CN112662685A

CN112662685A - 比利时杜鹃花fls基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组

Info

Publication number: CN112662685A
Application number: CN202110027872.7A
Authority: CN
Inventors: 汪庆昊; 吴月燕
Original assignee: Zhejiang Wanli University
Current assignee: Zhejiang Wanli University
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2021-04-16

Abstract

本发明公开了比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组，该基因为黄酮醇合成酶基因RhFLS，其保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明首次从比利时杜鹃花中克隆得到杜鹃花黄酮醇合成酶基因RhFLS，黄酮醇合成酶基因RhFLS为杜鹃花花色形成的关键基因之一，可以用于通过转基因等生物技术方法培育不同花色杜鹃花，为今后利用基因工程技术改良杜鹃花品质提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

Description

比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组。

背景技术

比利时杜鹃，又名西洋杜鹃，杜鹃花属(Rhododendron L.)，是由映山红(Rhododendron simsii Planch.)、皋月杜鹃(Rhododendron indicum(L.)Sweet)、毛白杜鹃(Rhododendron mucronatum(Blume)G.Don)反复杂交得到的品种。颜色多样，四季开花，常作为室内盆景，是杜鹃花花色育种的重要材料，但目前通过分子手段的花色育种在百合、牡丹、玫瑰、月季等花中报道较多，杜鹃目前大多还是采用杂交育种的手段。比利时杜鹃花色形成的机制研究报道甚少。花色素是影响植物花色呈色的重要因素，花色素多且复杂，主要分为三大类别：类黄酮(Flavonoid)、类胡萝卜素(Carotenoid)和生物碱(Alkaloid)。前期研究表明，影响杜鹃花花色的花色素主要是类黄酮(Flavonoid)，其花色合成主要通过类黄酮合成途径，合成的花青素使得花瓣具有白、红、粉红、紫以及淡紫等颜色，但目前杜鹃花类黄酮生物合成机理尚不清晰。

在花色素合成途径中，是以香豆酰辅酶A(4-coumaroyl-CoA)和丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)为前体，在查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的作用下香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合成四羟基查尔酮(Chalcone)，之后查尔酮异构酶(chalconeisomerase,CHI)使四羟基查尔酮发生立体异构变为无色柚皮素(Naringenin)，柚皮素继续被黄烷酮-3-羟化酶(flavanone3-hydroxylase,F3H)催化生成二氢山奈酚(dihydrokaelpferol,DHK)，DHK可以被类黄酮3’-羟化酶(flavonoid 3’-hyroxylase,F3’H)催化进而转变二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)，也可以被类黄酮3’,5’-羟化酶(flavonoid 3’,5’-hyroxylase,F3’5’H)的催化转变为二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)。DHK、DHQ和DHM即可被FLS催化生成黄酮醇，也能被二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)催化生成无色花色素。FLS与DFR有相同的底物竞争关系，对植物中花青素和黄酮醇含量的积累有重要影响。因此研究FLS的功能不仅能探讨植物中花青素和黄酮醇的生物合成途径，对植物花色也有重要影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：比利时杜鹃花FLS基因，该基因为黄酮醇合成酶基因RhFLS，其保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

用于克隆比利时杜鹃花FLS基因的引物组，包括用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物FLS-F1、FLS-R1、FLS-F2和FLS-R2，其序列分别为：

FLS-F1：GGAGAGCTACGCAAACGACC；

FLS-R1：TGGCAGCTAGAGGTTACGACTT；

FLS-F2：ACGACATTTGGCCCAAGAACCCT；

FLS-R2：GAGTACCGCCATCGCAAATTCAACA。

比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，包括以下步骤：

步骤(1)：比利时杜鹃花总RNA的提取和反转录；

步骤(2)：比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的扩增；

步骤(3)：比利时杜鹃花FLS基因3'RACE和5'RACE的扩增；

步骤(4)：PCR产物的克隆纯化与筛选。

作为优选，步骤(2)的具体流程为：根据已知与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种的FLS基因的氨基酸及核苷酸序列，设计得到扩增比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的引物FLS-F1和FLS-R1，以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，利用引物FLS-F1和FLS-R1进行PCR扩增反应，扩增得到比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，即SEQ IDNO.1。进一步地，PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25-35Cycles；72℃、2min，结束。

作为优选，所述的与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种为山茶、猕猴桃、锦绣杜鹃、杜仲和芍药。

