Molecular Medicine Reports 2016；5377:1316-1322)。全面的活性研究及不断被解释的药理表明淫羊藿苷在药用或者保健品等行业具有非常大的潜力。

在拟南芥、金鱼草、玉米、矮牵牛、苹果和葡萄等植物中，参与合成类黄酮代谢途径中的结构基因已经得到了分离与功能鉴定(Holton T,Cornish E.Genetics andbiochemistry of anthocyanin biosynthesis.The Plant Cell 1995；7:1071；Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynthesis.A colorful model for genetics,biochemistry,cell biology,and biotechnology.Plant physiology 2001；126:485；Koes R,Quattrocchio F,Mol J.The flavonoid biosynthetic pathway in plants:functionand evolution.BioEssays 2005；16:123)。近十几年来，科学家通过整合不同来源的类黄酮物质代谢途径中的基因在大肠杆菌或者酵母细胞工厂中进行类黄酮物质的合成已经有了很好的应用例子(Putignani L,Massa O,Alisi A.Engineered Escherichia coli asnew source of flavonoids and terpenoids.Food Research International 2013；54:1084-1095；Chemler JA,Yan Y,Koffas MAG.Biosynthesis of isoprenoids,polyunsaturated fatty acids and flavonoids in Saccharomycescerevisiae.Microbial Cell Factories 2006；5:20)，这种利用外源宿主，特别是微生物宿主的生物合成方法将是未来解决天然产物提取产率低、纯度低及化学合成操作繁琐、污染大等问题的一个很好的方案。但是这种方法的前提是想要得到目标物质，必须对目标物质合成的酶有一个系统和充分的了解，并且能够克隆得到编码对应酶的基因，才能整合至前体化合物合成代谢途径中，从而对前体化合物进行一系列的修饰后最终得到目标物质。淫羊藿苷以类黄酮结构为母体，所以具有很大前景的生物合成工业价值。而淫羊藿属植物并非为模式植物的一种，所以有关分子生物学、遗传学的研究相对比较滞后，淫羊藿苷在植物体内是如何形成，即其代谢途径中参与作用的酶、编码酶蛋白的基因及前体化合物的结构修饰等方面缺少全面体系的研究，充分鉴定并且了解相关的知识，对淫羊藿苷的高效高产运用具有非常重要的作用。

淫羊藿苷是在3位和7位具有两个糖基化位点的异戊烯基类黄酮化合物。依其被修饰的结构来看，无论是被糖基化、甲基化还是异戊烯基化，在生物体内可能都有一个固定的流程，在这些修饰中，糖基化通常存在于生物合成的最后一步，对于在细胞内稳定分子结构及后续的运输及存储提供了必要条件(Vogt T,Jones P.Glycosyltransferases in plantnatural product synthesis:characterization of a supergene family.Trends inPlant Science 2000；5(9):380-386)。整个代谢途径比较复杂，需要鉴定的基因及其功能比较多。因此，从最后一步着手，以产物为源头，鉴定最后一步的酶，会更加高效，对于整个途径的精确解析具有重要意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种7-O-糖基转移酶，其能在合成淫羊藿苷的最后一步糖基化中起作用，从而为鉴定淫羊藿苷的其他修饰奠定基础。

本发明的7-O-糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述7-O-糖基转移酶的编码基因。

所述的编码基因优选为7-O-糖基转移酶基因EsGT1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供上述7-O-糖基转移酶在淫羊藿苷合成中的应用。

优选，7-O-糖基转移酶以UDP-glucose为底物催化icariside II生成淫羊藿苷中的应用

本发明的第四个目的是提供7-O-糖基转移酶在类黄酮物质7-O位糖基化修饰中的应用。

优选7-O-糖基转移酶以UDP-glucose为底物在催化kaempferol生成kaempferol-7-O-glucoside中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实施：

