CN116355947A - 调控玉米铁含量的蛋白hrz及编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控玉米铁含量蛋白HRZ及其编码基因与应用，属于植物遗传改良技术领域。本发明发现ZmHRZ基因参与玉米铁含量的调控，ZmHRZ基因的突变会导致玉米多个组织，如叶片、茎秆、雌穗、籽粒等铁含量的积累。因此，ZmHRZ基因及其编码蛋白HRZ将在玉米铁生物强化方面具有重要意义和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物遗传改良技术领域，具体涉及一种调控玉米铁含量的蛋白HRZ及编码基因与应用。
背景技术
铁是人体必需的微量元素之一，是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其他酶系统的主要成分，它可以参与氧的运输和储存，也可以促进人体的发育，增加人体对疾病的抵抗力，对人的身体健康十分重要。同时铁也是植物生长发育所必需的微量元素，在植物中铁是许多功能蛋白的辅助因子，参与植物的光合作用、呼吸作用、叶绿素的合成、生物固氮等过程，在植物的生命活动中发挥重要的作用。
微量营养元素缺乏是全球关注的公共卫生问题，其中铁缺乏是全球三大“隐性饥饿”之首，是造成贫血的主要原因，全球约1/5人口患缺铁性贫血。人类膳食中的铁营养摄入不足是导致贫血的一个重要原因，在以植物性食物为主要膳食成分的发展中国家，妇女及儿童人群的缺铁性贫血程度更为严重。主要是因为大部分植物是缺铁的，虽然地壳中的铁含量很高，但铁的溶解度极低，植物很难吸收，从而造成植物缺铁影响植物健康生长，进一步造成人群铁营养摄入不足。目前用于纠正缺铁性贫血的方法主要有食疗法、口服补铁、注射补铁等。口服补铁具有价格便宜、易吸收、生物利用率高等优点，但有可能会产生一些胃肠道的副作用。注射补铁比口服补铁效果好，但是可能会造成严重的过敏反应甚至会导致死亡。食疗法是一种简单安全有效的方法，谷类、蔬菜、水果等植物性食物中的非血红素铁，占人体铁来源的60％～90％，通过食疗法补充含铁量高的食物是解决全球范围内的缺铁症状的主要途径，因此研究高铁含量的主食和果蔬具有重要意义。
我国的粮食作物主要有三种，分别为水稻、小麦、玉米这三大作物，而玉米在其中占据着十分重要的地位。玉米作为重要的粮食作物需求量越来越大，而且玉米不仅仅可以作为粮食作物，它还可以作为饲料和深加工的工业原料，对国民经济和人民生活具有重要意义。但玉米中的铁含量较低，不同玉米基因型之间的差异较大。Wolnik K.A.等的研究结果表明，玉米籽粒干物质铁含量平均约为20mg/kg，中国农科院与四川农业大学测定的玉米杂交种籽粒干物质铁含量平均在17.7mg/kg左右，远远低于营养学推荐的膳食标准。根据计算，为满足人体对铁的需求，玉米籽粒的铁含量应在40mg/kg左右。因此提高玉米的铁含量将有利于改善人类铁营养缺乏的状况。
近年来，随着作物遗传育种技术的快速发展，国际上建立了一种新型的人群营养改善途径即生物强化，通过育种等生物强化途径改善作物中的铁含量及其生物有效性，对解决人群铁微量元素营养缺乏具有重要意义。目前已成功克隆了许多作物铁营养代谢中的基因，为作物铁生物强化打下了良好的基础。但能够调控玉米铁含量的基因还很少见有报道，因此，通过现代生物学手段改变玉米中铁的吸收和积累模式，培育铁高效玉米新品种不仅对改善人体铁营养状况具有重要意义，也对青储玉米、鲜食玉米、普通玉米的改良具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种调控玉米铁含量的蛋白HRZ及编码基因与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供蛋白HRZ在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)调控植物中的铁含量；
(2)参与植物铁吸收代谢；
(3)创制铁生物强化的植物种质；
(4)经济作物育种改良；
所述蛋白HRZ为如下(A1)-(A3)任一所示的蛋白质：
(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与调控玉米铁含量相关的由序列1衍生的蛋白质；
(A3)在(A1)或(A2)中所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