作为优选，步骤(3)的具体流程为：首先根据比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，设计基因特异引物FLS-F2和FLS-R2，再以

RACE 5'/3'Kit提供的5'/3'RACE Outer Primer和基因特异引物FLS-F2和FLS-R2为引物，并以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，进行5'/3'末端PCR扩增反应，扩增得到比利时杜鹃花FLS基因5'RACE和3'RACE，与步骤(2)中得到的比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列拼接，得到比利时杜鹃花FLS基因全长核苷酸序列，即SEQ ID NO.2。进一步地，5'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，72℃3min，5Cycles；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5Cycles，结束；3'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，68℃30s，72℃3min，30Cycles，结束。

用于比利时杜鹃花FLS基因荧光定量PCR的RT-PCR引物组，包括引物FLS-F3和FLS-R3，其序列分别为：

FLS-F3：TTGGTGGACAAGGAACGAACAAGG；

FLS-R3：GCGATGGCGGTACTCAGCATAC。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明根据已知与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种的FLS基因的氨基酸及核苷酸序列，设计得到扩增比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的引物，再扩增得到比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，利用RACE技术扩增出比利时杜鹃花FLS基因的5'和3'末序列，最终首次获得比利时杜鹃花FLS基因全长核苷酸序列。通过荧光定量PCR分析表明，除了衰败期，比利时杜鹃花其他各个时期白花FLS基因的表达量均显著高于红花。FLS基因在两种不同花色的比利时杜鹃花的不同器官均有表达，在红花的叶子和雄蕊中的表达水平明显高于雌蕊和花瓣，而在雌蕊中的表达量最低；在白花的叶子中的表达水平显著高于雄蕊、雌蕊和花瓣，雌蕊中的表达量最低。由此说明叶片对黄酮醇合成酶的合成尤为关键，从而影响到比利时杜鹃花花色。黄酮醇合成酶基因RhFLS为杜鹃花花色形成的关键基因之一，可以用于通过转基因等生物技术方法培育不同花色杜鹃花，为今后利用基因工程技术改良杜鹃花品质提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

附图说明

图1为比利时杜鹃花FLS基因保守域；

图2为比利时杜鹃花FLS基因5'末端区域；

图3为比利时杜鹃花FLS基因3'末端区域；

图4为红白比利时杜鹃花不同花期FLS基因表达水平图；

图5为红白比利时杜鹃花不同组织部位FLS基因表达水平图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：比利时杜鹃花FLS基因，其特征在于，该基因为黄酮醇合成酶基因RhFLS，其保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2：比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，包括以下步骤：

步骤(1)：比利时杜鹃花总RNA的提取和反转录

根据RNA prep pure Plant Kit说明书进行实验操作，但对以下几点进行改良：取50-100mg杜鹃花苞在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μL裂解液(由665μL SL和35μLβ-巯基乙醇组成)，立即旋涡震荡混匀；取1μL RNA溶液与1μL ddH₂O和4μL 6RNA loading Buffer混匀，然后置于65℃5min、冰上1min反应，得RNA样品；取5μL RNA样品进行电泳检测，检测其完整性，取1.5uL RNA样品用NanoDopTM2000测定其纯度以及浓度；

按照TransScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)说明书合成得到比利时杜鹃花花苞的cDNA第一链。

步骤(2)：比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的扩增

从GenBank中下载与杜鹃花属植物亲缘关系相近的山茶的FLS基因的编码区氨基酸及全长核苷酸序列，采用DNAMAN进行多序列比对，在同源性较高的序列利用Primer 5.0设计引物FLS-F1和FLS-R1进行PCR扩增，FLS-F1和FLS-R1的序列分别为：

FLS-F1：GGAGAGCTACGCAAACGACC；

FLS-R1：TGGCAGCTAGAGGTTACGACTT；

以比利时杜鹃花花苞的cDNA第一链为模板，利用引物FLS-F1和FLS-R1进行PCR扩增反应(反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25-35Cycles；72℃、2min，结束)，扩增结果如图1所示，扩增得到的PCR产物即为比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列SEQ ID NO.1。

