WO2014017394A1 - 新規鉄・亜鉛結合性制御因子と、その発現調節による植物の鉄欠乏耐性向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進技術 - Google Patents

新規鉄・亜鉛結合性制御因子と、その発現調節による植物の鉄欠乏耐性向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進技術 Download PDF

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plant
zinc
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protein
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高範 小林
西澤　直子
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Definitions

  • the present invention relates to improvement of plant iron deficiency tolerance and promotion of iron / zinc accumulation in edible parts. Specifically, proteins, genes, vectors, transformants, gene-disrupted strains, antibodies, iron deficiency tolerance, and edible parts that have the function of controlling plant iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible part Plant production method with improved iron / zinc accumulation, composition for producing plants with improved iron deficiency tolerance and edible part, improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in edible part
  • the present invention relates to a plant production kit and a method for breeding a plant with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in edible parts.
  • Iron and zinc are required for plant growth, carbon fixation and material production. Plants take advantage of these by absorbing iron and zinc in the soil.
  • calcareous alkaline soil which accounts for about 30% of the world soil, there are few solubilized iron and zinc, and very little solubilized iron.
  • iron deficiency is a major limiting factor in the growth of plants in calcareous alkaline soils. Therefore, there is an urgent need to acquire plants that grow well even in poor soils such as calcareous alkaline soils.
  • plants that have absorbed iron and zinc from the soil are the main source of minerals for humans. Since iron deficiency and zinc deficiency are a serious problem for people all over the world, particularly children and women, it is desired to obtain plants containing a large amount of iron and zinc in the edible part.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and in calcareous soil, shows growth superior to that of ordinary plants, and can accumulate a large amount of iron and zinc in the edible part in both calcareous soil and excellent soil.
  • a composition for producing a plant with improved iron / zinc accumulation in the edible part a plant production kit with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible part, and iron deficiency tolerance and edible
  • a method for breeding plants with improved iron and zinc accumulation in the area is provided.
  • the edible part examples include plant seeds, above-ground parts, foliage, and roots, but are not necessarily limited to these parts as long as they are edible for food and feed.
  • the said plant is a rice, as a part corresponded to a seed, the brown rice, the germinated rice which polished this, classified rice, white rice etc. are mentioned.
  • the present inventors have found a protein having a function of suppressing the iron deficiency response of plants.
  • the inventors have found that by producing a plant that suppresses the expression of a gene encoding the protein, it is possible to improve the iron deficiency tolerance of the plant and the accumulation of iron and zinc in the edible part, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a protein, gene, vector, transformant, gene disruption strain, antibody, method for producing a plant with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible part, iron deficiency having the following characteristics: Composition for producing plants with improved tolerance and accumulation of iron and zinc in edible parts, kit for producing plants with enhanced iron deficiency tolerance and accumulation of iron and zinc in edible parts, and tolerance and deficiency in iron deficiency
  • the present invention provides a method for breeding plants with improved iron and zinc accumulation in the edible part.
  • a protein comprising the amino acid sequence of any one of the following (a) to (c) and being an iron / zinc binding regulator.
  • (2) a gene comprising a DNA of any one of the following (d) to (g) and encoding a protein that is an iron / zinc binding regulator.
  • the vector according to (4) which is capable of expressing an RNAi-inducible nucleic acid capable of suppressing the expression of the gene at the mRNA level.
  • the vector according to (5) wherein the RNAi-inducible nucleic acid has the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • a transformant obtained by introducing any one of the vectors (4) to (6) into a host.
  • a gene-disrupted strain comprising genomic DNA in which the gene of (2) or (3) is disrupted by incorporating an insertion sequence.
  • a method for producing a plant with improved deficiency in iron deficiency and iron / zinc accumulation in the edible portion comprising the step of introducing any one of the vectors (4) to (6) into the plant .
  • a composition for producing a plant having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in an edible part comprising the vector according to any one of (4) to (6).
  • a plant production kit having improved resistance to iron deficiency and iron / zinc accumulation in the edible portion comprising the vector according to any one of (4) to (6).
  • a method for breeding a plant with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in an edible part comprising the step of detecting the protein of (1) contained in an extract from a plant.
  • the present invention it is possible to produce a transformant and a gene-disrupted strain that show growth superior to ordinary plants in calcareous soil and can accumulate a large amount of iron and zinc in both calcareous soil and excellent soil. it can. Furthermore, according to the present invention, it is possible to contribute to carbon fixation / substance production in poor soil and alleviation of human iron / zinc deficiency.
  • FIG. 1 shows the region structure of the OsHRZ1 protein and OsHRZ2 protein of the present invention.
  • FIG. 2 shows the genome structure in the gene disruption strain of the present invention.
  • FIG. 3 shows a phylogenetic tree and a region structure of a protein having a hemerythrin region.
  • FIG. 4 shows the analysis results of mRNA expression levels of OsHRZ1 and OsHRZ2 using quantitative RT-PCR.
  • FIG. 5 shows the region structure of the prepared recombinant protein.
  • FIG. 6 shows the analysis results of the ability to bind to metal in wild type and mutant OsHRZ proteins.
  • FIG. 7 shows a photograph of the tube containing each recombinant protein lysate.
  • FIG. 8 shows the analysis result of the expression level of OsHRZ2 mRNA using quantitative RT-PCR in the OsHRZ2 expression-suppressed strain.
  • FIG. 9 shows the quantification result of the chlorophyll content in the latest leaf of the OsHRZ2 expression suppression strain under iron-deficient cultivation conditions.
  • FIG. 10 shows the quantification result of the chlorophyll content in the latest leaf of the OsHRZ2 expression suppression strain under long-term cultivation of calcareous soil.
  • FIG. 11 shows photographs of seedling heights of untreated (NT) rice and OsHRZ2 expression-suppressed strains under cultivation in calcareous soil for 28 days.
  • FIG. 12 shows the results of genomic PCR in the OsHRZ disrupted strain.
  • FIG. 13 shows the quantification result of the chlorophyll content in the newest leaf of the OsHRZ destruction strain under iron deficiency cultivation conditions.
  • FIG. 14 shows the accumulated iron concentration in leaves of OsHRZ2 expression-suppressed strains that were hydroponically cultivated for 7 days under iron-deficient conditions and iron-deficient conditions.
  • FIG. 15 shows the concentration of accumulated iron in rice straw of OsHRZ2 expression-suppressed strains grown in pots in calcareous soil and normal soil.
  • FIG. 16 shows the concentration of accumulated iron in the seeds of OsHRZ2 expression-suppressed strains that have been cultivated in calcareous soil and in normal soil.
  • FIG. 17 shows the accumulated iron concentration in brown rice and white rice of OsHRZ2 expression-suppressed strains cultivated in normal soil in an isolated field.
  • FIG. 18 shows the accumulated zinc concentration in seeds of OsHRZ2 expression-suppressed strains grown in pots in calcareous soil and normal soil.
  • FIG. 19 shows the accumulated zinc concentration in brown rice and white rice of an OsHRZ2 expression-suppressed strain cultivated in normal soil in an isolated field.
  • FIG. 20 shows the accumulated iron concentration in the seeds of the OsHRZ-disrupted strain grown in a pot in normal soil.
  • FIG. 21 shows the accumulated zinc concentration in seeds of OsHRZ-disrupted strains grown in pots in normal soil.
  • FIG. 22 shows the concentration of accumulated iron in rice straw of an OsHRZ-disrupted strain grown in a pot in normal soil.
  • FIG. 23 shows the accumulated zinc concentration in rice straw of OsHRZ-disrupted strains grown in pots in normal soil.
  • FIG. 24 shows the results of gene expression profile analysis using a 44K microarray in the roots of OsHRZ2 expression-suppressed strains that were hydroponically cultivated under iron-sufficient and iron-deficient conditions.
  • FIG. 25 shows the result of microarray analysis, which was verified using quantitative RT-PCR for genes whose expression was increased in the roots of OsHRZ2 expression-suppressed strains under sufficient iron conditions.
  • the protein of the present invention comprises any one of the following amino acid sequences (a) to (c) and is an iron / zinc binding regulator.
  • Amino acid sequence whose identity is 80% or more.
  • the amino acid sequence (a) is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the inventor has obtained proteins consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, as Oryza sativa Heterythrin-Mitting-Containing Really-Interesting New Gene (RING) -and Zinc-finger protein (hereinafter referred to as OZH and Zinc-finger protein). It was named OsHRZ2.
  • OsHRZ1 is involved in three putative hemerythrin (also known as HHE) regions from the N-terminal side to the C-terminal side, transcriptional control, post-transcriptional control, proteolytic control, etc.
  • OsHRZ2 has one heme erythrin region, three Zn finger regions (CHY-like Zn finger region, CTCHY-like Zn finger region, and RING-Zn finger region) from the N-terminal side to the C-terminal side. ) And a Rubredoxin-like motif. Expression of these OsHRZ protein-encoding genes is induced under cultivation under iron-deficient conditions.
  • OsHRZ protein synthesized in plants is considered to function as an iron sensor that binds to iron and zinc via the heme erythrin region and detects the concentration ratio of iron to other metals in plant cells. Furthermore, OsHRZ1 and OsHRZ2 proteins mainly express iron uptake-related genes and iron transfer-related genes through the three Zn finger regions presumed to be involved in transcriptional control, post-transcriptional control, and proteolytic control. Suppressed under sufficiently cultivated conditions.
  • Examples of (b) include a protein having a mutation (deletion, insertion, substitution, or addition) at a site other than the heme erythrin region, or a mutation in the heme erythrin region that retains iron / zinc binding activity.
  • the protein which has is mentioned.
  • region for example And proteins having mutations that retain the ability to suppress the expression of iron uptake-related genes and iron transfer-related genes.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, even more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3. One or two is most preferable.
  • introducing a mutation into one or several amino acids is easily performed using a well-known technique. For example, according to a known point mutation introduction method, an arbitrary base in a gene encoding a protein can be mutated.
  • a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site in a gene encoding a protein.
  • Examples of (c) include a protein having a mutation (deletion, insertion, substitution, or addition) at a site other than the heme erythrin region, or a mutation in the heme erythrin region that retains iron / zinc binding activity.
  • the protein which has is mentioned.
  • proteins having mutations that retain the ability to suppress the expression of iron uptake-related genes and iron transfer-related genes are examples of (c) include a protein having a mutation (deletion, insertion, substitution, or addition) at a site other than the heme erythrin region, or a mutation in the heme erythrin region that retains iron / zinc binding activity.
  • the protein which has which has is mentioned.
  • the homology (identity of amino acid sequences) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and 95% The above is particularly preferable, and 98% or more is most preferable.
  • a protein translation system comprising a cell-based vector for expressing a protein of the present invention in a host cell and a component having protein synthesis ability extracted from an appropriate cell.
  • a cell-free vector for expressing the protein of the present invention can be mentioned.
  • the cell system vector a known expression vector suitable for the host cell is used. Examples of Escherichia coli include ColEI-type plasmids typified by pBR322 derivatives, pACYC-type plasmids having a p15A origin, pSC-type plasmids, and Bac-type F factor-derived mini-F plasmids.
  • expression vectors having tryptophan promoters such as trc and tac, lac promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, arabinose-inducible promoter, cold shock promoter, tetracycline-inducible promoter, and the like.
  • the cell-free vector include an expression vector having a T7 promoter and an expression vector having a T3 promoter mentioned in the cell-based vector; a vector for wheat cell-free protein synthesis such as a pEU-based plasmid having an SP6 promoter or a T7 promoter. It is done.
