CN110029117A

CN110029117A - 黄酮醇合成酶基因SmFLS及其应用和黄酮醇合成酶

Info

Publication number: CN110029117A
Application number: CN201910273063.7A
Authority: CN
Inventors: 吕玲玲; 李威; 李可; 冯雪峰
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110029117B

Abstract

本发明涉及一种从茄子中克隆得到的黄酮醇合成酶基因SmFLS及其在调节茄子果皮的黄酮醇含量中的应用，以及黄酮醇合成酶。根据茄子基因组数据设计全长引物克隆得到的黄酮醇合成酶基因SmFLS编码如SEQ ID NO.2所示的黄酮醇合成酶。该黄酮醇合成酶基因SmFLS的序列如SEQ ID NO:1所示。采用农杆菌介导法转化茄子，结果证实转基因茄子植株与野生型植株相比，黄酮醇含量显著提高，导致茄子果皮颜色变浅。本发明有助于进一步了解茄子果皮着色机理，从而可利用生物技术手段来调控茄子果皮着色、选育着色均匀的茄子新品种。

Description

黄酮醇合成酶基因SmFLS及其应用和黄酮醇合成酶

技术领域

本发明涉及一种从茄子中克隆得到的黄酮醇合成酶基因SmFLS及其在调控茄子果皮黄酮醇含量中的应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)，茄科茄属类蔬菜，起源于印度，中国为第二起源地。茄子在我国南北均大面积栽培，但各地喜好的果形和颜色变化较大：在东北以绿色卵茄为主，江浙沪一带主要是细长的紫茄，在中原地区，主要以绿长茄为主，西南地区以紫茄为主，华南地区主要栽培紫红长茄。因此，果皮颜色成为茄子重要的育种目标之一。

黄酮醇合成酶(flavonol synthase，FLS)基因是催化生物合成黄酮醇的关键酶之一。在植物类黄酮生物合成途径中，以二氢黄酮醇为底物，二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)与FLS通过竞争底物分别合成无色花青素和黄酮醇。FLS的底物有三种并具有底物特异性，它可分别催化二氢杨梅素(DHM)、二氢山奈酚(DHK)和二氢槲皮素(DHQ)生成杨梅素(Myricetin)、山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercetin)，随后经尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)催化生成各种黄酮醇衍生物(Winkel-shirley,2001)。DFR催化DHQ、DHK和DHM分别合成无色花青素、无色天竺葵色素和无色飞燕草色素。FLS与DFR的竞争关系影响花青素和黄酮醇含量的积累，所以通过调控FLS的表达有可能会影响果皮颜色。因此，研究FLS的功能不仅影响着植物中类黄酮的生物合成途径，而且对植物花色果色的形成有重要影响。

McDFR的过表达或McFLS的沉默增加了花色素苷的含量；相反，当McFLS过表达或McDFR沉默时，观察到海棠叶和苹果皮中黄酮醇含量增加(Tian et al.,2015)。烟草中FLS沉默减少17％～53％黄酮醇含量，同时增加51％～93％儿茶素和18％～27％表儿茶素的含量，并且显示出DFR和花青素合成酶基因(ANS)明显上调表达(Mahajan et al.,2012)。DFR和ANS的表达分别上调1.95倍和1.56倍之后，转基因株系中FLS的表达水平较低(Yao etal.,2017)。

高温影响花色素苷合成的研究在苹果(Lin-Wang K et al,2011)和葡萄(Mori Ket al,2007；Mori K et al,2005)中均有报道，而高温对茄子果色的影响却未见报道，因此探究高温对FLS基因表达的影响及FLS基因在果色形成中的作用，对选育高温下果皮着色均匀的茄子新品种有至关重要的意义。

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的是根据茄子基因组数据设计全长引物克隆得到黄酮醇合成酶基因SmFLS，由此进一步了解茄子果皮着色机理，从而可利用生物技术手段来调控茄子果皮着色、选育着色均匀的茄子新品种。