在箭叶淫羊藿不同发育时期(S1-S5，5个时期的定义如图1所示)，从转录组数据中通过PSPG保守结构域预测并获得糖基转移酶候选基因，根据FKPM预测值，从候选基因中选择7个基因，分别命名为EsGT1至EsGT7，设计特异引物，进行RT-PCR(Quantity ReverseTranscript Polymerase chain reaction)实验分析(图2)，在GD箭叶淫羊藿不同发育时期进行表达量验证，EsGT1基因表达模式与淫羊藿苷及淫羊藿苷下游产物朝藿定C含量(图3)趋势最为一致。据此拟选择EsGT1为主要候选基因。将EsGT1基因与其他物种中已知功能的糖基转移酶基因聚类构建NJ数(图4)，预测其功能为3-O-糖基化或者7-O-糖基化。在EsGT1编码区设计引物，以箭叶淫羊藿叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板，经过PCR获得了7-O-糖基转移酶基因EsGT1的全长序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，其全长为1446bps，编码的蛋白质-7-O-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。随后，用pCold TF载体构建原核表达载体pCold TF-EsGT1，转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达，并对表达的产物7-O-糖基转移酶用SDS-PAGE的方法进行检测，结果表明，7-O-糖基转移酶基因EsGT1在大肠杆菌中成功获得正确的可溶蛋白(图5)，随后用镍亲和层析的方法对表达出来的重组蛋白进行纯化，纯化结果也经过SDS-PAGE检测(图6)。

然后，预测淫羊藿苷代谢的可能途径(图7)，并以途径中的化合物作为底物对该7-O-糖基转移酶进行酶活反应测试，酶活反应以50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液作为反应体系，分别以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose，Sigma公司)和尿苷二磷酸鼠李糖(UDP-rhamnose，该底物由中科院上海生命科学院植物生理生态研究所周志华研究员提供)作为糖基供体进行，反应完后用HPLC检测是否有产物生成。结果表明以icariin，icaritin和icariside I作为糖基受体，分别以UDP-glucose和UDP-rhamnose为糖基供体的反应均没有产物生成，只有以icariside II作为糖基受体，以UDP-glucose作为糖基供体时才有产物生成(结果如表1)。反应体系再经过LC-MS(图8、图9)、结合标准品可以确定产物是在icariside II的7位上加了一个葡萄糖基从而形成产物icariin。此结果说明，该7-O-糖基转移酶在淫羊藿苷的合成过程中，作用于最后一步的糖基化修饰，使icariside II在7位被糖基化后最终形成淫羊藿苷。以上结论也阐明了淫羊藿苷最后一步的形成过程。

纯化后的7-O-糖基转移酶以kaempferol作为糖基受体底物，以UDP-glucose作为糖基供体，发现该酶对kaempferol能够糖基化(图10、图11)。而以山奈酚-3-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-glucoside)及山奈酚-7-葡萄糖苷(kaempferol-7-O-glucoside)作为底物测试后发现均没有产物可被检测到，说明该酶还具有位点特异性，能够特异地催化7-O的糖基化反应，且类黄酮底物选择性较高，虽然kaempferol-3-O-glucoside也有7-位的-OH，但并不能作为其底物，同时也说明其不具备糖基延伸的功能。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明在确定候选基因的过程中发现，基因表达的产物(RNA)在不同发育时期与目标天然产物及其下游的产物的累积有一定的相关趋势。

2、本发明克隆的7-O-糖基转移酶是在淫羊藿苷合成过程中的最后一步的酶，这对于解析淫羊藿苷的合成途径具有重要意义。

3、本发明的7-O-糖基转移酶能够特异性地催化类黄酮物质(kaempferol)的7-O-糖基化反应。

附图说明：

图1.为箭叶淫羊藿叶片在不同发育时期的示意图。

其中5个不同发育时期的定义为：S1是萌发期；S2是幼叶展开期；S3是盛花期；S4是开花末期；S5是革质化期(果实成熟期)。

图2.为GD箭叶淫羊藿7个候选7-O-糖基转移酶基因相对表达量示意图。

其中横坐标为淫羊藿不同发育时期S1-S5，纵坐标为候选基因在不同发育时期的相对于S1时期的表达量。

图3.为不同发育时期箭叶淫羊藿叶片中淫羊藿苷及下游产物朝藿定C含量趋势图。

其中左图A为GD箭叶淫羊藿，B为GX箭叶淫羊藿；横坐标为淫羊藿不同发育时期S1-S5，纵坐标为淫羊藿苷或者朝藿定C在不同发育时期的含量。

图4.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1的系统发育树分析示意图。

其中实心圆圈代表的糖基转移酶能够将类黄酮作为底物并且将类黄酮物质的3-O位进行糖基化的，简称为3GT；空心圆圈代表的糖基转移酶基因能够将3-O糖基化后的产物作为底物，在糖基上再进行一次糖基化，简称为3GGT；实心菱形代表的糖基转移酶能够将类黄酮作为底物并且将类黄酮物质的7-O位进行糖基化，简称为7GT；空心菱形代表的糖基转移酶能够将7-O糖基化后的产物作为底物，在糖基上再进行一次糖基化，简称为7GGT。