  • cDNA is transcribed using a transcription system to synthesize mRNA.
  • transcription systems include conventionally known ones that are transcribed with RNA polymerase.
  • RNA polymerase examples include T7 RNA polymerase.
  • mRNA is translated using a cell-free protein synthesis system, which is a translation system, and a protein is synthesized.
  • This system contains elements necessary for translation, such as ribosomes, translation initiation factors, translation elongation factors, dissociation factors, and aminoacyl-tRNA synthetases.
  • protein translation systems include Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, and wheat germ extract.
  • a protein synthesized using a cell-based vector or a cell-free vector can be used in a cell-element extract, but can also be purified and used.
  • Examples of the purification method include salting out methods and methods using various chromatographies. If the expression vector is designed to express a tag sequence such as a histidine tag at the N-terminus or C-terminus of the target protein, use an affinity column that uses a substance having an affinity for this tag, such as nickel or cobalt.
  • a purification method is mentioned.
  • the purity of the protein of the present invention can be increased by appropriately combining and purifying, such as ion exchange chromatography and gel filtration chromatography.
  • the gene of the present invention encodes a protein comprising the amino acid sequence of any one of the above (a) to (c) and being an iron / zinc binding regulator.
  • the gene of the present invention encodes a protein that is composed of any one of the following DNAs (d) to (g) and that is an iron / zinc binding regulator.
  • the number of bases that may be deleted, substituted or added is preferably from 1 to 30, more preferably from 1 to 20, further preferably from 1 to 15, and particularly preferably from 1 to 10. 1 to 5 pieces are most preferable.
  • under stringent conditions includes, for example, a method described in MolecularMoCloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • 5 ⁇ SSC composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0
  • 0.1 wt% N-lauroyl sarcosine 0.02 wt% SDS
  • the hybridization can be performed by incubating at 55 to 70 ° C. for several hours to overnight in a hybridization buffer composed of a blocking reagent for nucleic acid hybridization and 50% formamide.
  • the washing buffer used for washing after incubation is preferably a 1 ⁇ SSC solution containing 0.1 wt% SDS, more preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1 wt% SDS.
  • RNAi-inducible nucleic acid capable of suppressing the expression of the gene at the mRNA level can be expressed.
  • An RNAi-inducible nucleic acid means a nucleic acid that can induce RNA interference when introduced into a plant cell.
  • RNA interference refers to the effect that RNA containing a base sequence complementary to mRNA (or a partial sequence thereof) suppresses the expression of the mRNA.
  • the mRNA targeted by the RNAi-inducing nucleic acid may be a coding region or a non-coding region.
  • the RNAi-inducible nucleic acid is preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and this RNAi-inducible nucleic acid targets the 3′UTR (untranslated region) full length of OsHRZ and a part of the coding region.
  • examples of the RNAi-inducible nucleic acid include siRNA and miRNA.
  • examples of vectors that are introduced into plant cells and cause RNAi in the same manner as siRNA include shRNA (short hairpin RNA / small hairpin RNA) expression vectors. According to the vector of the present invention, it is possible to improve plant iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation.
  • plant iron deficiency tolerance means the property of growing in soil with low solubilized iron content. For example, it causes iron deficiency called chlorosis (yellowing due to chlorophyll defect) in alkaline soil. It means characteristics such as difficulty.
  • iron / zinc accumulation means a characteristic that can accumulate high concentrations of iron and zinc in the above-ground part of rice, particularly in the edible seed. For example, seeds obtained by cultivating a transformant produced using the vector in normal soil in an isolated field (meaning an isolated field for genetic recombination provided based on a predetermined procedure). Contains about 3.8 times the amount of iron and about 1.2 times the amount of zinc compared to untreated rice seeds.
  • the vector of the present invention may be prepared by a well-known gene recombination technique.
  • the transformant of the present invention (sometimes referred to as expression-suppressed strain) is obtained by introducing the vector of the present invention into a host.
  • the vector of the present invention can improve the iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation of the host plant. Therefore, the transformant of the present invention is excellent in resistance to iron deficiency and can accumulate high concentrations of iron and zinc in the edible part.
  • the method for producing a plant having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation of the present invention means a method for producing a plant body having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation.
  • the method for producing a plant with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation according to the present invention is not particularly limited as long as it includes the step of introducing the vector of the present invention into a plant.
  • the vector to be used for transformation of a plant is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the gene of the present invention in the plant.
  • examples of such a vector include a vector having a promoter that constitutively expresses a gene in plant cells such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter; a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. Can be mentioned.
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, sieve parts, soft tissues, xylem, vascular bundles, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant culture cell, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus and the like.
  • plant organs eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.
  • plant tissues eg epidermis, sieve parts, soft tissues, xylem, vascular bundles, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.
  • a plant culture cell or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus and the like.
  • it does not specifically limit as a plant used for transformation It is preferable a Gramineae plant, and it is
  • transformation methods known to those skilled in the art for example, Agrobacterium method, gene gun, PEG method, electroporation method, etc.
  • Agrobacterium method for example, Agrobacterium tumefaciens
  • this strain is introduced into the leaf disk method (Hirofumi Uchimiya).
  • the plant gene manipulation manual (1990), pages 27-31, Kodansha Scientific, Tokyo) and the like can be used to infect sterile cultured leaf pieces to obtain transformed plants.
  • the method of Nagel et al. Micibiol. Lett., (1990) vol.
  • telomeres can be used.
  • an expression vector is first introduced into Agrobacterium, and then transformed Agrobacterium is transformed into a plant cell or a plant cell by the method described in Plant Molecular Biology Manual (SB Gelvin et al., Academic Press Publishers). It is a method of introducing into plant tissue.
  • plant tissue includes callus obtained by culturing plant cells.
  • pBI binary vectors for example, pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, and pPZP202
  • examples of methods for directly introducing genes into plant cells or plant tissues include electroporation and gene gun methods.
  • a gene gun the plant body, plant organ, plant tissue itself may be used as it is as a target for gene introduction, or it may be used after preparing a section, or a protoplast is prepared and used. Also good.
  • the sample thus prepared can be processed using a gene transfer apparatus (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)).
  • the treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
  • the cell or plant tissue into which the gene has been introduced is first selected for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant body by a conventional method. Regeneration of a plant body from a transformed cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
  • the selection marker is not limited to hygromycin resistance, and examples thereof include drug resistance to bleomycin, kanamycin, gentamicin, chloramphenicol and the like.
  • examples include a microinjection method, an electroporation method (electroporation method), a polyethylene glycol method, a gene gun (particle gun) method, a protoplast fusion method, and a calcium phosphate method.
  • electroporation method electroporation method
  • a polyethylene glycol method polyethylene glycol method
  • a gene gun (particle gun) method a protoplast fusion method
  • a calcium phosphate method By these methods, a recombinant vector is introduced into a cultured cell and transformed. Callus, shoots, hairy roots and the like obtained as a result of transformation can be used as they are in cell culture, tissue culture or organ culture. These can be regenerated to the plant body by administration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.) at an appropriate concentration using a conventionally known plant tissue culture method.
  • plant hormones auxin, cytokinin, gibberellin, abs
  • telomere length is a region of DNA sequence.
  • PCR is performed by designing a DNA-specific primer. PCR can be performed under conditions known to those skilled in the art. Thereafter, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis or the like, and stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, or the like. By detecting the amplified product as a single band, it can be confirmed that the transformation has been performed.
  • PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product. Furthermore, it is possible to employ a method in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or enzymatic reaction.
  • the transformant of the present invention includes a plant in which the vector of the present invention is introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or a tissue derived therefrom. .
  • the gene-disrupted strain of the present invention has genomic DNA in which the gene of the present invention is disrupted by incorporating an insertion sequence.
  • the present invention present on genomic DNA by inserting T-DNA (hrz1-1) into genomic DNA by homologous recombination, or by transposon (hrz2-1) transfer. Is disrupted and its expression is suppressed.
  • the expression of the gene and protein of the present invention is suppressed. Therefore, the constant suppression of expression of iron uptake-related genes and iron transfer-related genes is released, and iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in plants can be improved.
  • Tos17 insertion strain ND6059 (Rice Genome Resource Center) is preferable. Since this inserted strain is not a transformed plant, it is excellent in that it can grow immediately in a general field. As described above, the transformant and gene-disrupted strain of the present invention have excellent iron deficiency resistance in addition to the remarkable improvement of iron / zinc accumulation in the edible part. Therefore, it is particularly useful for stably producing iron-enriched foods under cultivation conditions such as semi-arid zones and calcareous soils that are potentially susceptible to iron deficiency.
  • composition for producing plants with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation contains the vector of the present invention.
  • the plant production kit with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation of the present invention comprises the vector of the present invention.
  • the “composition” means a form in which various components are contained in one substance.
  • “Kit” means a form in which at least one of various components is contained in another substance.
  • the “composition for producing a plant having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation” is a composition used for producing a plant body having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation.
  • kit for producing plants with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation is a kit used for producing plants with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation.
  • the transformant of the present invention is obtained by introducing the vector of the present invention into a host (plant). Thereby, the expression of the gene of the present invention is suppressed, and iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation can be improved.
  • the vector of the present invention can be introduced into a plant body. Therefore, the composition provided with the vector of the present invention or the kit provided with the vector is suitably used for producing a plant having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation.
  • composition for producing plants with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation according to the present invention, or the plant production kit with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation is the iron deficiency according to the present invention described above. It can be used as a vector source in a plant production method with improved tolerance and iron / zinc accumulation.
  • the composition for producing a plant with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation of the present invention may comprise a solvent, a dispersion medium, a reagent and the like in addition to the vector of the present invention.
  • the plant production kit with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation of the present invention comprises the vector of the present invention, a solvent, a dispersion medium, a reagent, instructions for using them, and the like. Also good.
  • “comprising” a solvent or the like, excluding the instructions means in any of individual containers (for example, bottles, plates, tubes, dishes, etc.) constituting the kit. It means a state that is included.
  • kit of the present invention may include, for example, the substance A and the substance B mixed in the same container or in separate containers.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc.
  • the kit of the present invention may include a container containing a diluent, a solvent, a cleaning liquid, and other reagents.
  • the antibody of the present invention is not limited as long as it specifically binds to the protein of the present invention, and may be a polyclonal antibody against the protein, but is preferably a monoclonal antibody against the protein.
  • Monoclonal antibodies are excellent in that they have the advantage that they are uniform in nature and easy to supply, and the production cells can be stored semipermanently as hybridomas.
  • antibody of the present invention examples include immunoglobulins (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, and these Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fc fragments), specifically, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Examples include, but are not limited to, antibodies, single chain antibodies and anti-idiotype antibodies.
  • immunoglobulins IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, and these Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fc fragments
  • polyclonal antibodies examples include, but are not limited to, antibodies, single chain antibodies and anti-idiotype antibodies.
  • the antibody of the present invention can be prepared according to various known methods.
  • monoclonal antibodies can be obtained by techniques known in the art (eg, hybridoma method (Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497 (1975)), trioma method, human B-cell hybridoma method (Kozbor , Immunology Today 4,72 (1983)) and EBV-hybridoma method (see Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96 (1985)).
  • peptide antibodies can be obtained by methods known in the art (for example, Chow, M., et. Al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1985) vol.82, pp.910-914; Bittle, F). J. et. Al., J. Gen. Virol. (1985) vol.66, pp2347-2354).
  • the antibody of the present invention includes fragments such as Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments.
  • fragments can typically be produced by proteolytically treating the antibody using enzymes such as papain (resulting in Fab fragments) or pepsin (resulting in F (ab ′) 2 fragments).
