CN103124738A - 芥子油苷转运蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述通过改变植物或其部分中的芥子油苷转运蛋白(GTR)活性来改变植物中、尤其是特定植物部分中的芥子油苷(GSL)含量的方法和手段。具体而言，提供降低植物种子及其籽粕的GSL含量的方法，以及提高绿色植物组织中的GSL含量的方法，该植物是十字花目植物。

Description

芥子油苷转运蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及农产品领域，尤其是具有改变的芥子油苷含量的作物植物及其部分。所提供的是通过改变植物或其部分中的芥子油苷转运蛋白(GTR)活性来改变植物中、尤其是特定植物部分中的芥子油苷含量的方法。可以通过下调或上调GTR基因表达或GTR蛋白质活性来达到GTR活性的这种改变。具体而言，提供降低植物种子及其籽粕((seed)meal)的GSL含量的方法，以及提高绿色植物组织中GSL含量的方法，该植物是十字花目(Brassicales)植物，尤其是十字花科(Brassicaceae)植物，如油料种子形式的芸苔属物种(Brassica spp.)(包括例如欧洲油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)和埃塞俄比亚芥(B.carinata))、甘蓝(B.oleracea)、芜菁(B.rapa)、十字花科生菜(包括例如芝麻菜(Eruca sativa)和细叶二行芥(Diplotaxis tenuifolia))和萝卜属(Raphanus)(包括例如萝卜(Raphanus sativa))。
背景技术
十字花目或白花菜目(Capparales)植物(包括十字花科(Brassicaceae、Cruciferae))包括为人类提供调味品、蔬菜、饲料作物及重要经济作物油菜(欧洲油菜和芸苔(Brassica campestris)或芜菁)和芥子(芥菜)的来源的许多栽培种。
这些植物的惊人和特征性的化学特性是它们高含量的芥子油苷，芥子油苷是氨基酸衍生的包含硫葡糖(thioglucose)和磺化肟的天然植物产物。虽然认为其本身无毒性，但这些含硫次生代谢物很重要，因为在植物损害时，通过水解酶黑芥子酶(葡硫糖苷葡糖水解酶；EC3.2.3.1)的切割从它们衍生诸如腈、环硫腈、噁唑烷-2-硫酮、硫氰酸和异硫氰酸的众多生理活性产物(Halkier和Gershenzon，2006，Annual Review of Plant Biology57：303-333)。
对于植物，芥子油苷/黑芥子酶系统保护免受食植动物侵袭，且涉及专化捕食者的宿主-植物识别。对于人类，芥子油苷(更确切地说，是它们的水解产物)作为防癌剂、香味化合物和潜在的生物杀虫剂受到越来越多的注意。
芥子油苷存在于植物的所有部分中。芥子油苷的水平在不同发育阶段的不同组织中不同(Fieldsend和Milford，1994，Ann.Appl.Biol.124：531-542；Porter等，1991，Ann.Appl.Biol.118：461-467)，且受诸如生长条件(Zhao等，1993，J.Sci.Food Agric.63：29-37；Zhao等，1994，J.Sci.Food Agric.64，295-304)、创伤(Bodnaryk，1992，Phytochemistry31：2671-2677)、真菌感染(Doughty等，1991，Ann.Appl.Biol.118：469-477)、实际和模拟的昆虫损害(Bodnaryk，1992，Phytochemistry31：2671-2677；Koritsas等，1991，Ann.Appl.Biol.118：209-221)及其他胁迫形式(Mithen，1992，Euphytica63：71-83)的外部因素影响。与在植物防御中的突出功能一致，最高的芥子油苷浓度见于生殖器官(包括种子、长角果、花和发育中的花序)中，随后是嫩叶、根系和完全展开叶。
已知芥子油苷经韧皮部从叶和长角果跨过几个质外体屏障从母体组织转运入植物，并进入胚，它们在其中累积至高水平(综述于Nour-Eldin andHalkier，2009，Phytochem Rev8：53-67中)。此转运的分子机制未知。芥子油苷在植物内的转运特性具有意义，因为转运机制的鉴定可以例如导致在种子及其籽粕中获得更低的水平。
描述了基于同源性和酵母功能互补的植物转运蛋白发现的方法。但是，在鉴定无已知同源物的转运蛋白时，或在不可以改造营养缺陷型酵母菌株时，这些方法具有局限性。Nour-Eldin(博士论文，University of Copenhagen，Faculty of Life Sciences，Department of Plant Biology，Plant BiochemistryLaboratory，2007，72页)描述了基于功能基因组途径的植物转运蛋白发现的方法。构建了拟南芥属(Arabidopsis)次生代谢物转运蛋白的规范化文库，并在爪蟾属(Xenopus)卵母细胞中以高通量方式筛选。针对对脂肪族芥子油苷4-甲硫基丁基(methylthiobytyl)(4-MTB)芥子油苷的摄取筛选了转运蛋白文库。鉴定了三个拟南芥属芥子油苷转运蛋白基因。它们中的两个(At3g47960和At1g18880；后文中称为AtGTR1和3)隶属于硝酸盐/肽转运蛋白家族，而第三个基因(At1g71880；称为AtSUC1)隶属于蔗糖转运蛋白家族。拟南芥属蔗糖转运蛋白家族包含9个基因(Williams等，2000，Trends Plant Sci5：283-290)，已显示其具有广泛的特异性，并转运多种β-葡糖苷(Chandran等，2003，J Biol Chem278：44320-44325)。显示AtSUC1、2、5、8和9以不同效率在爪蟾属卵母细胞中转运4-MTB(Nour-Eldin，2007，上文)。AtSUC9T-DNA敲除品系的种子显示四类芥子油苷的显著降低，而AtSUC1敲除品系显示种子芥子油苷含量无差异(Andersen等，2nd Conference on Glucosinolates，May24-27，2009)。基于同源性鉴定了另外两个AtGTR基因(At5g62680和At1g69870；后文中称为AtGTR2和AtGTR5)，随后也显示它们将4-MTB转运入爪蟾属卵母细胞(Nour-Eldin，2007，上文)。
在目前主导世界市场的油料种子作物中，油菜因两个重要原因而突出：它的高水平的油对人类具有优良的营养特性；富含蛋白质的籽饼粕是理想的动物饲料。降低种子中芥子油苷水平的兴趣源于苦味、毒性和致甲状腺肿的降解产物的存在，这限制了将菜籽粕掺入非反刍动物饲料(Thomson和Hughes，1986，Oilseed rape中.Scarisbrick和Daniels编辑.Collins，London，U.K.32-82页)。
迄今降低种子中芥子油苷水平的方法是通过阻断生物合成途径。但是，由于例如提高的对生物或非生物胁迫的敏感性，此方法通常伴随对植物适合度的不良影响。
在20世纪70年代，传统育种产生了依赖于多个基因座的欧洲油菜栽培种，其在包括种子的所有植物部分中具有降低的芥子油苷含量。此“00”(“双低”)变种及其后代随后成为整个北半球最广泛种植的油菜栽培种。但是，由此单一来源引起的延长的选择瓶颈为以后的欧洲油菜育种计划产生了有限的遗传多样性，并限制了种间杂交。这向力争通过种间杂交来改善产率和疾病抗性以及引入诸如耐旱性的新性状的欧洲油菜育种工作者提出了严重的问题。
“00”变体的另一问题是，虽然种子的芥子油苷含量低，但并非完全不含芥子油苷。提取油后从“00”变体获得的压榨籽饼通常将包含每克干重小于18-24微摩尔的总芥子油苷(GSL)(与每克包含120-150μmol总GSL的传统油菜籽粕相比)。对用于配合饲料，对反刍动物的适口性将所允许的总GSL水平设在每克干重不超过10-15微摩尔，这意味着，如果籽饼处于更低水平的GSL含量，则动物饲料理论上可以几乎完全配合“00”压榨籽饼。但是，最近发现，家禽和猪都比反刍动物对GSL的水平更敏感，饲料中每克干重超过2-4微摩尔GSL可以在这些动物中严重影响繁殖效率。对动物饲料配合者、压榨籽饼生产者和种植者而言，通过提高可以包含在配合饲料中的籽饼量和去除对持续监测他们的产品中的GSL水平的需要，真正的“零GSL”变体将具有明显的商业优势。
按后文在不同实施方案、实施例和权利要求中所述来解决这些及其他问题。
发明概述
本发明涉及具有改变的总芥子油苷(GSL)含量的植物和植物部分，如种子、籽粕、绿色植物组织和根组织。所提供的是通过改变功能性芥子油苷转运蛋白(GTR)活性来产生具有改变的总GSL含量的植物和植物部分的方法。具体而言，提供通过降低功能性GTR活性来产生具有降低的总GSL含量的种子的方法及产生具有提高的总GSL含量的绿色植物组织(如叶组织)的方法。还提供编码GTR的核酸分子在获得植物和植物部分中改变的GSL含量中的用途，及具有改变的功能性GTR活性的植物和植物部分例如在癌症预防中、在害虫防治中或在动物饲养中的用途。
在本发明的第一方面，可以通过下调GTR基因表达来达到功能性GTR活性的降低。在本发明的一个实施方案中，提供通过引入能够下调GTR基因表达的RNA分子，例如，通过引入包含表达时产生这种RNA分子的核苷酸区域的嵌合核酸构建体来改变植物和植物部分的总GSL含量的方法。
在一个实施方案中，通过引入包含部分编码GTR的核苷酸序列或同源序列的RNA分子，或通过引入编码这种RNA分子的嵌合DNA来下调GTR基因表达。在另一实施方案中，通过引入包含与至少部分编码GTR的核苷酸序列或同源序列互补的核苷酸序列的反义RNA分子，或通过引入编码这种RNA分子的嵌合DNA来下调GTR基因表达。还在另一实施方案中，通过引入双链RNA分子来下调GTR基因表达，该双链RNA分子包含分别对应于至少部分GTR基因序列和与至少部分GTR基因序列互补的有义和反义RNA区，该有义和反义RNA区能够相互形成双链RNA区。在另一实施方案中，可以通过引入能够指导切割GTR mRNA的微小RNA分子(其可以加工自前微小RNA分子)来下调GTR基因表达。同样，可以通过从编码这种miRNA、前miRNA或初级miRNA转录物的嵌合DNA分子表达来方便地将微小RNA分子引入植物细胞。
在本发明的另一实施方案中，提供通过改变内源GTR基因的核苷酸序列(例如，包括启动子序列、内含子加工信号、非翻译前导序列和尾随序列或多腺苷酸化信号序列的调节信号中的改变)下调GTR基因表达来改变植物或植物部分的总GSL含量的方法。
在本发明的第二方面，功能性GTR活性的降低可以发生在GTR活性水平。在本发明的一个实施方案中，提供通过引入编码能够下调GTR蛋白质活性的蛋白质的嵌合核酸构建体来改变植物和植物部分的总GSL含量的方法。在一个实施方案中，可以通过表达显性阴性GTR基因来下调GTR蛋白质活性。在本发明的另一实施方案中，可以通过表达GTR失活抗体来下调GTR蛋白质活性。还可以通过改变GTR蛋白质的磷酸化/去磷酸化状态来调节功能性GTR活性。如后文所述，这可以通过使用GTR编码基因的变体等位基因(由此改变磷酸化位点)来达到。
在本发明的另一实施方案中，提供通过改变内源GTR基因的核苷酸序列(例如，通过引入氨基酸插入、缺失或取代的编码区中的突变、所编码的蛋白质的截短或剪接位点突变)下调GTR蛋白质活性来改变植物或植物部分的总GSL含量的方法。
附图简述
图1a：拟南芥属NRT1/PTR家族中的蛋白质序列的无根系统树。蛋白质序列检索自ARAMEMNON植物膜蛋白数据库(Schwacke等，PlantPhysiol.131：16-26)。用括号标记At3g47960(AtGTR1)蛋白质亚类。灰色阴影的圆反映在爪蟾属卵母细胞中的相对体外GSL摄取活性，白色表示零摄取，黑色表示观察到最大摄取。未标记的基因未进行测试。用Neighbor-Joining法(Saitou和Nei，1987，Mol Biol Evol.4(4)：406-25)推断系统发生关系。用Poisson校正法(Zuckerkandl和Pauling，1965，在BrysonV，Vogel HJ(编辑)，Academic Press，New York，97-166页中)计算系统发生关系。从数据集去除包含缺口和缺失数据的所有位置(完全缺失选项)。最终数据集中有总计300个位置。在MEGA4(Tamura等，2007，Mol BiolEvol24：1596-1599)中进行系统发生分析。
图1b：拟南芥属GTR氨基酸序列的比对。POT1-6_AT..p：AtGTR1-6(SEQ ID No2、4、6、8、10和12)。
图1c：拟南芥属GTR氨基酸序列1至6的比对，GTR1中包含N端30个氨基酸的延伸(SEQ ID No142、4、6、8、10和12)。
图2：表达具有对应于SEQ ID NO：66的126位(Gly至Arg)、145位(Gly至Arg)、192位(Glu至Lys)、229位(Trp至终止)和359位(Ser至Phe)氨基酸的氨基酸取代的BrGTR2-A2蛋白质及野生型BrGTR2-A2蛋白质的爪蟾属卵母细胞中的4-MTB摄取。测定条件：0.5mM4-MTB，1小时。每个条(bar)是4个重复的平均值，误差是标准差。
图3：AtGTR1和2介导的爪蟾属卵母细胞中GSL转运的生物化学分析。A和B，AtGTR介导的GSL转运的pH依赖性。A，通过卵母细胞提取物的LC-MS分析测量的AtGTR2介导的4-MTB摄取，n＝3个卵母细胞。B，在pH5(●)、pH6(◆)和pH7(▲)下在不同膜电位测量1mM4-MTB诱导的AtGTR1电流。对在pH5、-60mV下诱导的电流归一化电流，误差棒是SD，n＝4个卵母细胞。C和D，AtGTR介导的芥子油苷转运的动力学分析。将-60mV膜电位下的归一化芥子油苷依赖性电流对4-MTB浓度作图，线显示Michaelis-Menten方程与数据的拟合；误差棒是SD。对于AtGTR1，n＝6个卵母细胞；对于AtGTR2，n＝5个卵母细胞。对在100μM4-MTB下引出的电流归一化各卵母细胞数据集。E和F，AtGTR的底物特异性。E，AtGTR1和AtGTR2在2mM4-MTB、2mMNO3 -、2mM葡萄糖+2mM SO4 --或2mM Ala-His+2mM Asp-Ala+2mMGly-Leu+2mM Ala-Phe+2mM Gly-Glu+2mM Gly-Gly-Gly的溶液存在下在pH5摄取0,04mM C-14标记的pOHBG，误差棒是SD，n＝8个卵母细胞。F，内源和外源芥子油苷诱导的AtGTR1电流，代表阳性、阴性和中性二肽及两种三肽。对100μtM4-MTB在-60mV下在pH5诱导的电流归一化电流，误差棒是SD，n＝4个卵母细胞。
图4：来自拟南芥属野生型和GTR敲除植物的种子中的芥子油苷含量。A-D，HPLC迹线，分别显示来自野生型、atgtr1、atgtr2和atgtr1/atgtr2植物的代表性长角果的全部种子中的GSL含量。A，来自野生型植物的54粒种子。B，来自atgtr2的51粒种子。C，来自atgtr1的53粒种子。D，来自atgtr1/atgtr2植物的39粒种子。E，来自用天然AtGTR2互补构建体转化的atgtr1/atgtr2植物的20粒种子。缩写词表示所检测的芥子油苷的词头。4ohb：4-羟丁基-GSL；4msb：4-甲基亚磺酰基丁基-GSL；5msp：5-甲基亚磺酰基戊基-GSL；6msh：6-甲基亚磺酰基己基-GSL；7msh：7-甲基亚磺酰基庚基-GSL；4mtb：4-甲硫基丁基-GSL；8mso：8-甲基亚磺酰基-GSL；i3m：吲哚-3-基-甲基-GSL；5mtp：5-甲硫基丁基-GSL；3bzop：3-苯甲酰基丙基-GSL；4bzob：4-苯甲酰基丁基-GSL；7mth：7-甲硫基庚基-GSL；8-甲硫基辛基-GSL。2-丙烯基-GSL：内部标准GSL，对纯化过程中的损失归一化。
图5：整个发育过程中来自土壤栽培的拟南芥属植物的不同植物部分中的总脂肪族芥子油苷(在Y轴上简写为“gls”)含量。收获时间点：抽苔前：3周龄植物；抽苔(和长角果开始发育)后：5周龄植物；老化(和种子成熟)：8周。对于时间点“抽苔后”和“老化”，从同一植物收获组织。A，种子。B，莲座。C，茎(包括花)、总茎生叶、整个完整长角果(包括发育中的种子和成熟种子)。D，单长角果壳(silique wall)。条代表平均值±SD。(总脂肪族GSL包括所有甲硫氨酸衍生的GSL，包括苯甲酰氧基-GSL)。
图6：整个发育过程中来自水培拟南芥属植物的不同植物部分中的总脂肪族芥子油苷(在Y轴上简写为“gls”)含量。收获时间点如图2中针对土壤栽培的植物所述。A，根。B，莲座抽苔。C，每毫克植物的脂肪族芥子油苷浓度。
图7：部分拟南芥属GTR氨基酸序列的比对详情：AtGTR2：SEQ IDNO：4的454位氨基酸至493位氨基酸；BrGTR2：SEQ ID NO：26的450位氨基酸至489位氨基酸；AtGTR1：SEQ ID NO：2的440位氨基酸至479位氨基酸(或SEQ ID No 142的470位氨基酸至509位氨基酸)；AtGTR3：SEQ ID NO：6的438位氨基酸至467位氨基酸；AtGTR5：SEQ ID NO：10的463位氨基酸至495位氨基酸；AtGTR6：SEQ ID NO：12的423位氨基酸至449位氨基酸；和AtGTR4：SEQ ID NO：8的425位氨基酸至451位氨基酸。
图8：GTR2蛋白质的预测的蛋白质结构，相对显示突变体BrGTR2蛋白质中的突变。虚线箭头指示GTR1、GTR2和GTR3蛋白质的环特征(还在图7中通过框内序列来指示)。
图9：芜菁种子中的3-丁烯基含量。X轴显示种子的BrGTR2基因型；对于各突变，深色柱表示来自纯合突变体的种子，而浅色柱表示来自野生型分离子(WTS)的种子。WT表示未突变的参考野生型种子。Y轴以nmol/mg显示3-丁烯基浓度。图A)来自各植物的种子的芥子油苷浓度；从n＝3粒种子计算标准差。图B)所有“W229X-”(终止密码子)突变体的平均芥子油苷浓度，分别从n＝27粒种子、n＝12粒种子和n＝3粒种子计算标准差。
图10：突变体和参考欧洲油菜种子中的总芥子油苷含量。Y轴显示种子的基因型。参考是未突变的同基因野生型种子。
图11：模拟磷酸化/去磷酸化的构建体的4-MTB摄取，与野生型AtGTR1和GTR2比较；X轴表示不同构建体的基因型。
图12：芜菁的多种组织中的芥子油苷浓度。X轴显示所分析的植物部分，Y轴显示nmol芥子油苷/mg鲜重。分析显示，整株Brgtr2植物中的芥子油苷浓度高于WT中，此提高的浓度由叶和长角果中而不是茎和根中的芥子油苷水平引起。从n＝5计算标准差。
图13：多种组织的鲜重。X轴显示所称量的植物部分，Y轴显示mg鲜重。分析显示，Brgtr2植物大于WT，此增加主要由叶和茎的重量引起。应指出，与真正的WT和Brgtr2长角果相比，BrGTR2WT长角果的低重量部分由这些长角果中低量的种子引起(结果未显示)。从n＝5计算标准差。
一般定义
本文所用的“芥子油苷”(本文中缩写为“GSL”或“GLS”)指氨基酸衍生的包含磺化醛肟部分的硫葡糖苷有机阴离子。取决于亲本氨基酸的可变侧链和其他侧链修饰赋予GSL不同的化学和生物学特性。文献中描述了约120种不同的GSL，且它们全都衍生自仅8种不同的氨基酸。方便地将亲本氨基酸用作分类标准。衍生自Ala、Leu、Ile、Val和Met的GSL称为“脂肪族GSL”，衍生自Tyr和Phe的那些称为“芳香族GSL”，而衍生自Trp的那些称为“吲哚族GSL”。GSL类型的巨大多样性由亲本氨基酸侧链上的许多修饰引起。尤其是，甲硫氨酸经历了广泛的转化。十字花科中占优势的脂肪族GSL具有衍生自Met的链延长形式的侧链，如脂肪族硫-GSL3-甲硫基丙基(3-MTP)-、4-甲硫基丁基(4-MTB)-、5-甲硫基戊基(5-MTP)-、6-甲硫基己基(6-MTH)-、7-甲硫基庚基(7-MTH)-和8-甲硫基辛基(8-MTO)-GSL；脂肪族亚磺酰基-GSL3-甲基亚磺酰基丙基(3-MSP)-、4-甲基亚磺酰基丁基(4-MSB)-、5-甲基亚磺酰基戊基(5-MSP)-、6-甲基亚磺酰基己基(6-MSH)-、7-甲基亚磺酰基庚基(7-MSH)-和8-甲基亚磺酰基辛基(8-MSO)-GSL；脂肪族羟基-GSL3-羟丙基(3-OHP)-和4-羟丁基(4-OHB)-GSL；脂肪族苯甲酰氧基-GSL3-苯甲酰氧基丙基(3-BZOP)-和4-苯甲酰氧基丁基(4-BZOB)-GSL；及脂肪族链烯基-GSL2-丙烯基(2-P)-和3-丁烯基(3-B)-GSL。十字花科中占优势的芳香族GSL具有衍生自Phe的侧链，如芳香族GSL2-苯乙基(2-PE)-GSL。还存在较低量的衍生自Trp的具有吲哚侧链的GSL，如吲哚-GSL吲哚-3-基-甲基(i3M)-GSL。GSL与GSL特异性硫葡糖苷酶黑芥子酶共存于植物中。此酶在植物中在物理上与GSL分开，但在组织破坏时与它的底物接触。每个GSL分子产生的水解产物由一个游离葡萄糖和一个糖苷配基分子组成。糖苷配基不稳定，易于重排为异硫氰酸、腈、硫氰酸和其他毒性更高或更低的化合物。取决于亲本氨基酸的侧链，这些水解产物有助于GSL实际的生物学活性，而完整的GSL被认为是无活性的贮存形式。
