CN104531727A - 桑树类黄酮3-o-糖基转移酶基因、蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次给出了桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因序列和氨基酸序列，并给出该桑树类黄酮3-O-糖基转移酶的制备方法，能够将UDP-葡萄糖生成槲皮素 3-β-D-葡萄糖甙，具有葡萄糖基转移酶的功能，且具有表达量大，酶活性高的特点。

Description

桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因、蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因(MaUFGT)。

背景技术

花青素(anthocyanin)属于类黄酮化合物，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是植物花瓣和果实的主要呈色物质。花青素存在于植物细胞的液泡中，在不同的pH值条件下，使花瓣呈现五彩缤纷的颜色。自然状态下，游离态的花青素极少见，主要以糖苷形式存在，花青素常与一个或多个葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。花青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病及保护肝脏的作用。成熟果实的桑椹，味甜汁多，色泽艳丽，营养丰富，花青素含量极为丰富，这些特征是评价桑椹品质的重要指标。

类黄酮3-O-糖基转移酶(UFGT)以槲皮素为底物，能够催化UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙，是花青素合成途径的关键基因之一，能将不稳定的花青素转变成稳定的花青苷，该基因的表达决定与否直接影响花青素含量的积累。因此桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因可应用于桑树花青素生物合成的调控，改良桑椹的品质。

研究发现，制约该基因取得进展的主要因素有：(1)蛋白表达量较低或不表达；(2)表达蛋白以包涵体形式存在；(3)包涵体复性后，蛋白没有酶活性。因此，探寻UFGT基因的高表达至关重要，尤其是获得具有活性的蛋白，对该基因的鉴定及功能研究提供了重要的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因及其氨基酸序列。

一种核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或其互补序列。所述核酸分子编码桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因。

上述核酸分子，其扩增引物为：

UFGT-F：5’>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3’，

UFGT-R：5’>GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT<3’。

一种蛋白分子，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。其为桑树类黄酮3-O-糖基转移酶。

一种载体，包含了上述核酸分子。

上述载体，其结构如图3所示。所述载体是将上述编码桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因作为目的基因导入恰当的载体构成图3所示结构的载体。所述载体中，两个组氨酸标签基因分别位于目的基因上下游两侧，目的基因，组氨酸标签等部分有机组合，为蛋白的纯化、表达量和酶活的提高提供了有利条件。

上述载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的另一目的在于提供上述桑树类黄酮3-O-糖基转移酶的制备方法，所得蛋白表达量大、酶活性高。

一种桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，包括获取目的基因，构建包含目的基因的载体，载体导入宿主菌，从宿主菌中获取目的蛋白、目的蛋白纯化，目的蛋白复性，所述目的蛋白复性是将纯化后的蛋白液依次用透析液I、II、III、IV、V、Vi、VII透析，每种透析液透析4h-8h。

透析液I配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，6M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液II配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，4M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液III配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，2M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液IV配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.1％SDS，1M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液V配方：100mM Tris.HCI，10mM EDTA，0.1％SDS，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VI配方：50mM Tris.HCl，5mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VII配方：20mM Tris.HCl，2mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)。

在桑树类黄酮3-O-糖基转移酶的制备过程中，极易造成蛋白的失活，蛋白液出现白色絮状物或沉淀，本发明所得蛋白液透明，避免沉淀或白色絮状物的产生，而且蛋白液的浓度高，并且不会产生透析袋胀袋问题。

上述桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，上述载体导入宿主菌后，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，28℃培养4h-6h。兼顾了目的基因的表达量高和酶活性高的特点。

一种桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因：提取成熟桑椹果实的RNA，反转录为cDNA，以其为PCR模板，采用引物UFGT-F和UFGT-R扩增得到SEQ ID NO.1；

(2)将SEQ ID NO.1连接到pMD19-T载体，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选pET28(a+)-MaUFGT载体阳性克隆，再将此载体转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞；

(3)表达宿主菌经卡拉霉素筛选后，培养至OD 600nm值为0.6～0.8，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.4mmol/L，在28℃下培养4h；