  • enzymes such as papain (resulting in Fab fragments) or pepsin (resulting in F (ab ′) 2 fragments).
  • fragments can be produced by application of recombinant DNA techniques or chemical synthesis.
  • the method for breeding a plant with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation according to this embodiment includes a step of detecting the protein of the present invention contained in an extract from the plant.
  • the plant breeding method with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation according to the present embodiment is a step of detecting the protein of the present invention in order to determine whether the expression of the protein of the present invention is suppressed in the plant body. Should be included. Based on the presence or absence of expression of the protein of the present invention, plants having iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible part are selected.
  • the protein of the present invention suppresses the expression of a gene having an important function when a plant acquires iron from soil. Therefore, the plant in which the expression of the protein is suppressed has a high ability to acquire iron, and iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation are improved.
  • the plant body bred according to the method of this embodiment may be a natural plant body or a transformant.
  • An extract from a plant can be obtained by a freeze crushing method using liquid nitrogen or a commercially available extraction kit, but is not limited thereto.
  • the “extract” may be a crude product or a purified sample that has undergone several purification steps.
  • the step of detecting the protein of the present invention contained in the extract from the plant described above comprises detecting the protein of the present invention by reacting the extract from the plant with the antibody of the present invention.
  • the process to do is mentioned.
  • the antibody specifically binds to the protein of the present invention to form an immune complex, so that the protein expressed in the plant body can be easily detected by detecting the formation of the complex. can do.
  • Formation of the complex is detected using, for example, a method in which the antibody is previously labeled with an isotope or a method using a secondary antibody against the antibody. Specifically, a well-known Western blot method, protein chip method, etc. can be used.
  • the antibody of the present invention is suitably used in the plant breeding method of the present embodiment with improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible part. Therefore, the composition containing the antibody of the present invention or the kit comprising the antibody is suitably used for breeding plants having improved iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible part.
  • the plant breeding method of this embodiment includes a step of detecting the gene of the present invention contained in an extract from a plant.
  • the step of detecting the gene of the present invention contained in the extract from the plant includes a step of incubating an oligonucleotide consisting of a fragment of the gene of the present invention or a complementary sequence thereof with the extract from the plant.
  • the method further includes a step of hybridizing an extract from a plant with genomic DNA, mRNA or cDNA for the mRNA derived from the target plant.
  • the plant body in which the expression of the gene of the present invention is suppressed can be easily detected.
  • the protein of the present invention plays an important role in the response of plants to iron deficiency. Therefore, minute mutations in the amino acid sequence of the protein can affect the iron deficiency tolerance of plants and iron / zinc accumulation in the edible part.
  • minute mutations in the amino acid sequence of the protein can affect the iron deficiency tolerance of plants and iron / zinc accumulation in the edible part.
  • By using well-known and conventional techniques such as PCR method, hybridization method, microarray method, etc., it is possible to detect a single base unit mutation of a gene. By these techniques, fine mutation of the amino acid sequence of the protein encoded by the gene Can be detected.
  • Plants with improved deficiency tolerance and accumulation of iron and zinc in the edible part can also be bred.
  • the oligonucleotide means a combination of several to several tens or hundreds of nucleotides.
  • the oligonucleotide used in the breeding method of the present embodiment can be used as a PCR primer or a hybridization probe for obtaining the gene of the present invention or a fragment thereof.
  • the length of the oligonucleotide used in this embodiment is preferably 7 bases or more, more preferably 15 bases or more, still more preferably 20 bases or more, and most preferably 40 bases or more.
  • These oligonucleotides are synthesized by, for example, Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) type 392 synthesizer.
  • oligonucleotide used in the breeding method of the present embodiment as a hybridization probe for detecting a gene encoding the protein of the present invention or a primer for amplifying the gene, A plant or tissue in which gene expression is suppressed can be easily detected.
  • the present inventors analyzed an iron deficiency-inducible gene group using a microarray (Ogo, Y., et. Al., J. Exp. Bot. (2006) vol. 57, pp. 2867-2878). .
  • AK068028 NCBI accession number: SEQ ID NO: 4
  • this gene includes a gene encoding a putative hemerythrin (also known as HHE) region (see FIG. 1).
  • HHE putative hemerythrin
  • the hemerythrin region is conserved in invertebrates, bacteria, and mammals, and is known to bind to divalent iron and molecular oxygen.
  • a protein having a heme erythrin region functions as a protein that transports oxygen.
  • human FBXL5 protein is known as a protein having a heme erythrin region (see FIG. 3).
  • the heme erythrin region functions as an iron sensor, and FBXL5 recognizes iron regulatory protein 2 (hereinafter referred to as IRP2) via the F-box region that functions as an E3 ligase of the ubiquitin-proteasome system.
  • IRP2 iron regulatory protein 2
  • the protein encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 4 did not contain an F-box region, but contained a RING-Zn finger region that functions as an E3 ligase in the same manner as the F-box region. (See FIG. 1).
  • the protein encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 4 forms an iron-sulfur cluster for electron transfer with two other Zn finger regions presumed to be involved in transcription control, post-transcriptional control, proteolysis control, etc. And a putative Rubredoxin-like motif (see FIG. 1).
  • the present inventor has identified the proteins encoded by the genes represented by SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively, as Oryza sativa HEALTHYTHLIN MOTION-CONTAINING REAL INTERESTING NEW GENE (RING) -and Zinc-finger protein (Z). 1 and OsHRZ2.
  • the cDNAs of OsHRZ1 and OsHRZ2 were amplified from the cDNA pool of the rice cultivar “Moonlight” using PCR, and the amplified product was inserted into pCR (registered trademark) -Blunt II-TOPO (registered trademark) vector. It was confirmed.
  • RNA samples extracted from hydroponically cultivated rice roots or leaf blades are obtained by using NucleoSpin RNA Plant Mini Kit (manufactured by Machalai Nagel) and RiverTra Ace reverse transcriptase (manufactured by TOYOBO), or RNeasy Plank (Trade by Qiagen) and ReverseTra Ace qRT-PCR RT Master Mix with gDNA Remover (manufactured by TOYOBO) were treated with DNaseI and subjected to the reverse transcription reaction. Subsequently, real-time PCR was performed by StepOnePlus (trademark) Real-Time PCR System (Applied Biosystems) using cDNA synthesized by reverse transcription reaction.
  • NucleoSpin RNA Plant Mini Kit manufactured by Machalai Nagel
  • RiverTra Ace reverse transcriptase manufactured by TOYOBO
  • RNeasy Plank Trade by Qiagen
  • ReverseTra Ace qRT-PCR RT Master Mix with gDNA Remover manufactured by TOYOBO
  • FIG. 4 represents the copy number of OsHRZ1 or OsHRZ2 per 1 ⁇ g of RNA.
  • FIG. 4A is a graph showing the expression level in the root
  • FIG. 4B is a graph showing the expression level in the leaf.
  • the left of FIG. 4 is a graph showing the expression level in OsHRZ1
  • the right of FIG. 4 is a graph showing the expression level in OsHRZ2.
  • significant differences were tested by t test.
  • * indicates P ⁇ 0.05
  • ** indicates P ⁇ 0.01.
  • FIG. 4 in both leaves and roots, increased expression levels of OsHRZ1 and OsHRZ2 mRNA were confirmed under iron-deficient conditions.
  • the MBP fusion system (manufactured by New England Biolabs) was used for expression purification of the recombinant protein.
  • E. coli was cultured at 22 ° C. to 25 ° C. and the manual was followed except that EDTA was removed from the column buffer.
  • the recombinant protein was subjected to SDS-PAGE and separated, and the purity of the recombinant protein was confirmed by Coomassie brilliant blue staining.
  • the expressed recombinant protein was desalted using a PD-10 column (GE Healthcare), and then purified using an anion exchange column (Q-Sepharose; GE Healthcare).
  • the region structure of the prepared recombinant protein is shown in FIG. In FIG.
  • OsHRZ1 FL represents the full length of the OsHRZ1 protein
  • OsHRZ1 ⁇ RZ consists of a third hemerythrin region on the C-terminal side from the full length of the OsHRZ1 protein, three Zn finger regions presumed to be involved in transcription control, post-transcriptional control, proteolysis control, and iron for electron transfer. This represents a deletion of the C-terminal region containing a Rubredoxin-like motif presumed to form a sulfur cluster.
  • OsHRZ1 ⁇ H represents a length obtained by deleting the N-terminal region including all three heme erythrin regions from the full length of the OsHRZ1 protein.
  • OsHRZ1 ⁇ HRZ is a Cs containing the entire OsHRZ1 protein, an N-terminal region containing all two heme erythrin regions on the N-terminal side, a third heme erythrin region on the C-terminal side, three Zn finger regions, and a Rubredoxin-like motif. Represents the terminal region deleted.
  • OsHRZ2 FL represents the full length of the OsHRZ2 protein
  • OsHRZ1 ⁇ H represents the entire OsHRZ2 protein deleted from the N-terminal region including the heme erythrin region.
  • BTS FL represents the full-length protein of Arabidopsis homologs of OsHRZ1 and OsHRZ2 (see FIG.
  • the concentration of metal bound to these proteins was measured by inductively coupled emission spectroscopy.
  • the purified protein is quantified using a Bio-Rad protein assay kit (manufactured by Bio-Rad), and 0.1 to 1 mg of purified protein solution is 13.4M using a MarsXpress oven (manufactured by CEM).
  • the mixture was treated with 2 mL of HNO 3 at 220 ° C. for 20 minutes and wet ashed.
  • the molar concentration of iron and zinc was measured using an ICP emission spectrometer (ICPS-8100; manufactured by Shimadzu Corporation). The results are shown in FIG. In FIG.
  • the horizontal axis of the graph indicates the type of recombinant protein used, and the vertical axis of the graph indicates the number of moles of iron or zinc bound to 1 mole of protein.
  • the full length of the OsHRZ1 protein and the full length of the OsHRZ2 protein contain about 2 times mole of iron and zinc, and this binding ability is about 0.5 times mole by deleting the heme erythrin region. It decreased to the following.
  • the three Zn finger regions and the Rubredoxin-like motif were deleted, the amount of iron and zinc bound per mole of protein was not significantly reduced. As shown in FIG.
  • the BTS protein of Arabidopsis thaliana showed binding to iron and zinc, indicating that a heme erythrin-like iron / zinc binding protein is conserved among plant species. It was issued.
  • transformed rice was prepared by suppressing the expression of OsHRZ by RNAi method. Specifically, a 335 bp fragment (base sequence represented by SEQ ID NO: 5) corresponding to the entire 3′UTR of OsHRZ2 and a part of the coding region was amplified, and this amplified product was amplified with pENTR®-Blunt II. -Inserted into TOPO (R) vector. Subsequently, this fragment was transferred to the destination vector pIG121-RNAi-DEST (Ogo, Y., et. Al., Plant J. (2007) vol.
  • the present inventor conducted a long-term test of these transformants in calcareous soil.
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the amount of chlorophyll (SPAD value) in the latest leaf
  • the horizontal axis indicates the number of cultivation days after transplantation.
  • a decrease in the amount of chlorophyll in the leaves was observed in all rice.
  • the degree of this decrease was less in the OsHRZ2 expression-suppressed strain than in the untreated rice.
  • the amount of chlorophyll in the leaves of the OsHRZ2 expression-suppressed strain gradually recovered after 22 days after transplantation.
  • the seedling height of the OsHRZ2 expression suppression strain reflects iron deficiency tolerance.