本文所用的植物或植物部分的“芥子油苷含量”指GSL的总和，包括脂肪族、芳香族和吲哚族GSL，而不考虑GSL的类型。因此，植物或植物部分的“总GSL含量”或“GSL含量”意指该植物或植物部分的总GSL的含量，且以分子(nmol/g或μmol/g)为基础(而不是以重量(mg/kg)为基础)来表示，因为GSL取决于其侧链大小而具有显著不同的分子量。GSL累积在组织和发育阶段之间不同。嫩叶和繁殖组织(如长角果和种子)包含最高浓度的GSL，而老化叶包含最低浓度的GSL。中间浓度见于所有“大”器官中，如根、叶和茎。此外，组织之间GSL谱的组成显著不同。在根和营养组织中，GSL含量由吲哚族和脂肪族GSL组成而缺乏芳香族GSL。在长角果和种子中，发现少量芳香族和吲哚族GSL，而其余GSL含量完全由脂肪族GSL组成。
“卡诺拉(canola)”、“双零油菜”或“双低油菜”是通过标准植物育种技术繁育为在油部分中具有低水平芥子酸(低于2％)且在籽粕部分中具有低水平GSL(低于30μmol/g)的油菜(欧洲油菜和芸苔或芜菁)的后代。(双零)油菜的“种子”小而圆，直径为1-2mm。它包含约42-43％油，其提取用作食用植物油。剩余的“籽粕”是动物饲料中广泛使用的蛋白质源。降低了油菜中的GSL，因为对大多数动物而言，它们有毒性且不适口，从而将动物饲料中油菜籽粕的包含水平限制在非常低的水平。卡诺拉和油菜籽粕在全世界范围内常用于动物饲料，并作为醪液或在颗粒中以散装形式出售。
相对于具有相似遗传背景的参考植物或植物部分的总GSL含量，测量通过本发明的方法达到的植物或植物部分的“总GSL含量的降低”或“总GSL含量的提高”。可以通过任意适当的方法来测量总GSL含量。定量总GSL含量和测定植物材料的GSL组成的方法为本领域公知，且包括但不限于：例如Hansen等(2007，Plant J.50(5)：902-910)所述的涉及脱硫并从阴离子交换柱洗脱的甲醇提取物的HPLC分析的HPLC-UV脱硫法；例如Botting等(2002，J.Agric.Food Chem.50(5)：983-988)所述的完整GSL的MALDI-TOF质谱分析法分析；例如Font等(2005，J.Agric.Sci.143：65-73)所述的近红外反射光谱法；例如Clarke(2010，Anal.Methods2：310-325)所概述的产生具有分光光度测定活性的降解产物的方法；例如Rochfort等(2008，Phytochemistry69：1671)所述的完整芥子油苷的HPLC质谱分析法分析。
本文所用的“生物熏蒸消毒(biofumigation)”指含有GSL的植物(如十字花科(例如卷心菜、花椰菜、羽衣甘蓝和芥子)、白花菜科(Capparidaceae)(例如白花菜(cleome))和辣木科(Moringaceae)(例如辣根)物种)作为具有生物学活性的轮种和绿肥作物在控制几种土传病原体和疾病中的用途。
“作物植物”指作为作物栽培的植物物种，如欧洲油菜(AACC，2n＝38)、芥菜(AABB，2n＝36)、埃塞俄比亚芥(BBCC，2n＝34)、芜菁(syn.B.campestris)(AA，2n＝20)、甘蓝(CC，2n＝18)或黑芥(Brassicanigra)(BB，2n＝16)。此定义不涵盖诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的杂草。
术语“核酸”或“核酸分子”指单链或双链形式的DNA或RNA分子，尤其是编码本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。“内源核酸”指植物细胞内的核酸，例如存在于芸苔属(Brassica)细胞的核基因组内的GTR基因的内源等位基因。用“分离的核酸”来指不再处于其天然环境中(如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中)的核酸。
术语“基因”意指包含与调节区(例如启动子)有效连接的在细胞中转录为RNA分子(例如，转录为包含内含子序列的前mRNA，然后前mRNA剪接为成熟mRNA，或直接转录为不含内含子序列的mRNA，或转录为前miRNA)的DNA区的DNA片段。因此，基因可以包含几个有效连接的DNA片段，如启动子、含有例如涉及翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和含有例如转录终止位点的3’非翻译序列。“内源基因”用来与“外来基因”、“转基因”或“嵌合基因”区分，指来自某植物属、种或变种的植物的基因，未通过转化将该基因引入该植物中(即，它不是“转基因”)，但其正常存在于该属、种或变种的植物中，或者通过正常育种技术或通过体细胞杂交(例如通过原生质体融合)将该基因从另一植物属、种或变种的植物引入其已正常存在于其中的植物中。类似地，基因的“内源等位基因”并非通过植物转化引入植物或植物组织中，而是例如通过植物诱变和/或选择产生，或通过筛选植物的自然群体获得。
本文所用的“嵌合核酸构建体”指通常不见于植物物种中的核酸构建体。嵌合核酸构建体可以是DNA或RNA。“嵌合DNA构建体”和“嵌合基因”可互换使用，指通常不见于植物物种中的基因，或指其中基因的启动子或一个或多个其他调节区在自然界中不与部分或全部转录DNA区结合的任意基因。
“基因的表达”或“基因表达”指其中与适当调节区(尤其是启动子)有效连接的DNA区转录为RNA分子的过程。然后在细胞内进一步加工(通过转录后加工)该RNA分子，例如通过RNA剪接和翻译起始并翻译为氨基酸链(多肽)，以及翻译终止密码子的翻译终止。本文用术语“功能性表达的”来指产生功能性蛋白质；用术语“非功能性表达的”来指产生具有显著降低的功能性或无功能性(生物学活性)的蛋白质，或未产生蛋白质(见下文)。在RNA分子能够与另一核酸或蛋白质相互作用，或能够翻译为具有生物学活性的多肽或蛋白质时，它具有生物学活性。在基因表达的终产物是具有生物学活性的RNA，例如反义RNA、核酶或miRNA时，称该基因编码RNA。在基因表达的终产物是蛋白质或多肽时，称该基因编码蛋白质。在基因表达的终产物能够下调GTR功能活性，即，能够下调GTR基因表达和/或GTR蛋白质活性时，称该基因编码GTR抑制性RNA。
为了本发明的目的，术语“植物有效启动子”和“植物可表达启动子”意指能够在植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞中驱动转录的启动子。这包括植物来源的任意启动子，以及能够在植物细胞中指导转录的非植物来源的任意启动子。
可以用于此方面的启动子是组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录物的启动子(Harpster等，1988，Mol.Gen.Genet.212：182-190)；CaMV19S启动子(US5,352,605；WO84/02913；Benfey等，1989，EMBO J.8：2195-2202)；地三叶斑点病毒(subterranean clover virus)启动子No4或No7(WO96/06932)；核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子(US4,962,028)；泛素启动子(Holtorf等，1995，Plant Mol.Biol.29：637-649)；T-DNA基因启动子，如来自土壤杆菌属(Agrobacterium)的章鱼碱合酶(OCS)和胭脂碱合酶(NOS)启动子；以及其在植物中的组成性表达为本领域技术人员已知的基因的其他启动子。
可以用于此方面的其他启动子是组织特异性或器官特异性启动子，优选种子特异性启动子，如2S白蛋白启动子(Joseffson等，1987，J.Biol.Chem.262：12196-12201)；菜豆蛋白启动子(US5,504,200；Bustos等，1989，Plant Cell1.(9)：839-53)；豆球蛋白启动子(Shirsat等，1989，Mol.Gen.Genet.215(2)：326-331)；“未知种子蛋白质”(USP)启动子(Baumlein等，1991，Mol.Gen.Genet.225(3)：459-67)；油菜籽蛋白启动子(US5,608,152；Stalberg等，1996，Planta199：515-519)；拟南芥属油质蛋白启动子(WO98/45461)；芸苔属Bce4启动子(WO91/13980)；以及其在植物中的种子特异性表达为本领域技术人员已知的基因的其他启动子。
可以使用的其他启动子是组织特异性或器官特异性启动子，如原基器官特异性启动子(An等，1996，Plant Cell8：15-30)、茎特异性启动子(Keller等，1988，EMBO J.7(12)：3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等，1989，Plant Mol.Biol.12：579-589)、叶肉特异性启动子(如光诱导型核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子)、根特异性启动子(Keller等，1989，Genes Dev.3：1639-1646)、块茎特异性启动子(Keil等，1989，EMBO J.8(5)：1323-1330)、维管组织特异性启动子(Peleman等，1989，Gene84：359-369)、雄蕊选择性启动子(WO89/10396，WO92/13956)、开裂带特异性启动子(WO97/13865)等。
可以用如WO90/12107、WO03/052108或WO2005/098004中所述的手段和方法来将本发明的嵌合RNA构建体递送至植物细胞。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸的链组成的分子，而不涉及具体的作用方式、大小、三维结构或来源。因此，GTR蛋白质的“片段”或“部分”仍可以称为“蛋白质”。用“分离的蛋白质”来指不再处于其天然环境中(例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中)的蛋白质。
用术语“转运蛋白”来指帮助某种物质或某类密切相关的物质跨过膜的跨膜蛋白。“芥子油苷转运蛋白”(本文中缩写为“GTR”)是涉及芥子油苷转运的质子依赖性寡肽转运(POT)蛋白。
术语“GTR基因”在本文中指编码芥子油苷转运蛋白(GTR)的核酸序列。
本文所用的术语“等位基因”意指特定基因座上的基因的任意一种或多种备选形式。在生物的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因定位在染色体上的特定位置或基因座。同源染色体对的每条染色体上存在一个等位基因。
本文所用的术语“同源染色体”意指这样的染色体，其包含用于相同的生物学特性的信息，且在相同的基因座上包含相同的基因，但可能是那些基因的不同等位基因。同源染色体是在减数分裂期间配对的染色体。“非同源染色体”(代表生物的所有生物学特征)形成组，在细胞中的组数称为倍性。二倍体生物包含两组非同源染色体，其中每条同源染色体遗传自不同亲本。在双二倍体物种中，基本上存在两组二倍体基因组，由此将两个基因组的染色体称为“同源染色体”(类似地，将两个基因组的基因座或基因称为同源基因座或同源基因)。二倍体或双二倍体植物物种可以在特定基因座上包含许多不同的等位基因。
本文所用的术语“杂合的”意指两个不同的等位基因存在于特定基因座上，但分别定位于细胞中对应的同源染色体对上时存在的遗传状态。相反，本文所用的术语“纯合的”意指两个相同的等位基因存在于特定基因座上，但分别定位在细胞中对应的同源染色体对上时存在的遗传状态。
本文所用的术语“基因座”意指染色体上的一个或多个特定位置或位点，可以在该位置或位点找到例如基因或遗传标记。例如，“GTR-A1基因座”指A基因组的染色体上的位置，可以在该位置找到GTR-A1基因(和两个GTR-A1等位基因)，而“GTR-C1等位基因”指C基因组的染色体上的位置，可以在该位置找到GTR-C1基因(和两个GTR-C1等位基因)。
每当提到本发明的“植物”时，应理解，除非另有说明，本文还涵盖保留亲本的明显特征(尤其是特定植物部分中的芥子油苷含量)的植物的植物部分、后代，如通过自交或杂交获得的种子，例如杂种种子(通过杂交两个近交亲本品系获得)、杂种植物及从其衍生的植物部分。
本文所用的“植物部分”指植物的任意部分，包括植物细胞、植物组织、植物器官、长角果或种荚(seed pod)、种子、切断部分，如根、叶、花、花粉等。
“分子测定”(或测试)在本文中指(直接或间接)显示一个或多个特定GTR等位基因在一个或两个GTR基因座上(例如在一个或两个GTR-A1或GTR-C1基因座上)的存在或缺乏的测定。在一个实施方案中，它允许技术人员测定任意单株植物中的基因座上的特定(野生型或突变体)等位基因是纯合的还是杂合的。
本文所用的“野生型(wild type)”(也书写为“wildtype”或“wild-type”)指植物或基因最常存在于自然界中的典型形式。“野生型植物”指具有自然群体中的这种植物的最常见表型的植物。“野生型等位基因”指产生野生型表型所需的基因的等位基因。相反，“突变体植物”指具有自然群体中的这种植物的不同稀有表型的植物，或通过人为干预(例如通过诱变)产生的植物，而“突变体等位基因”指产生突变体表型所需的基因的等位基因。
本文所用的术语“野生型GTR”(例如野生型GTR-A1或GTR-C1)意指见于植物、尤其是十字花科植物、尤其是拟南芥属和芸苔属植物中的天然存在的GTR等位基因，其编码功能性GTR蛋白质(例如分别为功能性GTR-A1或GTR-C1)。相反，本文所用的术语“突变体GTR”(例如突变体GTR-A1或GTR-C1)指不编码功能性GTR蛋白质的GTR等位基因，即，编码非功能性GTR蛋白质(例如分别为非功能性GTR-A1或GTR-C1)或完全不编码GTR蛋白质的GTR等位基因，本文所用的非功能性GTR蛋白质指与对应的野生型功能性GTR蛋白质相比无生物学活性或具有显著降低的生物学活性的GTR蛋白质。这种“突变体GTR等位基因”(也称为“完全敲除”或“无效”等位基因)是这样的野生型GTR等位基因，其在它的核酸序列中包含一个或多个突变，该一个或多个突变由此优选在体内导致细胞中显著降低量的功能性GTR蛋白质。编码GTR蛋白质的核酸序列的突变体等位基因在本文中命名为“gtr”(例如分别为gtr-a1或gtr-c1)。突变体等位基因可以是“天然突变体”等位基因(其是见于自然界中的突变体等位基因(例如在不人为应用诱变剂的情况下自发产生))或“诱导突变体”等位基因(其是通过人为干预(例如通过诱变)诱导的)。
“显著降低量的功能性GTR蛋白质”(例如功能性GTR-A1或GTR-C1蛋白质)是指，与由不包含突变体GTR等位基因的细胞产生的功能性GTR蛋白质的量相比，由包含突变体GTR等位基因的细胞产生的功能性GTR蛋白质的量降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即，细胞不产生功能性GTR蛋白质)。此定义涵盖了在体内无GSL转运活性的“非功能性”GTR蛋白质(例如截短的GTR蛋白质)的产生；功能性GTR蛋白质的绝对量的降低(例如，由于GTR基因中的突变而不产生功能性GTR蛋白质)；和/或与功能性野生型GTR蛋白质相比具有显著降低的GSL转运活性的GTR蛋白质(如这样的GTR蛋白质，其中，将下文示例的对所编码的GTR蛋白质的GSL转运活性至关重要的一个或多个氨基酸残基取代为另一氨基酸残基)的产生。本文所用的术语“突变体GTR蛋白质”指由突变体GTR核酸序列(“gtr等位基因”)编码的GTR蛋白质，与非突变体野生型GTR序列(“GTR等位基因”)编码的GTR蛋白质的活性相比，该突变由此在体内导致显著降低的GTR活性和/或无GTR活性。
本文所用的“诱变”指这样方法，其中使植物细胞(例如，多个芸苔属种子或其他部分，如花粉等)经受在细胞的DNA中诱导突变的技术，如与诱变剂接触，该诱变剂如化学物质(如甲基磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENU)等)或电离辐射(中子(如在快中子诱变等中)、α射线、γ射线(如由钴60源提供)、X-射线、紫外辐射等)或这些中的两种或多种的组合。因此，可以通过以下来实现希望的一个或多个GTR等位基因的诱变：通过使用化学手段，如通过使一种或多种植物组织与甲基磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲等接触；通过使用物理手段，如X-射线等；或通过γ辐射，如由钴60源提供的γ辐射。通过辐射产生的突变通常是大的缺失或其他严重损伤，如易位或复杂重排，而通过化学诱变剂产生的突变通常是更离散的损伤，如点突变。例如，EMS烷基化鸟嘌呤碱基，导致碱基错配：烷基化的鸟嘌呤将与胸腺嘧啶碱基配对，主要导致G/C至A/T的转换。
在用于谈论植物时，本文所用的术语“非天然存在的”意指具有经人为修饰的基因组的植物。例如，转基因植物是非天然存在的植物，其包含外源核酸分子，例如含有在转录时产生能够降低内源基因(如本发明的GTR基因)的表达的生物活性RNA分子的转录区的嵌合基因，因此在遗传上经人为修饰。此外，由于暴露于诱变剂而在内源基因中包含突变，例如在内源GTR基因中(例如，在调节元件中或在编码序列中)包含突变的植物也视为非天然植物，因为它已在遗传上经人为修饰。此外，特定物种(如欧洲油菜)的这样的植物也视为非天然存在的植物，该植物在内源基因中(例如在内源GTR基因中)包含自然界中不存在于该特定植物物种中的突变，该突变是由于例如该植物与相同物种或另一物种(如芥菜或芜菁)的植物的定向育种方法，如标记辅助育种和选择或渐渗现象而产生的。相反，只包含自发或天然存在的突变的植物，即，在遗传上未经人为修饰的植物不是本文定义的“非天然存在的植物”，因此不包含在本发明之内。本领域技术人员理解，虽然非天然存在的植物与天然存在的植物相比通常具有改变的核苷酸序列，但非天然存在的植物也可以在遗传上经人为修饰而不改变它的核苷酸序列，例如，通过修饰甲基化模式。
术语基因或蛋白质的“直向同源物”在本文中指见于另一物种中的同源基因或蛋白质，其具有与该基因或蛋白质相同的功能，但(通常)从包含该基因的物种趋异的时间点开始在序列上趋异(即，通过物种形成从共同祖先进化的基因)。因此，可以根据序列比较(例如，根据整个序列内或特定结构域内的百分比序列同一性)和/或功能分析二者来在其他植物物种(例如芥菜等)中鉴定例如欧洲油菜GTR基因的直向同源物。
本文按照UPOV协定使用“变种”，指最低已知等级的单个植物分类单位内的植物分组，该分组可以通过源自给定基因型或基因型组合的特征的表达来定义，可以通过至少一种该特征的表达来区别于任意其他植物分组，且就其对无变化(稳定)繁殖的适应性视为一个单位。
术语“包含”将解释为指出所述部分、步骤或成分的存在，但不排除一个或多个其他部分、步骤或成分的存在。因此，包含某性状的植物可以包含其他性状。包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的核苷酸或氨基酸多的核苷酸或氨基酸，即，包含在更大的核酸或蛋白质中。包含在功能上或结构上定义的DNA区的嵌合基因可以包含其他DNA区等。
应理解，在提到单数形式的单词(例如，植物或根)时，本文还包括复数形式(例如，多个植物、多个根)。因此，除非文中清楚地要求有且仅有一个元素，通过不定冠词“一”或“一个”提到元素不排除存在一个以上元素的可能性。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