为了使(A1)或(A2)中的蛋白质便于纯化，可在(A1)或(A2)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上标签。所述标签可以为Poly-Arg(通常为6个RRRRR)，Poly-His(通常为6个HHHHHH)，FLAG(DYKDDDDK)，Strep-tag II(WSHPQFEK)或c-myc(EQKLISEEDL)。
本发明的第二方面，提供蛋白HRZ的编码基因在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)调控植物中的铁含量；
(2)参与植物铁吸收代谢；
(3)创制铁生物强化的植物种质；
(4)经济作物育种改良。
上述应用中，优选的，所述蛋白HRZ的编码基因为如下i)-v)任一所示的核酸分子：
i)序列表中序列2或编码区包括序列2第90-3704位所示的核酸分子；
ii)序列表中序列3或编码区包括序列3第90-2564位所示的DNA分子；
iii)序列表中序列4或编码区包括序列4第90-3704位所示的DNA分子；
iv)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子；
v)与i)或ii)或iii)的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性且表达相同功能蛋白质的核酸分子。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码蛋白HRZ的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用计算机软件进行评价，例如可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。
本发明的第三方面，提供携带蛋白HRZ的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)调控植物中的铁含量；
(2)参与植物铁吸收代谢；
(3)创制铁生物强化的植物种质；
(4)经济作物育种改良。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。
上述应用中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。其中，所述单子叶植物可以为禾本科植物，具体如玉米。
本发明的第四方面，提供一种提高玉米植株中铁含量的方法，包括以下步骤：
将玉米植株中蛋白HRZ的活性降低或丧失；
或者，抑制玉米基因组中蛋白HRZ的编码基因的表达。
优选的，使玉米植株中蛋白HRZ的活性降低或丧失的方法包括：将序列1所示的蛋白HRZ的第826位氨基酸由色氨酸变为终止密码子；或者将序列1所示的蛋白HRZ的第1043位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。
优选的，抑制玉米基因组中蛋白HRZ的编码基因的表达的方法包括：突变或敲除序列2所示的编码基因的全部或者部分序列；或者使用干扰RNA干扰序列2所示的编码基因的表达；或者使用基因沉默系统使序列2所示的编码基因沉默。
上述方法中，可以采用CRISPR/Cas9核酸酶对玉米基因组中所述编码基因的DNA序列进行特异性剪切，使玉米丧失表达有功能的所述蛋白的能力。
其中，所述CRISPR/Cas9核酸酶对玉米编码HRZ蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切时的靶标片段为所述受体植物中编码HRZ蛋白的基因组DNA序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，所述靶标片段为所述受体植物中编码HRZ蛋白的基因组DNA序列中的“5”-CCTTGACTTGCTCTCTTAACTGG-“3”。
本发明的第五方面，提供一种培育高铁含量玉米品种的方法，包括以下步骤：
以含有ZmHRZ基因突变体的玉米植株作为亲本，进行自交或杂交育种。
上述方法中，所述含有ZmHRZ基因突变体的玉米植株由如下方法构建而成：
将玉米植株基因组中的序列2所示的ZmHRZ基因的全部或者部分序列进行突变或敲除，使ZmHRZ基因编码的蛋白活性降低或丧失。
本发明的有益效果：
(1)本发明的玉米ZmHRZ基因分离自玉米，作为玉米的内源基因，对玉米的基因工程改造非常有利。
(2)本发明克隆了一个玉米ZmHRZ基因，玉米ZmHRZ基因参与调控玉米植株的铁含量，该基因突变可以获得铁含量提高的植株。该基因为玉米铁生物强化提供了新的育种资源，为玉米中铁离子平衡、铁稳态提供了新的见解，同时对青储玉米、鲜食玉米、普通玉米的改良具有重要价值。