  • the OsHRZ2 expression-suppressed strain showed a higher rice straw resource amount and crop yield compared to untreated (NT) rice.
  • the inventor obtained and analyzed an OsHRZ1-disrupted strain in which T-DNA was inserted into a rice genome gene and an OsHRZ2-disrupted strain in which Tos17 was inserted.
  • the OsHRZ1-disrupted strain is 3A-06066 strain obtained from South Korea POSTECH (Pohang University of Science and Technology).
  • the OsHRZ2 disruption strain is ND6059 strain obtained from the Rice Genome Resource Center.
  • FIG. 2 shows the insertion state of the inserted sequences (hrz1-1, hrz2-1) into the genome in the OsHRZ1-disrupted strain and the OsHRZ2-disrupted strain.
  • Genomic DNA was extracted from about 0.1 cm 2 leaf fragments of the OsHRZ1-disrupted strain and the OsHRZ2-disrupted strain using 100 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) /0.1 mM EDTA solution.
  • the extracted genomic DNA was subjected to PCR using KOD FX Neo (manufactured by TOYOBO).
  • KOD FX Neo manufactured by TOYOBO
  • FIG. 12 the arrows indicate the primers used and correspond to the primers that anneal on the genomic DNA shown in FIG.
  • hrz1-1 and hrz2-1 were specifically inserted into OsHRZ1 and OsHRZ2, respectively.
  • FIG. 13 shows the vertical axis indicates the amount of chlorophyll (SPAD value) in the latest leaf, and the horizontal axis indicates the number of cultivation days under iron-deficient conditions.
  • Fig. 13 (a) shows the amount of chlorophyll in the latest leaves of untreated (wild-type: WT) rice and OsHRZ1-disrupted strain
  • Fig. 13 (b) shows untreated (wild-type: WT) rice and OsHRZ2-disrupted strain. Shows the amount of chlorophyll in the latest leaf.
  • FIG. 13 shows the amount of chlorophyll in the latest leaf.
  • the OsHRZ1-disrupted strain retained a slightly higher amount of chlorophyll than untreated rice. Moreover, it was confirmed that the OsHRZ2-disrupted strain has a chlorophyll amount clearly higher than that of untreated rice, and exhibits resistance to iron-deficient cultivation conditions.
  • FIG. 17 (a) shows the result for brown rice
  • FIG. 17 (b) shows the result for white rice.
  • the OsHRZ2 expression-suppressed strain seeds had a higher concentration of iron compared to the untreated strain seeds, and therefore suppressed the OsHRZ gene expression. Accumulation of high-concentration iron was confirmed in the edible part of rice.
  • FIG. 18 (a) shows the results under iron-deficient conditions using calcareous soil
  • FIG. 18 (b) shows the results under iron-sufficient conditions using normal soil.
  • the seeds of the OsHRZ2 expression-suppressed strain were compared with the seeds of the untreated strain under both the iron-sufficient condition and the iron-deficient condition (FIG. 18 (a) and FIG. 18 (b)). It was confirmed that high concentration of zinc was accumulated.
  • FIG. FIG. 19 (a) shows the result for brown rice
  • FIG. 19 (b) shows the result for white rice.
  • the OsHRZ2 expression-suppressed strain seeds accumulated higher concentrations of zinc than the untreated strain seeds. Accumulation of high-concentration zinc was confirmed in the edible part of suppressed rice.
  • FIG. 20 (a) shows the result of iron accumulation in the seeds of the OsHRZ1-disrupted strain (hrz1-1)
  • FIG. 20 (b) shows the result of iron accumulation in the seeds of the OsHRZ2-disrupted strain (hrz2-1).
  • the OsHRZ-disrupted seeds accumulated a higher concentration of iron than the untreated rice (wild-type: WT) seeds.
  • FIG. 21 (a) shows the results of zinc accumulation in the seeds of the OsHRZ1-disrupted strain (hrz1-1)
  • FIG. 21 (b) shows the results of zinc accumulation in the seeds of the OsHRZ2-disrupted strain (hrz2-1).
  • the OsHRZ-disrupted seeds accumulated higher concentrations of zinc than the untreated rice (wild-type: WT) seeds. From this, accumulation of high concentration of zinc in the edible part of the OsHRZ-disrupted strain was confirmed.
  • FIGS. 22 and 23 show the results of iron accumulation in rice straw of OsHRZ-destructed strains (hrz1-1 and hrz2-1), and FIG. 23 shows zinc accumulation in rice straw of OsHRZ-destructed strains (hrz1-1 and hrz2-1). Results are shown.
  • the rice straw of the OsHRZ-disrupted strain accumulated higher concentrations of iron and zinc than the rice straw of untreated rice (wild type: WT). From this, it was confirmed that high concentrations of iron and zinc were accumulated in rice straw of the OsHRZ-disrupted strain.
  • Rice 44K microarray (manufactured by Agilent Technologies) contains 43144 60mer oligonucleotides based on sequence information obtained from the rice full-length cDNA project.
  • Total RNA was prepared from the roots of hydroponically cultivated OsHRZ2 expression-suppressed strains using NucleoSpin RNA Plant Mini Kit (manufactured by Macherey-Nagel).
  • FIG. 24 is a diagram showing expression profiles of various genes. As shown in FIG. 24, in the roots of the OsHRZ2 expression-suppressed strain, enhanced expression of various iron uptake-related genes and iron transfer-related genes was shown, particularly under iron-sufficient conditions. Furthermore, the results of microarray analysis under iron sufficient conditions were verified using quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG. In FIG. 25, the horizontal axis indicates the rice used, and the vertical axis indicates the mRNA expression intensity of each gene (OsIRO2, OsNAS2, OsYSL2). As shown in FIG. 25, it was confirmed that the expression change of each gene was consistent with the result of microarray analysis.
  • OsHRZ protein is a negative regulator that responds to iron deficiency, and by suppressing the expression of OsHRZ protein, it suppresses the expression of iron uptake-related genes and iron transfer-related genes mainly under iron-sufficient conditions. It was confirmed that can be released.
  • a plant having improved iron deficiency tolerance can be obtained, so that a crop that can grow even in alkaline soil or the like having a low solubilized iron content can be obtained. Furthermore, according to the present invention, it is possible to obtain a plant that significantly accumulates iron and zinc, particularly iron, in the edible portion, and therefore it is possible to obtain a crop that reduces iron deficiency and zinc deficiency. In particular, according to the present invention, a trait having both the above-mentioned iron deficiency tolerance and iron / zinc accumulation in the edible portion can be obtained, so that it is likely to fall into iron deficiency potentially in semi-arid areas and calcareous soils.
  • the present invention can be suitably used for "a novel iron / zinc-binding regulator and a technique for improving the iron deficiency tolerance of plants by regulating its expression and promoting the accumulation of iron / zinc in the edible part" and is extremely useful industrially It is.

Abstract

本発明により、石灰質土壌において通常の植物よりも優れた生育を示し、石灰質土壌及び優良土壌の双方において鉄及び亜鉛を多量に蓄積できる形質転換体及び遺伝子破壊株、並びに、これらを作出するために用いられる遺伝子、ベクター、タンパク質、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法・作出用組成物・作出用キット・育種方法が提供される。本発明のタンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であることを特徴とする。（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列。

Description

新規鉄・亜鉛結合性制御因子と、その発現調節による植物の鉄欠乏耐性向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進技術
　本発明は、植物の鉄欠乏耐性の向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進に関するものである。詳細には、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を制御する働きを有するタンパク質、遺伝子、ベクター、形質転換体、遺伝子破壊株、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット、並びに、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法に関するものである。　
　本願は、２０１２年７月２６日に、日本に出願された特願２０１２－１６６２３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　植物が成育し、炭素固定と物質生産を行うためには、鉄と亜鉛が必要である。植物は、土壌中の鉄及び亜鉛を吸収することにより、これらを利用する。
　しかしながら、世界の土壌のおよそ３０％を占めている石灰質アルカリ土壌では、可溶化した鉄及び亜鉛が少なく、中でも可溶化した鉄が極めて少ない。よって、石灰質アルカリ土壌での植物の生育において、鉄欠乏が主要な制限要因となっている。
　そのため、石灰質アルカリ土壌をはじめとする不良土壌においても良好に生育する植物の取得が急務である。
　また、土壌から鉄及び亜鉛を吸収した植物は、ヒトの主要なミネラル供給源である。鉄欠乏症及び亜鉛欠乏症は、世界中の人々、特に子供や女性にとって深刻な問題となっているため、可食部に多くの鉄及び亜鉛を含む植物の取得が望まれている。
　近年、鉄及び亜鉛（特に鉄）の吸収と利用に関与する遺伝子の同定及び解析が進んでいる。その遺伝子を改変して植物に導入することにより、鉄及び亜鉛の欠乏耐性が向上した植物、又は、可食部に多くの鉄及び亜鉛を蓄積する植物が取得されている（例えば、非特許文献１～１１参照）。
Takahashi, M., et. al., Nature Biotech., (2001) vol.19, pp.466-469. Ishimaru, Y., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2007) vol.104, pp.7373-7378. Suzuki, M., et. al., Soil Sci. Plant Nutr., (2008) vol.54, pp.77-85. Ogo, Y., et. al., Plant Mol. Biol., (2011) vol.75, pp.593-605. Goto, F., et .al., Nature Biotech., (1999) vol.17, pp.282-286. Uauy, C., et. al., Science, (2006) vol.314, pp.1298-1301. Masuda, H., et. al., Rice, (2008) vol.1, pp.100-108. Masuda, H., et. al., Rice, (2009) vol.2, pp.155-166. Lee, S., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009) vol.106, pp.22014-22019. Wirth, J., et .al., Plant Biotech. J., (2009) vol.7, pp.1-14. Ishimaru, Y., et .al., Plant J., (2010) vol.62, pp.379-390.