图5.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1外源表达SDS-PAGE示意图。

其中第一条泳道为蛋白marker，第二条泳道为用空载体转化后作为对照的可溶性总蛋白，第三条泳道为含有7-O-糖基转移酶基因EsGT1的载体表达出来的可溶性总蛋白，线框箭头所示为目标蛋白加上载体上标签后的条带位置。

图6.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的目标蛋白纯化SDS-PAGE示意图。

其中第一条泳道为蛋白marker，第二条泳道为菌体提取可溶性总蛋白，第三条泳道为纯化过柱子后的流穿液，第四条泳道为用20mM咪唑溶液洗涤柱子，除去大部分非目标蛋白质及一部分目标蛋白，第五条泳道为250mM咪唑洗脱后的蛋白质溶液，即纯化后的蛋白溶液。

图7.为淫羊藿苷代谢可能途径示意图。

其中淫羊藿苷可能合成途径为1(虚线箭头所示)：淫羊藿素先经过7-O葡萄糖基化合成icariside I，再经过3-O鼠李糖基化后形成淫羊藿苷；或者为途径2(虚线箭头所示)：淫羊藿素先经过3-O鼠李糖基化后，再经过7-O葡萄糖基化后形成淫羊藿苷。验证EsGT1的酶活通过图示4种底物，分别以UDP-glucose和UDP-rhamnose为糖基供体进行。

图8.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的目标蛋白(7-O-糖基转移酶)在淫羊藿苷糖基化作用中酶活反应体系的HPLC示意图。

其中，icariside II为底物icariside II标准品；icariin为icariin标准品；EsGT1-Icariside II+UDP-G为icariside II和UDP-glucose在7-O-糖基转移酶催化下的反应体系；EV-Icariside II+UDP-G为负对照，即空载体表达的可溶蛋白的反应体系。

图9.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的目标蛋白在淫羊藿苷糖基化作用中酶活反应体系的质谱示意图。

正离子模式下的质谱图，其中A为icariside II的标准品，515.2072是[M+H]⁺,369.1466是[M-Rha+H]⁺(其中Rha为鼠李糖基rhamnoside，下同)；B为icariin标准品，677.2618是[M+H]⁺,531.2011是[M-Rha+H]⁺；C为7-O-糖基转移酶催化后的产物，677.2625是[M+H]⁺,531.2019是[M-Rha+H]⁺；产物的质谱与icariin标准品的质谱一致，说明7-O-糖基转移酶催化icariside II与UDP-glucosde的产物为icariin。

图10.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的目标蛋白7-O-糖基转移酶在类黄酮(kaempferol)糖基化作用中酶活反应体系的HPLC示意图。

其中，kaempferol为底物kaempferol标准品；kaempferol-7-O-glucoside为kaempferol-7-O-glucoside标准品；kaempferol-7-O-glucoside为kaempferol和UDP-glucose在EsGT1(7-O-糖基转移酶)催化下的反应体系；蓝色虚线框内为kaempferol-7-O-glucoside的光谱图。

图11.为一种7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的目标蛋白7-O-糖基转移酶在类黄酮(kaempferol)糖基化作用中酶活反应体系的质谱示意图。

正离子模式下的质谱图，其中A为底物kaempferol标准品，287.0640是[M+H]⁺,309.0458是[M+Na]⁺；B是kaempferol-7-O-glucoside标准品，449.1191是[M+H]⁺,287.0621是[M-Glc+H]⁺(其中Glc为葡萄糖基glucoside，下同)；C是EsGT1(7-O-糖基转移酶)催化后的产物，449.1212是[M+H]⁺,287.0641是[M-Glc+H]⁺。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：PSPG保守结构域预测糖基转移酶基因

通过糖基转移酶蛋白在C端有一段约44个氨基酸的保守序列(PSPG box：PlantSecondary Product Glycosyltransferase)搜索箭叶淫羊藿转录组数据库，得到多个不同的糖基转移酶基因的候选序列。