(3)本发明的突变体Zmhrz1-1或Zmhrz1-2可以回交导入自然材料进行改良(突变后的ZmHRZ基因是可以稳定遗传的隐性基因，通过与自然材料进行杂交产生的子一代籽粒富铁能力可能没有明显改善，通过与隐性亲本进行回交，后代籽粒中铁积累量升高，从而达到改良目的)；同时可以通过CRISPR/Cas9敲除技术对玉米ZmHRZ基因进行基因编辑，从而获得高铁植株，进一步培育铁高效玉米新品种，可以为作物铁生物强化打下良好的基础，同时对解决人群铁微量元素营养缺乏改善人体铁营养状况具有重要意义。
附图说明
图1为野生型材料与突变体材料叶片表型对比以及百粒重的比较。A为野生型材料和突变体Zmhrz1-1及Zmhrz1-1的等位Zmhrz1-2的植株叶片比较(图1.A，Bar＝2cm)；B为野生型材料和突变体Zmhrz1-1及Zmhrz1-1的等位Zmhrz1-2的果穗比较(图1.B，Bar＝2cm)；C为野生型材料和突变体Zmhrz1-1及Zmhrz1-1的等位Zmhrz1-2的籽粒比较(图1.C，Bar＝5mm)的表型比较；D野生型材料和突变体Zmhrz1-1、等位Zmhrz1-2的成熟籽粒百粒重的比较；P为显著性检验。
图2为野生型材料与突变体Zmhrz1-1植株不同组织普鲁士蓝染色结果比较。其中，A为植株籽粒染色结果(A，Bar＝1mm)；B为植株根部染色结果(B，Bar＝1cm)；C为植株叶片染色结果(C，Bar＝1cm)；D为植株穗轴染色结果(D，Bar＝1cm)。每张图片的左侧为野生型(Wild type)，右侧为突变体(Zmhrz1-1)。
图3为ZmHRZ基因的图位克隆。其中，A为ZmHRZ基因的图位克隆；B为ZmHRZ基因基因结构示意图。
图4为野生型材料与突变体Zmhrz1-1、Zmhrz1-2植株叶片和籽粒铁含量测定结果比较。其中，A为叶片铁含量测定结果；B为种子铁含量测定结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，玉米作为重要的粮食作物需求量越来越大，而且玉米不仅仅可以作为粮食作物，它还可以作为饲料和深加工的工业原料。但玉米中的铁含量普遍偏低，因此，选育高铁玉米新品种具有重要意义；提高玉米种子的铁含量对改善人群的铁营养元素缺乏具有重要价值。开发调控玉米植株铁含量的新的基因资源将在植物育种领域发挥重要的作用。
基于此，本发明采用图位克隆的策略，用玉米铁含量提高突变体Zmhrz1-1与玉米自交系B73组配F1和F2群体，将控制这一突变性状的基因定位到玉米六号染色体，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离，约为53kb，共包括8个基因。其中基因号为Zm00001d038916的序列在突变体与野生型之间存在差异，突变体Zmhrz1-1有一个G到A的碱基转换，导致氨基酸由色氨酸(Trp)变为终止密码子。突变体Zmhrz1-2中基因号为Zm00001d038916有一个C到T的碱基转换，导致氨基酸由组氨酸(His)变为酪氨酸(Tyr)。遗传分析表明，突变体Zmhrz1-1、Zmhrz1-2互为等位突变体，等位材料及杂交后代均为高铁表型。因此Zm00001d038916基因即是调控玉米植株铁含量提高的目的基因，命名为ZmHRZ基因。
ZmHRZ基因在野生型玉米材料中编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
MATPLAGKGPIAAAIPRSPPPLAEGGAGGSAAEAPVLIFVYFHKAIRAELERMHAAAVRLAMGRAGGDVATLEARCRFLFTVYRHHCDAEDAVIFPALDIRVKNVAGTYSLEHKGENDLFAHLFTLLQLDVQNDNAIRRELASCTGAIRTFVSQHMSKEEEQVFPLLIKKFSHEEQADLVWQFLCSIPVNMMAKFLPWISASVSTDENQDILDCLSKIVPEEKLLQEVVFTWFGGKSESSSTCESSSGQTDKHAHSLEHTKIGKRKSIESSQLVTHPIDEILYWHNAVLRELSDIAEETKRIHQSGDFSDIAGFNMRLQFIADVCIFHSIAEDQVIFPAVDGELSFVQEHAEEERRLNKFRSLIEQIQLAGAKSTVVDFHSELCSQADQIMQKIESHFNDEEIKVLPKARIKFSPEKQRELLYQSLCVMPLKLLERVLPWFIVKLNDAEAVSFLQNMRLAAPSSETALVTLLSGWACKGRLEDTSNPGKFVCMASGAVTCASDGNGFKTCQSLCPCYVSSNGAFSKPVKRASQGESSTNTDRNHSSHNAATEASQCNNRACYIPRLRVESSYLGVHSSTPTKSFRPLSFNYVAPSLYSSLFSWDTDTLVSGPDNISKPIDTIFKFHKAIRKDLEFLDLESGKLIDGNESCLSQFIGRFRLLWGLYRAHSNAEDEIVFPALESKEALHNVSHSYTLDHKQEEKLFQDISTVLSELSQLHDGLSYPLDVEAGTNDISSNEIDWARKRNELLTKLQGLCKSIRVTLSNHVHREELELWPLFDKHFSVDEQDKIIGHIIGTTGAEVLQSMLPWVTSALSLEEQNMMLDTWKQATKNTMFDEWLNEWWKGPSTSSDPSDKASTPSEESHFQENLEQNDQMFRPGWKDIFRMNQSELEAEIRKVSRDSTLDPRRKAYLIQNLMTSRWIAAQQKSPQPSVEGHNGCTRRPGCVASYRDPGKQIFGCEHYKRNCKLVAACCDKLFTCRFCHDKVSDHTMDRKSVMEMMCMQCLNVQPVGPNCQSPSCNGLSMAKYYCSICKFFDDERSVYHCPFCNLCRLGSGLGTDFFHCMKCNCCLGIKMIEHKCREKMLEMNCPICCDFLFTSSAPVKGLPCGHFMHSACFQAYTCTHYTCPICCKSLGDMTVYFGMLDGLLAAEQLPEEYQDRCQDILCNDCERKGRSRFHWLYHKCGFCGSYNTRVIKTDTAECSRPL。
ZmHRZ基因在野生型玉米材料中的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示，具体如下：
CCAACCGAGCGAGACAGAGGCACACAGCCGGACGCGCACCACGGTACCAGAGCACACACGGAGGTGCCACCGCGCGCCGCAGCCGGAGCATGGCGACGCCGCTGGCCGGGAAGGGCCCGATCGCGGCGGCGATCCCGCGGTCCCCACCCCCTCTGGCCGAGGGCGGCGCGGGAGGGTCGGCGGCCGAGGCGCCCGTGCTCATCTTCGTATACTTCCACAAGGCGATCCGCGCGGAGCTGGAGCGGATGCACGCCGCGGCGGTGCGCCTCGCCATGGGACGCGCGGGCGGGGACGTGGCCACGCTCGAGGCGCGCTGCCGGTTCCTCTTCACCGTCTACAGGCACCACTGCGACGCCGAGGACGCGGTTATTTTTCCAGCACTTGACATTCGAGTGAAAAATGTCGCAGGGACATATTCTCTTGAACATAAAGGAGAAAATGATCTCTTCGCACATCTATTCACTCTGCTACAGTTGGATGTGCAGAATGATAATGCTATTAGGAGGGAACTTGCATCCAGTACTGGAGCAATTCGGACGTTTGTATCCCAACACATGTCCAAGGAAGAAGAACAGGTCTTCCCGTTACTCATCAAGAAGTTTTCACACGAAGAGCAAGCAGATTTAGTATGGCAGTTCTTATGTAGCATCCCTGTAAACATGATGGCAAAATTTCTTCCATGGATTTCTGCTTCTGTTTCTACAGATGAGAATCAAGATATTCTTGACTGCCTAAGTAAAATAGTTCCTGAAGAAAAACTCCTCCAAGAGGTTGTTTTCACGTGGTTTGGAGGGAAATCAGAAAGCAGTTCTACATGTGAGTTTAGCTCTGGCCAAACAGATAAACATGCATATTCACTTGAACACACCAAAATTGGAAAGAGGAAGTCTATAGAATCTAGTCAGCTTGTCACACATCCAATTGATGAGATTCTGTATTGGCACAATGCTGTTCGGAGAGAACTGAGTGATATAGCAGAGGAGACTAAAAGGATACAGCAGTCTGGAGATTTTTCTGACATAGCAGGATTTAATATGAGGCTGCAATTTATTGCAGATGTGTGCATTTTCCACAGTATTGC