　しかしながら、石灰質土壌において、優良土壌における生育と同程度かそれ以上の生育を示す植物は取得されていない。また、石灰質土壌及び優良土壌の双方において、鉄及び／又は亜鉛を多量に（例えば、従来の２倍量以上）蓄積できる植物は取得されていない。
　従って、このような性質を有する植物を取得するという点では未だ改良の余地があった。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、石灰質土壌において、通常の植物よりも優れた生育を示し、石灰質土壌及び優良土壌の双方において、鉄及び亜鉛を可食部に多量に蓄積できる形質転換体及び遺伝子破壊株、並びに、これらを作出するために用いられる遺伝子、ベクター、タンパク質、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット、並びに、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法を提供する。可食部とは、例えば植物の種子、地上部、茎葉、根などが挙げられるが、食用、飼料用として可食である部分であれば、必ずしもこれらの部分に限定されない。なお前記植物が稲である場合、種子に相当する部分として玄米や、これを精米した胚芽米、分づき米、白米などが挙げられる。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、植物の鉄欠乏応答を抑制する働きを有するタンパク質を見出した。そのタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制した植物を作出することにより、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を向上できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記の特徴を有するタンパク質、遺伝子、ベクター、形質転換体、遺伝子破壊株、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット、並びに、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法を提供するものである。
（１）以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であることを特徴とするタンパク質。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、又は、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
（２）前記（１）のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（３）以下の（ｄ）～（ｇ）のいずれか一つのＤＮＡからなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、又は、
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）の遺伝子の発現を抑制し得ることを特徴とするベクター。
（５）前記遺伝子の発現をｍＲＮＡレベルで抑制し得るＲＮＡｉ誘導性核酸を発現可能である前記（４）のベクター。
（６）前記ＲＮＡｉ誘導性核酸が、配列番号５で表される塩基配列である前記（５）のベクター。
（７）前記（４）～（６）のいずれか一つのベクターを宿主に導入してなることを特徴とする形質転換体。
（８）挿入配列が組み込まれることにより、前記（２）又は（３）の遺伝子が破壊されているゲノムＤＮＡを有することを特徴とする遺伝子破壊株。
（９）前記（１）のタンパク質と特異的に結合することを特徴とする抗体。
（１０）前記（４）～（６）のいずれか一つのベクターを植物に導入する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法。
（１１）前記（４）～（６）のいずれか一つのベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物。
（１２）前記（４）～（６）のいずれか一つのベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット。
（１３）植物からの抽出液に含まれる前記（１）のタンパク質を検出する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
（１４）植物からの抽出液に含まれる前記（２）又は（３）の遺伝子を検出する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
　本発明によれば、石灰質土壌において、通常の植物よりも優れた生育を示し、石灰質土壌及び優良土壌の双方において、鉄及び亜鉛を多量に蓄積できる形質転換体及び遺伝子破壊株を作出することができる。
　更に、本発明によれば、不良土壌における炭酸固定・物質生産、及び、ヒトの鉄・亜鉛欠乏症の緩和に貢献することができる。
図１は、本発明のＯｓＨＲＺ１タンパク質及びＯｓＨＲＺ２タンパク質の領域構造を示す。 図２は、本発明の遺伝子破壊株におけるゲノム構造を示す。 図３は、ヘムエリスリン領域を有するタンパク質の系統樹及び領域構造を示す。 図４は、定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いたＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの解析結果を示す。 図５は、作製した組換えタンパク質の領域構造を示す。 図６は、野生型及び変異型ＯｓＨＲＺタンパク質における金属との結合能の解析結果を示す。 図７は、各組換えタンパク質溶解液を含んだチューブの写真を示す。 図８は、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株における定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いたＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの解析結果を示す。 図９は、鉄欠乏栽培条件下でのＯｓＨＲＺ２発現抑制株の最新葉におけるクロロフィル含量の定量結果を示す。 図１０は、石灰質土壌長期栽培下でのＯｓＨＲＺ２発現抑制株の最新葉におけるクロロフィル含量の定量結果を示す。 図１１は、石灰質土壌２８日間栽培下での未処理（ＮＴ）のイネ及びＯｓＨＲＺ２発現抑制株の苗丈の写真を示す。 図１２は、ＯｓＨＲＺ破壊株におけるゲノムＰＣＲの結果を示す。 図１３は、鉄欠乏栽培条件下でのＯｓＨＲＺ破壊株の最新葉におけるクロロフィル含量の定量結果を示す。 図１４は、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下で７日間水耕栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉における蓄積鉄濃度を示す。 図１５は、石灰質土壌中及び通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の稲わらにおける蓄積鉄濃度を示す。 図１６は、石灰質土壌中及び通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子における蓄積鉄濃度を示す。 図１７は、隔離圃場内の通常土壌で栽培したＯｓＨＲＺ２発現抑制株の玄米及び白米における蓄積鉄濃度を示す。 図１８は、石灰質土壌中及び通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子における蓄積亜鉛濃度を示す。 図１９は、隔離圃場内の通常土壌で栽培したＯｓＨＲＺ２発現抑制株の玄米及び白米における蓄積亜鉛濃度を示す。 図２０は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の種子における蓄積鉄濃度を示す。 図２１は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の種子における蓄積亜鉛濃度を示す。 図２２は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける蓄積鉄濃度を示す。 図２３は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける蓄積亜鉛濃度を示す。 図２４は、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下で水耕栽培されたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根での、４４Ｋマイクロアレイを用いた、遺伝子発現プロファイルの解析結果を示す。 図２５は、マイクロアレイ解析により、鉄十分条件下のＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根において発現上昇が認められた遺伝子について、定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いて検証した結果を示す。
＜ＯｓＨＲＺタンパク質＞
　本発明のタンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）いずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列。
　前記（ａ）のアミノ酸配列は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列である。
　本発明者は、配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を、それぞれ、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ　ｍｏｔｉｆ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｒｅａｌｌｙ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ　Ｎｅｗ　Ｇｅｎｅ　（ＲＩＮＧ)－　ａｎｄ　Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＯｓＨＲＺという）１及びＯｓＨＲＺ２と名付けた。
　図１に示すように、ＯｓＨＲＺ１は、Ｎ末端側からＣ末端側にかけて、三つの推定上のヘムエリスリン（ＨＨＥとしても知られている）領域と、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される二つのＺｎフィンガー領域（ＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域及びＣＴＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域）と、Ｅ３リガーゼとして機能してタンパク質分解制御に関与するＲＩＮＧ－Ｚｎフィンガー領域と、電子伝達の為に鉄硫黄クラスターを形成すると推定されるＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含んでいる。
　また、図１に示すように、ＯｓＨＲＺ２は、Ｎ末端側からＣ末端側にかけて、一つのヘムエリスリン領域と、三つのＺｎフィンガー領域（ＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域、ＣＴＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域及びＲＩＮＧ－Ｚｎフィンガー領域）と、Ｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含んでいる。
　鉄欠乏条件の栽培下、これらＯｓＨＲＺタンパク質をコードする遺伝子は、発現誘導される。
　植物中で合成されたＯｓＨＲＺタンパク質は、ヘムエリスリン領域を介して鉄及び亜鉛と結合し、植物細胞内の鉄と他の金属との濃度比を検出する鉄センサーとして機能すると考えられる。
　更に、ＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２タンパク質は、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される上記三つのＺｎフィンガー領域を介して、鉄取り込み関連遺伝子及び鉄移行関連遺伝子の発現を主に鉄十分条件の栽培下で抑制している。
　前記（ｂ）としては、例えば、ヘムエリスリン領域以外の部位に変異（欠失、挿入、置換、又は付加）を有するタンパク質、又はヘムエリスリン領域における変異であって鉄・亜鉛結合活性を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
　また、前記（ｂ）としては、例えば、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される上記三つのＺｎフィンガー領域以外の部位に変異を有するタンパク質、又は上記Ｚｎフィンガー領域における変異であって鉄取り込み関連遺伝子及び鉄移行関連遺伝子の発現抑制能を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
　ここで、欠失、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１ ～１０個が好ましく、１～７個がより好ましく、１ ～ ５個がさらにより好ましく、１～３個が特に好ましく、１～２個が最も好ましい。
　本発明のタンパク質を構成するアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸に変異を導入することは、周知技術を使用して容易に行われる。
　例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードする遺伝子中の任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードする遺伝子中の任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
前記（ｃ）としては、例えば、ヘムエリスリン領域以外の部位に変異（欠失、挿入、置換、又は付加）を有するタンパク質、又はヘムエリスリン領域における変異であって鉄・亜鉛結合活性を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
　また、前記（ｃ）としては、例えば、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される上記三つのＺｎフィンガー領域以外の部位に変異を有するタンパク質、又は上記Ｚｎフィンガー領域における変異であって鉄取り込み関連遺伝子及び鉄移行関連遺伝子の発現抑制能を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
　ここで、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との相同性（アミノ酸配列の同一性）としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
　本発明のタンパク質を発現させる為に用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞に本発明のタンパク質を発現させる細胞系ベクターと、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において本発明のタンパク質を発現させる、無細胞系ベクターが挙げられる。
　細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥＩ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
　無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
　無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いてｃＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
　次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いてｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
　更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
　細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質を、細胞素抽出液中で用いることもできるが、精製して用いることもできる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、本発明のタンパク質の純度を高めることができる。
＜ＯｓＨＲＺ遺伝子＞
　本発明の遺伝子は、前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードする。
　また、本発明の遺伝子は、以下の（ｄ）～（ｇ）のいずれか一つのＤＮＡからなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードする。
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号３又は４で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、又は、
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ。
　ここで、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ ～３０個が好ましく、１～２０個がより好ましく、１ ～１５個がさらに好ましく、１ ～１０個が特に好ましく、１ ～ ５個が最も好ましい。
　本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム,０．３Ｍ クエン酸溶液,ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
＜ＯｓＨＲＺ遺伝子発現抑制ベクター＞
　本発明のベクターは、上述した本発明の遺伝子の発現を抑制し得るものである。前記遺伝子の発現をｍＲＮＡレベルで抑制し得るＲＮＡｉ誘導性核酸を発現可能であることが好ましい。
　ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、植物細胞内に導入されることによりＲＮＡ干渉を誘導し得る核酸を意味する。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡ（又はその部分配列）に相補する塩基配列を含むＲＮＡが、そのｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。