将PCR产物与

18-T Vector载体连接，在PCR管中加入1μL pMD18-T载体、4μLPCR产物和5μL SolutionⅠ，离心混匀后，在恒温金属浴上16℃连接过夜。取30μL溶解后的DH5α加入到连接产物中，冰上静置30min，42℃水浴45s，热激后立即放入冰中，冷却5min，在无菌环境中加入400μL LB液体培养基，混匀，37℃，220rpm恒温振荡1h，取200μL菌液均匀涂布于含有100mgL-1Amp LB固体培养基上，于生化培养箱中37℃正置1h后，倒置培养12-14h。在无菌环境下，用枪头从固体培养基上随机挑取6-8个白色单菌落，转入500μL含有100mgL-1Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm恒温振荡5h。将菌液代替cDNA模板，根据相同条件进行PCR，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测检测。挑选2-3个含有目的片段的菌液送上海生工生物有限公司测序。

步骤(3)：比利时杜鹃花FLS基因3'RACE和5'RACE的扩增

根据比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，设计基因特异引物FLS-F2和FLS-R2用于RACE扩增，FLS-F2和FLS-R2的序列分别为：

FLS-F2：ACGACATTTGGCCCAAGAACCCT；

FLS-R2：GAGTACCGCCATCGCAAATTCAACA；

RACE扩增过程按照Clonetech公司的

RACE 5'/3'Kit提供的说明书5'/3'RACE Outer Primer进行，并分别以FLS-F2和FLS-R2为引物、以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，分别进行5'末端、3'末端PCR扩增反应，其中，5'末端扩增以5'cDNA为模板，利用RACE通用引物UPM和FLS-R2进行PCR扩增，5'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，72℃3min，5Cycles；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5Cycles，结束，得到5'末端全长；3'末端扩增以3'cDNA为模板，利用RACE通用引物UPM和FLS-F2进行PCR扩增，3'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，68℃30s，72℃3min，30Cycles，结束，得到3'末端全长。PCR产物经电泳检测，扩增的比利时杜鹃花FLS基因5'末端区域如图2所示，3'末端区域如图3所示。

利用DNAMAN软件将比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列、5'和3'末端序列进行比对拼接，得到全长为1281bp的比利时杜鹃花FLS基因全长核苷酸序列SEQ ID NO.2，编码347个氨基酸，得到比利时杜鹃花FLS基因编码区氨基酸序列SEQ ID NO.3。

实施例3：用于比利时杜鹃花FLS基因荧光定量PCR的RT-PCR引物组，包括引物FLS-F3和FLS-R3，其序列分别为：

FLS-F3：TTGGTGGACAAGGAACGAACAAGG；

FLS-R3：GCGATGGCGGTACTCAGCATAC。

上述用于比利时杜鹃花FLS基因荧光定量PCR的RT-PCR引物组的获取方法为：根据比利时杜鹃花FLS基因的cDNA序列，利用Primer 5.0软件并结合Oligo 7.0软件，设计原则为退火温度(Tm)60℃左右，GC含量40℃-60℃，产物长度150-300bp，设计FLS-F3：TTGGTGGACAAGGAACGAACAAGG；FLS-R3：GCGATGGCGGTACTCAGCATAC。按照NovoScript PlusAll-in-one1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)试剂盒(近岸蛋白质科技有限公司)合成qRT-PCR的模板cDNA。以杜鹃18S为内参，设计内参引物18S-F和18S-R，内参基因引物分别为18S-F：AACCATAAACGATGCCGACCAGG；18S-R：TTCAGCCTTGCGACCATACTCCC；参考Transstart Tip Green qPCRSuperMixS说明书(北京全式金生物技术有限公司)进行qRT-PCR扩增，选取的材料为杜鹃花叶子、蕊雌、雄蕊以及花瓣。叶子和花瓣采自花朵发育第四阶段，雄蕊和雌蕊来源于花朵发育第三阶段。分析比利时杜鹃花FLS基因在花朵不同发育阶段中的表达情况时，采取不同发育阶段不同形态的花朵。每个单株植物只采取一种样品，样品采集后于液氮速冻后置于-80℃保存。每种样品分别提取RNA，用于后续实验。