根据本发明的一个方面，提供一种从茄子中克隆得到的黄酮醇合成酶基因SmFLS，编码如SEQ ID NO:2所示的黄酮醇合成酶。

所述黄酮醇合成酶基因SmFLS的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，SmFLS基因的最大阅读框(ORF)的大小为1014bp。

所述黄酮醇合成酶基因SmFLS编码337个氨基酸，具有H-X-D和R-X-S两个保守结构域，属于2-酮戊二酸依赖型的双加氧酶家族。

根据本发明的另一方面，提供一种黄酮醇合成酶，所述黄酮醇合成酶的序列如SEQID NO:2所示。

以18s rRNA为内参基因，经实时荧光定量表达分析，所述黄酮醇合成酶基因SmFLS在白茄、绿茄、紫红茄和紫黑茄中都有表达，且表达量从大到小依次为：白茄>绿茄>紫红茄>紫黑茄。

所述黄酮醇合成酶基因SmFLS在果实不同发育时期都有表达，但35℃高温处理(HT)下的表达量显著高于25℃对照(CK)下的表达量。

根据本发明的另一方面，还提供所述黄酮醇合成酶基因SmFLS在调控茄子果皮的黄酮醇含量中的应用。其中，所述黄酮醇合成酶基因SmFLS与植物表达载体正向相连后得到重组质粒，将所述重组质粒转化农杆菌，经农杆菌介导法转化茄子后，茄子果皮中黄酮醇含量升高。

具体地，SmFLS基因与载体pBI121正向相连后得到重组质粒pBI121-SmFLS，将所述重组质粒pBI121-SmFLS转化农杆菌菌株GV3101，经农杆菌介导法转化茄子后，茄子果皮中黄酮醇含量极显著升高。

根据本发明的另一方面，提供含上述黄酮醇合成酶基因SmFLS的载体。

根据本发明的又一方面，提供含上述黄酮醇合成酶基因SmFLS的宿主细胞。

通过本发明得到的黄酮醇合成酶基因SmFLS可通过生物技术手段来调控茄子果皮着色、选育着色均匀的茄子新品种。

附图说明

图1表示FLS同源基因编码的氨基酸序列比对。

图2表示SmFLS基因在4个不同果皮颜色茄子品种中的表达。

图3表示在35℃高温(HT)处理和25℃对照(CK)下，SmFLS基因在开花后10天、15天和20天(10DAF、15DAF和20DAF)果皮中的表达。

图4示出了SmFLS转基因植株的PCR检测结果。

图5示出了SmFLS转基因植株中黄酮醇含量的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，这些实施例只用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

本发明所提供的FLS同源基因，是从茄子果皮中克隆得到，命名为SmFLS基因，ORF序列如SEQ ID NO:1(序列1)。

SmFLS基因编码的蛋白质，命名为SmFLS蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2(序列2)。

一、SmFLS基因的克隆及其序列分析

上述SmFLS基因的克隆方法及其序列分析，包括如下步骤：

1、RNA提取

以从福建引进的茄子高代自交系30#的果皮为材料，用北京华越洋RNA提取试剂盒来提取茄子果皮总RNA，具体方法如下：

(1)将茄子果皮用液氮充分研磨使组织破碎，离心管装取50～100mg样品，加入1mL的细胞裂解液，充分震荡混匀；

(2)转移研磨物约800μL至干净的离心管中，不得超于1mL；

(3)在离心管中加入300μL去蛋白液(使用前静置2min，取下层溶液)和200μL氯仿，在漩涡振荡器上震荡1min混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状；

(4)室温静置2min，然后12000rpm室温离心10min，将上清液转移到另一干净的离心管中，上清液不宜多余700μL；

(5)加入等体积(同上清液体积)的漂洗液，充分颠倒混匀后将混合液转移至离心吸附柱中(少量多次加入，每次转移量不得多于700μL)，室温12000rpm离心1min，弃穿透液；

(6)加500μL洗柱液，室温12000rpm离心1min，弃穿透液；加500μL洗柱液，重复此步骤，然后在室温12000rpm离心1min,弃掉残液；

(7)将6μL的RNase-free DNaseI加入到44μL DNase buffer(冰上解冻)中混匀(先在离心管中混匀)，加入到离心吸附柱中(加入到膜中央且移液枪不接触膜)，37℃温浴20～30min，时间可适当延长；