实施例2：qRTPCR表达量分析候选基因及箭叶淫羊藿叶片中淫羊藿苷含量分析

提取不同发育时期(不同发育时期的定义如图1所示)的淫羊藿叶片总RNA，分别使用Prime Script RT Reagent Kit With gDNA Eraser(Takara公司)进行基因组DNA的消化及反转录。基因组DNA消化的反应体系如下：5X gDNA Eraser Buffer 2.0ul,gDNA Eraser1.0ul,总RNA 1ug,加RNase Free的H₂O至10ul；在42℃条件下反应2min；结束后将体系置于冰上。反转录的反应体系如下：基因组DNA消化的反应体系10ul,5X PrimeScript Buffer 2(for real time)4.0ul,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0ul,RT Primer Mix 1.0ul,RNase Free dH₂O 4.0ul；在37℃反应15分钟后，85℃保持5秒；所得产物即为不同发育时期淫羊藿叶片cDNA，保存于-20℃。

设计不同候选基因qRT-PCR的引物(如表1)，将cDNA原液稀释5-10倍作为扩增模板，以Actin基因作为内参基因(正向引物为：GCCATTCAGGCTGTTCTTTC，反向引物为：GGTAAGATCGCGACCTGCTA)，按照SYBR Premix Ex Taq^TM II(Takara公司)说明配置反应体系：SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2X)10ul,正向引物(10uM)0.8ul,反向引物(10uM)0.8ul,模板2ul,dH₂O 6.4ul；在ABI PRISM 7500定量PCR仪上完成反应。扩增程序为：95℃变性30S，95℃5S、60℃30S、72℃30S、40个循环，反应结束后继续运行溶解曲线程序，以确保目的产物的特异性扩增，重复3次。用2^-ΔΔCT方法(Livak KJ,SchmittgenTD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCRand the 2^-ΔΔC _T method.Methods 2001,25(4):402-408)计算不同候选基因在淫羊藿不同发育时期相对于S1时期的表达量。具体结果如图2所示。

淫羊藿苷的提取方法及含量测定方法：根据已报道的文献(张华峰，高翔，卢大炎，王瑛。HPLC法同时测定淫羊藿中朝藿定A、B、C与淫羊藿苷的含量。分析测试学报，2007，26：198-201)，以50％乙醇溶液为溶剂，在温度50℃及料液比1：60的条件下通过超声提取方式提取淫羊藿苷及朝藿定。经过HPLC分析后用标品标准曲线给淫羊藿苷及朝藿定进行定量。具体结果如图3所示。

从图2和图3可以看出，EsGT1基因表达模式与淫羊藿苷及淫羊藿苷下游产物朝藿定C含量趋势最为一致。据此拟选择EsGT1为主要候选基因。

表1. 7个候选基因QRT-PCR引物序列

基因编号	正向引物	反向引物
			EsGT1	GGTAGAGGTGCTTCATCA	GTGGTGTCAACTTCATCTG
EsGT2	GATGGTGGTTATGCCTTATG	CCTCTTCTCAACTTCAACAG
			EsGT3	TTGATGAACAGTGATGATAGC	AGAGACGAGAAGGAGGAT
EsGT4	AATCAACTTCCAACAATACCAT	AACATCCTAACGGCTGAA
			EsGT5	CGTAGTCTCGGCACCCTCTG	CAATCACTATCCTGACCTCATTCGC
EsGT6	TCGCACATTATATTCCAGCAATCGC	GGGACTAAATGATAGGCAACAGCAG
			EsGT7	CCCAACCAGAATGAAACAATGAACC	GGCTGAGAACGACGATGATTCC

实施例3：EsGT1基因的克隆分离

将EsGT1基因与其他物种中已知功能的糖基转移酶基因聚类构建NJ数(图4)，预测其功能为3-O-糖基化或者7-O-糖基化。在EsGT1编码区设计一对引物(正向引物：GGTACCATGGGTTCCATCAACGAACAAAC；反向引物：CTCGAGTTACTTTCCATTTACTTTTTCCTCCTTTC；下划线为酶切位点，其中正向引物酶切位点为KpnI，反向引物酶切位点为XhoI，为构建表达载体做好准备)，PCR反应体系总体积为50uL，包括反转录得到的cDNA模板2uL，1×Ex Taqbuffer，0.2mM dNTP，1uM引物(正向引物和反向引物各一半)，1U E x Taq DNA polymerase(Takara公司，下同)，加ddH₂O至50uL。反应程序为：94℃变性3min，94℃30sec、46℃45sec、72℃1min、35cycles，72℃延伸8min。PCR产物上样电泳，显示扩增产物仅为一条大小约为1.5kb左右的条带，将其切胶回收，连接至pMD 19-T载体(Takara公司，下同)，转化DH5α感受态菌株，涂加有氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)抗性的LB固体平板(配方如下：称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，12克琼脂溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，121℃，高压消毒20min，分装于培养皿，4℃冷藏备用，下同)，37℃倒置培养12h。挑独立克隆12个，摇菌，用M13引物进行菌液PCR检测(M13.F正向引物：GTAAAACGACGGCCAGT；M13.R反向引物：CAGGAAACAGCTATGAC)。菌液PCR体系(无特殊说明，下同)为20uL，1×Taq buffer,0.2mM dNTP，0.2uM M13引物(正向引物和反向引物各一半)，1U Taq DNA polymerase，加ddH₂O至20uL。其中，用牙签蘸一下菌液作为菌液PCR中的模版。PCR反应程序为95℃5min，95℃30sec、53℃30sec、72℃30sec、32cycles，72℃5min。将3个阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司或者华大武汉分公司测序。保存正确的质粒于-20℃冰箱。