荧光定量PCR检测比利时杜鹃花不同花期和不同组织部位FLS基因的表达量：提取红白比利时杜鹃不同花期(花苞期、初开期、盛开期、衰败期)和不同组织部位(雄蕊、雌蕊、花瓣、叶片)的总RNA，取5μL RNA溶液作为模板，用于合成Real-time PCR检测的cDNA第一链。按照HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)说明书进行操作。以合成的cDNA第一链为模板，按照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix说明书进行PCR反应，反应程序为：94℃30s；94℃5s，59℃30s，42Cycles；65℃5s；95℃5s，结束。qPCR反应结束后，从扩增曲线上得到每个样品中目的基因和内参基因的Ct值，利用2^{-[Ct(目的基因)-Ct(18s)]}得到目的基因对内参基因的表达水平，每种样品都设3次重复。利用SPSS 20做单因素方差分析以及Duncan新复极差法做显著性分析(P<0.05)，结果如图4图5所示。可见，FLS基因在两种不同花色的比利时杜鹃花的不同器官均有表达，在红花的叶子和雄蕊中的表达水平明显高于雌蕊和花瓣，而在雌蕊中的表达量最低；在白花的叶子中的表达水平显著高于雄蕊、雌蕊和花瓣，雌蕊中的表达量最低。由此说明叶片对黄酮醇合成酶的合成尤为关键，从而影响到比利时杜鹃花花色。

序列表

<110> 浙江万里学院

<120>比利时杜鹃花FLS基因、用于克隆该基因的引物组及其克隆方法和荧光定量引物组

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 603

<212> DNA

<213>黄酮醇合成酶基因RhFLS的保守域的核苷酸序列（SEQ ID NO.1）

<400>1

CACGTCATGCACCCGCCCAAGAAGGTCAATTACGACATTTGGCCCAAGAACCCTTCTTCTTACAGGGGAGCGACAGAGGAATATGGCAAGGAACTACAGCAAGTAACAAATAAGCTACTGGAGTTGCTCTCGGAGGGGCTAGGTTTGGAAGGGAAGGCATTAAGATCTTGTTTGAGGGACGAAGAAATAGAATACGAAATGAAAATAAACATGTACCCACCATGCCCGCAGCCTGAACTCGCCCTCGGAGTTGAACCCCACACGGACATGTCCGCTCTCACCCTGCTCGTCCCAAACGATGTTCCGGGCCTTCAGGTCTGGAAAGACGGTAACTGGGTCGCTGTCAACTACCTGCCAAACGCGCTTTTCGTCCATGTCGGTGATCAAGTTGAGGTGCTAAGCAACGGCAAGTACAAGAGCGTTCTTCACAGGAGTTTGGTGGACAAGGAACGAACAAGGATGTCATGGGCTGTGTTTGTTACGCCTCCACATGAAGCAATGATCGGTCCTATTCCGGAGCTCATTAACGAAGAAAACCCTTCCAAATATTCCACCAAAACGTATGCTGAGTACCGCCATCGCAAATTCAACAAGATTCCACAG

<210> 2

<211> 1281

<212> DNA

<213>黄酮醇合成酶基因RhFLS的全长核苷酸序列（SEQ ID NO.2）

<400>2

TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGGCCCATTCACATCATACACTAAAGTCTTAACCAAACAAAACACAAAGAGGAAAAACAGAAACATGGAGGTGGAGAGGGTGAGGGTCCAGTCGCTAGCCCACGGAGGCCTCCACGAGCTCCCGGCGCAGTTCATCCGCCCGGCCAGCGAGCGCCCTGAGAACAGCAAGGCCCTAGTCGGGGTCACGGTTCCCGTCGTCTCCCTCTCCCAGCCGCACGACGTCGTCGTGGACGAGATATCGAGGGCTTGCAGCGAGTGGGGGTTCTTCCTCCTCACGGACCACGACGTCTCGCCCGCGGCGATACTGCGGCTGAAGGAGGTGGGGGAGGAGTTCTTTAACCTCCCTCTCAAGGAGAAGGAGAGCTACGCAAACGACCCCTCCAGCGGGCGTTTCGATGGGTATGGAACGAAGATGACTAAAAATCTTGACGAGAAGGTTGAGTGGGTGGACTATTTTTTTCACGTCATGCACCCGCCCAAGAAGGTCAATTACGACATTTGGCCCAAGAACCCTTCTTCTTACAGGGGAGCGACAGAGGAATATGGCAAGGAACTACAGCAAGTAACAAATAAGCTACTGGAGTTGCTCTCGGAGGGGCTAGGTTTGGAAGGGAAGGCATTAAGATCTTGTTTGAGGGACGAAGAAATAGAATACGAAATGAAAATAAACATGTACCCACCATGCCCGCAGCCTGAACTCGCCCTCGGAGTTGAACCCCACACGGACATGTCCGCTCTCACCCTGCTCGTCCCAAACGATGTTCCGGGCCTTCAGGTCTGGAAAGACGGTAACTGGGTCGCTGTCAACTACCTGCCAAACGCGCTTTTCGTCCATGTCGGTGATCAAGTTGAGGTGCTAAGCAACGGCAAGTACAAGAGCGTTCTTCACAGGAGTTTGGTGGACAAGGAACGAACAAGGATGTCATGGGCTGTGTTTGTTACGCCTCCACATGAAGCAATGATCGGTCCTATTCCGGAGCTCATTAACGAAGAAAACCCTTCCAAATATTCCACCAAAACGTATGCTGAGTACCGCCATCGCAAATTCAACAAGATTCCACAGTACAACGTTTCGGCCACCTGCGGCGTTGGCATCGGAAAAGTTTGAATGGATTCTCTGTTACTGGGAATAAAGTCTTTTGGCTACTTAATTAGGAATTGCTAGTAATTTTCATTAATAATCATTTGTCCAGTTCAGAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