为了本发明的目的，表示为百分比的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”指两条最佳比对的序列中具有相同残基的位置数(x100)除以所比较的位置数。将缺口(即比对中的位置，一个序列中的该位置上存在残基，而另一个序列中的该位置上不存在残基)视为具有非相同残基的位置。通过用默认设置(缺口开放罚分＝10(对于核苷酸)/10(对于蛋白质)和缺口延伸罚分＝0.5(对于核苷酸)/0.5(对于蛋白质))按照TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS，Rice等，2000，Trends in Genetics16(6)：276277；见例如http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch，1970，J Mol Biol48(3)：443-53)在全长内比对两个序列来找到这两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，所使用的默认评分矩阵是EDNAFULL，对于蛋白质，默认评分矩阵是EBLOSUM62。
显而易见，每当通过引用对应的DNA分子的核苷酸序列来定义RNA分子的核苷酸序列时，应该用尿嘧啶(U)取代核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)。所提到的是RNA分子还是DNA分子将从本申请的背景显而易见。
本文所用的“基本相同”或“基本相似”指在按上文所定义最佳比对时具有至少某最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义)的序列。
可以用“严格杂交条件”来鉴定与给定的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件依赖于序列，且在不同环境中将不同。通常，选择严格条件为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热溶解点(Tm)低约5℃。Tm是这样的温度(在确定的离子强度和pH下)，在该温度下，50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。通常，将选择这样的严格条件，其中pH7下的盐浓度是约0.02摩尔，温度是至少60℃。降低盐浓度和/或提高温度将提高严格性。用于RNA-DNA杂交(使用例如100nt的探针的Northern印迹)的严格条件是例如包括在63℃下在0.2X SSC中进行20分钟的至少一次洗涤的那些，或等同的条件。
可以例如通过在含有6x SSC(20x SSC包含3.0M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH7.0)、5x Denhardt′s(100X Denhardt’s包含2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和20μg/ml变性载体DNA(平均长度为120-3000个核苷酸的单链鱼精DNA)作为非特异性竞争剂的水溶液中在65℃下杂交来提供“高严格性条件”。杂交后，可以在几个步骤中进行高严格性洗涤，最后的洗涤(约30分钟)在0.2-0.1×SSC、0.1％SDS中在杂交温度下进行。
“中等严格性条件”指等同于在上述溶液中但在约60-62℃下杂交的条件。可以在1x SSC、0.1％SDS中在杂交温度下进行中等严格性洗涤。
“低严格性”指等同于在约50-52℃下在上述溶液中杂交的条件。可以在2x SSC、0.1％SDS中在杂交温度下进行低严格性洗涤。还见Sambrook等(1989)及Sambrook和Russell(2001)。
发明详述
本发明基于模式植物拟南芥中GSL转运(GTR)蛋白和对应的GTR基因的鉴定(Nour-Eldin，2007，上文)。发明人发现，拟南芥属GTR基因形成具有6个同源物(命名为GTR1至6)的小亚类(图1a)。发明人进一步发现，与野生型植物相比，GTR1或GTR2转运蛋白敲除的拟南芥属植物的种子的总脂肪族GSL浓度分别无显著降低和降低约50％，GTR1和GTR2转运蛋白二者都敲除的拟南芥属植物的种子具有零GSL种子表型。令人惊奇地，来自gtr敲除植物的老化叶中GSL水平高，而在野生型植物中，叶老化时GSL变少。发明人进一步发现，芜菁(基因组AA，2n＝20)和甘蓝(基因组CC，2n＝18)各在它们的基因组中包含三个GTR1基因和三个GTR2基因，而欧洲油菜(基因组AACC，2n＝4x＝38)(由于它源自二倍体祖先，它是包含基本上两个二倍体基因组(A和C基因组)的异源四倍体(双二倍体)物种)，在它的基因组中包含六个GTR1基因和六个GTR2基因；六个GTR1和GTR2基因中的三个定位在A基因组，三个定位在C基因组。芥菜(基因组AABB，2n＝4x＝36)(其是包含基本上两个二倍体基因组(A和B基因组)的另一异源四倍体物种)也在它的基因组中包含六个GTR2基因；六个GTR2中的三个定位在A基因组上，三个定位在B基因组上。定位在A基因组上的GTR1和GTR2基因在本文中称为“GTRx-Ay”(其中x是1或2，y是1、2或3)，定位在C基因组上的GTR1和GTR2基因在本文中称为“GTRx-Cy”(其中x是1或2，y是1、2或3)。定位在B基因组上的GTR1和GTR2基因在本文中称为“GTRx-By”(其中x是1或2，y是1、2或3)。将来自欧洲油菜的GTRx-Ay基因称为与对应的来自欧洲油菜的GTRx-Cy基因“同源”，即，“A基因”见于A基因组上且源自二倍体祖先芜菁(AA)，而“C基因”见于欧洲油菜的C基因组上且源自二倍体祖先甘蓝(CC)。类似地，将来自芥菜的GTRx-Ay基因称为与对应的来自芥菜的GTRx-By基因“同源”，即，“A基因”见于A基因组上且源自二倍体祖先芜菁(AA)，而“B基因”见于欧洲油菜的B基因组上且源自二倍体祖先黑芥(BB)。
如在任意二倍体基因组中，对于基因组中每个GTR基因座上的每个GTR基因，体内可以存在两个“等位基因”(一个等位基因是见于一条染色体上的基因序列，另一等位基因在同源染色体上)。在任意给定的植物中，这两个等位基因的核苷酸序列可以相同(纯合植物)或不同(杂合植物)，但在整个物种群体中，各GTR基因存在的可能的不同等位基因的数目可以远大于2。
本文提供的是来自十字花科物种的野生型和突变体GTR基因/等位基因的核酸序列，以及野生型和突变体GTR蛋白质。还提供在十字花科植物中产生和组合突变体和野生型GTR等位基因的方法，以及在其基因组中包含野生型和突变体GTR等位基因的特定组合，由此改变这些植物的特定部分中的GSL含量的十字花科植物和植物部分。这些植物在将突变体GTR等位基因转移至其他植物中的用途也是本发明的实施方案，所述任意植物的植物产物也是本发明的实施方案。此外，提供用于组合或检测GTR基因和/或等位基因的标记辅助选择(MAS)的试剂盒和方法。下文详细描述本发明的不同实施方案。
本发明的核酸序列
提供来自十字花科，尤其是来自芸苔属物种，尤其是来自欧洲油菜、芥菜、芜菁或甘蓝，但也来自其他芸苔属作物物种的GTR基因的编码功能性GTR蛋白质的野生型GTR核酸序列和突变体gtr核酸序列(包含一个或多个突变，优选导致所编码的GTR蛋白质无GSL转运活性或GSL转运活性显著降低，或导致无GTR蛋白质产生的突变)二者。例如，包含A和/或C基因组的芸苔属物种可以包含GTR-A或GTR-C基因的不同等位基因，其可以鉴定并组合在本发明的单株植物中。此外，可以用诱变方法来在野生型GTR等位基因中产生突变，从而产生用于本发明的突变体gtr等位基因。由于优选通过杂交和选择来将特定GTR等位基因组合在植物中，在一个实施方案中，在植物内提供GTR和/或gtr核酸序列(即，内源地)，该植物例如芸苔属植物，优选可以与欧洲油菜、芥菜、芜菁或甘蓝杂交，或可以用来制备“合成”欧洲油菜植物的芸苔属植物。本领域描述了不同芸苔属物种间的杂交，例如，如Snowdon(2007，Chromosomeresearch15：85-95)中所提到。种间杂交可以例如用来将基因从例如欧洲油菜(AACC)中的C基因组转移至埃塞俄比亚芥(BBCC)中的C基因组，或甚至从例如欧洲油菜(AACC)中的C基因组转移至芥菜(AABB)中的B基因组(通过它们的C和B基因组间非常规重组的偶发性事件)。可以通过杂交原始祖先甘蓝(CC)和芜菁(AA)来产生“重新合成”或“合成”的欧洲油菜品系。可以例如通过胚胎拯救技术或原生质体融合(见例如Snowdon，上文)来在芸苔属作物物种与它们的亲缘种间的杂交中成功克服种间以及属间不相容性屏障。
但是，本文还提供分离的GTR和gtr核酸序列(例如通过克隆从植物分离，或通过DNA合成制备)及其变体和任意这些的片段，因为这些可以用来确定哪个序列内源存在于植物或植物部分中，该序列编码功能性蛋白质、非功能性蛋白质或不编码蛋白质(例如，通过在下文所述的重组宿主细胞中表达)，用于选择并将特定等位基因从一种植物转入另一种植物，以产生具有希望的功能性等位基因和突变体等位基因的组合的植物。
本发明的“GTR核酸序列”或“GTR变体核酸序列”是编码与SEQID NO：2具有至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或与SEQ ID NO：1具有至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。这些核酸序列还可以称为与序列表中提供的GTR序列“基本相似”或“基本相同”。
如序列表中所示，GTR1至6的核酸序列分离自拟南芥属，GTRx-Ay的核酸序列分离自芜菁、芥菜和欧洲油菜，GTRx-By的核酸序列分离自芥菜，GTRx-Cy的核酸序列分离自甘蓝和欧洲油菜。显示了野生型GTR序列，而这些序列的突变体gtr序列和与这些基本相似的序列在下文和实施例中参考野生型GTR序列来描述。基因组GTR蛋白质编码DNA和对应的前mRNA包含由3个内含子(从5’端开始编号为内含子1-3)断裂开的4个外显子(从5’端开始编号为外显子1-4)。如序列表中所示，在cDNA和对应的加工mRNA(即剪接RNA)中，去除了内含子并连接外显子。外显子序列在进化上更保守，因此可变性低于内含子序列。
本发明的“GTR1、2、3、4、5或6核酸序列”或“GTR1、2、3、4、5或6变体核酸序列”是编码分别与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。这些核酸序列还可以称为与序列表中提供的GTR序列“基本相似”或“基本相同”。
因此，本发明提供编码野生型功能性GTR1、2、3、4、5或6蛋白质(包括其变体和片段(如下文进一步定义))的核酸序列以及任意这些的突变体核酸序列二者，核酸序列中的突变由此优选导致与野生型GTR蛋白质相比插入、缺失或取代一个或多个氨基酸。优选地，核酸序列中的一个或多个突变导致一个或多个氨基酸改变(即，相对于野生型氨基酸序列插入、缺失和/或取代了一个或多个氨基酸)，GTR蛋白质的GSL转运活性由此显著降低或完全废除。GTR蛋白质的GSL转运活性的显著降低或完全废除在本文中指GTR蛋白质的GSL转运活性的降低或废除，使得与表达对应的野生型GTR蛋白质的植物相比，改变了表达突变体GTR蛋白质的植物的特定部分中的GSL含量。
为了测定特定GTR核酸或蛋白质的功能性，可以例如按Nour-Eldin等(2006，Plant Methods2：17)和下文实施例中所述在爪蟾属卵母细胞中对它们进行功能筛选。
为了测定特定GTR等位基因或蛋白质在植物中、尤其是在十字花科植物中的功能性，可以例如通过按例如Hansen等(2007，Plant J.50(5)：902-910)所述或按下文实施例中所述进行脱硫并从sephadex阴离子交换柱洗脱的甲醇提取物的HPLC-UV分析，例如在包含不同形式的特定GTR等位基因或蛋白质(例如突变形式和野生型形式的特定GTR等位基因或蛋白质)的植物的特定部分间比较GSL含量。
本文提供内源核酸序列和分离的核酸序列二者。还提供上文定义的GTR序列和GTR变体核酸序列的片段，其用作引物或探针，且用作本发明的另一方面的试剂盒的成分(进一步见下文)。GTR或gtr核酸序列或其变体(如所定义)的“片段”可以具有多种长度，如GTR或gtr序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、200、500、600个相邻核苷酸。
编码功能性GTR蛋白质的核酸序列
序列表中所示的核酸序列编码来自拟南芥属、芜菁、甘蓝、芥菜和欧洲油菜的野生型功能性GTR蛋白质。因此，对从其分离它们的植物而言，这些序列是内源的。可以针对其他GTR等位基因(编码相同的GTR蛋白质或其变体)筛选其他十字花科植物(包括芸苔属作物物种、变种、繁殖品系或野生亲缘种(wild accession))。例如，可以用核酸杂交技术(例如，使用例如严格杂交条件的Southern印迹分析)或基于PCR的技术来鉴定其他十字花科植物(如多种欧洲油菜、甘蓝和芜菁变种、品系或亲缘种)的内源GTR等位基因，但也可以针对其他野生型GTR等位基因筛选芥菜(尤其是A基因组上的GTR等位基因)和埃塞俄比亚芥(尤其是C基因组上的GTR等位基因)植物、器官和组织。为了针对GTR等位基因的存在筛选这类植物、植物器官或组织，可以使用序列表中提供的GTR核酸序列，或任意这些的变体或片段。例如，可以用全序列或片段作为探针或引物。例如，可以用特异性引物或简并引物来从植物、植物器官或组织的基因组DNA扩增编码GTR蛋白质的核酸序列。可以用标准分子生物学技术分离和测序这些GTR核酸序列。然后可以用生物信息学分析来表征该一个或多个等位基因，例如，以确定该序列对应于哪个GTR等位基因，以及该序列编码哪种GTR蛋白质或蛋白质变体。
可以通过本领域已知的重组DNA技术来分析核酸序列是否编码功能性GTR蛋白质，例如，通过使用例如拟南芥属植物(其对一个或多个完全敲除的gtr突变体等位基因而言是纯合的)或芸苔属植物(其对一个或多个完全敲除的gtr突变体等位基因而言是纯合的)的遗传互补测试，或通过按Nour-Eldin等(2006，Plant Methods2，17)所述在爪蟾属卵母细胞中对GTR蛋白质进行功能筛选。
此外，应理解，通过针对基本相似的序列筛选核酸数据库，可以在计算机芯片上鉴定GTR核酸序列及其变体(或任意这些的片段)。同样，可以化学合成核酸序列。还提供下文进一步描述的本发明的核酸分子的片段。片段包括仅编码下文所述的特定保守结构域和功能结构域的核酸序列。
编码突变体GTR蛋白质的核酸序列
相对于野生型核酸序列包含一个或多个核苷酸缺失、插入或取代的核酸序列是本发明的另一实施方案，这类突变体核酸分子的片段也是本发明的实施方案。可以用下文进一步描述的多种已知方法来产生和/或鉴定这类突变体核酸序列(称为gtr序列)。同样，以内源形式和分离形式这两种形式提供这类核酸分子。在一个实施方案中，该一个或多个突变在所编码的GTR蛋白质的氨基酸序列中产生一个或多个改变(缺失、插入和/或取代)(即，它不是“沉默突变”)。在另一实施方案中，核酸序列中的该一个或多个突变导致所编码的GTR蛋白质的GSL转运活性相对于野生型蛋白质显著降低或完全废除。
因此，核酸分子可以包含一个或多个突变，如：
(a)“错义突变”或“取代突变”，其是核酸序列中导致氨基酸取代为另一氨基酸的改变；
(b)“无义突变”或“终止密码子突变”，其是核酸序列中导致过早引入终止密码子，从而终止翻译的改变(产生截短的蛋白质)；植物基因包含翻译终止密码子“TGA”(RNA中为UGA)、“TAA”(RNA中为UAA)和“TAG”(RNA中为UAG)；因此，导致这些密码子之一出现在所翻译的成熟mRNA中(在阅读框中)的任意核苷酸取代、插入、缺失将终止翻译；
(c)核酸的编码序列中加入一个或多个密码子引起的一个或多个氨基酸的“插入突变”；
(d)核酸的编码序列中缺失一个或多个密码子引起的一个或多个氨基酸的“缺失突变”；
(e)导致核酸序列在突变的下游以不同的阅读框翻译的“移码突变”。移码突变可以具有多种原因，如一个或多个核苷酸的插入、缺失或重复，但影响前mRNA剪接的突变(剪接位点突变)也可以导致移码；
(f)“剪接位点突变”，其改变或废除前mRNA序列的正确剪接，产生具有不同于野生型的氨基酸序列的蛋白质。例如，RNA剪接过程中可以跳过一个或多个外显子，产生缺乏由所跳过的外显子编码的氨基酸的蛋白质。备选地，可以通过不正确的剪接改变阅读框，或者可以保留一个或多个内含子，或者可以产生其他剪接供体或受体，或者可以在其他位置(例如，在内含子内)起始剪接，或者可以产生其他多腺苷酸化信号。正确的前mRNA剪接是复杂的过程，其可以受GTR编码基因的核苷酸序列中的多种突变影响。在高等真核生物(如植物)中，主要剪接体剪接在5’剪接位点(供体位点)包含GU且在3’剪接位点(受体位点)包含AG的内含子。核真核基因的约99％的剪接位点都遵循此GU-AG规则(或GT-AG规则；见Lewin，Genes VI，Oxford University Press1998，885-920页，ISBN0198577788)，而在5’和3’剪接位点包含诸如GC-AG和AU-AC的其他二核苷酸的内含子仅分别占约1％和0.1％。序列表中显示了在5’剪接位点(供体位点)包含GU且在3’剪接位点(受体位点)包含AG的内含子的实例。
如已提到，希望核酸序列中的一个或多个突变优选导致突变体蛋白质包含显著降低的体内GSL转运活性或无体内GSL转运活性，或导致无蛋白质产生。导致蛋白质相对于野生型蛋白质包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代的任意突变都可以导致显著降低的GSL转运活性或无GSL转运活性。但是，应理解，蛋白质的某些部分中的突变更有可能导致突变体GTR蛋白质的功能减少，如导致截短的蛋白质的突变，由此使大部分的保守结构域或功能结构域缺乏。
拟南芥属GTR1、2、3、4、5和6蛋白质的保守结构域和功能结构域可以在Arabidopsis Information Resource(TAIR)数据库(http://www.arabidopsis.org/)中找到，AtGTR1(SEQ ID NO：2)在At3g47960下、AtGTR2(SEQ ID NO：4)在At5g62680下、AtGTR3(SEQID NO：6)在At1g18880下、AtGTR4(SEQ ID NO：8)在At1g69860下、AtGTR5(SEQ ID NO：10)在At1g69870下和AtGTR6(SEQ ID NO：12)在At1g27080下，和/或通过最佳比对拟南芥属GTR1、2、3、4、5和6蛋白质序列，并确定保守结构域(见图1)，如氨基酸序列F/VALTKPTLGM/LAPRKGE/AISS(SEQ ID NO：2的448至466位氨基酸或SEQ ID No.142的478至496位氨基酸)及与之基本相似的序列(如SEQ ID NO：4的462至480位氨基酸和SEQ ID NO：6中的436至454位氨基酸)；氨基酸序列L/INxxxLDxY/FY/FxxxxxxxxxNxxY/F(SEQ ID NO：2的545至567位氨基酸或SEQ ID No.142的575至597位氨基酸)及与之基本相似的序列。
可以通过最佳比对芸苔属和拟南芥属GTR蛋白质和根据TAIR数据库中的注释信息来确定芸苔属GTR蛋白质的对应的保守结构域和功能结构域。
已发现，拟南芥属GTR1、2和GTR3包含上述序列F/VALTKPTLGM/LAPRKGE/AISS，而拟南芥属GTR4、5和GTR6不包含该序列(见图7的比对)。如下文实施例中详述，GTR1、GTR2和GTR3在爪蟾属卵母细胞测试中显示最大的芥子油苷摄取活性。预测的GTR2蛋白质的蛋白质结构包含12个跨膜结构域(图8)。如图8中通过虚线箭头指示，保守序列在蛋白质的羧基端附近形成GTR1/2/3特异性环。