(4)蛋白纯化：将步骤(3)处理后得到的菌体在冰浴中经超声破碎后，依次用10mmol/L、40mmol/L、100mmol/L、250mmol/L咪唑洗脱液进行Ni-NTA亲和层析；

(5)蛋白复性：将纯化后的蛋白液，在4℃依次用透析液I、II、III、IV、V、VI、VII透析复性，每种透析液透析4h；

透析液I配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，6M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液II配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，4M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液III配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，2M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液IV配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.1％SDS，1M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液V配方：100mM Tris.HCI，10mM EDTA，0.1％SDS，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VI配方：50mM Tris.HCl，5mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VII配方：20mM Tris.HCl，2mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)。

有益效果

1.本发明针对桑树中花青素不稳定、含量较低的问题，提供一个调控桑树花青素生物合成的基因以及蛋白酶活性的方法。本发明首次给出了桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因序列和氨基酸序列，并且此桑树黄酮3-O-糖基转移酶基因的表达产物能够将UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙，具有葡萄糖基转移酶的功能。

2.本发明采用较低温度下表达，选择恰当浓度、恰当的诱导剂(IPTG)诱导，使用不同的表达载体以及复性条件的优化等方式，获得的MaUFGT蛋白表达量高，酶活性高。

3.本发明获得的是类黄酮生物合成途径的一个关键基因，其表达产物具有将UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙的活性。此外，该发明还可以应用到其他植物中，改变植物体内花青素的含量及种类，有利于促进类黄酮物质在医药产业和保健产业中的开发利用。

4.本发明涉及一个桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因MaUFGT序列及应用。该基因全长1386bp，编码461个氨基酸。UFGT是桑树花青素生物合成途径的最后一个关键基因，能使不稳定的花青素转变成稳定的花青苷。该基因在大肠杆菌BL21宿主细胞中成功表达，重组MaUFGT蛋白以槲皮素为底物，能够将UDP-葡萄糖转化成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙。这一发明能够应用于调控花青素的含量，改善植物果实的品质。

附图说明

图1实施例1MaUFGT全长扩增电泳图。1：MAUFGT基因核心片段的克隆，M：Marker(Trams 2K)；

图2实施例2原核表达载体双酶切鉴定。M：Maker(Trams 2K)；1：MaUFGT全长克隆片段；1-4：原核表达载体双酶切鉴定5：重组质粒。

图3pET28(a+)-MaUFGT载体构建图。

图4实施例2MaUFGT重组蛋白的诱导。1：诱导pET-28a(+)空载体表达产物；2：诱导4h的上清表达产物；3：诱导4h的沉淀表达产物；M：蛋白Marker。

图5实施例3MaUFGT重组蛋白Ni柱纯化。1：诱导pET-28a(+)空载体表达产物；2：沉淀穿透液；3：10mmol/L咪唑洗脱；4：40mmol/L咪唑洗脱；5：100mmol/L咪唑洗脱；6-9：250mmol/L咪唑洗脱；M：蛋白Marker。

图6实施例3HPLC分析MaUFGT酶活性。A：槲皮素3-β-D-葡萄糖甙标准品；B：槲皮素标准品C：MaUFGT蛋白反应产物。其中，峰1：槲皮素3-β-D-葡萄糖甙的保留时间：16min；峰2：槲皮素保留时间：23.5min。

图7实施例4MaUFGT基因在桑椹不同发育时期果实中的表达。

具体实施方式

实施例1桑树MaUFGT基因的克隆

1)以结紫黑色桑椹的桑树品种(嘉陵40号)为材料，提取成熟果实的总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA第一链，作为PCR扩增的模板。

2)用设计的特异性引物UFGT-F：(5’>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3’)和UFGT-R：(5’>GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT<3’)进行扩增，得到1386bp的基因片段(图1)，连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。

实施例2桑树MaUFGT基因原核表达诱导重组蛋白

1)根据获得的桑树UFGF基因的CDS序列，设计特异引物：

UFGT-F：(5’>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3’)

UFGT-R：(5’>GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT<3’)，添加酶切位点和保护碱基。

2)将获得的UFGF片段及植物表达载体pET28(a+)分别经EcoR I和Not I双酶切(图2)，回收目的片段与载体。并与T4连接酶混合后，连接反应体系如下(10μL)：