测序结果表明：与转录组数据一致，获得了一种分离的基因，将其命名为7-O-糖基转移酶基因EsGT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过ExPASy网站的翻译工具(http://web.expasy.org/translate/)翻译出核苷酸序列编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，命名为7-O-糖基转移酶。

实施例4：表达载体构建

具体过程如下：将实施例3保存的质粒(含7-O-糖基转移酶基因EsGT1)在两种限制性内切酶反应体系中进行双酶切，反应体系为10xH buffer 5ul，BSA 5uL，KpnI 2ul，XhoI2ul，实施例3保存的质粒30ul，补加灭菌蒸馏水至50ul，混匀后于37℃反应4小时，同时，pCold TF表达载体也进行相同的双酶切反应，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后用核酸回收试剂盒切胶回收。回收之后进行连接反应，反应体系为：酶切回收pCold TF载体5ul，Ligase buffer 1ul，T4 DNA Ligase(Takara公司)1ul，酶切回收带双酶切位点的7-O-糖基转移酶基因EsGT1 3ul，4℃连接过夜。将连接产物转化BL21(DE3)菌株，涂加有氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)抗性的LB固体平板(配方如下：称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，12克琼脂溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。121℃，高压消毒20min，分装于培养皿，4℃冷藏备用，下同)，37℃倒置培养12h。挑独立克隆12个，摇菌，用M13引物进行菌液PCR检测(M13.F正向引物：GTAAAACGACGGCCAGT；M13.R反向引物：CAGGAAACAGCTATGAC)。菌液PCR验证后将3个阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司或者华大武汉分公司测序。保存正确的质粒于-20度冰箱，另外将含正确质粒的菌株在25％甘油中并存于-80度冰箱。测序结果表明，7-O-糖基转移酶基因EsGT1插入了pCold TF表达载体的KpnI和XhoI酶切位点之间。

实施例5：目标蛋白诱导表达及纯化

挑实施例4中测序正确的阳性单克隆接种至3mL LB(含Amp)培养基中，37℃，220rpm培养过夜；吸取2mL菌液转接至200mL LB培养基(含Amp)中,37℃，220rpm培养至菌液OD600为0.6-0.8；在冰水中冷却菌液30分钟后加入IPTG使其终浓度为1mM；16℃，150rpm培养24h；4℃，5000rpm，10min收集菌体，菌体用20ml Lysis buffer(pH8.0,50mM Tris HCl,300mM NaCl)悬浮，加入PMSF至终浓度为1mM。菌悬液使用压榨破碎(Constant CellDisruption Systems)，破碎压力为25KPSI。裂解完成后4℃，12000g，35分钟离心，取上清作为目标蛋白粗酶溶液，总体积为20ml。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测在总蛋白及可溶性蛋白中是否有目标蛋白的存在：总蛋白样品为裂解完成后的菌液，可溶蛋白样品为离心后得到的上清，同时以空载体的总蛋白和可溶蛋白作为对照。蛋白样品取40uL，加10uL 5xLoading buffer，混匀后煮沸5min，12000rpm室温离心10min，取上清5uL上样。SDS-PAGE分离胶为12％，电泳时浓缩胶段电压为120V，分离胶段电压为100V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳并取出凝胶，置于染色液(考马斯亮蓝R250)中，染色2h后脱色，每隔2h更换脱色液，直至背景干净，各蛋白条带清晰。结果如图5所示，从图5可以看出，7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的蛋白7-O-糖基转移酶在大肠杆菌中成功获得正确的可溶蛋白。