可以在芸苔属物种的GTR1和GTR2蛋白质中找到类似的结构域，其包括：BnGTR1-A1(SEQ ID NO：14氨基酸位置456-474)；BnGTR1-A2(SEQ ID NO：16氨基酸位置459-477)；BnGTR1-A3(SEQ ID NO：18氨基酸位置457-475)；BnGTR1-C1(SEQ ID NO：20氨基酸位置456-474)；BnGTR1-C2(SEQ ID NO：22氨基酸位置459-477)；BnGTR1-C3(SEQ IDNO：24氨基酸位置457-475)；BnGTR2-A1(SEQ ID NO：26氨基酸位置458-476)；BnGTR2-A2(SEQ ID NO：28氨基酸位置458-476)；BnGTR2-A3(SEQ ID NO：30氨基酸位置458-476)；BnGTR2-C1(SEQ ID NO：32氨基酸位置458-476)；BnGTR2-C2(SEQ ID NO：34氨基酸位置401-419)；BnGTR2-C3(SEQ ID NO：36氨基酸位置457-475)；BrGTR1-A1(SEQ IDNO：38氨基酸位置456-474)；BrGTR1-A2(SEQ ID NO：40氨基酸位置459-477)；BrGTR1-A3(SEQ ID NO：42氨基酸位置457-475)；BrGTR2-A1(SEQ ID NO：44氨基酸位置458-476)；BrGTR2-A2(SEQ ID NO：46氨基酸位置458-476)；BrGTR2-A3(SEQ ID NO：48氨基酸位置458-476)；BoGTR1-C1(SEQ ID NO：50氨基酸位置456-474)；BoGTR1-C2(SEQ IDNO：52氨基酸位置459-477)；BoGTR1-C3(SEQ ID NO：54氨基酸位置457-475)；BoGTR2-C1(SEQ ID NO：56氨基酸位置458-476)；BoGTR2-C2(SEQ ID NO：58氨基酸位置458-476)；BoGTR2-C3(SEQ ID NO：60氨基酸位置458-476)；BjGTR2-A1(SEQ ID NO：120氨基酸位置458-476)；BjGTR2-A2(SEQ ID NO：122氨基酸位置458-476)；BjGTR2-A3(SEQ IDNO：124氨基酸位置458-476)；BjGTR2-B1(SEQ ID NO：126氨基酸位置405-423)；BjGTR2-B2(SEQ ID NO：128氨基酸位置458-476)；和BjGTR2-B3(SEQ ID NO：130氨基酸位置452-470)。
最近还发现并通过蛋白质组学数据确认，与SEQ ID No2中所示的GTR1蛋白质相比，拟南芥的GTR1蛋白质可以包含长度为30个氨基酸的氨基端肽延伸。SEQ ID No.142中提供具有N端延伸的变体，SEQ ID No.141中提供编码这种蛋白质的核苷酸序列。可以在芜菁GTR1_A1、GTR1_A2、GTR1_A3、欧洲油菜GTR1_A1、GTR1_A2、GTR1_A3、甘蓝GTR_C1、GT1_C2、GTR1_C3和欧洲油菜GTR_C1、GT1_C2、GTR1_C3(SEQ ID NOS：143-150)中找到类似的N端肽。可以预期，可以在如存在于芥菜中的GTR1_B1、GTR1_B2和GTR1_B3中找到类似的延伸。改变此30/23氨基酸序列的突变可以导致突变体GTR蛋白质在植物细胞中定位在不同的亚细胞位置，从而导致功能上更少或无活性的GTR1蛋白质。氨基端肽还可以与在某些条件下(例如不同种类的胁迫)提供影响GTR1活性的调节机制的蛋白质相互作用，此区域中的突变体也可以以这种方式影响功能性。
因此，在一个实施方案中，提供包含上述突变类型中的任意一种或多种的核酸序列。在另一实施方案中，提供包含一个或多个终止密码子(无义)突变、一个或多个取代(错义)突变和/或一个或多个剪接位点(移码)突变的gtr序列。提供任意以上突变体核酸序列本身(以分离形式)，以及内源包含这类序列的植物和植物部分。在下文的表格中，描述了最优选的gtr等位基因。
本文所用的GTR等位基因中的无义突变是GTR等位基因中的突变，由此将一个或多个翻译终止密码子引入对应的野生型GTR等位基因的编码DNA及对应的mRNA序列中。翻译终止密码子是TGA(mRNA中为UGA)、TAA(UAA)和TAG(UAG)。因此，导致在编码序列中产生符合读框的终止密码子的任意突变(缺失、插入或取代)将导致翻译的终止和氨基酸链的截短。在一个实施方案中，包含无义突变的突变体GTR等位基因是这样的GTR等位基因，其中，通过单核苷酸取代(如CAG至TAG、TGG至TAG或TGA、CGA至TGA、CAA至TAA的突变等(见下表))来将符合读框的终止密码子引入GTR密码子序列。在一方面，包含无义突变的突变体GTR等位基因是这样的GTR等位基因，其在对应于SEQ IDNO：66中的229位氨基酸的密码子的位置上包含终止密码子，如下文实施例3的表7中所示的GTR等位基因。在另一实施方案中，包含无义突变的突变体GTR等位基因是这样的GTR等位基因，其中，通过双核苷酸取代(如CAG至TAA、TGG至TAA、CGA至TAA的突变等(见下表))来将符合读框的终止密码子引入GTR密码子序列。还在另一实施方案中，包含无义突变的突变体GTR等位基因是这样的GTR等位基因，其中，通过三核苷酸取代(如CGG至TAA的突变等(见下表))来将符合读框的终止密码子引入GTR密码子序列。截短的蛋白质缺乏由突变下游的编码DNA编码的氨基酸(即GTR蛋白质的C端部分)，保留由突变上游的编码DNA编码的氨基酸(即GTR蛋白质的N端部分)。突变体GTR蛋白质与野生型GTR蛋白质相比截短得越多，该截短越可以导致GTR蛋白质的活性显著降低或无活性。
下表描述本文提供的拟南芥属和芸苔属GTR序列中的一系列可能的无义突变：
表1.AtGTR1和AtGTR2的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
对于AtGTR1，考虑到N端30AA的延伸，可以将数字增加90nt或30AA来引用位置。
表2a.BnGTR1-A1和C1的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500321
＊SEQ ID NO：14和20中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：13和19中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
对于SEQ ID No.137的BnGTR1-C1，可以通过EMS诱变来在每个以下位置诱导终止密码子：103-105、127-129、1227-1229、1239-1241、1257-1259、1344-1346、1398-1400、1425-1427、1458-1460、1473-1475、1641-1643、1647-1649、1710-1712、1868-1870、1886-1888、1931-1933、1970-1972、1991-1993、2000-2002、2162-2164、2252-2254、2276-2278、2309-2311、2321-2323、2366-2368、2387-2389、2516-2518、2618-2620、2687-2689、2690-2692。
表2b BnGTR1-A2和C2的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500331
＊SEQ ID NO：16和22中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：15和21中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
表2c BnGTR1-A3和C3的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500341
＊SEQ ID NO：18和24中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：17和23中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
表3a BnGTR2-A1和C1的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500351
＊SEQ ID NO：26和32中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：25和31中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
a实施例的BnGTR2-A1-ems02等位基因
b实施例的BnGTR2-C1-ems01等位基因
c实施例的BnGTR2-C1-ems05等位基因
表3b BnGTR2-A2和C2的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500361
＊SEQ ID NO：28和34中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：27和33中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
d实施例的BnGTR2-A2-ems03等位基因
e实施例的BnGTR2-A2-ems09等位基因
f实施例的BnGTR2-C2-ems02等位基因
表3c BnGTR2-A3和C3的外显子(缩写为E)1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
＊SEQ ID NO：30和36中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：29和35中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
表3dBjGTR2-A1和B1的外显子1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500381
＊SEQ ID NO：120和126中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：119和125中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
表3eBjGTR2-A2和B2的外显子1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500391
＊SEQ ID NO：122和128中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：121和127中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
表3fBjGTR2-A3和B3的外显子1、2、3和4中潜在的EMS诱导的终止密码子突变
Figure BDA00002840656500401
＊SEQ ID NO：124和130中对应的氨基酸位置分别对应于由序列表中的SEQ ID NO：123和129中的所示核苷酸位置上的氨基酸密码子编码的氨基酸的编号。
显然，突变不限于上表中所示的突变，应理解，gtr等位基因中可以存在除序列表中所示和上表中所提到的那些以外的类似终止密码子突变。
本文所用的GTR等位基因中的错义突变是GTR等位基因中的任意突变(缺失、插入或取代)，由此改变对应的野生型GTR等位基因的编码DNA和对应的mRNA序列中的一个或多个密码子，导致野生型GTR蛋白质中的一个或多个氨基酸取代为突变体GTR蛋白质中的一个或多个其他氨基酸。在一个实施方案中，包含错义突变的突变体GTR等位基因是这样的GTR等位基因，其中，取代上文所示的一个或多个保守性氨基酸。在另一实施方案中，包含错义突变的突变体GTR等位基因是编码GTR蛋白质的GTR等位基因，其中，取代对应于SEQ ID NO：66中的126、145、192或359位的位置上的氨基酸，如下文实施例3的表7中所示的那些。
本文所用的GTR等位基因中的移码突变是GTR等位基因中的突变(缺失、插入、重复等)，其导致核酸序列在突变下游以不同的阅读框翻译。如上文所示，剪接位点突变可以导致移码。本文提供的拟南芥属和芸苔属GTR序列中可能的EMS诱导的剪接位点突变是那些，其在序列表中所示的5’剪接位点的GU供体位点上或3’剪接位点的AG受体位点上产生突变，例如，其在这些位点中导致G/C至A/T的转换。
本发明的氨基酸序列
提供来自十字花科、尤其是来自芸苔属物种、尤其是来自欧洲油菜，但也来自其他芸苔属作物物种的野生型(功能性)GTR氨基酸序列和突变体GTR氨基酸序列(包含一个或多个突变，优选导致GTR蛋白质的GSL转运活性显著降低或无GSL转运活性的突变)二者。例如，包含A和/或C或B基因组的芸苔属物种可以编码不同的GTR-A、GTR-B或GTR-C氨基酸。此外，可以用诱变方法来在野生型GTR等位基因中产生突变，从而产生可以编码其他突变体GTR蛋白质的突变体等位基因。在一个实施方案中，在芸苔属植物内(即，内源地)提供野生型和/或突变体GTR氨基酸序列。但是，本文还提供分离的GTR氨基酸序列(例如，从植物分离或合成制备)及其变体和任意这些的片段。
本发明的“GTR氨基酸序列”或“GTR变体氨基酸序列”是与SEQID NO：2具有至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％，至少78％、至少79％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以称为与序列表中提供的GTR序列“基本相似”或“基本相同”。
如序列表中所示，已从拟南芥属中分离了GTR1至6蛋白质的氨基酸序列，从芜菁、芥菜和欧洲油菜分离了GTRx-Ay蛋白质的氨基酸序列，
从甘蓝和欧洲油菜分离了GTRx-Cy蛋白质的氨基酸序列，从芥菜分离了GTRx-By蛋白质的氨基酸序列。显示了野生型GTR氨基酸序列，而这些序列的突变体序列和与这些基本相似的序列在下文和实施例中参考野生型GTR氨基酸序列来描述。
本发明的“GTR1、2、3、4、5或6氨基酸序列”或“GTR1、2、3、4、5或6变体氨基酸序列”是分别与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还可以称为与序列表中提供的GTR序列“基本相似”或“基本相同”。
因此，本发明提供野生型功能性GTR1、2、3、4、5或6蛋白质(包括其变体和片段(如下文进一步定义))的氨基酸序列以及任意这些的突变体氨基酸序列二者，氨基酸序列中的突变由此优选导致GTR蛋白质的GSL转运活性与对应的野生型GTR蛋白质的GSL转运活性相比显著降低或完全废除。GTR蛋白质的GSL转运活性的降低或废除在本文中指GTR蛋白质的GSL转运活性显著降低或完全废除，使得与表达对应的野生型GTR蛋白质的植物相比，改变了表达突变体GTR蛋白质的植物的特定部分中的GSL含量。
本文提供内源氨基酸序列和分离的氨基酸序列二者。还提供上文定义的GTR氨基酸序列和GTR变体氨基酸序列的片段。GTR氨基酸序列或其变体(如所定义)的“片段”可以具有多种长度，如GTR序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、150、175、180个相邻氨基酸。
功能性GTR蛋白质的氨基酸序列
序列表中所示的氨基酸序列编码来自拟南芥属、芜菁、甘蓝、芥菜和欧洲油菜的野生型功能性GTR蛋白质。因此，对从其分离它们的植物而言，这些序列是内源的。可以按上文所述针对具有相同氨基酸序列的其他功能性GTR蛋白质或其变体筛选其他十字花科植物(包括芸苔属作物物种、变种、繁殖品系或野生亲缘种)。
此外，应理解，通过针对基本相似的序列筛选氨基酸数据库，可以在计算机芯片上鉴定GTR氨基酸序列及其变体(或任意这些的片段)。还提供本发明的氨基酸分子的片段。片段包括上文所示的保守结构域和功能结构域的氨基酸序列。
突变体GTR蛋白质的氨基酸序列
相对于野生型氨基酸序列包含一个或多个氨基酸缺失、插入或取代的氨基酸序列是本发明的另一实施方案，这类突变体氨基酸分子的片段也是本发明的实施方案。可以用上文所述的多种已知方法来产生和/或鉴定这类突变体氨基酸序列。同样，以内源形式和分离形式这两种形式提供这类氨基酸分子。
在一个实施方案中，氨基酸序列中的一个或多个突变导致GTR蛋白质的GSL转运活性相对于野生型蛋白质显著降降低或完全废除。如上文所述，基本上，导致蛋白质相对于野生型蛋白质包含至少一个氨基酸插入、缺失和/或取代的任意突变都可以导致GSL转运活性显著降低或无GSL转运活性。但是，应理解，蛋白质的某些部分中的突变更有可能导致突变体GTR蛋白质的功能减少，如导致截短的蛋白质的突变，由此使大部分的功能结构域(如跨膜结构域或底物结合结构域)缺乏或被取代。在一方面，在跨膜结构域中包含错义突变的突变体GTR蛋白质是这样的GTR蛋白质，其中，取代了对应于SEQ ID NO：66中的126位或359位的位置上的氨基酸，如下文实施例3的表7中所示的突变体GTR蛋白质。
因此，在一个实施方案中，提供包含一个或多个缺失或插入突变的突变体GTR蛋白质，该一个或多个缺失或插入由此导致具有显著降低的体内活性或无体内活性的突变体蛋白质。这类突变体GTR蛋白质是这样的GTR蛋白质，其中，与野生型GTR蛋白质相比，缺失或插入了至少1个、至少2、3、4、5、10、20、30、50、100、100、150、175、180或更多个氨基酸，该一个或多个缺失或插入由此导致具有显著降低的体内活性或无体内活性的突变体蛋白质。
在另一实施方案中，提供截短的突变体GTR蛋白质，该截短由此导致具有显著降低的体内活性或无体内活性的突变体蛋白质。这类截短的GTR蛋白质是这样的GTR蛋白质，其缺乏对应的野生型GTR蛋白质的C端部分中的功能结构域，而保留对应的野生型GTR蛋白质的N端部分。突变体蛋白质与野生型蛋白质相比截短得越多，该截短越可以导致GTR蛋白质的活性显著降低或无活性。
还在另一实施方案中，提供包含一个或多个取代突变的突变体GTR蛋白质，该一个或多个取代由此导致具有显著降低的体内活性或无体内活性的突变体蛋白质。这类突变体GTR蛋白质是这样的GTR蛋白质，由此取代了具有特定功能(如在底物或质子结合中的功能)的保守性氨基酸残基。
还提供改变其磷酸化/去磷酸化状态的变体GTR蛋白质。这类蛋白质的实例是本文所述的GTR1或GTR2蛋白质，其中，用天冬氨酸(在该位点模拟组成性磷酸化)或丙氨酸(在该位点模拟组成性去磷酸化)取代磷酸化位点的丝氨酸或苏氨酸残基，如包含具有以下取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的GTR1蛋白质：
a.22位的S取代为A；
b.22位的S取代为D；
c.105位的T取代为A；
d.105位的T取代为D；
e.605位的S取代为A；
f.605位的S取代为D；
或包含具有以下取代的SEQ ID NO：142的氨基酸序列的GTR1蛋白质：
g.52位的S取代为A；
h.52位的S取代为D；
i.135位的T取代为A；
j.135位的T取代为D；
k.635位的S取代为A；
l.635位的S取代为D；
或包含具有以下取代的氨基酸序列SEQ ID NO：4的GTR2蛋白质
m.58位的T取代为A；
n.58位的T取代为D；
o.117位的T取代为A；
p.117位的T取代为D；
q.323位的T取代为A；
r.323位的T取代为D。
可以在来自芸苔属物种(如本文所述的物种)的GTR1和GTR2蛋白质中产生对应的取代。
本发明的方法
可以用本领域的一系列常规方法来产生(例如通过诱变来诱导)和/或鉴定突变体gtr等位基因，例如，用基于PCR的方法来扩增部分或全部gtr基因组或cDNA。
诱变后，用已知技术从处理的种子栽培或从处理的细胞再生植物。例如，可以按照常规栽培方法种植诱变的种子，并在自花授粉后在植物上形成种子。备选地，可以例如按Coventry等(1988，Manual for MicrosporeCulture Technique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OACPublication 0489.Univ.of Guelph，Guelph，Ontario，加拿大)所述从处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体小植物来立刻形成纯合植物。可以收获由于这种自花授粉而在本代或下一代形成的其他种子，并用本领域的常规技术针对突变体GTR等位基因的存在进行筛选，例如基于聚合酶链反应(PCR)的技术(扩增gtr等位基因)或基于杂交的技术(例如Southern印迹分析、BAC文库筛选等)和/或直接测序gtr等位基因。已知几种筛选特定突变体等位基因的技术，例如，DeleteageneTM(Delete-a-gene；Li等，2001，Plant J27：235-242)用聚合酶链反应(PCR)测定来筛选通过快中子诱变产生的缺失突变体，TILLING(定向诱导基因组局部突变；McCallum等，2000，Nat Biotechnol18：455-457)鉴定EMS诱导的点突变等。为了针对点突变(所谓的单核苷酸多态性或SNP)在突变体GTR等位基因中存在进行筛选，可以使用本领域常规的SNP检测方法，例如，基于寡聚连接(oligoligation)的技术、基于单碱基延伸的技术或基于限制位点的差异的技术(如TILLING)。