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TCAAGACTGATACGGCAGAGTGTTCTCGCCCTCTATAATTTCTTTTATGCAATCCATTTGTATATATATCGACGGGGTAGAAACCTTGT。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：
野生型玉米自交系RP125、玉米自交系B73为现有的玉米自交系材料；突变体Zmhrz1-1、Zmhrz1-2是以玉米自交系RP125为背景构建的EMS突变体库中的材料，记载在文献(“Genome assembly of the Chinese maize elite inbred line RP125 and its EMSmutant collection provide new resources for maize genetics research and cropimprovement”，The Plant Journal(2021)108,40–54)中。上述试验材料公众可以从山东农业大学获得，以重复本实验。玉米基因组测序信息参考MaizeGDB数据库，该数据库链接如下：http://www.maizegdb.org/。
实施例1：调控玉米植株铁含量基因ZmHRZ的图位克隆
一、玉米突变体Zmhrz1-1的表型鉴定
申请人以玉米自交系材料RP125为背景，构建了一个表型变异丰富的EMS突变体库(Nie et al,2021)，从该突变体库中发现1份植株叶片的叶边缘和叶脉间出现黄棕色斑点的突变体，将该突变体命名为Zmhrz1-1，该突变体在不同环境下植株叶片均有此表型，说明其性状稳定。与正常植株RP125(Wild type)相比，玉米突变体Zmhrz1-1在果穗大小和百粒重方面未有明显变化(图1)。
Perls普鲁士蓝是非常经典的组织化学反应，是显示组织内三价铁的一种敏感、传统优良的方法，其染色原理为：亚铁氰化钾溶液使三价铁离子从蛋白质中被稀盐酸分离出来，三价铁与亚铁氰化钾反应，生成一种不溶解的蓝色化合物即三价铁的亚铁氰化物普鲁士蓝，所以该反应被称为普鲁士蓝反应。
利用普鲁士蓝试剂盒对授粉后17天的野生型(Wild type)和突变体(Zmhrz1-1)植株的根、穗轴、叶片和籽粒进行染色，结果如图2所示。染色结果表明突变体(Zmhrz1-1)的根、穗轴、籽粒和叶片染色程度明显高于野生型(Wild type)。以上染色结果说明突变体(Zmhrz1-1)比野生型(Wild type)积累了更多的铁，因此认为突变体叶片的表型是由铁含量增加导致的。
二、遗传定位群体的构建
将高铁突变体Zmhrz1-1与玉米自交系B73杂交组配F1，F1代植株叶片没有表现出高铁突变体Zmhrz1-1的表型，说明突变基因属于隐性遗传，将F1代果穗自交获得F2籽粒，随机播种F2籽粒，统计F2群体的总株数以及表现与高铁突变体Zmhrz1-1类似表型(叶片的叶边缘和叶脉间出现黄棕色斑点)的株数，利用适合性卡方测验分析，植株表型(正常:突变)分离比符合3:1的孟德尔分离定律(表1)，综上说明Zmhrz1-1的高铁表型是由单隐性基因控制。将F2群体扩大并作为遗传定位群体用于目的基因的图位克隆。
表1：F2分离群体的适合性卡方测验
三、ZmHRZ基因的图位克隆
首先，以构建遗传定位群体的两个亲本，突变体Zmhrz1-1和B73的基因组DNA为模板，用玉米全基因组引物筛选在突变体Zmhrz1-1和B73之间有多态性的引物。然后，从F2群体中选取有表型单株和正常单株各20株，验证多态性引物是否与植株突变表型连锁。筛选出连锁引物，用于对群体中75个单株基因型的测定，结合植株表型筛选出基因型与表型不符的为交换单株，并根据不同引物筛选出的交换单株个数的不同，依照减少趋势确定定位区间，由此将ZmHRZ基因定位于玉米六号染色体的引物标记ID-1和ID-5之间。在ID-1和ID-5之间继续开发多态性分子标记，选取更大F2群体中的1256株隐性单株进行检测，最终将ZmHRZ基因定位在标记ID-6(166.848Mb)和ID-4(166.901Mb)之间，参考已公布的玉米自交系B73基因组测序结果，物理距离约为53Kb(图3中A)。其中，用于基因定位的分子标记引物序列如表2所示。
表2：用于基因定位的分子标记引物
四、ZmHRZ基因的克隆