表达载体中含有组氨酸标签，并与目标蛋白形成融合表达，于是将目标蛋白(7-O-糖基转移酶)粗酶溶液进行镍填料(Ni-NTA agarose，QIAGEN公司)亲和纯化，所有操作在低温情况下以保持酶活，具体步骤如下：取2mL充分悬浮的Ni-NTA悬液用Lysis buffer平衡20ml后加入到20ml7-O-糖基转移酶蛋白粗酶溶液中，在4℃温度下用旋转振荡器(转速为200rpm)轻轻混匀1小时；将蛋白粗酶溶液与Ni-NTA混合物转移至空的蛋白层析重力柱中，收集流穿液；用20ml Wash buffer洗涤柱子一次，收集部分洗涤液用作SDS-PAGE分析；用4ml Elution buffer洗脱目标蛋白，洗脱液用EP管接收，约0.5ml每管，用Bradford试剂(BioRad公司)检测每管的蛋白质含量，合并能够检测到蛋白质的洗脱液，作后续脱盐及浓缩处理。

脱盐及浓缩：用脱盐缓冲液(pH8.0,50mM Tris-HCl)浸润Millipore超滤管的滤膜，倒掉缓冲液并将超滤管插在冰上预冷；加入合并后的洗脱液，按照超滤管说明书上的指示，4℃条件下，7000g离心力，到总蛋白液浓缩至1ml左右，需要大概30分钟时间；加入4ml脱盐缓冲液，按照上述条件离心；再重复2次，最后一次的浓缩终体积约为500ul，将浓缩后的蛋白(7-O-糖基转移酶)溶液保存于-80℃。

然后对蛋白纯化进行SDS-PAGE检测效果(图6)，步骤如以上检测总蛋白及可溶蛋白中的目标蛋白质，检测样品包括：目标蛋白粗酶液、流穿液、部分洗涤液、浓缩后蛋白溶液(因浓缩后浓度较高，将该酶溶液稀释50倍后再作为SDS-PAGE样品)。

用Bradford试剂(Bio-Rad公司)测定所得浓缩蛋白溶液的浓度：将Bradford试剂从冰箱中拿出平衡到室温，并在使用之前将试剂充分混匀；将标准BSA溶液稀释成2000,1500,1000,750,500,250,125,0ug/ml的梯度溶液，连同浓缩后的蛋白溶液样品，每个浓度3个重复加入至酶标板中，标准BSA梯度溶液及样品溶液体积为5ul，Bradford溶液为250ul，充分混匀，室温放置5min以后，于595nm条件下测量吸光值。计算并绘制出标准曲线并且计算出浓缩后蛋白溶液的最终浓度。

预测淫羊藿苷代谢的可能途径如图7所示。下面通过实施例6和7进行验证

实施例6：以UDP-Glucose和Icariside II作为底物进行酶活测定及产物鉴定

每50ul的反应体系包含：50mM Tris-HCl(pH7.5)，250uM Icariside II，1mM UDP-Glucose，40ug实施例5得到的蛋白酶(7-O-糖基转移酶)。混匀后35℃反应2小时，反应结束后加入50ul甲醇终止反应。反应产物12000rpm离心10min后取上清进行HPLC分析，程序如下：0-2min,15％B；2-16min,15-70％B,16-18min,70％-95％B,18-20min,95％-15％B(其中，A为0.01％乙酸-水，B为乙腈)；流速是0.45ml/min；检测波长为290nm和360nm。同时以预期产物icariin标品跑HPLC进行比较，根据出峰时间及紫外光谱初步预测产物结构。

之后反应体系进行LC-MS检测，LC-MS条件为：Bruker Dltonics Esquire3000plus仪器，正离子模式，N₂温度为350℃，流速是9L/min，喷雾器压力为40psig，离子化电压为3500V，裂解电压为160V，扫描的质量范围为50-1500m/z。LC-MS结果如图8和9所示，通过与icariin标品的质谱结合HPLC结果确定产物为icariin。因此，说明7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的蛋白质7-O-糖基转移酶能够以UDP-glucose为底物对icariside II在7-位C上进行糖基化。