　ＲＮＡｉ誘導性核酸が標的とするｍＲＮＡは、コーディング領域であっても、ノンコーディング領域であってもよい。前記ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、配列番号５で表される塩基配列であることが好ましく、このＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＯｓＨＲＺの３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ）全長およびコーディング領域の一部を標的とする。
　また、ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡが挙げられる。植物細胞内に導入され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすベクターとしては、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ／ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）発現ベクターが挙げられる。
　本発明のベクターによれば、植物の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積を向上させることができる。
　ここで、「植物の鉄欠乏耐性」とは、可溶化した鉄分の少ない土壌でも生育できる特性を意味し、例えば、アルカリ土壌においてクロローシス（クロロフィルの欠陥による黄色化）と称される鉄欠乏症を起こしにくい等の特性を意味する。
　また、「鉄・亜鉛蓄積」とは、イネの地上部、特に可食部である種子中に高濃度の鉄及び亜鉛を蓄積できる特性を意味する。例えば、前記ベクターを用いて作出された形質転換体を隔離圃場（所定の手続きに基づいて設けられた遺伝子組換え用の隔離圃場を意味する。）内の通常土壌で栽培して得られた種子は、未処理のイネの種子と比較して、約３．８倍量の鉄を含有し、約１．２倍量の亜鉛を含有する。
　本発明のベクターは、周知の遺伝子組換え技術により作製してもよい。
＜形質転換体、並びに、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法＞
　本発明の形質転換体（発現抑制株ということもある。）は、本発明のベクターを宿主に導入してなるものである。上述したように、本発明のベクターは、宿主である植物の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積を向上させることができるものである。よって、本発明の形質転換体は、鉄欠乏耐性に優れ、かつ、とりわけ可食部に高濃度の鉄・亜鉛を蓄積することができる。
　また、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法とは、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物体を作製するための方法を意味する。本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法は、本発明のベクターを植物体内に導入する工程を含んでいれば特に限定されない。
　組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられるべきベクターは、その植物内で本発明の遺伝子の発現を抑制させることが可能なベクターであれば特に限定されない。
　このようなベクターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等の植物細胞内で遺伝子を構成的に発現させるプロモーターを有するベクター；外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
　本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、もしくは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等のいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されないが、イネ科植物であることが好ましく、イネ、オオムギ、コムギまたはトウモロコシであることがさらに好ましい。
　植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７～３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）等に従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得る方法が用いられ得る。
　また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（１９９０）ｖｏｌ．６７， ｐｐ３２５）が用いられ得る。この方法は、先ず、発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ． Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
　また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法等が挙げられる。遺伝子銃を用いる場合は、遺伝子を導入する対象として、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ－１０００（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０～２０００ｐｓｉ程度の圧力、４～１２ｃｍ程度の距離で行う。
　遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
　植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。これらの方法によって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能である。これらは従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
　遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、当業者に公知の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色する。そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
　本発明のベクターがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、その植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、前記植物体またはその子孫、もしくはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に前記植物体を量産することができる。
　従って、本発明の形質転換体には、本発明のベクターが発現可能に導入された植物体、若しくは、その植物体と同一の性質を有する前記植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
＜遺伝子破壊株＞
　本発明の遺伝子破壊株は、挿入配列が組み込まれることにより、本発明の遺伝子が破壊されているゲノムＤＮＡを有する。例えば、図２に示されるように、相同組換えによりゲノムＤＮＡにＴ－ＤＮＡ（ｈｒｚ１－１）を挿入させることにより、またはトランスポゾン（ｈｒｚ２－１）の転移により、ゲノムＤＮＡ上に存在する本発明の遺伝子が破壊され、その発現が抑制される。
　本発明の遺伝子破壊株によれば、本発明の遺伝子及びタンパク質の発現が抑制されている。よって、鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の恒常的な発現抑制が解除され、植物中の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積を向上させることができる。
　本発明の遺伝子破壊株としては、Ｔｏｓ１７挿入株ＮＤ６０５９ ( イネゲノムリソースセンター) が好ましい。この挿入株は、形質転換植物ではないため、一般圃場ですぐに生育可能である点で優れている。
　本発明の形質転換体及び遺伝子破壊株は、上述した様に、可食部への顕著な鉄・亜鉛蓄積の向上に加えて、優れた鉄欠乏耐性を兼ね備えている。よって、半乾燥地帯や石灰質土壌等の潜在的に鉄欠乏に陥りやすい栽培条件において安定的に鉄富化食物を生産するのに特に有用である。
＜鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、並びに、作出用キット＞
　本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物は、本発明のベクターを含んでいる。また、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キットは、本発明のベクターを備えている。ここで、「組成物」とは、各種成分が一物質中に含有されている形態を意味する。「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態を意味する。
　また、「鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物」は、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物体を作製するために用いる組成物である。「鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット」は、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を作製するために用いるキットである。
　本発明の形質転換体は、本発明のベクターが宿主（植物）に導入してなるものである。これにより本発明の遺伝子が発現抑制され、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上され得る。そして、上述したように、本発明のベクターを用いれば植物体に本発明のベクターを導入し得る。従って、本発明のベクターを備えている組成物、またはベクターを備えているキットは、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を作出するために好適に用いられる。
　即ち、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、又は、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キットは、上述した本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法におけるベクターの供給源として用い得る。
　本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物は、本発明のベクターの他、溶媒、分散媒、試薬等を備えていてもよい。
　また、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キットは、本発明のベクターの他、溶媒、分散媒、試薬、それらを使用するための指示書などを備えていてもよい。ここで、本発明のキットにおいて、指示書を除く、溶媒等を「備えている」とは、キットを構成する個々の容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）のいずれかの中に内包されている状態を意味する。
　また、本発明のキットは、例えば、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。また、本発明のキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液、その他の試薬を内包した容器を備え得ていてもよい。
＜抗体＞
　本発明の抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体であれば限定されず、前記タンパク質に対するポリクローナル抗体等でもよいが、前記タンパク質に対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすく、その産生細胞をハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する点で優れている。
　本発明の抗体としては、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が挙げられ、具体的には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。
　尚、本発明の抗体は、種々の公知の方法に従い作製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、この分野において公知の技術（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５－４９７ （１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ－細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２ （１９８３））およびＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ７７－９６ （１９８５））等参照）を用いることにより、作製され得る。
　また、ペプチド抗体は、この分野に公知の方法（例えば、Ｃｈｏｗ， Ｍ．，ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （１９８５） ｖｏｌ．８２， ｐｐ．９１０－９１４； Ｂｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ．ｅｔ． ａｌ．，  Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８５）　ｖｏｌ．６６， ｐｐ２３４７－２３５４）に従うことにより作製され得る。
　本発明の抗体は、上述したようにＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメント等のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用して、抗体をタンパク質分解することにより産生され得る。
　または、このようなフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
＜育種方法＞
［第一実施形態］
　本実施形態の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法は、植物からの抽出物に含まれる本発明のタンパク質を検出する工程を含む。
　本実施形態の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法は、植物体内で本発明のタンパク質の発現が抑制されているかどうかを判別するために、本発明のタンパク質を検出する工程を含んでいればよい。本発明のタンパク質の発現の有無に基づいて、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を有する植物を選抜する。
　上述したように、本発明のタンパク質は、植物が土壌から鉄を獲得する際に重要な働きを有する遺伝子の発現を抑制する。従って、上記タンパク質の発現が抑制された植物は鉄を獲得する能力が高く、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上している。
　なお、本実施形態の方法に従って育種された植物体は、天然の植物体であっても形質転換体であってもよい。
　植物からの抽出物は、液体窒素を用いた凍結破砕法や、市販の抽出キットを用いて取得することができるが、これらに限定されない。また、「抽出物」は、粗精製物であってもいくつかの精製工程を経た精製標品であってもよい。
　本実施形態の育種方法において、上記植物からの抽出物に含まれる本発明のタンパク質を検出する工程としては、その植物からの抽出物を本発明の抗体と反応させることにより本発明のタンパク質を検出する工程が挙げられる。上述したように上記抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合して免疫複合体を形成するので、その複合体の形成を検出することにより植物体内において発現されている上記タンパク質を容易に検出することができる。
　上記複合体の形成は、例えば、上記抗体を予め同位体などで標識する方法、又は、上記抗体に対する２次抗体を用いる方法等を用いて検出される。具体的には、周知のウェスタンブロット法、プロテインチップ法等が用いられ得る。
　また、本発明の抗体は、本実施形態の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法に好適に用いられる。従って、本発明の抗体を含んでいる組成物または前記抗体を備えているキットは、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を育種するために好適に用いられる。
［第二実施形態］
　本実施形態の植物の育種方法は、植物からの抽出物に含まれる本発明の遺伝子を検出する工程を含む。
　上記植物からの抽出物に含まれる本発明の遺伝子を検出する工程は、本発明の遺伝子のフラグメント、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを、前記植物からの抽出物とインキュベートする工程を含むことが好ましく、植物からの抽出物を目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を含むことがより好ましい。
　本実施形態の育種方法を用いてハイブリダイズした標的遺伝子を検出することによって、本発明の遺伝子の発現が抑制された植物体を容易に検出することができる。
　さらに、上述したように、本発明のタンパク質は、鉄欠乏に対する植物体の応答において重要な働きをする。そのため、上記タンパク質のアミノ酸配列の細かな変異が、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積に影響を及ぼし得る。ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法等の周知慣用の技術を用いることにより遺伝子の１塩基単位の変異を検出し得るため、これらの技術により、前記遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の細かな変異を検出し得ることができる。
　したがって、本実施形態の植物の育種方法を用いることにより、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積に影響を及ぼす上記タンパク質のアミノ酸配列の細かな変異に基づいて、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を育種することもできる。
　本実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドが数個ないし数十個または数百個結合したものを意味する。
　本実施形態の育種方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子またはそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