10×T4 DNA Ligase	1μL
		T4连接酶	1μL
pET-28a(+)载体	2μL
		回收的目的片段	6μL

22℃保温3h，经热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，采用菌液PCR和菌液电泳的方法鉴定后，提取滞后质粒进行双酶切鉴定。筛选阳性克隆并进行测序分析，最终构建成植物表达载体pET28(a+)-MaUFGT(图3)。故将pET28(a+)-MaUFGT质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，采用PCR法鉴定阳性克隆。3)筛选出来的表达宿主菌接种于5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃培养过夜；然后按体积比1∶100接种于250mL的含卡那抗性的LB液体培养基，37℃培养至OD600值在0.6～0.8之间，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，在28℃下培养4h最后对所收集菌体处理后，进行SDS-PAGE分析(图4)。从图4可以看出：沉淀里目的蛋白大量表达，而上清中表达量很低。

实施例3蛋白纯化、复性和酶活性测定

1)将收集到细胞培养物于4℃下5000r/min离心15min。弃上清，每克菌体加入3mL PBS，轻轻用玻棒旋动，使菌体悬起，冰浴超声波破碎(功率500W，工作1s停2s，共20min)。4℃下10 000r/min离心20min，分别取上清和沉淀进行电泳分析(图4)，沉淀用适量的8mol/L的尿素溶解过夜，10000r/min离心20min取上清，即得包涵体溶液。

采用Ni-NTA亲和柱对超声波破碎的包涵体溶液中的表达蛋白进行分离纯化，纯化步骤为：首先将NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱体积平衡液冲洗Ni柱，然后将样品加入层析柱中流速控制在15mL/h，待样品通过柱子完全后，依次用5倍柱体积的10mmol/L、40mmol/L、100mmol/L、250mmol/L咪唑洗脱液进行洗脱，所得蛋白-80℃保存；取纯化的蛋白10ul，进行SDS-PAGE电泳(图5)。

收集到的目的蛋白4℃进行透析，依次用500ml的透析液I、II、III、IV、V、Vi、VII透析除去尿素，每种透析液透析4h，透析液于10000r/min离心15min以去除不溶蛋白，-80℃冰箱保存备用使蛋白质复性。透析液配制方法如下：

透析液I：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，6M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

透析液II：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，4M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

透析液III：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，2M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

透析液IV：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0.1％SDS，1M尿素，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

透析液V：100mM Tris.HCI，10mM EDTA，0.1％SDS，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

透析液VI：50mM Tris.HCl，5mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

透析液VII：20mM Tris.HCl，2mM EDTA，5％甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)

经透析复性后得到透明的、无白色絮状物的蛋白液，浓度为72ug/ml。

3)取纯化的蛋白液200ul，加入200ul 50mmol/L甘氨酸缓冲液(PH8.5)，30ul2mg/ml的槲皮素和20ul 15mg/ml的UDP葡萄糖，30℃水浴反应20min。加入150ul20％三氯乙酸甲醇溶液终止反应。10000×g离心5min，取上清液保存于-20℃，待测。采用高效液相(HPLC)对反应产物进行分析。洗脱条件如下表：C₁₈柱，流动相A为0.1％(体积比)甲酸水溶液，B为乙腈，流速为1ml/min，洗脱50min。产物槲皮素3-β-D-葡萄糖苷在350nm下被洗脱下来，结果见图5。体外酶活反应(图6-C)检测到槲皮素3-β-D-葡萄糖甙(峰1)的生成说明原核表达制备的UFGT蛋白具有糖基转移酶的活性。体外酶活反应(图6-C)检测到槲皮素(峰2)的生成。

实施例4桑树MaUFGT基因在嘉陵40的不同果实发育时期的表达

1)以嘉陵40号果实为试验材料。于2014年3月26日至5月1日取材，将果实分为8个时期，于盛花期(雌花柱头发白)后的第0，8，14，21，26，31，34，37天取材。各取50mg新鲜组织于预冷的研钵中加液氮迅速研磨成粉末状，参照RNA抽提试剂盒提取总RNA，将提取的RNA用DNA酶消化，最后用40μL DEPC水溶解RNA，经过1％琼脂糖变性凝胶电泳检测后，紫外分光光度计测定浓度。以总RNA为模板，以Oligod(T)18为引物，利用M-MLV反转录酶合成cDNA第1链，置-80℃保存备用。