(8)直接加入500μL去酶液到离心吸附柱中，盖上盖后颠倒混匀数次；

(9)室温12000rpm离心1min，弃穿透液；

(10)再加500μL的去酶液室温12000rpm离心1min，弃穿透液；

(11)室温12000rpm离心2min，去除残留的乙醇；

(12)将离心吸附柱转移到RNase-free管中，加入50μLRNA洗脱液，室温放置3min；

(13)室温12000rpm离心1min，然后将洗脱的RNA重新加入到吸附柱中，室温放置3min，离心1min，离心管中样品即为RNA样品；

(14)取2μL RNA进行电泳检测，检验其完整性。

2、反转录

采用大连宝生物工程公司(TAKARA)第一链反转录试剂盒来进行反转录，得到cDNA第一链，作为随后PCR扩增的模板。

3、引物设计

根据茄子基因组数据(http://eggplant.kazusa.or.jp/)设计SmFLS cDNA全长扩增引物：

FLSQC-F:5’-ATGAAAACAGTTCAAGGTCAGA-3’

FLSQC-R:5’-TCACTGAGGAAGTTTGTTAAGC-3’

反应体系为：PCR缓冲液12.5μl，8.4μl灭菌去离子水，0.1μl Taq酶，正向、反向引物各1μl(10μM)，cDNA模板2μl；PCR扩增条件为：94℃变性3min；94℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min。

4、PCR扩增后得到的目的片段用TAKARA的Agarose Gel DNA Purification KitVer 2.0进行回收，具体操作如下：

(1)将目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净离心管中，称重；

(2)向胶块中加入3倍体积的Buffer PG；

(3)50℃孵育10min，期间不断温和地颠倒离心管，保证胶块充分溶解；

(4)柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液；

(5)将上步所得到的溶液加入到吸附柱中，室温静置2min，13000rpm，离心1min，倒掉废液；

(6)向吸附柱中加入500μL Buffer PG，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将柱放回收集管中；

(7)向吸附柱中加入750μL Buffer PW，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

(8)13000rpm离心1min，弃穿透液，吸附柱静置数分钟，以彻底蒸发乙醇；

(9)将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加50μLBufferEB，室温静置2min，13000rpm离心1min，收集DNA溶液。

目的片段在16℃与pMD19-T载体连接2～4h，连接产物转化JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为茄子SmFLS cDNA全长。其全长为1080bp，ORF为1014bp(SEQ ID NO:1)，编码337个氨基酸(SEQ ID NO:2)。

5、序列分析

从NCBI上搜索同源序列进行比对(图1)，结果显示SmFLS与马铃薯FLS基因的同源性最高，达到90％，与辣椒的同源性为89％，与番茄，烟草、矮牵牛的同源性均在85％以上。

SmFLS属于2-酮戊二酸依赖型的双加氧酶家族，具有典型的2OG-FeII_Oxy加氧酶活性区域(214～310aa)、1个DIOX_N功能域(55～165aa)，含有H-X-D和R-X-S 2个保守结构域(图1)，这些结构与其蛋白功能相关。

二、SmFLS基因的表达

以18s rRNA为内参基因，对SmFLS基因在不同果皮颜色茄子品种及果实不同发育时期的表达进行实时荧光定量表达分析，以验证其功能。具体实施方案如下：

常规栽培下取白茄、绿茄、紫红茄和紫黑茄成熟果实的果皮，分别提取其总RNA；35℃高温(HT)处理和25℃对照(CK)下，在开花后10d、15d和20d(10DAF、15DAF和20DAF)，分别取果皮并提取其总RNA。用核酸蛋白仪测定其浓度，分别定量取出1μg RNA，使用TAKARA定量反转录试剂盒来进行反转录，得到的cDNA用作定量表达的模板。