如上文所述，诱变(自发以及诱导)特定野生型GTR等位基因导致一个或多个缺失、插入或取代的核苷酸(后文称为“突变区”)在产生的突变体GTR等位基因中的存在。因此，突变体GTR等位基因可以表征为一个或多个缺失、插入或取代的核苷酸在野生型GTR等位基因中的定位和配置(configuration)。野生型GTR等位基因中已分别插入、缺失或取代了一个或多个核苷酸的位点在本文中也称为“突变区或序列”。本文所用的“5’或3’侧翼区或序列”指突变体(或对应的野生型)GTR等位基因中不同于包含该一个或多个缺失、插入或取代的核苷酸的DNA的至少20bp、优选至少50bp、至少750bp、至少1500bp和至多5000bp DNA的DNA区或序列，优选突变体GTR等位基因中(或对应的野生型GTR等位基因中)刚好定位在突变区上游且与突变区相邻(5’侧翼区或序列)或刚好定位在突变区下游且与突变区相邻(3’侧翼区或序列)的来自突变体(或对应的野生型)GTR等位基因的DNA。本文所用的“连接区”指突变体(或对应的野生型)GTR等位基因中的DNA区域，突变区和5’或3’侧翼区在该DNA区域相互连接。因此，跨越突变区与5’或3’侧翼区之间的连接区的序列包含突变序列以及与之相邻的侧翼序列。
开发来鉴定特定突变体GTR等位基因、或包含特定突变体GTR等位基因的植物或植物材料、或包含含有特定突变体GTR等位基因的植物材料的产品的工具基于该特定突变体GTR等位基因与对应的野生型GTR等位基因的基因组特征相比的特定基因组特征，如包含突变区的基因组区的特定限制图谱、分子标记或侧翼区和/或突变区的序列。
一旦测序了特定突变体GTR等位基因，即可以利用分子生物学技术来开发在样品的核酸(DNA或RNA)中特异性识别突变体GTR等位基因的5’侧翼、3’侧翼和/或突变区内的序列的引物和探针。例如，可以开发PCR方法来在生物样品(如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中鉴定突变体GTR等位基因。这种PCR基于至少两条特异性“引物”：一条识别突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼区内的序列，另一条识别突变体GTR等位基因的3’或5’侧翼区内的序列；或者一条识别突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼区内的序列，另一条识别突变体GTR等位基因的突变区内的序列；或者一条识别突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼区内的序列，另一条识别跨越特定突变体GTR等位基因的3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的序列(如下文进一步描述)。
引物优选具有15和35个核苷酸之间的序列，其在优化的PCR条件下“特异性识别”特定突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼区内的序列、突变区内的序列或跨越3’或5’侧翼区与突变区之间的连接区的序列，使得从包含该特定突变体GTR等位基因的核酸样品扩增出特异性片段(“突变体GTR特异性片段”或区分扩增子)。这意指只有所靶向的突变体GTR等位基因(而没有植物基因组中的其他序列)在优化的PCR条件下扩增。
适合用于本发明的PCR引物可以是以下：
-寡核苷酸，其长度在17nt至约200nt的范围内，包含选自特定突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼序列或其互补序列(即，例如，本发明的突变体GTR等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸的5’或3’侧翼的序列，如上述无义、错义或移码突变的5’或3’侧翼的序列，或上表中所示的终止密码子突变或上文所示的取代突变的5’或3’侧翼的序列，或其互补序列)的至少17个连续核苷酸、优选20个连续核苷酸的核苷酸序列；或
-寡核苷酸，其长度在17nt至约200nt的范围内，包含选自特定突变体GTR等位基因的突变区序列或其互补序列(即，例如，本发明的GTR基因中插入或取代的核苷酸的序列或其互补序列)的至少17个连续核苷酸、优选20个核苷酸的核苷酸序列(识别突变序列的引物)。
引物当然可以比所提到的17个连续核苷酸长，且可以是例如18、19、20、21、30、35、50、75、100、150、200nt长或甚至更长。引物可以完全由选自所提到的侧翼序列和突变序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。但是，引物的5’端核苷酸序列(即，3’定位的17个连续核苷酸的外侧)重要性较低。因此，根据需要，引物的5’序列可以由选自侧翼序列或突变序列的核苷酸序列组成，但可以包含几个(例如1、2、5、10)错配。引物的5’序列甚至可以完全由与侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列(例如，代表限制酶识别位点的核苷酸序列)组成。这类不相关的序列或具有错配的侧翼DNA序列应优选不长于100个核苷酸，更优选不长于50或甚至25个核苷酸。
此外，适宜的引物可以包含跨越侧翼序列与突变序列之间的连接区(即，例如，本发明的突变体GTR等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸的5’或3’侧翼的序列与该一个或多个插入或取代的核苷酸的序列或分别处于该一个或多个缺失的核苷酸的3’或5’侧翼的序列之间的连接区，如上文所述的本发明的GTR基因中的无义、错义或移码突变的5’或3’侧翼的序列与该无义、错义或移码突变的序列之间的连接区，或上表中所示的潜在的终止密码子突变或上文所示的取代突变的5’或3’侧翼的序列分别与该潜在的终止密码子突变或该取代突变的序列之间的连接区)的核苷酸序列或由此核苷酸序列组成，只要该核苷酸序列并非专一性地衍生自突变区或侧翼区。
技术人员还将立刻明白，正确选择的PCR引物对还不应包含彼此互补的序列。
为了本发明的目的，“以SEQ ID No：X表示的核苷酸序列的互补序列”是这样的核苷酸序列，其可以通过按Chargaff’s规则
Figure BDA00002840656500491
用它们的互补核苷酸取代核苷酸而衍生自所表示的核苷酸序列，并以5’至3’方向阅读序列，即，与所表示的核苷酸序列方向相反。
适于鉴定特定突变体GTR等位基因的引物的实例描述于实施例中。
本文所用的“SEQ ID No.Z的X位至Y位的核苷酸序列”指包括两个核苷酸终点的核苷酸序列。
优选地，扩增的片段具有50至1000个核苷酸的长度，如50至500个核苷酸的长度，或100至350个核苷酸的长度。特异性引物可以具有与5’或3’侧翼区内的序列、与突变区内的序列或与跨越特定突变体GTR等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间的连接区的序列80％至100％同一的序列，只要该错配仍允许在优化的PCR条件下用这些引物特异性鉴定该特定突变体GTR等位基因。但是，允许的错配的范围可以通过实验容易地确定，且为本领域技术人员已知。
“突变体GTR特异性片段”的检测和/或鉴定可以以多种方式进行，例如，通过凝胶或毛细管电泳后的大小估计，或通过基于荧光的检测方法。还可以直接测序突变体GTR特异性片段。用于检测扩增的DNA片段的其他序列特异性方法也为本领域已知。
本领域描述了标准PCR流程，如在″PCR Applications Manual″(Roche Molecular Biochemicals，第2版，1999)和其他参考文献中。在“PCR鉴定流程”中为每个特定突变体GTR等位基因指定了最适的PCR条件(包括特异性引物的序列)。但是，应理解，PCR鉴定流程中的许多参数可以需要调整至具体的实验室条件，且可能稍作修改来获得相似的结果。例如，用不同的方法制备DNA可能需要调整例如所使用的引物、聚合酶的量、MgCl2浓度或退火条件。类似地，其他引物的选择可能要求用于PCR鉴定流程的其他最适条件。但是，这些调整对本领域技术人员而言显而易见，且详细描述于当前的PCR应用手册(如上文引用的手册)中。
鉴定特定突变体GTR等位基因的PCR鉴定流程的实例描述于实施例中。
备选地，可以用特异性引物来扩增突变体GTR特异性片段，该片段可以用作“特异性探针”来在生物样品中鉴定特定突变体GTR等位基因。在允许探针与它在核酸中对应的片段杂交的条件下使生物样品的核酸与探针接触，导致核酸/探针杂化物的形成。可以检测此杂化物的形成(例如，标记核酸或探针)，借此杂化物的形成来指示特定突变体GTR等位基因的存在。本领域已描述了这类基于与特异性探针杂交(在固相载体上或在溶液中)的鉴定方法。特异性探针优选是这样的序列，该序列在优化的条件下与特定突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼区内和/或突变区内的区域(后文称为“突变体GTR特异性区域”)特异性杂交。优选地，特异性探针包含10至1000bp之间、50至600bp之间、100至500bp之间、150至350bp之间的序列，该序列与特异性区域的核苷酸序列至少80％、优选80％至85％、更优选85％至90％、尤其优选90％至95％、最优选95％至100％同一(或互补)。优选地，特异性探针将包含与特定突变体GTR等位基因的特异性区域同一(或互补)的约13个至约100个相邻核苷酸的序列。
适合用于本发明的特异性探针可以是以下：
-寡核苷酸，其长度在13nt至约1000nt的范围内，包含选自特定突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼序列或其互补序列(即，例如，本发明的突变体GTR等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸的5’或3’侧翼的序列，如上述无义、错义或移码突变的5’或3’侧翼的序列，或上表中所示的潜在的终止密码子突变或上文所示的取代突变的5’或3’侧翼的序列)的至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，或与之具有至少80％序列同一性的序列(识别5’侧翼序列的探针)；或
-寡核苷酸，其长度在13nt至约1000nt的范围内，包含选自特定突变体GTR等位基因的突变序列或其互补序列(即，例如，本发明的GTR基因中插入或取代的核苷酸的序列，或其互补序列)的至少13个连续核苷酸的核苷酸序列，或与之具有至少80％序列同一性的序列(识别突变序列的探针)。
探针可以完全由选自所提到的侧翼序列和突变序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。但是，探针的5’或3’端的核苷酸序列重要性较低。因此，根据需要，探针的5’或3’序列可以由选自侧翼序列或突变序列的核苷酸序列组成，但可以由与侧翼序列或突变序列不相关的核苷酸序列组成。这类不相关的序列应优选不长于50个核苷酸、更优选不长于25个核苷酸或甚至不长于20个或15个核苷酸。
此外，适宜的探针可以包含跨越侧翼序列与突变序列之间的连接区(即，例如，本发明的突变体GTR等位基因中缺失、插入或取代的一个或多个核苷酸的5’或3’侧翼的序列与该一个或多个插入或取代的核苷酸的序列或分别处于该一个或多个缺失的核苷酸的3’或5’侧翼的序列之间的连接区，如上文所述的本发明的GTR基因中的无义、错义或移码突变的5’或3’侧翼的序列与该无义、错义或移码突变的序列之间的连接区，或上表中所示的潜在的终止密码子突变或上文所示的取代突变的5’或3’侧翼的序列分别与该潜在的终止密码子突变或取代突变的序列之间的连接区)的核苷酸序列或由此核苷酸序列组成，只要所提到的核苷酸序列并非专一性地衍生自突变区或侧翼区。
适于鉴定特定突变体GTR等位基因的特异性探针的实例描述于实施例中。
与特异性探针杂交的“突变体GTR特异性区域”的检测和/或鉴定可以以多种方式进行，例如，通过凝胶电泳后的大小估计，或通过基于荧光的检测方法。用于检测与特异性探针杂交的“突变体GTR特异性区域”的其他序列特异性方法也为本领域已知。
备选地，可以用其他方法来产生和鉴定包含一个或多个突变体gtr等位基因的植物或植物部分，如用PCR来筛选通过快中子诱变产生的缺失突变体的“Delete-a-geneTM”法(由Li和Zhang，2002，Funct IntegrGenomics2：254-258综述)、用变性高效液相层析(DHPLC)通过异源双链体分析检测碱基对变化来鉴定EMS诱导的点突变的TILLING(定向诱导基因组局部突变)法(McCallum等，2000，Nat Biotech18：455和McCallum等2000，Plant Physiol.123，439-442)等。如所提到，TILLING使用高通量突变筛选(例如，用Cel1切割突变体-野生型DNA异源双链体，并用测序凝胶系统检测)。因此，本文涵盖用TILLING来鉴定包含一个或多个突变体gtr等位基因的植物或植物部分，以及用于产生和鉴定这类植物、植物器官、组织和种子的方法。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：诱变植物种子(例如EMS诱变)、混合植物个体或DNA、PCR扩增目的区域、异源双链体形成和高通量检测、鉴定突变体植物、测序突变体PCR产物。应理解，其他诱变和选择方法可以同等地用来产生这类突变体植物。
可以通过本领域已知的方法来鉴定天然(自发)突变体等位基因，而不是在GTR等位基因中诱导突变。例如，可以用ECOTILLING(Henikoff等2004，Plant Physiology135(2)：630-6)来针对天然突变体gtr等位基因的存在筛选多个植物或植物部分。至于以上诱变方法，优选筛选包含A和/或C基因组的芸苔属物种，以便随后可以通过杂交(种间或种内杂交)和选择来将所鉴定的gtr等位基因引入其他芸苔属物种，如欧洲油菜。在ECOTILLING中，通过上述TILLING方法来筛选繁殖品系或相关物种中的天然多态性，其中，用植物的个体或集合体来进行gtr靶标的PCR扩增、异源双链体形成和高通量分析。这之后可以选择具有所需要的突变的个体植物，随后将该植物用于育种计划来掺入希望的突变体等位基因。
然后可以测序所鉴定的突变体等位基因，并将序列与野生型等位基因相比较来鉴定一个或多个突变。可选地，可以按上文所示测试功能性。使用此方法，可以鉴定多个突变体gtr等位基因(和包含一个或多个这些等位基因的芸苔属植物)。然后通过下文进一步描述的杂交和选择方法来将希望的突变体等位基因与希望的野生型等位基因组合。最后，产生包含希望数目的突变体gtr等位基因和希望数目的野生型GTR等位基因的单株植物。
适合作为用于检测特定突变体GTR等位基因的PCR引物或特异性探针的寡核苷酸也可以用来开发测定该特定突变体GTR等位基因的接合性(zygosity)状态的方法。
为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以开发基于PCR的测定来测定突变体和/或对应的野生型GTR特异性等位基因的存在。
为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以这样设计特异性识别野生型GTR等位基因的两条引物，使得它们相互针对，并使突变区定位在引物之间。这些引物可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的引物。这组引物允许同时进行突变体以及对应的野生型GTR等位基因的诊断性PCR扩增。
备选地，为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以这样设计特异性识别野生型GTR等位基因的两条引物，使得它们相互针对，且它们中的一条特异性识别突变区。这些引物可以是分别特异性识别野生型GTR等位基因的5’或3’侧翼区和突变区的引物。这组引物与特异性识别突变体GTR等位基因中的突变区的第三引物一起，允许同时进行突变体GTR基因以及野生型GTR基因的诊断性PCR扩增。
备选地，为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以这样设计特异性识别野生型GTR等位基因的两条引物，使得它们相互针对，且它们中的一条特异性识别5’或3’侧翼区与突变区之间的连接区。这些引物可以是分别特异性识别野生型GTR等位基因的5’或3’侧翼序列和突变区与3’或5’侧翼区之间的连接区的引物。这组引物分别与特异性识别突变体GTR等位基因的突变区与3’或5’侧翼区之间的连接区的第三引物一起，允许同时进行突变体GTR基因以及野生型GTR基因的诊断性PCR扩增。
备选地，可以通过使用特异性识别突变体和野生型GTR等位基因的备选引物组来测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态。
如果植物为突变体GTR基因或对应的野生型GTR基因纯合，则上述诊断性PCR测定将产生突变体或野生型GTR等位基因的典型(优选典型长度)的单一PCR产物。如果植物为突变体GTR等位基因杂合，则将出现反映突变体和野生型GTR等位基因二者的扩增的两种特异性PCR产物。
可以例如通过以下来进行野生型和突变体GTR特异性PCR产物的鉴定：通过凝胶或毛细管电泳后的大小估计(例如，突变体GTR等位基因包含许多插入或缺失的核苷酸，其导致从野生型和突变体GTR等位基因扩增的片段之间的大小差异，使得可以在凝胶上目测区分该片段)；通过在凝胶或毛细管电泳后评价两种不同片段的存在或缺乏，由此可以可选地将突变体GTR等位基因的诊断性PCR扩增与野生型GTR等位基因的诊断性PCR扩增分开进行；通过直接测序所扩增的片段；或通过基于荧光的检测方法。
适于测定特定突变体GTR等位基因的接合性的引物的实例描述于实施例中。
备选地，为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以开发基于杂交的测定来测定突变体和/或对应的野生型GTR特异性等位基因的存在。
为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以这样设计识别野生型GTR等位基因的两个特异性探针，使得每个探针特异性识别GTR野生型等位基因内的序列，且突变区定位在探针所识别的序列之间。这些探针可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的探针。这些探针中的一个或优选两个的使用允许同时进行突变体以及对应的野生型GTR等位基因的诊断性杂交。
备选地，为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以这样设计识别野生型GTR等位基因的两个特异性探针，使得它们中的一个在突变区上游或下游(优选在突变区上游)特异性识别GTR野生型等位基因内的序列，它们中的一个特异性识别突变区。这些探针可以是分别特异性识别野生型GTR等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)和突变区的序列的探针。可选地与特异性识别突变体GTR等位基因中的突变区序列的第三探针一起，这些探针中的一个或优选两个的使用允许进行突变体和野生型GTR基因的诊断性杂交。
备选地，为了测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态，可以这样设计识别野生型GTR等位基因的特异性探针，使得该探针特异性识别野生型GTR等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)与突变区之间的连接区。可选地与特异性识别突变体GTR等位基因的5’或3’侧翼区(优选5’侧翼区)与突变区之间的连接区的第二探针一起，此探针允许进行突变体和野生型GTR基因的诊断性杂交。
备选地，可以用特异性识别突变体和野生型GTR等位基因的备选探针组来测定特定突变体GTR等位基因的接合性状态。
如果植物是突变体GTR基因或对应的野生型GTR基因纯合，则上述诊断性杂交测定将产生突变体或野生型GTR等位基因的典型(优选典型长度)的单一特异性杂交产物，如一个或多个杂交DNA(限制)片段。如果植物是突变体GTR等位基因杂合，则将出现反映突变体和野生型GTR等位基因二者的杂交的两种特异性杂交产物。