2)根据荧光定量引物设计原则，以桑树肌动蛋白基因Actin(GenBank：HQ163774)为内参基因，以克隆的桑树UFGT基因为靶基因，设计引物UFGT-F：(5’>CATCGGACCCTTTACCCTAA<3’)和UFGT-R：(5’>AACCAGTCTAAGCAGCCGTT<3’)。分析UFGT基因在不同发育时期的表达情况(图7)。实时定量PCR按照Takara公司的定量试剂盒使用Takara公司的Premix Ex Taq^TMII说明书进行操作，表达量分析采用2^-Δt计算。

 SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120>桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因、蛋白及其制备方法 <160>  <210> 1  <211>  1386

<212> DNA  <213>桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因

 

<220>

<221>

<222> （1）..（3）

<223> 起始密码子

<222> （1384）..（1386）

<223> 终止密码子

 

<400> 1

atggcaccat caccaccttg ccacgtcgcc gtggcggcct ttcccttcgg cacgcacgcc        60

gccccactcc tcgccatcgt ccgtcgccta gctgcggcgt ccccgggaac aacattctcc       120

ttcttcaaca ctagacaatc caacaacacc atcttcaaca aggacaccac cactcaattc       180

cccaacatta aggcctatga catatgggat ggggtgccgg aaggccatgt cttcacgggg       240

aagccgcagg agcgcatcga gctgttcgtg aaggcggcac cggagagtct gcggattaac       300

atagagatgg cggtggtgga gacggggagg gaggttagct gcttgctgac ggacgctttc       360

ttttggtttg gaggagagtt ggctcaagac atgagaatgg ctagttgggt ccaattttgg       420

actgcaggac cttgttctct gtctgctcat ttttacactg atcttattag gcagcggatt       480

tccattgcag ctaaaggaag tgaaaacgaa cccctcagtt tcatcccagg aatgtccaaa       540

tttcttgtcc aagatctgcc cgaaggagtc ctctttggaa acttggaatc agtcttccca       600

aacatgttac acaaaatggg cctatcgcta ccacgtgcaa aggcagtttt cataaactcc       660

tttgaagagc tagacaaaac cattacgcat gacctcaagt ccaaattcaa taaattcctc       720

aatgtggggc ccctcaactt agtgtcccca tcactgccgc caaccccgga tgaaagcggc       780

tgcctgcggt ggctcggcgg gcagaaggct gacgcgtcgg tggcatacat tagctttggt       840

tcagtcatga tgccaccaag agaggaacta gaggaaatag ctactgcctt agaaggaggt       900

ggggtcccat ccatttggtc cctcagggag aatgcaaggc aaaatttgcc aattgggttt       960

ttggagaaaa caaggaaaac tggaatggtg gtgccgtggg ccccacagac tgatgtattg      1020

gcgcacagag cagtcggggt gtttgtgaca cattgtggtt ggaactcagt tttggaaagc      1080

atagttggcg gtgtgcccat gatttgcagg ccatttttcg gagaccaaag gctcaatagg      1140

cggatggtgc aggaggtgtt ggagatcggt gtgaaagttg agggtggggc tttcacaaag      1200

gtagggctag aaagatgttt ggatctagtt ttatgtcaag agagagggaa gaaaatgagg      1260

gacaagatca agagtctcaa agaagttgca aatgaagctg tgggtccaag aggaagctcc      1320

acagagaact tcaagctgtt gctggatgtg gtaacgaggc ctcaaggagt tgtaagactg      1380

atataa                                                                             1386

 

<210> 2

<211>  461 <212> protein  <213> 桑树类黄酮3-O-糖基转移酶

 