SmFLS定量表达的引物：

FLSdl-up:TTGTGCCAAATGAAGTCCAA

FLSdl-dn:TTCACTGTTGTCCGGTGGTA

反应体系：95℃30sec，1个循环；95℃5sec，55℃30sec，72℃30sec，40个循环。如果制作标准曲线，最后再添加一个溶解曲线的反应：95℃60sec，58℃30sec，95℃30sec，1个循环。

实时荧光定量表达结果显示，SmFLS基因在不同果皮颜色茄子品种中都有表达，且表达量从大到小依次为：白茄>绿茄>紫红茄>紫黑茄(图2)；SmFLS基因在果实不同发育时期都有表达，但35℃高温处理下的表达量都高于25℃对照下的表达量，并在15DAF和20DAF时达到显著水平(图3)。说明高温诱导SmFLS上调表达。

三、含SmFLS基因植物表达载体的构建

构建含SmFLS基因的植物表达载体，经农杆菌介导法转入茄子，进一步验证SmFLS基因的功能。

1、带酶切位点编码区的扩增

设计带酶切位点的引物：

FLSmq-F：CGGGATCCGCACAACAGCCCTGATGGAG

BamHI

FLSmq-R：CGAGCTCGACGATTTCACTGAGGAAGTTTGTT

SacI

PCR反应体系：25μl总反应体积中含模板第一链cDNA 2μl，上下游引物各1μl(10μmo1/L)，Taq DNA聚合酶0.1μl(5U/μl)，2x Mix缓冲液12.5μl，用无菌重蒸馏水补足体积。

PCR反应条件为：94℃3min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，36个循环；72℃延伸10min。扩增得到的FLSmq与pMD19-T连接后，命名为pMD19-SmFLS，转化JM109感受态后，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为包括编码区的带酶切位点的SmFLS基因。

2、植物表达载体的构建

用限制性内切酶BamHI和SacI从含有目的基因的重组质粒pMD19-SmFLS中切下目的片段，同时用BamHI和SacI双酶切pBIl2l载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用TAKARA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和pBIl2l载体的大片段。利用T₄DNA连接酶将SmFLS正向插入到pBIl2l载体中，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经PCR鉴定后，获得植物表达载体pBIl2l-SmFLS。

3、植物表达载体导入农杆菌

取农杆菌GV3101的感受态细胞冰上解冻以后，加入1μg pBIl2l-SmFLS质粒DNA，混匀，冰浴30min，液氮中放置1min，迅速转入37℃中水浴5min，融化后加入0.8ml新鲜的LB液体培养基(不含抗生素)，于28℃振荡培养2～4h；取200μl菌液涂布于含卡那霉素(简称为Kan)30mg/L和特美汀(简称为Tim)400mg/L的LB固体培养基上，28℃培养2～3天。并对菌落进行PCR检测。

4、目的基因转化茄子

挑取鉴定好的阳性农杆菌单克隆于10ml含有Tim(400mg/L)和Kan(30mg/L)的LB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养成光学密度(Optical density，简称为OD)为0.5左右的菌液。在转化前一天，取1ml该菌液转入100ml含Tim(400mg/L)和Kan(30mg/L)的LB液体培养基中振荡培养过夜，第二天，当菌液OD600在1.0～1.5之间时取出使用。

制备好已转化了pBIl21-SmFLS重组质粒的农杆菌菌液100ml，室温5000rpm离心10min，弃上清，沉淀悬浮于LB液体培养基+Tim(400mg/L)+Kan(30mg/L)中，重悬后的菌液OD600在0.6左右。将农杆菌悬浮液倒在培养皿中，将茄子外植体浸没于农杆菌菌液中，浸泡10min，期间不时摇动。取出外植体进行共培养(MS+0.1mg/L IAA+1.0mg/L ZT)2d后，转入抑菌筛选培养基(MS+0.1mg/L IAA+1.0mg/L ZT+400mg/L Tim+30mg/L Kan)，经愈伤组织出芽，小芽切下后接入生根培养基(MS+30mg/L Kan)，经生根后移栽到营养钵中。

5、SmFLS基因的应用

1)转化植株的PCR检测

提取转化植株的基因组DNA，以DNA为模板，以FLSmq-F，FLSmq-R为引物进行PCR扩增，以未转基因茄子的DNA为阴性对照。结果表明SmFLS基因已经整合到茄子基因组中(图4)。