可以例如通过以下来进行野生型和突变体GTR特异性杂交产物的鉴定：通过凝胶或毛细管电泳后的大小估计(例如，突变体GTR等位基因包含许多插入或缺失的核苷酸，其导致来自野生型和突变体GTR等位基因的杂交DNA(限制)片段之间的大小差异，使得可以在凝胶上目测区分该片段)；通过在凝胶或毛细管电泳后评价两种不同的特异性杂交产物的存在或缺乏，由此可以可选地将突变体GTR等位基因的诊断性杂交与野生型GTR等位基因的诊断性杂交分开进行；通过直接测序杂交DNA(限制)片段；或通过基于荧光的检测方法。
适于测定特定突变体GTR等位基因的接合性的探针的实例描述于实施例中。
此外，还可以用本文提供的特定突变体GTR等位基因特异性序列信息来开发不同于基于PCR或杂交的扩增方法的对特定突变体GTR等位基因特异的检测方法。这类备选检测方法包括：基于侵入性切割特定核酸结构的线性信号扩增检测法，也称为InvaderTM技术(描述于例如美国专利5,985,557“Invasive Cleavage of Nucleic Acids”、6,001,567“Detection ofNucleic Acid seq uences by Invader Directed Cleavage”中，这两个专利在此引用作为参考)；基于RT-PCR的检测方法，如Taqman；或其他检测方法，如SNPlex。简言之，在InvaderTM技术中，可以例如用标记的第一核酸寡核苷酸(包含突变序列的核苷酸序列或跨越5’侧翼区与突变区之间的连接区的序列)和第二核酸寡核苷酸(包含刚好位于突变序列下游且与突变序列相邻的3’侧翼序列)与靶突变序列杂交，其中，该第一和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸。通过此杂交产生的双链体或三链体结构允许用酶
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选择性切割探针，而使靶序列保持完整。随后可能通过导致进一步信号扩增的中间步骤来检测经切割的标记探针。
本文所用的“试剂盒”指用于进行本发明的方法(更具体而言，在生物样品中鉴定特定突变体GTR等位基因，或测定包含特定突变体GTR等位基因的植物材料的接合性状态)目的的一套试剂。更具体而言，本发明的试剂盒的优选实施方案包含上文所述的用于鉴定特定突变体GTR等位基因的至少两条特异性引物，或用于测定接合性状态的至少两条或三条特异性引物。可选地，试剂盒可以进一步包含本文在PCR鉴定流程中所述的任意其他试剂。备选地，根据本发明的另一实施方案，试剂盒可以包含上文所述的用于鉴定特定突变体GTR等位基因的至少一个特异性探针(其与生物样品的核酸特异性杂交来鉴定特定突变体GTR等位基因在其中的存在)，或用于测定接合性状态的至少两个或三个特异性探针。可选地，试剂盒可以进一步包含用于用特异性探针在生物样品中鉴定特定突变体GTR等位基因的任意其他试剂(如，但不限于杂交缓冲液、标记)。
为了质量控制(例如，种子批次的纯度)、检测特定突变体GTR等位基因在植物材料或包含植物材料或衍生自植物材料的材料(如，但不限于食物或饲料产品)中的存在或缺乏的目的，可以使用本发明的试剂盒，且可以具体地调整它的成分。
本文所用的术语“引物”涵盖能够在依赖于模板的方法(如PCR)中引发新生核酸的合成的任意核酸。通常，引物是10至30个核苷酸的寡核苷酸，但可以利用更长的序列。引物可以以双链形式提供，但优选单链形式。探针可以用作引物，但设计为与靶DNA或RNA结合，无需用于扩增方法。
在提到特异性引物时，本文所用的术语“识别”指特异性引物在该方法中所示的条件(如PCR扩增流程的条件)下特异性杂交至特定突变体GTR等位基因中的核酸序列的事实，由此通过阳性和阴性对照的存在来测定特异性。
在提到特异性探针时，本文所用的术语“杂交”指探针在标准严格性条件下结合至特定突变体GTR等位基因的核酸序列中的特定区域的事实。本文所用的标准严格性条件指本文所述的杂交条件，或指Sambrook等，1989(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbour Laboratory Press，NY)所述的常规杂交条件，其例如可以包括以下步骤：1)将植物基因组DNA片段或BAC文库DNA固定在滤膜上；2)在6X SSC、5X Denhardt’s试剂、0.5％SDS和20μg/ml变性载体DNA中65℃预杂交滤膜1至2小时；3)加入已标记的杂交探针；4)孵育16至24小时；5)在6X SSC、0.1％SDS中68℃洗涤滤膜一次，30分钟；6)在2X SSC、0.1％SDS中68℃洗涤滤膜三次(两次在30ml中，每次30分钟，一次在500ml中，10分钟)；7)将滤膜-70℃暴露于X射线片4至48小时。
本文所用的“生物样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”旨在涵盖任意成熟阶段的植物组织，以及取自或衍生自任意这种植物的任意细胞、组织或器官，其非限制性地包括任意种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。本文所用的“植物材料”指获自或衍生自植物的材料。包含植物材料的产品涉及用植物材料产生或可以被植物材料污染的食物、饲料或其他产品。应理解，在本发明的背景中，针对特定突变体GTR等位基因特异的核酸的存在测试这类生物样品，暗示核酸在该样品中的存在。因此，本文提到的用于在生物样品中鉴定特定突变体GTR等位基因的方法涉及在包含特定突变体GTR等位基因的核酸的生物样品中的鉴定。
本发明还涉及特定GTR等位基因在一株植物中的组合、一个或多个特定突变体GTR等位基因从一株植物转移至另一株植物、包含一个或多个特定突变体GTR等位基因的植物、从这些植物获得的后代及衍生自这些植物的植物细胞、植物部分和植物种子。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供用于将两个或多个所选择的突变体GTR等位基因组合在一株植物中的方法，其包括以下步骤：
(a)按上文所述产生和/或鉴定各包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的两株或多株植物；
(b)使包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的第一植物与包含一个或多个所选择的其他突变体GTR等位基因的第二植物杂交，从该杂交收集F1种子，并可选地按上文所述鉴定包含来自该第一植物的一个或多个所选择的突变体GTR等位基因和来自该第二植物的一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的F1植物；
(c)可选地，重复步骤(b)，直至获得包含所选择的所有突变体GTR等位基因的F1植物；
(d)可选地，
-通过按上文所述测定突变体GTR等位基因的接合性状态来鉴定所选择的突变体GTR等位基因为纯合或杂合的F1植物；或
-通过进行以下步骤之一来产生所选择的突变体GTR等位基因中的一个或多个为纯合的植物：
-按上文所述从包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的F1植物的经处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体植物；
-使包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的F1植物自交一代或多代(y)，从该自交收集F1Sy种子，并按上文所述鉴定该一个或多个突变体GTR等位基因为纯合的F1Sy植物。
在本发明的另一实施方案中，提供用于将一个或多个突变体GTR等位基因从一株植物转移至另一株植物的方法，其包括以下步骤：
(a)按上文所述产生和/或鉴定包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的第一植物，或通过按上文所述将该一个或多个所选择的突变体GTR等位基因组合在一株植物中来产生该第一植物(其中，该第一植物为该一个或多个突变体GTR等位基因纯合或杂合)；
(b)使包含该一个或多个突变体GTR等位基因的第一植物与不包含该一个或多个突变体GTR等位基因的第二植物杂交，从该杂交收集F1种子(其中，如果第一植物为突变体GTR等位基因纯合，则种子为该突变体GTR等位基因杂合，其中，如果第一植物为突变体GTR等位基因杂合，则一半种子为该突变体GTR等位基因杂合，一半种子为该突变体GTR等位基因不成对，即不包含该突变体GTR等位基因)，并可选地按上文所述鉴定包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的F1植物；
(c)使包含一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的F1植物与不包含该一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的第二植物回交一代或多代(x)，从该杂交收集BCx种子，并按上文所述在每一代中鉴定包含该一个或多个所选择的突变体GTR等位基因的BCx植物。
(d)可选地，通过进行以下步骤之一来产生该一个或多个所选择的突变体GTR等位基因为纯合的BCx植物：
-按上文所述从包含该一个或多个希望的突变体GTR等位基因的BCx植物的经处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体植物；
-使包含该一个或多个希望的突变体GTR等位基因的BCx植物自交一代或多代(y)，从该自交收集BCx Sy种子，并按上文所述鉴定该一个或多个希望的突变体GTR等位基因为纯合的BCx Sy植物。
在本发明的一方面，该第一和第二植物是十字花科植物，尤其是芸苔属植物，尤其是欧洲油菜植物或来自另一芸苔属作物物种的植物，如芜菁、芥菜或甘蓝。在本发明的另一方面，该第一植物是十字花科植物，尤其是芸苔属植物，尤其是欧洲油菜植物或来自另一芸苔属作物物种的植物，该第二植物是来自十字花科繁殖品系，尤其是来自芸苔属繁殖品系，尤其是来自欧洲油菜繁殖品系或来自另一芸苔属作物物种的繁殖品系的植物。本文所用的“繁殖品系”优选是可通过用来产生杂种子代的优选基因型和/或表型与其他植物品系区分开的纯合植物品系。
发明人进一步发现，与野生型植物相比，GTR1或GTR2转运蛋白敲除的拟南芥属植物的种子的总脂肪族GSL浓度分别无显著降低和降低约50％，GTR1和GTR2转运蛋白二者都敲除的拟南芥属植物的种子具有零GSL种子表型。此外，与野生型植物的这些组织中的GSL水平相比，gtr敲除植物的花序中和根组织中的GSL水平降低。令人惊奇地，来自gtr敲除植物的老化叶中的GSL水平高，而在野生型植物中，老化时GSL变少。此外，与野生型植物相比，gtr敲除植物的长角果壳中的GSL水平提高。在芜菁中进行了类似的观察。
因此，发明人发现，GTR活性、尤其是GTR2活性或GTR1和GTR2活性降低的十字花科植物在种子、花序组织和根组织中具有降低至检测不到的GSL含量，而绿色组织(如莲座叶、茎生叶、长角果壳)中的GSL水平仍然高。观察结果表明，本发明的GTR蛋白质(尤其是GTR1和GTR2蛋白质)是涉及GSL从绿色组织(如莲座叶、茎生叶和长角果壳(所谓的“源”组织))转运入种子、花及(在植物生活史的某个时期)转运入根(所谓的“库”组织)的转运途径的重要成分。
在一个实施方案中，本发明提供改变真核细胞或生物(如爪蟾属卵母细胞)中的GSL转运的方法，其包括改变该真核细胞或生物中的功能性GTR活性。
在另一实施方案中，本发明提供改变植物和植物部分中的GSL含量的方法，其包括改变该植物或植物部分中的功能性GTR活性。
植物和植物部分中GSL含量的改变使得能够改变例如油料种子十字花科植物的籽粕质量、园艺十字花科植物的防癌活性和香味和/或对食植动物和病原体的抗性及生物熏蒸消毒(biofumigative)活性。
在一方面，通过降低功能性GTR活性来降低植物种子中的GSL含量。
本文所用的“种子”包含胚、胚乳和/或种皮。
在另一方面，通过降低功能性GTR活性来提高或维持绿色植物组织中的GSL含量。
本文所用的“绿色植物组织”指叶、莲座叶、茎生叶和长角果壳。
还在另一方面，通过降低功能性GTR活性来降低植物种子中的GSL含量和提高绿色植物组织中的GSL含量。
在本发明的一个实施方案中，该植物是来自十字花目或白花菜目的具有高含量GSL的植物。这类植物的非限制性实例是：叠珠树科(Akaniaceae)、Bataceae、十字花科、白花菜科(Capparaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、环蕊科(Gyrostemonaceae)、刺枝树科(Koeberliniaceae)、池花科(Limnanthaceae)、辣木科、瘤药树科(Pentadiplandraceae)、木犀草科(Resedaceae)、刺茉莉科(Salvadoraceae)、夷白花菜科(Setchellanthaceae)、多籽果科(Tovariaceae)和旱金莲科(Tropaeolaceae)的植物。
在本发明的具体实施方案中，该植物隶属于十字花科。在本发明的甚至更具体的实施方案中，该植物是欧洲油菜植物(如油菜、卡诺拉和大头菜)、芜菁(如白菜和芜菁)、甘蓝植物(如羽衣甘蓝、卷心菜、嫩茎花椰菜(broccoli)、花椰菜、球芽甘蓝和球茎甘蓝)、埃塞俄比亚芥植物(埃塞俄比亚芥菜)、芥菜植物(芥菜)或黑芥植物(黑芥)。
用于通过例如降低种子中的GSL含量来改变籽粕质量的最重要的作物是油料种子形式的芸苔属物种(例如欧洲油菜、芜菁(synB.campestris)、芥菜和埃塞俄比亚芥)。
对于通过例如提高绿色植物组织中的GSL含量来增强香味和防癌特性，最重要的物种是甘蓝(包括例如嫩茎花椰菜和花椰菜)、园艺形式的欧洲油菜(例如芜菁甘蓝[＝rutabaga，spp.napobrassica]、油菜)和芜菁(包括芜菁和白菜[＝小白菜(pakchois)]二者)、十字花科生菜(包括例如芝麻菜和细叶二行芥)和园艺形式的萝卜属(例如萝卜(Raphanus sativa))。
可以通过降低功能性GTR活性来改变GSL含量。本文所用的植物或植物部分中的“功能性GTR活性”指存在于该植物或植物部分中的GTR活性。功能性GTR活性是GTR基因表达水平和GTR活性的结果。因此，可以通过下调GTR基因表达水平或通过下调GTR活性或通过这二者来降低植物或植物部分中的功能性GTR活性，根据本发明，可以通过下调GTR基因表达水平或通过下调GTR活性或通过这二者来达到植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞的GSL含量的改变。
方便地，通过引入改变GTR基因表达水平的嵌合基因和/或通过引入改变GTR活性的嵌合基因和/或通过改变内源GTR编码基因来在遗传上控制GTR基因表达水平或GTR活性。
按照本发明，为了改变GSL含量，优选显著降低功能性GTR活性。优选地，靶细胞中的功能性GTR活性应降低该靶细胞中的正常水平和/或活性的约75％、优选约80％、尤其是约90％、更尤其是约95％、更优选约100％。测定特定蛋白质(如GTR蛋白质)含量的方法为本领域技术人员公知，且包括但不限于用特异性抗体(组织化学)定量这类蛋白质。定量GTR活性的方法描述于下文实施例中。
因此，在一个实施方案中，用于改变植物或植物部分的GSL含量的方法包括下调GTR基因表达的步骤。在本发明的另一实施方案中，用于改变植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞的GSL含量的方法包括下调GTR活性。
在本发明的一个实施方案中，通过在植物或植物部分中引入包含以下有效连接的DNA区的嵌合DNA构建体来下调GTR基因表达：
a)在植物或植物部分中具有功能的植物可表达启动子；
b)转录时产生能够下调GTR基因表达的GTR抑制性RNA分子的DNA区；和
c)在植物细胞中具有功能的涉及转录终止和多聚腺苷化作用的DNA区。
转录DNA区编码降低翻译可用GTR mRNA的水平的生物活性RNA。这可以通过包括共抑制(有义RNA抑制)、反义RNA、双链RNA(dsRNA)或微小RNA(miRNA)的完善的技术来达到。
在一个实施方案中，可以通过引入嵌合DNA构建体来下调GTR基因表达，该构建体产生能够通过共抑制来下调GTR基因表达的有义RNA分子。转录DNA区将在转录时产生能够以转录或转录后的方式降低靶植物或植物细胞中GTR基因表达的所谓的有义RNA分子。转录DNA区(和产生的RNA分子)包含与存在于该植物细胞或植物中的GTR编码基因的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸。
在另一实施方案中，通过引入嵌合DNA构建体来下调GTR基因表达，该构建体产生能够下调GTR基因表达的反义RNA分子。转录DNA区将在转录时产生能够以转录或转录后的方式降低靶植物或植物细胞中GTR基因表达的所谓的反义RNA分子。转录DNA区(和产生的RNA分子)包含与存在于该植物细胞或植物中的GTR编码基因的核苷酸序列的互补序列具有至少95％序列同一性的至少20个连续核苷酸。
但是，该反义或有义RNA区的约20nt GTR编码区的最小核苷酸序列可以包含在更大的RNA分子内，该RNA分子的大小从20nt至等于靶基因大小的长度。因此，所提到的反义或有义核苷酸区的长度可以是约21nt至约5000nt，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt或甚至约5000nt或更大。此外，为了本发明的目的，所使用的抑制性GTR RNA分子的核苷酸序列或转基因的编码区无需与内源GTR基因(靶向该基因来降低其在植物细胞中的表达)完全相同或互补。序列越长，对总体序列同一性的要求越不严格。因此，有义或反义区可以与内源GTR基因的核苷酸序列或其互补序列具有约40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的总体序列同一性。但是，如所提到，反义或有义区应包含与内源GTR基因的核苷酸序列具有约95％至约100％序列同一性的20个连续核苷酸。约95％至约100％序列同一性的序列可以是约50、75或100nt。
可以通过包含导致异常、非聚腺苷酰化GTR抑制性RNA分子的表达的DNA元件来进一步增强上述用于反义RNA或有义RNA介导的基因表达水平下调的嵌合基因的效率。适合用于该目的的一个这种DNA元件是WO00/01133中所述的编码自剪接核酶的DNA区。还可以通过按WO03/076619中所述为所产生的RNA分子提供核定位或滞留信号来增强效率。
还在另一实施方案中，可以通过引入嵌合DNA构建体来下调GTR基因表达，该构建体产生能够下调GTR基因表达的双链RNA分子。通过DNA区的转录，RNA能够通过有义和反义区之间的常规碱基配对形成dsRNA分子，由此该有义和反义区是上文所述的核苷酸序列。本发明的编码dsRNA的降低GTR表达的嵌合基因可以按照WO99/53050(在此引入作为参考)的公开内容进一步包含定位在例如有义和反义RNA区之间的间隔序列中的内含子(如异源内含子)。为了达到这种转基因的构建，可以使用WO02/059294A1中所述的载体。
还在另一实施方案中，通过引入嵌合DNA构建体来下调GTR基因表达，该构建体产生加工为能够指导切割GTR mRNA的miRNA的前miRNARNA分子。miRNA是小的内源RNA，其在植物中，但也在其他真核细胞中调节基因表达。在植物中，通过DICERLIKE1(DCL1)的切割活性从长的内源前miRNA的茎环区加工这些长度约为21个核苷酸的RNA。植物miRNA与保守的靶mRNA高度互补，并指导切割它们的靶标。miRNA似乎是调节尤其是涉及发育的途径的复杂网络的基因表达的关键成分。
本文所用的“miRNA”是长度约为20至22个核苷酸的RNA分子，其可以装载入RISC复合体，并指导切割靶RNA分子，其中，该靶RNA分子包含与该miRNA分子的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列，由此可以存在以下错配中的一个或多个：
-该miRNA的5’端的核苷酸与靶RNA分子中对应的核苷酸序列之间的错配；
-该miRNA的1位至9位的核苷酸中的任一个与靶RNA分子中对应的核苷酸序列之间的错配；
-该miRNA的12位至21位的核苷酸中的任一个与靶RNA分子中对应的核苷酸序列之间的三个错配，只要不存在超过两个连续错配。