　本実施形態に用いられるオリゴヌクレオチドの長さとしては、７塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、２０塩基以上が更に好ましく、４０塩基以上が最も好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザー等によって合成される。
　このように、本実施形態の育種方法において用いられるオリゴヌクレオチドを、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を検出するハイブリダイゼーションプローブ、または前記遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することによって、本発明の遺伝子の発現が抑制された植物体または組織を容易に検出することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[イネ由来新規鉄結合タンパク質の同定]
　本発明者らは、鉄欠乏誘導性遺伝子群について、マイクロアレイを用いて解析した（Ｏｇｏ， Ｙ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ． （２００６） ｖｏｌ．５７， ｐｐ．２８６７－２８７８）。これら遺伝子群の中で、鉄センサーとして一つの候補遺伝子ＡＫ０６８０２８(ＮＣＢＩのアクセッション番号：配列番号４）に着目した。上述したように、この遺伝子は、推定上のヘムエリスリン（ＨＨＥとしても知られている）領域をコードする遺伝子を含んでいる（図１参照）。ヘムエリスリン領域は、無脊椎動物、バクテリア、及び哺乳類まで保存されており、二価鉄及び分子状酸素と結合することが知られている。
　無脊椎動物において、ヘムエリスリン領域を有するタンパク質は酸素を輸送するタンパク質として機能している。
　一方、ヒトにおいては、ヘムエリスリン領域を有するタンパク質としてヒトＦＢＸＬ５タンパク質が知られている（図３参照）。ヒトＦＢＸＬ５タンパク質においてヘムエリスリン領域は鉄センサーとして働き、ＦＢＸＬ５はユビキチン－プロテアソーム系のＥ３リガーゼとして機能するＦ－ボックス領域を介して、鉄制御タンパク質２（Ｉｒｏｎ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２；以下、ＩＲＰ２という。）を認識して分解することが知られている（Ｒｏｕａｕｌｔ， Ｔ． Ａ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ｖｏｌ．３２６， ｐｐ．６７６－６７７； Ｖａｓｈｉｓｈｔ， Ａ．，ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ｖｏｌ．３２６， ｐｐ．７１８－７２１； Ｓａｌａｈｕｄｅｅｎ， Ａ． Ａ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ｖｏｌ．３２６， ｐｐ．７２２－７２６）。
　興味深いことに、配列番号４で表される遺伝子がコードするタンパク質は、Ｆ－ボックス領域を含んでいなかったが、Ｆ－ボックス領域と同様にＥ３リガーゼとして機能するＲＩＮＧ－Ｚｎフィンガー領域を含んでいる（図１参照）。配列番号４で表される遺伝子がコードするタンパク質は転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される二つの他のＺｎフィンガー領域と、電子伝達の為に鉄硫黄クラスターを形成すると推定されるＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含んでいる（図１参照）。
　データベースサーチにより、ヘムエリスリン領域をコードする遺伝子を含む遺伝子を、イネにおいて更に２つ見出し（図３参照；ＯｓＨＯＲＺ１及び後述するＯｓＨＲＺ１）、シロイヌナズナにおいて４つ見出した（図３参照；ＢＴＳ， Ａｔ３ｇ５４２９０， Ａｔ１ｇ７４７７０， Ａｔ１ｇ１８９１０）。これらのうち、ＡＫ２８８３９４ (ＮＣＢＩのアクセッション番号：配列番号３）がコードするタンパク質は、配列番号４で表される遺伝子がコードするタンパク質が有する全ての領域構造を含有しており、更に２つのヘムエリスリン領域を有している（図１参照）。
　よって、本発明者は、配列番号３及び４で表される遺伝子がコードするタンパク質を、それぞれ、Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ　ｍｏｔｉｆ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｒｅａｌｌｙ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ　Ｎｅｗ　Ｇｅｎｅ　（ＲＩＮＧ)－　ａｎｄ　Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＯｓＨＲＺという）１及びＯｓＨＲＺ２と名付けた。
　ＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｃＤＮＡをイネ栽培品種「月の光」のｃＤＮＡプールからＰＣＲを用いて増幅し、この増幅産物をｐＣＲ（登録商標）－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒに挿入し、塩基配列を確認した。
[鉄欠乏栽培条件に応答したＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２の発現レベルの変化]
　イネ品種「日本晴」の葉及び根における、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下でのＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの変化を、定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いて解析した。
　詳細には、水耕栽培したイネの根又は葉身から抽出したＲＮＡサンプルを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（マッハライ・ナーゲル社製）及びＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、又は、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ(キアゲン社製) 及びＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ ｑＲＴ－ＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＤＮａｓｅＩを用いて処理し、逆転写反応に供した。次いで、逆転写反応により合成したｃＤＮＡを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ (アプライドバイオシステムズ社製)により、リアルタイムＰＣＲを行った。試薬として、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ及びＥｘＴａｑ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ－ＰＣＲ　ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ社製) 、又は、 ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製)を用いた。標的とする転写産物の量を、イネα－２チューブリンの転写レベルで補正し、１μｇの全ＲＮＡ当たりのコピー数として表した。
　結果を図４に示す。図４のグラフ横軸は、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下での栽培日数を示す。＋７ｄは、鉄十分条件下、７日栽培後のイネ由来のサンプルを表し、－１ｄは、鉄欠乏条件下、１日栽培後のイネ由来のサンプルを表し、－７ｄは、鉄欠乏条件下、７日栽培後のイネ由来のサンプルを表す。図４のグラフ縦軸は、ＲＮＡ１μｇ当たりのＯｓＨＲＺ１又はＯｓＨＲＺ２のコピー数を表す。図４（ａ）は、根における発現レベルを表したグラフであり、図４（ｂ）は、葉における発現レベルを表したグラフである。図４左は、ＯｓＨＲＺ１における発現レベルを表したグラフであり、図４右は、ＯｓＨＲＺ２における発現レベルを表したグラフである。また、以降の実施例において、有意差については、ｔ検定により検定を行った。以降の図中、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
　図４に示すように、葉及び根の両方において、鉄欠乏条件下でＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの上昇が確認された。
[組換えＯｓＨＲＺ１タンパク質及びＯｓＨＲＺ２タンパク質の鉄結合能の評価]
　植物由来のヘムエリスリン領域が鉄との結合能を有するかどうかについては知られていない。発明者は、先ず、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子の下流に、全長ＨＲＺ遺伝子又はＨＲＺ欠失変異遺伝子を繋いだものをｐＭＡＬ－ｃ２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に挿入した発現ベクターを作製した。
　次いで、これらマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合ＯｓＨＲＺ組換えタンパク質の複数の欠失変異体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに発現させて作製した。組換えタンパク質の発現精製については、ＭＢＰフュージョンシステム（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いた。大腸菌を２２℃～２５℃で培養しカラムバッファーからＥＤＴＡを除いた以外は、マニュアルに従った。組換えタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して分離した後、クマシー・ブリリアント・ブルー染色により組換えタンパク質の純度を確認した。発現させた組換えタンパク質を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて脱塩した後、陰イオン交換カラム（Ｑ－セファロース；ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。作製した組換えタンパク質の領域構造を図５に示す。
　図５中、ＯｓＨＲＺ１　ＦＬは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長を表し、ＯｓＨＲＺ１　
ΔＲＺは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長から、Ｃ末端側にある３番目のヘムエリスリン領域と、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される三つのＺｎフィンガー領域と、電子伝達の為に鉄硫黄クラスターを形成すると推定されるＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含むＣ末端領域を欠失させたものを表す。ＯｓＨＲＺ１　ΔＨは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長から、三つのヘムエリスリン領域全てを含むＮ末端領域を欠失させたものを表す。ＯｓＨＲＺ１　ΔＨＲＺは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長から、Ｎ末端側にある２つのヘムエリスリン領域全てを含むＮ末端領域と、Ｃ末端側にある３番目のヘムエリスリン領域と三つのＺｎフィンガー領域とＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフとを含むＣ末端領域を欠失させたものを表す。
　図５中、ＯｓＨＲＺ２　ＦＬは、ＯｓＨＲＺ２タンパク質全長を表し、ＯｓＨＲＺ１　
ΔＨは、ＯｓＨＲＺ２タンパク質全長から、ヘムエリスリン領域を含むＮ末端領域を欠失させたものを表す。ＢＴＳ　ＦＬは、ＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のシロイヌナズナホモログのタンパク質全長を表す（図３参照）。
　これらのタンパク質に結合している金属濃度を、誘導結合発光分光により測定した。詳細には、精製したタンパク質をＢｉｏ－Ｒａｄプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて定量し、ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓオーブン（ＣＥＭ社製）を用いて０．１～１ｍｇの精製タンパク質溶解液を１３．４Ｍ　ＨＮＯ３２ｍＬで２２０℃２０分処理し、湿式灰化した。鉄及び亜鉛のモル濃度を、ＩＣＰ発光分析装置（ＩＣＰＳ－８１００；島津製作所製）を用いて測定した。結果を図６に示す。
　図６中、グラフ横軸は、用いた組換えタンパク質の種類を示し、グラフ縦軸は、タンパク質１モルに結合している鉄又は亜鉛のモル数を示す。図６に示すように、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長及びＯｓＨＲＺ２タンパク質全長は、約２倍モル前後の量の鉄及び亜鉛を含んでおり、この結合能はヘムエリスリン領域を欠失させることにより約０．５倍モル以下にまで減少した。一方、三つのＺｎフィンガー領域とＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフとを欠失させても、タンパク質１モル当たりの鉄及び亜鉛結合量は顕著に減少しなかった。
　このことは、図７に示すように、ヘムエリスリン領域を含むＯｓＨＲＺ１　ＦＬタンパク質の濃縮溶解液が、ヘムエリスリン領域を含まないＯｓＨＲＺ１　ΔＨタンパク質の濃縮溶解液と比較して、鉄由来の赤茶色を呈していることからも明らかである。
　これらのことから、ＯｓＨＲＺタンパク質において、鉄及び亜鉛は、Ｚｎフィンガー領域やＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフよりも、ヘムエリスリン領域に主に結合することが確認された。また、シロイヌナズナのＢＴＳタンパク質も、ＯｓＨＲＺ１タンパク質及びＯｓＨＲＺ２タンパク質と同様に、鉄及び亜鉛との結合を示したことから、ヘムエリスリン様の鉄・亜鉛結合性タンパク質が植物種間で保存されていることが見出された。
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネにおける鉄欠乏耐性能の確認]
　ＯｓＨＲＺの機能を調べるため、ＲＮＡｉ法によりＯｓＨＲＺの発現を抑制した形質転換イネを作製した。具体的には、ＯｓＨＲＺ２の３’ＵＴＲ全長およびコーディング領域の一部に相当する３３５ｂｐの断片（配列番号５で表される塩基配列）を増幅し、この増幅産物をｐＥＮＴＲ（登録商標）－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒに挿入した。次いで、ＬＲクロナーゼ反応により、この断片をデスティネーションベクターｐＩＧ１２１－ＲＮＡｉ－ＤＥＳＴ（Ｏｇｏ， Ｙ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔ　Ｊ． （２００７） ｖｏｌ．５１， ｐｐ．３６６－３７７）に、正逆両方向に１コピーずつリンカー配列を介して挿入して、発現ベクターを作製した。
　次いで、定法に従い、ＯｓＨＲＺ２の発現が抑制された３つの形質転換体（２ｉ－１～２ｉ－３）を作出した（Ｈｉｅｉ， Ｙ．，ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔ 　Ｊ． （１９９４） ｖｏｌ．６， ｐｐ．２７１－２８２； Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔａ （２００１） ｖｏｌ．２１２， ｐｐ．８６４－８７１）。
　作出した形質転換体を鉄欠乏条件下７日間栽培し、上述した定量ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて各形質転換体におけるＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルを調べた。
　図８に示すように、これらの形質転換体においては、ＯｓＨＲＺ２の発現抑制が確認された。更に、これらの形質転換体は、通常の栽培条件下で、顕著な表現型を示すことなく健全に生長することが確認された。
　また、鉄欠乏栽培条件が、これらの形質転換体に与える影響を調べるために、鉄欠乏栽培条件下での最新葉におけるクロロフィル含量を定量した。結果を図９に示す。図９中、縦軸は、最新葉中のクロロフィル（ＳＰＡＤ値）を示し、横軸は、鉄欠乏栽培条件下での栽培日数を示す。図９に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉は、未処理（ＮＴ）のイネの葉と比較して、鉄欠乏条件下においても高いクロロフィル含量を示した。このことから、形質転換体は鉄欠乏栽培条件に対して耐性を示すことが確認された。
　更に、有効鉄含有量の少ない特殊土壌におけるこれらの形質転換体の生育状態を評価すべく、本発明者は石灰質土壌におけるこれらの形質転換体の長期試験を行った。結果を図１０に示す。図１０中、縦軸は最新葉中のクロロフィル量（ＳＰＡＤ値）を示し、横軸は移植後の栽培日数を示す。
　図１０に示すように、移植後２０日以内に、葉中のクロロフィル量の減少は、すべてのイネにおいて観察された。しかしながら、この減少の度合いは、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の方が未処理のイネよりも少ないことが確認された。更に、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉中のクロロフィル量は、移植後２２日以降徐々に回復した。図１１に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の苗丈が鉄欠乏耐性を反映している。収穫期において、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株は未処理（ＮＴ）のイネと比較して、高い稲わらの資源量及び穀物の収穫量を示すことが確認された。
　更に、発明者は、イネのゲノム遺伝子に、Ｔ－ＤＮＡを挿入させたＯｓＨＲＺ１破壊株、及び、Ｔｏｓ１７を挿入させたＯｓＨＲＺ２破壊株を取得して解析した。ＯｓＨＲＺ１破壊株は、韓国ＰＯＳＴＥＣＨ（Ｐｏｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）より取得した３Ａ－０６０６６株である。ＯｓＨＲＺ２破壊株は、イネゲノムリソースセンターより取得したＮＤ６０５９株である。図２は、ＯｓＨＲＺ１破壊株及びＯｓＨＲＺ２破壊株における、挿入配列（ｈｒｚ１－１，ｈｒｚ２－１）のゲノムへの挿入状態を示す。