<210> 3

<211> 347

<212> RNA

<213>黄酮醇合成酶基因RhFLS的编码区氨基酸序列（SEQ ID NO.3）

<400> 3

MEVERVRVQSLAHGGLHELPAQFIRPASERPENSKALVGVTVPVVSLSQPHDVVVDEISRACSEWGFFLLTDHDVSPAAILRLKEVGEEFFNLPLKEKESYANDPSSGRFDGYGTKMTKNLDEKVEWVDYFFHVMHPPKKVNYDIWPKNPSSYRGATEEYGKELQQVTNKLLELLSEGLGLEGKALRSCLRDEEIEYEMKINMYPPCPQPELALGVEPHTDMSALTLLVPNDVPGLQVWKDGNWVAVNYLPNALFVHVGDQVEVLSNGKYKSVLHRSLVDKERTRMSWAVFVTPPHEAMIGPIPELINEENPSKYSTKTYAEYRHRKFNKIPQYNVSATCGVGIGKV

Claims

1.比利时杜鹃花FLS基因，其特征在于，该基因为黄酮醇合成酶基因RhFLS，其保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.用于克隆比利时杜鹃花FLS基因的引物组，其特征在于，包括用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物FLS-F1、FLS-R1、FLS-F2和FLS-R2，其序列分别为：

FLS-F1：GGAGAGCTACGCAAACGACC；

FLS-R1：TGGCAGCTAGAGGTTACGACTT；

FLS-F2：ACGACATTTGGCCCAAGAACCCT；

FLS-R2：GAGTACCGCCATCGCAAATTCAACA。

3.比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：比利时杜鹃花总RNA的提取和反转录；

步骤(2)：比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的扩增；

步骤(3)：比利时杜鹃花FLS基因3'RACE和5'RACE的扩增；

步骤(4)：PCR产物的克隆纯化与筛选。

4.根据权利要求3所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，步骤(2)的具体流程为：根据已知与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种的FLS基因的氨基酸及核苷酸序列，设计得到扩增比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列的引物FLS-F1和FLS-R1，以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，利用引物FLS-F1和FLS-R1进行PCR扩增反应，扩增得到比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1。

5.根据权利要求4所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25-35Cycles；72℃、2min，结束。

6.根据权利要求4所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，所述的与杜鹃花属植物亲缘关系相近的植物物种为山茶、猕猴桃、锦绣杜鹃、杜仲和芍药。

7.根据权利要求3所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，步骤(3)的具体流程为：首先根据比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列，设计基因特异引物FLS-F2和FLS-R2，再以

RACE 5'/3'Kit提供的5'/3'RACE Outer Primer和基因特异引物FLS-F2和FLS-R2为引物，并以比利时杜鹃花苞的cDNA为模板，进行5'/3'末端PCR扩增反应，扩增得到比利时杜鹃花FLS基因5'RACE和3'RACE，与步骤(2)中得到的比利时杜鹃花FLS基因保守域的核苷酸序列拼接，得到比利时杜鹃花FLS基因全长核苷酸序列，即SEQ IDNO.2。

8.根据权利要求7所述的比利时杜鹃花FLS基因的克隆方法，其特征在于，5'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，72℃3min，5Cycles；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5Cycles，结束；3'末端PCR扩增反应的反应程序为：94℃30s，68℃30s，72℃3min，30 Cycles，结束。

9.用于比利时杜鹃花FLS基因荧光定量PCR的RT-PCR引物组，其特征在于，包括引物FLS-F3和FLS-R3，其序列分别为：

FLS-F3：TTGGTGGACAAGGAACGAACAAGG；

FLS-R3：GCGATGGCGGTACTCAGCATAC。