2)转化植株黄酮醇含量的测定

以同时期野生型植株为对照。

黄酮醇的提取及其组分含量测定(HPLC)：黄酮醇提取参考谭晓亮等(2015)的方法并略作修改。样品研磨称重后，加入50％甲醇溶液2mL，30℃恒温超声30min，8000rpm离心10min，收集上清液，重复浸提3次，合并上清液，定容至5mL，摇匀，0.22μm微滤膜过滤。利用岛津高效液相色谱仪进样，选择紫外检测器，色谱柱为反相C18柱，柱温设定为35℃，波长330nm；流动相A：甲醇，流动相B：0.2％磷酸水溶液；进样量10uL；流速1mL/min；梯度洗脱：0min，5％；10min，10％；15min，38％；25min，68％；30min，48％；35min，5％；43min，5％。

结果如图5所示，与野生型植株(CK)相比，转化植株的黄酮醇含量极显著升高，说明SmFLS促进了黄酮醇的积累。

以上所述，仅为本发明的较佳实例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

<110> 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所

<120> 黄酮醇合成酶基因SmFLS及其应用和黄酮醇合成酶

<160> 2

<210> 1

<211> 1014

<212> cDNA

<213> 茄子

<400> 1

1 atggaggtggcgagggtacaagcgatatcgtcaataacgagatgcatggacacaattcca

61 tcggaatatattcgttcagagaacgaacaacctgtggccacaacgctgcacggagtagtt

121 cttgaggtgccagtcatcgacataggtacttgtgtcgatgaggaaaaaatagcgaaagag

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241 gaggtgattgcgaatttacagaaagttgggaaggagttctttgaggaagtgccacaagaa

301 gagaaagagttgattgcgaagaagccaggggcgcagagtatagaagggtatgggacttct

361 ttgcagaaggaagtggaagggaaaaaaggttgggtggatcatttgtttcataagatttgg

421 cctccttcagccatcaactatcgttattggcctaaaaaccctcctttctacagggaagca

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541 cttgggcttggtttggaagcccatgaaatgattgaggcagctggtagtgaagacatagtt

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961 accaagaagtacaaggattatgtctattgtaagcttaacaaacttcctcagtga

<210> 2

<211> 337

<212> 氨基酸

<213> 茄子

<400> 2

1 MEVARVQAISSITRCMDTIPSEYIRSENEQPVATTLHGVV

41 LEVPVIDIGTCVDEEKIAKEIAEASKEWGIFQVINHGIPD

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121 LQKEVEGKKGWVDHLFHKIWPPSAINYRYWPKNPPFYREA

161 NEEYAKKLRDVGDKMFRSLSLGLGLEAHEMIEAAGSEDIV

201 YMLKINYYPPCPRPDLALGVVAHTDMSYITLLVPNEVQGL

241 QVFKDGHWYDVSYIPNAIIVHIGDQIEILSNGKYKSVYHR

281 TTVNKDKTRMSWPVFLEPPPEHEVGPMPKLINEANPPKFK

321 TKKYKDYVYCKLNKLPQ

Claims

1.一种从茄子中克隆得到的黄酮醇合成酶基因SmFLS，其特征在于，所述黄酮醇合成酶基因SmFLS编码如SEQ ID NO:2所示的黄酮醇合成酶。

2.根据权利要求1所述的黄酮醇合成酶基因SmFLS，所述黄酮醇合成酶基因SmFLS的序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的黄酮醇合成酶基因SmFLS，编码337个氨基酸，具有H-X-D和R-X-S两个保守结构域。

4.一种黄酮醇合成酶，所述黄酮醇合成酶的序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的黄酮醇合成酶基因SmFLS在调控茄子果皮的黄酮醇含量中的应用。

6.含权利要求1至3中任意一项所述的黄酮醇合成酶基因SmFLS的载体。

7.含权利要求1至3中任意一项所述的黄酮醇合成酶基因SmFLS的宿主细胞。