　ＯｓＨＲＺ１破壊株及びＯｓＨＲＺ２破壊株の約０．１ｃｍ２の葉断片から、１００μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＰＣＲに供した。結果を図１２に示す。
　図１２中、矢印は、用いたプライマーを示し、図２において示されるゲノムＤＮＡ上にアニールするプライマーに対応する。
　図１２に示すように、ｈｒｚ１－１及びｈｒｚ２－１は、それぞれＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２に特異的に遺伝子断片の挿入が起こっていることが確認された。
　これらの破壊株を鉄欠乏条件下で水耕栽培し、最新葉中のクロロフィル量を定量した。結果を図１３に示す。図１３中、縦軸は最新葉中のクロロフィル量（ＳＰＡＤ値）を示し、横軸は鉄欠乏条件下の栽培日数を示す。図１３（ａ）は未処理（野生株：ＷＴ）のイネとＯｓＨＲＺ１破壊株における最新葉中のクロロフィル量を示し、図１３（ｂ）は未処理（野生株：ＷＴ）のイネとＯｓＨＲＺ２破壊株における最新葉中のクロロフィル量を示す。図１３に示すように、ＯｓＨＲＺ１破壊株は、未処理のイネよりもわずかに高いクロロフィル量を保持していた。また、ＯｓＨＲＺ２破壊株は、未処理のイネよりも明確に高いクロロフィル量を保持しており、鉄欠乏栽培条件に対して耐性を示すことが確認された。
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの葉における鉄蓄積の確認]
　ＯｓＨＲＺ発現抑制株の鉄欠乏栽培条件に対する耐性機構を調べるため、７日間水耕栽培をしたイネの葉における金属濃度を定量した。結果を図１４に示す。図１４中、横軸は用いたイネの種類を示し、縦軸は葉中の鉄含有量を示す。図１４に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉は未処理株の葉と比較して、鉄十分条件下（図１４（ａ））及び鉄欠乏条件下（図１４（ｂ））のどちらにおいても高濃度の鉄を蓄積していることが確認された。
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの稲わら及び種子における鉄と亜鉛の蓄積の確認]
　ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における鉄の蓄積を調べるため、ポット栽培をしたイネの稲わら及び種子における鉄濃度を定量した。
　稲わらにおける鉄蓄積の結果を図１５に示し、種子における鉄蓄積の結果を図１６に示す。図１５及び図１６中、横軸は用いたイネの種類を示し、縦軸は稲わら又は種子中の鉄含有量を示す。図１５（ａ）及び図１６（ａ）は、石灰質土壌を用いた鉄欠乏条件下における結果を示し、図１５（ｂ）及び図１６（ｂ）は、通常の土壌を用いた鉄十分条件下における結果を示す。
　図１５及び図１６に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の稲わら及び種子は、未処理株の稲わら及び種子と比較して、鉄十分条件下（図１５（ｂ）及び図１６（ｂ））及び鉄欠乏条件下（図１５（ａ）及び図１６（ａ））のどちらにおいても、高濃度の鉄を蓄積していることが確認された。この結果から、稲わらは可食部ではないが、本発明を葉菜類等の鉄富化に適応可能であると考えられる。
　同様に、隔離圃場内の通常土壌で栽培された玄米及び白米における鉄の蓄積を調べた。
結果を図１７に示す。図１７（ａ）は、玄米における結果を示し、図１７（ｂ）は、白米における結果を示す。図１７（ａ）及び図１７（ｂ）のどちらにおいてもＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子は、未処理株の種子と比較して高濃度の鉄を蓄積していたことから、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における高濃度の鉄の蓄積が確認された。
　また、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における亜鉛の蓄積を調べるため、ポット栽培をしたイネの種子における亜鉛濃度を定量した。図１８（ａ）は、石灰質土壌を用いた鉄欠乏条件下における結果を示し、図１８（ｂ）は、通常の土壌を用いた鉄十分条件下における結果を示す。図１８に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子は未処理株の種子と比較して、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下（図１８（ａ）及び図１８（ｂ））のどちらにおいても、高濃度の亜鉛を蓄積していることが確認された。
　同様のイネについて、隔離圃場内の通常土壌で栽培された玄米及び白米における亜鉛の蓄積を調べた。結果を図１９に示す。図１９（ａ）は、玄米における結果を示し、図１９（ｂ）は、白米における結果を示す。図１９（ａ）及び図１９（ｂ）のどちらにおいても、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子は未処理株の種子と比較して、高濃度の亜鉛を蓄積していたことから、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における高濃度の亜鉛の蓄積が確認された。
　更に、上記と同様の通常の土壌を用いたポット試験を、ＯｓＨＲＺ１破壊株（ｈｒｚ１－１）及びＯｓＨＲＺ２破壊株（ｈｒｚ２－１）を用いて行った。結果を図２０に示す。
図２０（ａ）は、ＯｓＨＲＺ１破壊株（ｈｒｚ１－１）の種子における鉄蓄積の結果を示し、図２０（ｂ）は、ＯｓＨＲＺ２破壊株（ｈｒｚ２－１）の種子における鉄蓄積の結果を示す。図２０（ａ）及び図２０（ｂ）のどちらにおいても、未処理のイネ（野生株：ＷＴ）の種子と比較してＯｓＨＲＺ破壊株の種子が高濃度の鉄を蓄積していた。このことから、ＯｓＨＲＺ破壊株の可食部における高濃度の鉄の蓄積が確認された。
　また、同様の栽培条件でＯｓＨＲＺ破壊株の種子における亜鉛の蓄積を調べた。結果を図２１に示す。図２１（ａ）は、ＯｓＨＲＺ１破壊株（ｈｒｚ１－１）の種子における亜鉛蓄積の結果を示し、図２１（ｂ）は、ＯｓＨＲＺ２破壊株（ｈｒｚ２－１）の種子における亜鉛蓄積の結果を示す。図２１（ａ）及び図２１（ｂ）のどちらにおいても、未処理のイネ（野生株：ＷＴ）の種子と比較して、ＯｓＨＲＺ破壊株の種子が高濃度の亜鉛を蓄積していた。このことから、ＯｓＨＲＺ破壊株の可食部における高濃度の亜鉛の蓄積が確認された。
　また、同様の栽培条件でＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける鉄及び亜鉛の蓄積を調べた。結果を図２２及び図２３に示す。図２２は、ＯｓＨＲＺ破壊株（ｈｒｚ１－１及びｈｒｚ２－１）の稲わらにおける鉄蓄積の結果を示し、図２３は、ＯｓＨＲＺ破壊株（ｈｒｚ１－１及びｈｒｚ２－１）の稲わらにおける亜鉛蓄積の結果を示す。図２２及び図２３のどちらにおいても、未処理のイネ（野生株：ＷＴ）の稲わらと比較してＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらが高濃度の鉄・亜鉛を蓄積していた。このことから、ＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける高濃度の鉄・亜鉛の蓄積が確認された。
　以上、ＯｓＨＲＺの発現を抑制した形質転換イネ及びＯｓＨＲＺ破壊株の両方で同じ表現型を示したことから、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制することにより、イネの可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上することが確認された。
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの根における鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の発現増強の確認]
　発明者は、４４Ｋマイクロアレイ解析を行い、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下で水耕栽培されたＯｓＨＲＺ２発現抑制株（２ｉ－１～２ｉ－３）の遺伝子発現プロファイルを調べた。イネ４４Ｋマイクロアレイ（アジレントテクノロジーズ社製）は、イネ全長ｃＤＮＡプロジェクトから得られた配列情報に基づいて、４３１４４種類の６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを含んでいる。水耕栽培したＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。マイクロアレイハイブリダイゼーション、データ取り込み、及びデータ解析を以前報告した内容に沿って行い（Ｏｇｏ， Ｙ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ． （２００６） ｖｏｌ．５７， ｐｐ．２８６７－２８７８）、発現比を（ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の平均シグナル値）／（未処理（ＮＴ）のイネの平均シグナル値）として算出した。結果を図２４に示す。
　図２４は、各種遺伝子の発現プロファイルを示した図である。図２４に示されるように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根において、特に鉄十分条件下で、多種の鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の発現増強が示された。
　さらに、定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いて、鉄十分条件下におけるマイクロアレイ解析の結果を検証した。結果を図２５に示す。図２５中、横軸は用いたイネを示し、縦軸は各遺伝子（ＯｓＩＲＯ２，ＯｓＮＡＳ２，ＯｓＹＳＬ２）のｍＲＮＡの発現強度を示す。図２５に示すように、各遺伝子の発現変化は、マイクロアレイ解析の結果と一致していることが確認された。
　これらのことから、ＯｓＨＲＺタンパク質は、鉄欠乏に応答する負の制御因子であり、ＯｓＨＲＺタンパク質の発現を抑制することにより、主に鉄十分条件下における鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の発現抑制を解除できることが確認された。
　本発明によれば、鉄欠乏耐性が向上した植物を取得することができるので、可溶化した鉄分が少ないアルカリ性の土壌等でも生育可能な作物を取得することができる。
　さらに、本発明によれば、可食部に鉄と亜鉛、とりわけ鉄を顕著に蓄積する植物を取得することができるので、鉄欠乏症及び亜鉛欠乏症を軽減する作物を取得することができる。
　特に、本発明によれば、上記の鉄欠乏耐性と可食部への鉄・亜鉛蓄積を同時に兼ね備えた形質が得られるので、半乾燥地帯や石灰質傾向土壌などの潜在的に鉄欠乏に陥りやすい栽培条件において安定的に鉄富化食物を生産するのにきわめて有利であると考えられる。
　したがって、本発明は「新規鉄・亜鉛結合性制御因子と、その発現調節による植物の鉄欠乏耐性向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進技術」に好適に利用でき、産業上極めて有用である。

Claims (14)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であることを特徴とするタンパク質。
    （ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、又は、
    （ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列
  2. 　請求項１に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
  3. 　以下の（ｄ）～（ｇ）のいずれか一つのＤＮＡからなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
    （ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
    （ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
    （ｆ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、又は、
    （ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
  4. 　請求項２又は３に記載の遺伝子の発現を抑制し得ることを特徴とするベクター。
  5. 　前記遺伝子の発現をｍＲＮＡレベルで抑制し得るＲＮＡｉ誘導性核酸を発現可能である請求項４に記載のベクター。
  6. 　前記ＲＮＡｉ誘導性核酸が、配列番号５で表される塩基配列である請求項５に記載のベクター。
  7. 　請求項４～６のいずれか一項に記載のベクターを宿主に導入してなることを特徴とする形質転換体。
  8. 　挿入配列が組み込まれることにより、請求項２又は３に記載の遺伝子が破壊されているゲノムＤＮＡを有することを特徴とする遺伝子破壊株。
  9. 　請求項１に記載のタンパク質と特異的に結合することを特徴とする抗体。
  10. 　請求項４～６のいずれか一項に記載のベクターを植物に導入する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法。
  11. 　請求項４～６のいずれか一項に記載のベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物。
  12. 　請求項４～６のいずれか一項に記載のベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット。
  13. 　植物からの抽出液に含まれる請求項１に記載のタンパク質を検出する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
  14. 　植物からの抽出液に含まれる請求項２又は３に記載の遺伝子を検出する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105441475A (zh) * 2014-05-02 2016-03-30 中央研究院 具有增加微量元素含量的转基因植物及其生产方法
WO2024008752A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 John Innes Centre Methods to increase iron content in plants

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116355947A (zh) * 2023-03-27 2023-06-30 山东农业大学 调控玉米铁含量的蛋白hrz及编码基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040123343A1 (en) * 2000-04-19 2004-06-24 La Rosa Thomas J. Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4998809B2 (ja) * 2007-04-26 2012-08-15 独立行政法人科学技術振興機構 植物の鉄欠乏耐性を向上させるポリペプチドおよびその利用
AR075773A1 (es) * 2009-03-02 2011-04-27 Evogene Ltd Polipetidos y polinucleotidos aislados y metodos para su uso en el aumento del rendimiento de plantas y las caracteristicas agricolas
US20110214205A1 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Monsanto Technology Llc. Isolated Novel Nucleic Acid and Protein Molecules from Foxtail Millet and Methods of Using Those Molecules to Generate Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040123343A1 (en) * 2000-04-19 2004-06-24 La Rosa Thomas J. Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 17 December 2008 (2008-12-17), YU,J. ET AL.: "Definition: Oryza sativa (indica cultivar-group) chromosome 1", retrieved from http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CM000126 accession no. M000126 REGION: 31695449..31706033 *
OZAWA K. ET AL.: "Development of an Efficient Agrobacterium-Mediated Gene Targeting System for Rice and Analysis of Rice Knockouts Lacking Granule-Bound Starch Synthase (Waxy) and Pl,2- Xylosyltransferase", PLANT CELL PHYSIOL., vol. 53, no. 4, 10 February 2012 (2012-02-10), pages 755 - 61 *
TAKANORI KOBAYASHI ET AL.: "Shokubutsu no Tetsu Ketsubo Oto Mechanism", HEMATOLOGY FRONTIER, vol. 22, no. 1, 30 December 2011 (2011-12-30), pages 100 - 104 *
TERADA R. ET AL.: "Gene Targeting by Homologous Recombination as a Biotechnological Tool for Rice Functional Genomics", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 4, no. 2, 14 June 2007 (2007-06-14), pages 846 - 56 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105441475A (zh) * 2014-05-02 2016-03-30 中央研究院 具有增加微量元素含量的转基因植物及其生产方法
WO2024008752A1 (en) * 2022-07-05 2024-01-11 John Innes Centre Methods to increase iron content in plants

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