实施例7：以UDP-Glucose和Kaempferol作为底物进行酶活测定及产物鉴定

每50ul的反应体系包含：50mM Tris-HCl(pH7.5)，250uM Kaempferol，1mM UDP-Glucose，40ug实施例5得到的蛋白酶(7-O-糖基转移酶)。混匀后35℃反应2小时，反应结束后加入50ul甲醇终止反应。反应产物12000rpm离心10min后取上清进行HPLC分析，程序如下：0-2min,15％B；2-16min,15-70％B,16-18min,70％-95％B,18-20min,95％-15％B(其中，A为0.01％乙酸-水，B为乙腈)；流速是0.45ml/min；检测波长为290nm和360nm。同时以预期产物icariin-7-O-glucoside标品跑HPLC进行比较，根据出峰时间及紫外光谱初步预测产物结构。

之后反应体系进行LC-MS检测，LC-MS条件为：Bruker Dltonics Esquire3000plus仪器，正离子模式，N₂温度为350℃，流速是9L/min，喷雾器压力为40psig，离子化电压为3500V，裂解电压为160V，扫描的质量范围为50-1500m/z。通过与kaempferol-7-O-glucoside标品的质谱图结合HPLC结果(图10、图11)确定产物为kaempferol-7-O-glucoside。因此，说明7-O-糖基转移酶基因EsGT1编码的蛋白质7-O-糖基转移酶能够在类黄酮物质(如，kaempferol)7-O位糖基化反应的作用。

而以icariin，icaritin和icariside I作为糖基受体，分别以UDP-glucose和UDP-rhamnose为糖基供体的反应均没有产物生成，说明该7-O-糖基转移酶还具有位点特异性，能够特异地催化7-O的糖基化反应，且类黄酮底物选择性较高，虽然kaempferol-3-O-glucoside也有7-位的-OH，但并不能作为其底物；同时也说明其不具备糖基延伸的功能。具体如表1所示。

表2.不同糖基供体及糖基受体反应结果统计(N.D.表示没有检测到产物生成)

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120>一种7-O-糖基转移酶及其编码基因和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213>箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.）

<400> 1

atgggttcca tcaacgaaca aacccgtgaa ggagaacaac aggtgatgag agtgttgatg 60

tttccatggt tggctcatgg gcacatttct ccctttttag agctagccaa gagaatggca 120

cgtagaaaca tctacatata cttctgttcc acccctgtaa acatgccatc cattcagaaa 180

caactactag ttactagtaa tgagcttgat gctgataaag cttcaaactc aatagaacta 240

gtagagattc atctcccaca attgccaaat cttcctcctc gctaccacac cacaaagtca 300

cttccactcc atctcatgtc caccctaaaa acagcccttg atttatatga accaaccttc 360

ttccaactcc tcaaaaccat acggccagat atagttatct acgatttcat ccaaccatgg 420

gcgcctctcg tggcttcttc ccttaacatt ccggccgttg caatgttgat cactggtggg 480

gctacttcat cctactttta ccatatttgc atcaacggta tcaccaaaga gttcccattt 540

tcagctatca aacttcccga acatgaggtc aacaaaacct cccggttgct cagctcatta 600

gcaaatggtc tcacggataa agaccgtgtt gtccagtccg tagaccgctc ttcaaccatt 660

gtcttggcca aaacatttag ggaaatcgaa gcgaagtaca ttgattacta tcatcttctc 720

actgggaagg agttaatcgg tgttggacca cttattcagg aaccaacaaa ggaggatagc 780

cggtccacct ttgtggaatg gctcgataac aaggatactc cagccgtgtt catttcattt 840

gggactgagt actacttgtc taaagaggag atggaagagc tggcttatgg tcttgaactt 900

agtggtgtca acttcatctg ggttcttaaa ttcccagagg aagaaaacat caccagtgtt 960

gatgaagcac ctctaccaaa agggttctta gagagggttg gggagaaagg aatggtggta 1020

gttaacagtt gggctccaca gtcaaaaata ttggcacatc aaaatacggg agcgtttgtg 1080

agtcattgtg gttcgggttc agtgaccgag gcattacggt ttggtgttcc gattatagga 1140

atacccatgc atctagacca gccaatgaat tcaaagatgg tggtggaact tggtgtagct 1200

gctgaggtga agagagatga gaagactgga agatacgaga gagaggaagt tgagaaagtg 1260

attaagaaag tagtgtttga taaagatggg gaacaggtga ggaggaaagc aagagagcta 1320

ggagagaagt tgaggaagaa aggggaagaa gatatagatg ttgtggtgaa gaaactcaag 1380

caagtatgtg ggaagctgga ttgtagtgac atggatggaa aggaggaaaa agtaaatgga 1440

aagtaa 1446

<210>2

<211> 481

<212> PRT

<213>箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.）

<400> 2

Met Gly Ser Ile Asn Glu Gln Thr Arg Glu Gly Glu Gln Gln Val

1 5 10 15

Met Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala His Gly His Ile Ser

20 25 30

Pro Phe Leu Glu Leu Ala Lys Arg Met Ala Arg Arg Asn Ile Tyr

35 40 45

Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Val Asn Met Pro Ser Ile Gln Lys