参考玉米基因组测序信息，定位区间的53Kb范围内共包括8个基因。以野生型和突变体的基因组DNA为模板，扩增基因并比较其序列差异，发现只有Zm00001d038916的序列在突变体与野生型之间存在差异，突变体有一个G到A的碱基转换，导致氨基酸由色氨酸(Trp)变为终止密码子。因此推测Zm00001d038916基因可能就是Zmhrz1-1的候选基因，图3中B展示了在玉米自交系B73中Zm00001d038916的基因结构，由14个外显子(黑色方框)和13个内含子(黑色线段)组成。
以所述野生型自交系材料RP125的总RNA，反转录为cDNA，利用Zm00001d038916基因的cDNA引物primer-1(表2)进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列2，序列2即为ZmHRZ基因在野生型玉米自交系RP125中的cDNA序列；提取突变体Zmhrz1-1材料的总RNA，反转录为cDNA，同样利用Zm00001d038916基因的cDNA引物primer-1(表2)进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列3，序列3即为ZmHRZ基因在突变体Zmhrz1-1中的cDNA序列。
五、ZmHRZ基因的等位验证
在我们构建的以RP125为背景的玉米EMS突变体库(Nie et al,2021)中又找到另一份跟Zmhrz1-1表型相似的突变体材料，将其命名为Zmhrz1-2(图1)，构建Zmhrz1-1×Zmhrz1-2杂交的遗传材料，杂交后植株均有高铁表型，说明这两份材料为同一个基因的等位变异材料。提取Zmhrz1-2的DNA，并进行ZmHRZ的基因扩增，测序后数据分析发现，在第11个外显子存在一个C到T的转换。提取突变体Zmhrz1-2材料的总RNA，反转录为cDNA，同样利用Zm00001d038916基因的cDNA引物primer-1(表2)进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列4，序列4即为ZmHRZ基因在突变体Zmhrz1-2中的cDNA序列。
结果表明：基因号为Zm00001d038916的序列在突变体与野生型之间存在差异，突变体Zmhrz1-1有一个G到A的碱基转换，导致第826位氨基酸由色氨酸(Trp)变为终止密码子。突变体Zmhrz1-2中基因号为Zm00001d038916有一个C到T的碱基转换，导致第1043位氨基酸由组氨酸(His)突变为酪氨酸(Tyr)。
实施例2：玉米ZmHRZ基因突变能显著提高玉米中铁含量
通过电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测定成熟期野生型玉米自交系材料RP125(Wild type)和突变体(Zmhrz1-1和Zmhrz1-2)植株叶片和籽粒的铁含量。
结果如图4所示，野生型(Wild type)叶片的铁含量为99.11mg/kg，突变体Zmhrz1-1叶片的铁含量为328.55mg/kg，比野生型(Wild type)增加了3.31倍；突变体Zmhrz1-2叶片的铁含量为342.78mg/kg，比野生型(Wild type)增加了3.46倍(图4中A)。
野生型(Wild type)籽粒的铁含量为20.11mg/kg，突变体Zmhrz1-1籽粒的铁含量为39.15mg/kg，比野生型(Wild type)增加了1.95倍；突变体Zmhrz1-2籽粒的铁含量为40.80mg/kg，比野生型(Wild type)增加了2.03倍(图4中B)。
结果表明：ZmHRZ基因突变后玉米叶片、籽粒等组织的铁含量与野生型相比均能极显著增加。
综上所述，本发明通过图位克隆和等位测验明确了突变基因是ZmHRZ，并克隆了ZmHRZ基因，该基因可以参与调控玉米植株铁含量，该基因编码的蛋白突变后，会导致玉米植株的铁含量显著提高。本发明为植物特别是玉米的品质性状研究提供了新的基因资源，选择具有hrz/hrz或HRZ/HRZ优良等位基因型的自交系作为供体用于玉米的遗传改良，将在玉米育种领域的应用中发挥重要作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.蛋白HRZ在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)调控植物中的铁含量；
(2)参与植物铁吸收代谢；
(3)创制铁生物强化的植物种质；
(4)经济作物育种改良；
所述蛋白HRZ为如下(A1)-(A3)任一所示的蛋白质：
(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与调控玉米铁含量相关的由序列1衍生的蛋白质；