<400> 2

1      MAPSPPCHVA  VAAFPFGTHA  APLLAIVRRL  AAASPGTTFS  FFNTRQSNNT  IFNKDTTTQF   

61     PNIKAYDIWD  GVPEGHVFTG  KPQERIELFV  KAAPESLRIN  IEMAVVETGR  EVSCLLTDAF   

121    FWFGGELAQD  MRMASWVQFW  TAGPCSLSAH  FYTDLIRQRI  SIAAKGSENE  PLSFIPGMSK   

181    FLVQDLPEGV  LFGNLESVFP  NMLHKMGLSL  PRAKAVFINS  FEELDKTITH  DLKSKFNKFL   

241    NVGPLNLVSP  SLPPTPDESG  CLRWLGGQKA  DASVAYISFG  SVMMPPREEL  EEIATALEGG   

301    GVPSIWSLRE  NARQNLPIGF  LEKTRKTGMV  VPWAPQTDVL  AHRAVGVFVT  HCGWNSVLES    

361    IVGGVPMICR  PFFGDQRLNR  RMVQEVLEIG  VKVEGGAFTK  VGLERCLDLV  LCQERGKKMR   

421    DKIKSLKEVA  NEAVGPRGSS  TENFKLLLDV  VTRPQGVVRL  I

 

<210> 3 <211> 6733 <212> DNA  <213> pET28(a+)-MaUFGT表达载体

 

<220>

<221>

<222> （5173）..（5178）

<223>EcoR I酶切位点

<222>（5179）..（6561）

<223> 桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因

<222>（6562）..（6569）

<223>NotI酶切位点

<222>（5083）..（5100）和（6577）..（6594）

<223> 2个组氨酸标签基因

 

<400> 3

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg        60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc       120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg       180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc       240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt       300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc       360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta       420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt       480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta       540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat       600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa       660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc       720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga       780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc       840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac       900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac       960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat      1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag      1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca      1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac      1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg      1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca      1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac      1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa      1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga      1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg      1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc      1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag      1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc      1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg      1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac      1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga      1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt      1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag      2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg      2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta      2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc      2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg      2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta      2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg      2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct      2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag      2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc      2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag      2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt      2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa      2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg      2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg      2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc      2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta      3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca      3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc      3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc      3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa      3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc      3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac      3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca      3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta      3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa      3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat      3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca      3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa      3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt      3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg      3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca      3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta      3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg      4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat      4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct      4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg      4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat      4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc      4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca      4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg      4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt      4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg      4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct      4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga      4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg      4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc      4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg      4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg      4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga      4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa      5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac      5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg      5160