miRNA的10位和11位不允许错配(从miRNA分子的5’端开始显示所有miRNA位置)。
本文所用的“前miRNA”分子是约100至约200个核苷酸，优选约100至约130个核苷酸的RNA分子，其可以采用包含dsRNA茎和单链RNA环的二级结构，且进一步在双链RNA茎中包含miRNA的核苷酸序列及其互补序列miRNA＊。优选地，miRNA及其互补序列定位在距miRNA dsRNA茎的游离端约10至约20个核苷酸处。单链环区的长度和序列并不重要，且可以显著不同(例如，长度在30和50nt之间)。优选地，未配对和配对的RNA结构间的自由能差异在-20和-60千卡/摩尔之间，尤其是约-40千卡/摩尔。miRNA和miRNA＊之间无需完全互补，可以容忍约1至3个未配对核苷酸的鼓起。可以通过本领域的常规计算机算法(如mFold、UNAFold和RNAFold)来预测RNA分子所采用的二级结构。由DCL活性释放并装载至RISC复合体上的来自前miRNA的dsRNA茎的具体链由5’端的互补程度决定，由此，在其5’端最少涉及切割的dsRNA茎的不同链的核苷酸之间的氢键形成的链装载至RISC复合体上，并将决定靶RNA分子降解的序列特异性。但是，如果实验中来自特定合成前miRNA分子的miRNA分子因“错误”链装载在RISC复合体上而不具有功能，则将立即明白，可以通过改变该miRNA分子及其互补序列在前miRNA分子的dsRNA茎的各条链上的位置来解决此问题。如本领域已知，涉及两个氢键的A和U之间的结合或涉及两个氢键的G和U之间的结合不如涉及三个氢键的G和C之间的结合强。
miRNA分子可以包含在其天然存在的前miRNA分子内，但也可以通过将从现有的前miRNA分子正常加工的miRNA分子的核苷酸序列换为另一目的miRNA的核苷酸序列来将它们引入这种现有的前miRNA分子支架中。前miRNA的支架也可以是完全合成的。同样，合成的miRNA分子可以包含在现有的前miRNA分子支架或合成的前miRNA支架内，并从现有的前miRNA分子支架或合成的前miRNA支架加工。
在本发明的另一实施方案中，可以通过在植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞中引入包含以下有效连接的DNA区的嵌合DNA构建体来下调GTR蛋白质活性：
a)在植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞中有效的启动子；
b)转录时产生能够下调GTR活性的GTR抑制性RNA分子的DNA区；和
c)涉及转录终止和多聚腺苷化作用的DNA区。
在一方面，能够下调内源GTR蛋白质活性的GTR抑制性RNA分子是可以翻译为能够降低GTR活性水平的生物活性蛋白质的RNA分子。这可以通过例如GTR蛋白质的失活抗体来达到。“GTR蛋白质的失活抗体”是至少特异性结合GTR蛋白质的一些表位(如上述底物/质子结合结构域或保守结构域)或使转运蛋白陷入不允许转运的构象(描述于例如JBC274(22)：15420-15426，1999中)和抑制靶蛋白的活性的抗体或其部分。
可以以常规方式将用来通过下调GTR基因表达水平和/或通过下调GTR蛋白质活性来降低功能性GTR活性的嵌合DNA构建体稳定插入单个植物细胞的核基因组中，并可以以常规方式用这样转化的植物细胞来产生具有改变的GSL含量的转化植物。在这方面，可以用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的T-DNA载体(包含用来降低功能性GTR活性的嵌合DNA构建体)来转化植物细胞，然后可以用例如EP0116718、EP0270822、WO84/02913和公开的欧洲专利申请EP0242246中及Gould等(1991)中所述的方法从转化的植物细胞再生转化植物。用于土壤杆菌属介导的植物转化的T-DNA载体的构建为本领域公知。T-DNA载体可以是EP0120561和EP0120515中所述的二元载体，或EP0116718中所述的可以通过同源重组整合入土壤杆菌属Ti质粒的共整合载体。优选的T-DNA载体各包含与T-DNA边界序列之间的转录DNA区有效连接，或至少定位在右边界序列左侧的启动子。边界序列描述于Gielen等(1984)中。可以用已知的方法(如电穿孔或三亲交配)来实现将T-DNA载体引入土壤杆菌属。当然，可以使用诸如直接基因转移(描述于例如EP0223247中)、花粉介导的转化(描述于例如EP0270356和WO85/01856中)、原生质体转化(描述于例如US4,684,611中)、植物RNA病毒介导的转化(描述于例如EP0067553和US4,407,956中)、脂质体介导的转化(描述于例如US4,536,475中)的方法和其他方法，用其他类型的载体来转化植物细胞。产生的转化植物可以用于常规植物育种方案来产生具有改变的总GSL含量的更多转化植物。
在本发明的另一实施方案中，可以通过改变内源GTR基因的核苷酸序列来降低GTR的功能活性。在优选实施方案中，改变调节GTR基因表达的序列，以便下调GTR基因表达。
达到内源GTR基因的这种改变的方法包括例如通过美国专利5,527,695中所述的方法进行同源重组来将内源GTR基因换为突变体GTR基因。在优选实施方案中，通过引入WO96/22364或美国专利5,565,350中所述的嵌合DNA/RNA寡核苷酸来达到内源GTR基因的核苷酸序列的这种位点定向改变。
达到内源GTR基因的这种改变的方法还包括诱变。技术人员将立刻明白，可以用其中功能性GTR活性降低的突变体植物细胞和植物品系达到与本文所述的转基因植物细胞和植物品系相同的效果。可以用本领域已知的筛选方法容易地鉴定植物细胞或植物的GTR基因中的突变，由此将化学诱变(例如EMS诱变)与灵敏的检测方法(例如变性HPLC)组合。这种技术的实例是McCallum等，Plant Physiology123439-442或WO01/75167中所述的所谓的“定向诱导基因组局部突变”法。但是，检测特定基因组区域或甚至等位基因中的突变的其他方法也可用，且包括筛选现有或新产生的插入突变体植物品系的文库，由此用对插入的DNA片段特异的引物和对基因组区域或等位基因特异的引物对这些突变体植物品系的基因组DNA的混合物进行PCR扩增，其中预期插入(见例如Maes等，1999，Trends in Plant Science，4，90-96页)。因此，本领域中可获得方法来鉴定GTR基因中包含突变的植物细胞和植物品系。然后可以针对功能性GTR活性和GSL含量测试这个突变体细胞或植物品系的群体，并与具有相似遗传背景的非突变细胞或植物品系相比较。
还提供可通过上述方法获得的植物及其部分和产物(包括种子、籽粕、种子油、绿色植物组织(如莲座叶、茎生叶和长角果壳)和根组织)，及其例如在动物饲料、害虫防治(如生物熏蒸消毒)和癌症预防中的用途。
根据本发明的具体实施方案，通过本发明的方法获得的转化或突变的植物细胞和植物可以分别包含至少一个其他嵌合基因或至少一个嵌合基因，该嵌合基因包含编码目的蛋白质的核酸。这类目的蛋白质的实例包括对除草剂具有抗性的酶，如耐受基于草胺膦(glufosinate)的除草剂的bar或pat酶(EP0257542、WO87/05629和EP0257542，White等1990)、耐受基于草甘膦的除草剂的EPSPS酶(如双突变体玉米EPSPS酶)(US6,566,587和WO97/04103)或耐受HPPD抑制剂除草剂(如异噁唑)的HPPD酶(WO96/38567)。
通过本发明的方法获得的转化或突变的植物细胞和植物可以进一步用于本领域公知的育种方法，如杂交、自交和回交。育种计划可以涉及杂交产生F1代(第一子代)，然后进行几代的自交(产生F2、F3等)。育种计划还可以涉及回交(BC)步骤，由此使子代与亲本品系之一(称为回归亲本)回交。
通过本发明的方法获得的转化或突变的植物细胞和植物还可以进一步用于随后的转化方法。
以下非限制性实施例描述按照本发明获得的植物的特征。除非另有说明，所有重组DNA技术都按照Sambrook等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY中及Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的卷1和2中所述的标准流程进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications，UK出版的R.D.D.Croy的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)中。
在描述和实施例中，参考以下序列：
SEQ ID NO：1：来自拟南芥的编码野生型GTR1蛋白质的GTR1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：2：由SEQ ID NO：1编码的野生型GTR1蛋白质。
SEQ ID NO：3：来自拟南芥的编码野生型GTR2蛋白质的GTR2基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：4：由SEQ ID NO：3编码的野生型GTR2蛋白质。
SEQ ID NO：5：来自拟南芥的编码野生型GTR3蛋白质的GTR3基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：6：由SEQ ID NO：5编码的野生型GTR3蛋白质。
SEQ ID NO：7：来自拟南芥的编码野生型GTR4蛋白质的GTR4基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：8：由SEQ ID NO：7编码的野生型GTR4蛋白质。
SEQ ID NO：9：来自拟南芥的编码野生型GTR5蛋白质的GTR5基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：10：由SEQ ID NO：9编码的野生型GTR5蛋白质。
SEQ ID NO：11：来自拟南芥的编码野生型GTR6蛋白质的GTR6基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：12：由SEQ ID NO：11编码的野生型GTR6蛋白质。
SEQ ID NO：13：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-A1蛋白质的GTR1-A1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：14：由SEQ ID NO：13编码的野生型GTR1-A1蛋白质。
SEQ ID NO：15：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-A2蛋白质的GTR1-A2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：16：由SEQ ID NO：15编码的野生型GTR1-A2蛋白质。
SEQ ID NO：17：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-A3蛋白质的GTR1-A3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：18：由SEQ ID NO：17编码的野生型GTR1-A3蛋白质。
SEQ ID NO：19：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-C1蛋白质的GTR1-C1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：20：由SEQ ID NO：19编码的野生型GTR1-C1蛋白质。
SEQ ID NO：21：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-C2蛋白质的GTR1-C2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：22：由SEQ ID NO：21编码的野生型GTR1-C2蛋白质。
SEQ ID NO：23：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-C3蛋白质的GTR1-C3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：24：由SEQ ID NO：23编码的野生型GTR1-C3蛋白质。
SEQ ID NO：25：来自欧洲油菜的编码野生型GTR2-A1蛋白质的GTR2-A1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：26：由SEQ ID NO：25编码的野生型GTR2-A1蛋白质。
SEQ ID NO：27：来自欧洲油菜的编码野生型GTR2-A2蛋白质的GTR2-A2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：28：由SEQ ID NO：27编码的野生型GTR2-A2蛋白质。
SEQ ID NO：29：来自欧洲油菜的编码野生型GTR2-A3蛋白质的GTR2-A3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：30：由SEQ ID NO：29编码的野生型GTR2-A3蛋白质。
SEQ ID NO：31：来自欧洲油菜的编码野生型GTR2-C1蛋白质的GTR2-C1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：32：由SEQ ID NO：31编码的野生型GTR2-C1蛋白质。
SEQ ID NO：33：来自欧洲油菜的编码野生型GTR2-C2蛋白质的GTR2-C2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：34：由SEQ ID NO：33编码的野生型GTR2-C2蛋白质(部分序列)。
SEQ ID NO：35：来自欧洲油菜的编码野生型GTR2-C3蛋白质的GTR2-C3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：36：由SEQ ID NO：35编码的野生型GTR2-C3蛋白质。
SEQ ID NO：37：来自芜菁的编码野生型GTR1-A1蛋白质的GTR1-A1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：38：由SEQ ID NO：37编码的野生型GTR1-A1蛋白质。
SEQ ID NO：39：来自芜菁的编码野生型GTR1-A2蛋白质的GTR1-A2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：40：由SEQ ID NO：39编码的野生型GTR1-A2蛋白质。
SEQ ID NO：41：来自芜菁的编码野生型GTR1-A3蛋白质的GTR1-A3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：42：由SEQ ID NO：41编码的野生型GTR1-A3蛋白质。
SEQ ID NO：43：来自芜菁的编码野生型GTR2-A1蛋白质的GTR2-A1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：44：由SEQ ID NO：43编码的野生型GTR2-A1蛋白质。
SEQ ID NO：45：来自芜菁的编码野生型GTR2-A2蛋白质的GTR2-A2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：46：由SEQ ID NO：45编码的野生型GTR2-A2蛋白质。
SEQ ID NO：47：来自芜菁的编码野生型GTR2-A3蛋白质的GTR2-A3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：48：由SEQ ID NO：47编码的野生型GTR2-A3蛋白质。
SEQ ID NO：49：来自甘蓝的编码野生型GTR1-C1蛋白质的GTR1-C1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：50：由SEQ ID NO：49编码的野生型GTR1-C1蛋白质。
SEQ ID NO：51：来自甘蓝的编码野生型GTR1-C2蛋白质的GTR1-C2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：52：由SEQ ID NO：51编码的野生型GTR1-C2蛋白质。
SEQ ID NO：53：来自甘蓝的编码野生型GTR1-C3蛋白质的GTR1-C3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：54：由SEQ ID NO：53编码的野生型GTR1-C3蛋白质。
SEQ ID NO：55：来自甘蓝的编码野生型GTR2-C1蛋白质的GTR2-C1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：56：由SEQ ID NO：55编码的野生型GTR2-C1蛋白质。
SEQ ID NO：57：来自甘蓝的编码野生型GTR2-C2蛋白质的GTR2-C2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：58：由SEQ ID NO：57编码的野生型GTR2-C2蛋白质。
SEQ ID NO：59：来自甘蓝的编码野生型GTR2-C3蛋白质的GTR2-C3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：60：由SEQ ID NO：59编码的野生型GTR2-C3蛋白质。
SEQ ID NO：61：来自拟南芥的编码野生型GTR1蛋白质的GTR1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：62：由SEQ ID NO：61编码的野生型GTR1蛋白质。
SEQ ID NO：63：来自拟南芥的编码野生型GTR2蛋白质的GTR2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：64：由SEQ ID NO：63编码的野生型GTR2蛋白质。
SEQ ID NO：65：来自芜菁北京生态型(Brassicar rapa ecotypepekinensis)的编码野生型GTR2-A2蛋白质的GTR2-A2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：66：由SEQ ID NO：65编码的野生型GTR2-A2蛋白质。
SEQ ID NO：67：引物BrGTR2-A2-f(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：68：引物BrGTR2-A2-r(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：69：引物BrGTR2-A2-Till-f
SEQ ID NO：70：引物BrGTR2-A2-Till-r
SEQ ID NO：71：引物BrGTR2-A2-Inner-fw
SEQ ID NO：72：引物BrGTR2-A2-Inner-fw2
SEQ ID NO：73：引物BrGTR2-A2-Inner-rv
SEQ ID NO：74：引物BrGTR2-A2-126-f(尿嘧啶在10位)
SEQ ID NO：75：引物BrGTR2-A2-126-r(尿嘧啶在10位)
SEQ ID NO：76：引物BrGTR2-A2-145-f(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：77：引物BrGTR2-A2-145-r(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：78：引物BrGTR2-A2-192-f(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：79：引物BrGTR2-A2-192-r(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：80：引物BrGTR2-A2-229-f(尿嘧啶11位)