(A3)在(A1)或(A2)中所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
2.蛋白HRZ的编码基因在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)调控植物中的铁含量；
(2)参与植物铁吸收代谢；
(3)创制铁生物强化的植物种质；
(4)经济作物育种改良。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白HRZ的编码基因为如下i)-v)任一所示的核酸分子：
i)序列表中序列2或编码区包括序列2第90-3704位所示的核酸分子；
ii)序列表中序列3或编码区包括序列3第90-2564位所示的DNA分子；
iii)序列表中序列4或编码区包括序列4第90-3704位所示的DNA分子；
iv)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子；
v)与i)或ii)或iii)的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性且表达相同功能蛋白质的核酸分子。
4.携带蛋白HRZ的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)调控植物中的铁含量；
(2)参与植物铁吸收代谢；
(3)创制铁生物强化的植物种质；
(4)经济作物育种改良。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
优选的，所述植物为玉米。
6.一种提高玉米植株中铁含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将玉米植株中蛋白HRZ的活性降低或丧失；
或者，抑制玉米基因组中蛋白HRZ的编码基因的表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使玉米植株中蛋白HRZ的活性降低或丧失的方法包括：将序列1所示的蛋白HRZ的第826位氨基酸由色氨酸变为终止密码子；或者将序列1所示的蛋白HRZ的第1043位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，抑制玉米基因组中蛋白HRZ的编码基因的表达的方法包括：突变或敲除序列2所示的编码基因的全部或者部分序列；或者使用干扰RNA干扰序列2所示的编码基因的表达；或者使用基因沉默系统使序列2所示的编码基因沉默。
9.一种培育高铁含量玉米品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以含有ZmHRZ基因突变体的玉米植株作为亲本，进行自交或杂交育种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有ZmHRZ基因突变体的玉米植株由如下方法构建而成：
将玉米植株基因组中的序列2所示的ZmHRZ基因的全部或者部分序列进行突变或敲除，使ZmHRZ基因编码的蛋白活性降低或丧失。
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| CN104245933A (zh) * | 2012-07-26 | 2014-12-24 | 独立行政法人科学技术振兴机构 | 新的铁锌结合性调控因子以及通过其表达调节提高植物的耐缺铁性和促进可食用部分中的铁锌蓄积的技术 |
| CN111349636A (zh) * | 2019-04-30 | 2020-06-30 | 山东农业大学 | 一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用 |
| CN115215930A (zh) * | 2021-04-21 | 2022-10-21 | 山东农业大学 | 控制玉米种子总蛋白和类胡萝卜素含量的蛋白ptox1及其编码基因与应用 |
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2023
- 2023-03-27 CN CN202310305450.0A patent/CN116355947A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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