ggtcgcggat ccgaattcat ggcaccatca ccaccttgcc acgtcgccgt ggcggccttt      5220

cccttcggca cgcacgccgc cccactcctc gccatcgtcc gtcgcctagc tgcggcgtcc      5280

ccgggaacaa cattctcctt cttcaacact agacaatcca acaacaccat cttcaacaag      5340

gacaccacca ctcaattccc caacattaag gcctatgaca tatgggatgg ggtgccggaa      5400

ggccatgtct tcacggggaa gccgcaggag cgcatcgagc tgttcgtgaa ggcggcaccg      5460

gagagtctgc ggattaacat agagatggcg gtggtggaga cggggaggga ggttagctgc      5520

ttgctgacgg acgctttctt ttggtttgga ggagagttgg ctcaagacat gagaatggct      5580

agttgggtcc aattttggac tgcaggacct tgttctctgt ctgctcattt ttacactgat      5640

cttattaggc agcggatttc cattgcagct aaaggaagtg aaaacgaacc cctcagtttc      5700

atcccaggaa tgtccaaatt tcttgtccaa gatctgcccg aaggagtcct ctttggaaac      5760

ttggaatcag tcttcccaaa catgttacac aaaatgggcc tatcgctacc acgtgcaaag      5820

gcagttttca taaactcctt tgaagagcta gacaaaacca ttacgcatga cctcaagtcc      5880

aaattcaata aattcctcaa tgtggggccc ctcaacttag tgtccccatc actgccgcca      5940

accccggatg aaagcggctg cctgcggtgg ctcggcgggc agaaggctga cgcgtcggtg      6000

gcatacatta gctttggttc agtcatgatg ccaccaagag aggaactaga ggaaatagct      6060

actgccttag aaggaggtgg ggtcccatcc atttggtccc tcagggagaa tgcaaggcaa      6120

aatttgccaa ttgggttttt ggagaaaaca aggaaaactg gaatggtggt gccgtgggcc      6180

ccacagactg atgtattggc gcacagagca gtcggggtgt ttgtgacaca ttgtggttgg      6240

aactcagttt tggaaagcat agttggcggt gtgcccatga tttgcaggcc atttttcgga      6300

gaccaaaggc tcaataggcg gatggtgcag gaggtgttgg agatcggtgt gaaagttgag      6360

ggtggggctt tcacaaaggt agggctagaa agatgtttgg atctagtttt atgtcaagag      6420

agagggaaga aaatgaggga caagatcaag agtctcaaag aagttgcaaa tgaagctgtg      6480

ggtccaagag gaagctccac agagaacttc aagctgttgc tggatgtggt aacgaggcct      6540

caaggagttg taagactgat agcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat      6600

ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa      6660

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga      6720

actatatccg gat                                                                   6733 

 

 

 

Claims (9)

1.一种核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或其互补序列。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其扩增引物为：

UFGT-F：5'>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3'，

UFGT-R：5'> GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT <3'。

3.一种蛋白分子，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

4.一种载体，包含了权利要求1或2所述核酸分子。

5.如权利要求4所述的载体，其结构如图3所示。

6.如权利要求4所述的载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

7.一种桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，包括获取权利要求1所述的核酸分子为目的基因，构建包含目的基因的载体，载体导入宿主菌，从宿主菌中获取目的蛋白、目的蛋白纯化，目的蛋白复性，所述目的蛋白复性是将纯化后的蛋白液依次用透析液I、II、III、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ透析，每种透析液透析4-8h；

透析液I配方：100mM Tris.HCl，lOmM EDTA，0．5％SDS，6M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液II配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0．5％SDS，4M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液III配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，O．5％SDS，2M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液IV配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0．1％SDS，1M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液V配方：100mM Tris.HCI，lOmM EDTA，0．1％SDS，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VI配方：50mM Tris.HCl，5mM EDTA，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VII配方：20mM Tris.HCl，2mM EDTA，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)。

8.如权利要求7所述的桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，所述载体导入宿主菌后蛋白纯化前，加入终浓度为0.4 mmol/L 的IPTG，28℃培养4h。

9.如权利要求7所述的桑树类黄酮3-O-糖基转移酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）获取桑树类黄酮3-O-糖基转移酶基因：提取成熟桑椹果实的RNA，反转录为cDNA，以其为PCR模板，采用引物UFGT-F和UFGT-R扩增得到SEQ ID NO.1；

（2）将SEQ ID NO.1连接到pMD19-T载体，转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，挑选pET28(a+)-MaUFGT载体阳性克隆，再将此载体转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞；

（3）表达宿主菌经卡拉霉素筛选后，培养至OD 600nm值为0. 6～0. 8，加入IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）至终浓度为0.4 mmol/L，在28℃下培养4-6h；

（4）蛋白纯化：将步骤（3）处理后得到的菌体在冰浴中经超声破碎后，依次用10mmol/L、40mmol/L、100mmol/L、250mmol/L咪唑洗脱液进行Ni-NTA亲和层析；

（5）蛋白复性：将纯化后的蛋白液，在4℃依次用透析液I、II、III、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ透析复性，每种透析液透析4h；

透析液I配方：100mM Tris.HCl，lOmM EDTA，0．5％SDS，6M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液II配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0．5％SDS，4M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液III配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，O．5％SDS，2M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液IV配方：100mM Tris.HCl，10mM EDTA，0．1％SDS，1M尿素，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液V配方：100mM Tris.HCI，lOmM EDTA，0．1％SDS，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VI配方：50mM Tris.HCl，5mM EDTA，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)；

透析液VII配方：20mM Tris.HCl，2mM EDTA，5%甘油，2mM β-巯基乙醇(pH8.0)。