50 55 60

Gln Leu Leu Val Thr Ser Asn Glu Leu Asp Ala Asp Lys Ala Ser

65 70 75

Asn Ser Ile Glu Leu Val Glu Ile His Leu Pro Gln Leu Pro Asn

80 85 90

Leu Pro Pro Arg Tyr His Thr Thr Lys Ser Leu Pro Leu His Leu

95 100 105

Met Ser Thr Leu Lys Thr Ala Leu Asp Leu Tyr Glu Pro Thr Phe

110 115 120

Phe Gln Leu Leu Lys Thr Ile Arg Pro Asp Ile Val Ile Tyr Asp

125 130 135

Phe Ile Gln Pro Trp Ala Pro Leu Val Ala Ser Ser Leu Asn Ile

140 145 150

Pro Ala Val Ala Met Leu Ile Thr Gly Gly Ala Thr Ser Ser Tyr

155 160 165

Phe Tyr His Ile Cys Ile Asn Gly Ile Thr Lys Glu Phe Pro Phe

170 175 180

Ser Ala Ile Lys Leu Pro Glu His Glu Val Asn Lys Thr Ser Arg

185 190 195

Leu Leu Ser Ser Leu Ala Asn Gly Leu Thr Asp Lys Asp Arg Val

200 205 210

Val Gln Ser Val Asp Arg Ser Ser Thr Ile Val Leu Ala Lys Thr

215 220 225

Phe Arg Glu Ile Glu Ala Lys Tyr Ile Asp Tyr Tyr His Leu Leu

230 235 240

Thr Gly Lys Glu Leu Ile Gly Val Gly Pro Leu Ile Gln Glu Pro

245 250 255

Thr Lys Glu Asp Ser Arg Ser Thr Phe Val Glu Trp Leu Asp Asn

260 265 270

Lys Asp Thr Pro Ala Val Phe Ile Ser Phe Gly Thr Glu Tyr Tyr

275 280 285

Leu Ser Lys Glu Glu Met Glu Glu Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Leu

290 295 300

Ser Gly Val Asn Phe Ile Trp Val Leu Lys Phe Pro Glu Glu Glu

305 310 315

Asn Ile Thr Ser Val Asp Glu Ala Pro Leu Pro Lys Gly Phe Leu

320 325 330

Glu Arg Val Gly Glu Lys Gly Met Val Val Val Asn Ser Trp Ala

335 340 345

Pro Gln Ser Lys Ile Leu Ala His Gln Asn Thr Gly Ala Phe Val

350 355 360

Ser His Cys Gly Ser Gly Ser Val Thr Glu Ala Leu Arg Phe Gly

365 370 375

Val Pro Ile Ile Gly Ile Pro Met His Leu Asp Gln Pro Met Asn

380 385 390

Ser Lys Met Val Val Glu Leu Gly Val Ala Ala Glu Val Lys Arg

395 400 405

Asp Glu Lys Thr Gly Arg Tyr Glu Arg Glu Glu Val Glu Lys Val

410 415 420

Ile Lys Lys Val Val Phe Asp Lys Asp Gly Glu Gln Val Arg Arg

425 430 435

Lys Ala Arg Glu Leu Gly Glu Lys Leu Arg Lys Lys Gly Glu Glu

440 445 450

Asp Ile Asp Val Val Val Lys Lys Leu Lys Gln Val Cys Gly Lys

455 460 465

Leu Asp Cys Ser Asp Met Asp Gly Lys Glu Glu Lys Val Asn Gly

470 475 480

Lys

481

Claims

1.7-O-糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的7-O-糖基转移酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述的7-O-糖基转移酶在以UDP-glucose为底物催化icariside II生成淫羊藿苷中的应用。

5.权利要求1所述的7-O-糖基转移酶在类黄酮物质7-O位糖基化修饰中的应用，所述的应用是7-O-糖基转移酶以UDP-glucose为底物在催化kaempferol生成kaempferol-7-O-glucoside中的应用。