SEQ ID NO：81：引物BrGTR2-A2-229-r(尿嘧啶在11位)
SEQ ID NO：82：引物BrGTR2-A2-359-f(尿嘧啶在10位)
SEQ ID NO：83：引物BrGTR2-A2-359-r(尿嘧啶在10位)
SEQ ID NO：84：引物AtGTR2f(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：85：引物AtGTR2r(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：86：引物AtGTR4e1f(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：87：引物AtGTR4e1r(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：88：引物AtGTR4e2f(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：89：引物AtGTR4e2r(尿嘧啶在13位)
SEQ ID NO：90：引物AtGTR4e3f(尿嘧啶在13位)
SEQ ID NO：91：引物AtGTR4e3r(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：92：引物AtGTR4e4f(尿嘧啶在9位)
SEQ ID NO：93：引物AtGTR4e4r(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：94：引物AtGTR5f(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：95：引物AtGTR5r(尿嘧啶在8位)
SEQ ID NO：96：引物T7
SEQ ID NO：97：引物pNB1rev
SEQ ID NO：98：引物AtGTR1_N879742_RP
SEQ ID NO：99：引物AtGTR1_N879742_RP
SEQ ID NO：100：引物AtGTR1_N870210_RP
SEQ ID NO：101：引物AtGTR1_N870210_RP
SEQ ID NO：102：引物AtGTR1_N409421_RP
SEQ ID NO：103：引物AtGTR1_N409421_RP
SEQ ID NO：104：引物AtGTR1_RP_fw
SEQ ID NO：105：引物AtGTR1_RP_rev
SEQ ID NO：106：引物AtGTR2_RP_fw
SEQ ID NO：107：引物AtGTR2_RP_rev
SEQ ID NO：108：引物AtGTR3_RP_fw
SEQ ID NO：109：引物AtGTR3_RP_rev
SEQ ID NO：110：引物AtGTR1pf
SEQ ID NO：111：引物AtGTR1pr
SEQ ID NO：112：引物AtGTR2pf
SEQ ID NO：113：引物AtGTR2pr
SEQ ID NO：114：引物AtGTR1r-YFP
SEQ ID NO：115：引物YFPf-AtGTR1-融合
SEQ ID NO：116：引物YFPr-AtGTR1-3’utr-融合
SEQ ID NO：117：引物AtGTR1(3’utr)f-YFP融合
SEQ ID NO：118：引物AtGTR1(3’utr)r
SEQ ID NO：119：来自芥菜的编码野生型GTR2-A1蛋白质的GTR2-A1基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：120：由SEQ ID NO：119编码的野生型GTR2-A1蛋白质。
SEQ ID NO：121：来自芥菜的编码野生型GTR2-A2蛋白质的GTR2-A2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：122：由SEQ ID NO：121编码的野生型GTR2-A2蛋白质。
SEQ ID NO：123：来自芥菜的编码野生型GTR2-A3蛋白质的GTR2-A3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：124：由SEQ ID NO：123编码的野生型GTR2-A3蛋白质。
SEQ ID NO：125：来自芥菜的编码野生型GTR2-B1蛋白质的GTR2-B1基因的编码DNA(含内含子)(从外显子2起的部分序列)。
SEQ ID NO：126：由SEQ ID NO：125编码的野生型GTR2-B1蛋白质(部分序列)。
SEQ ID NO：127：来自芥菜的编码野生型GTR2-B2蛋白质的GTR2-B2基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：128：由SEQ ID NO：127编码的野生型GTR2-B2蛋白质。
SEQ ID NO：129：来自芥菜的编码野生型GTR2-B3蛋白质的GTR2-B3基因的编码DNA(含内含子)。
SEQ ID NO：130：由SEQ ID NO：129编码的野生型GTR2-B3蛋白质。
SEQ ID NO：131：来自芥菜的编码野生型GTR2-C1蛋白质的GTR2-A1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：132：来自芥菜的编码野生型GTR2-A2蛋白质的GTR2-A2基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：133：来自芥菜的编码野生型GTR2-A3蛋白质的GTR2-A3基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：134：来自芥菜的编码野生型GTR2-B1蛋白质的GTR2-B1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：135：来自芥菜的编码野生型GTR2-B2蛋白质的GTR2-B2基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：136：来自芥菜的编码野生型GTR2-B3蛋白质的GTR2-B3基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：137：来自欧洲油菜的编码野生型GTR1-C1蛋白质的GTR1-C1基因的编码DNA(含内含子)(变体)。
SEQ ID NO：138：用于下调欧洲油菜中的GTR1表达的dsRNA构建体。
SEQ ID NO：139：用于下调欧洲油菜中的GTR2表达的dsRNA构建体。
SEQ ID NO：140：用于下调欧洲油菜中的GTR1和GTR2表达的dsRNA构建体。
SEQ ID NO：141：来自拟南芥的编码包含30个氨基酸的NH2端延伸的野生型GTR1蛋白质的GTR1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：142：由SEQ ID NO：141编码的包含30个氨基酸的N端延伸的野生型GTR1蛋白质。
SEQ ID NO：143：来自欧洲油菜的编码包含23个氨基酸的NH2端延伸的野生型GTR1-A1蛋白质的GTR1-A1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：144：由SEQ ID NO：143编码的包含23个氨基酸的N端延伸的野生型GTR1-A1蛋白质。
SEQ ID NO：145：来自欧洲油菜的编码包含23个氨基酸的NH2端延伸的野生型GTR1蛋白质的GTR1-C1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：146：由SEQ ID NO：145编码的包含23个氨基酸的N端延伸的野生型GTR1-C1蛋白质。
SEQ ID NO：147：来自芜菁的编码包含23个氨基酸的NH2端延伸的野生型GTR1-A1蛋白质的GTR1-A1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：148：由SEQ ID NO：147编码的包含23个氨基酸的N端延伸的野生型GTR1-A1蛋白质。
SEQ ID NO：149：来自甘蓝的编码包含23个氨基酸的NH2端延伸的野生型GTR1-C1蛋白质的GTR1-C1基因的编码DNA(不含内含子)。
SEQ ID NO：150：由SEQ ID NO：149编码的包含23个氨基酸的N端延伸的野生型GTR1-C1蛋白质。
除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术都按照Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY中、Ausubel等(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的卷1和2中、以及Brown(1998)Molecular Biology LabFax，第2版，Academic Press(UK)的卷I和II中所述的标准分子生物学技术进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications，UK联合出版的R.D.D.Croy的PlantMolecularBiology Labfax(1993)中。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可以见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中，以及McPherson等(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第1版，Springer Verlag，德国中。
实施例
根据本文公开的内容，本领域普通技术人员可以在无过度负担的情况下进行下文未明确描述的本发明的任意方法。
实施例1：GTR蛋白质的鉴定和表征
拟南芥属GTR序列的鉴定和表征
针对最高丰度的拟南芥属GSL4-甲硫基丁基芥子油苷(4-MTB)摄入爪蟾属卵母细胞，以十个基因为库，对可作为全长cDNA从RIKEN生物资源中心(Ibaraki，日本)获得的拟南芥属转运蛋白文库进行功能筛选。构建的文库由拟南芥属膜蛋白文库数据库(Nour-Eldin等，2006，PlantMethods2：17)中分类为具有10-14个跨膜区段的“有机溶质转运蛋白”或“未知功能”的239种转运蛋白组成。由于此研究中预期的转运蛋白靶标是来自质外体的潜在输入者，在酸性缓冲液(pH5)中进行爪蟾属卵母细胞摄取测定。此方法后，将At3g47960(本文中称为AtGTR1；SEQ IDNO：1、2、61和62)和At1g18880(本文中称为AtGTR3；SEQ ID NO：5和6)鉴定为GSL转运蛋白(Nour-Eldin，2007，上文)。
At3g47960和At1g18880隶属于NRT/PTR转运蛋白家族(Steiner等，1995，Molecular Microbiology16：825-834；Tsay等，2007，FEBS letters581：2290-2300)，已显示该家族由硝酸盐、亚硝酸盐和肽转运蛋白组成(Tsay等，2007，FEBS letters581：2290-2300；Segonzac等，2007，Plant Cell19：3760-3777；Komarova等，2008，Plant Physiol148：856-869)。系统发生分析显示，这两个基因形成具有六个同源物的小亚类(见图1a)：At3g47960(本文中称为AtGTR1；SEQ ID NO：1、2、61和62)、At5g62680(本文中称为AtGTR2；SEQ ID NO：3、4、63和64)、At1g18880(本文中称为AtGTR3；SEQ ID NO：5和6)、At1g69860(本文中称为AtGTR4；SEQ IDNO：7和8)、At1g69870(本文中称为AtGTR5或NRT1.7；SEQ ID NO：9和10)、At1g27080(本文中称为AtGTR6或NRT1.6；SEQ ID NO：11和12)。图1b和表4显示不同AtGTR序列之间的序列同一性。
表4.拟南芥属GTR1(不含30个N端AA，即，如SEQ ID No2中所示)、2、3、4、5和6氨基酸序列/核酸(不含内含子的编码序列)序列(各自的SEQ ID NO：编号显示在括号内)之间的序列同一性(以％表示)
Figure BDA00002840656500781
芸苔属物种GTR序列的鉴定和表征
通过针对与上文鉴定的拟南芥属GTR1和GTR2序列基本相似的序列筛选基因组数据库来在计算机芯片上鉴定欧洲油菜、芜菁和甘蓝的GTR1和GTR2的核酸和氨基酸序列。根据它们与拟南芥属GTR1同源物的递减的相似性(表5a和b)，将芸苔属GTR1序列命名为GTR1-(A/C)1、2和3(见序列表SEQ ID NO：13-24、SEQ ID NO：37-42、SEQ ID NO：49-54和SEQ ID NO：61-62)。类似地，根据它们与拟南芥属GTR2同源物的递减的相似性(表6a和b)，将芸苔属GTR2序列命名为GTR2-(A/C)1、2和3(见序列表SEQ ID NO：25-36、SEQ ID NO：43-48、SEQ ID NO：55-60和SEQ ID NO：63-66)。SEQ ID NO：119-136中提供芥菜的核苷酸和氨基酸序列。
表5a.拟南芥属(At)、芜菁(Br)、甘蓝(Bo)、欧洲油菜(Bn)GTR1氨基酸序列之间的序列同一性(以％表示)(通过ClustalW测定-SEQ IDNO：编号显示在括号内)(使用SEQ ID No.2中所示的拟南芥的短GTR1)
Figure BDA00002840656500782
表5b.拟南芥属(At)、芜菁(Br)、甘蓝(Bo)、欧洲油菜(Bn)GTR1核酸(编码-不含内含子)序列之间的序列同一性(以％表示)(通过ClustalW测定-SEQ ID NO：编号显示在括号内)(使用SEQ ID No.1中所示的拟南芥的短GTR1)
表6a.拟南芥属(At)、芜菁(Br)、甘蓝(Bo)、欧洲油菜(Bn)GTR2氨基酸序列之间的序列同一性(以％表示)(通过ClustalW测定-SEQ IDNO：编号显示在括号内)
Figure BDA00002840656500792
表6b.拟南芥属(At)、芜菁(Br)、甘蓝(Bo)、欧洲油菜(Bn)GTR2核酸(编码-不含内含子)序列之间的序列同一性(以％表示)(通过ClustalW测定-SEQ ID NO：编号显示在括号内)
Figure BDA00002840656500801
此外，在欧洲油菜胚转录组数据库中鉴定了GTR1和GTR2序列的1型和2型序列(即GTR1-A1、GTR1-C1、GTR1-A2、GTR1-C2、GTR2-A1、GTR2-C1、GTR2-A2和GTR2-C2序列)，表明这些类型的GTR1和2序列在欧洲油菜胚中表达。
此外，通过用引物BrGTR2-A2-f(SEQ ID NO：67)和BrGTR2-A2-r(SEQ ID NO：68)克隆分离自芜菁北京生态型叶的cDNA鉴定了芜菁GTR2-A2核酸和氨基酸序列(序列表中的SEQ ID NO：65和66)。
实施例2：GTR蛋白质的功能表征
拟南芥属和芸苔属GTR蛋白质的功能表征
在爪蟾属卵母细胞中针对4-MTB的摄取活性分别测试了AtGTR1至5、BrGTR2-A2和来自拟南芥属NRT/PTR家族的12个其他成员。
AtGTR1和2显示比AtGTR3高5倍的摄取活性，而与AtGTR1相比，AtGTR4和AtGTR5显示10％的4-MTB摄取活性。测试的所有其他NRT/PTR的摄取活性都与未注射的卵母细胞无差别。
表达BrGTR2-A2的卵母细胞每个卵母细胞每小时输入约2.5nmol4-MTB(图2)，而未注射的卵母细胞显示无可检测到的4-MTB摄取。相比之下，表达AtGTR2的卵母细胞每小时输入约5nmol4-MTB(图3A)。
拟南芥属芥子油苷转运蛋白的生物化学表征
在爪蟾属卵母细胞中对显示最高GSL摄取活性的AtGTR1和AtGTR2进行了生物化学表征。对于这两个基因，摄取培养基中的pH从6降低至5导致累积在卵母细胞内侧的4-MTB高约8倍，而在pH7下的摄取与pH5下未注射的卵母细胞无区别(图3A)。这表明AtGTR是质子：GSL同向转运蛋白(symporter)。
在pH5暴露于100μM4-MTB的分别表达AtGTR1和AtGTR2的卵母细胞上进行电流记录时，固定在(clamp)-50mV的电压引出30nA范围内的内向电流。这表明暴露于GSL时通过AtGTR净流入阳离子。GSL诱导的内向电流依赖于电压，在+30至-120mV的范围内随超极化膜电位增加(图3B和F)。由于每个GSL分子携带一个负电荷，质子与GSL的化学计量关系必须是至少2：1，这似乎通常是质子依赖性寡肽转运蛋白(POT)转运带负电荷底物时的典型特征(Daniel等，2006，Physiology21：93-102)。在pH5固定在-60mV，AtGTR1和2的4-MTB输入分别符合Michaelis-Menten饱和动力学，以Km＝20±1.2μM和Km＝18,7±4,2μM显示AtGTR1和ATGTR2对4-MTB的高亲和力(图3C-D)。这表明GSL可能是植物中AtGTR的生理底物。显著地，AtGTR2在500μM4-MTB下的底物依赖性转运速率比在250μM和1mM下低25％。此观察结果在直接通过LC-MS检测GSL摄取测量的底物依赖性转运速率中也显著。
研究了AtGTR对具有不同侧链的GSL的底物特异性。在用100μM的内源短链甲硫氨酸衍生的GSL4-MTB、4-甲基亚磺酰基丁基-GSL和外源苯丙氨酸衍生的对-羟基苄基-GSL(pOHBG)灌注于pH5固定在-50mV的表达AtGTR1的卵母细胞时，观察到了AtGTR1的30、10和nA的量度内的内向电流(图3F)。通过卵母细胞提取物的LC-MS分析测量，AtGTR2相似地摄取全部三种芥子油苷(结果未显示)。这表明，就GSL侧链而言，转运蛋白具有广泛的特异性。
将底物特异性研究扩展至包括之前针对NRT/PTR转运蛋白家族鉴定的底物，即二肽和三肽及硝酸盐。在pH5用133μM的二肽ala-his、gly-leu、asp-ala及三肽gly-gly-gly和met-ala-ser灌注表达AtGTR1的卵母细胞未产生任何可检测到的电流。但是，用1mM NO3 -灌注确实产生了电流，但这些电流仅为用100μM4-MTB灌注时测量到的电流的1/10(图3F)。这表明AtGTR可能具有双底物特异性。为了进一步对此进行研究，在50x过量的未标记4-MTB、NO3 -和二/三肽的混合物的存在下将表达AtGTR1和AtGTR2的卵母细胞暴露于40μMC14标记的pOHBG。只有50x过量的4-MTB将pOHBG的摄取降至背景水平，而其他化合物不具有显著的抑制作用(图3E)。
概括起来，我们的生物化学分析显示，AtGTR1和AtGTR2是对范围广泛的GSL具有广泛特异性的高亲和力、特异、生电的质子驱动型GSL转运蛋白。
材料和方法-实施例2：
爪蟾属卵母细胞中转运蛋白cDNA文库的功能筛选：基本按Nour-Eldin等(2006，Plant Methods2：17)中所述，作两点修改来进行239种拟南芥属转运蛋白的文库在爪蟾属卵母细胞中的制备和功能筛选。首先，体外转录前不混合DNA模板。相反，各PCR产物单独进行体外转录，然后混合为每个库10种转录物。进行单独转录来避免由混合的PCR片段可能不同的转录效率引起的不平衡基因库。其次，将文库分为各包含10种转录物的23个库和包含9种转录物的第24个库。在含有1mM4-MTB(对于拟南芥属序列)或0.5mM4-MTB(对于芸苔属序列)的Kulori pH5中室温下进行输入测定。随后将介导GSL摄入所注射的卵母细胞的转录物库作为单个转录物注射来鉴定GSL转运蛋白。
用于在爪蟾属卵母细胞中表达的构建体：分别用引物对AtGTR2f(SEQ ID NO：84)和AtGTR2r(SEQ ID NO：85)及引物对AtGTR5f(SEQID NO：94)和AtGTR5r(SEQ ID NO：95)从来自叶组织的cDNA克隆AtGTR2和AtGTR5的编码序列(Nour-Eldin等，2006，Nucl Acids Res34：e122)。通过PCR扩增来克隆AtGTR4，引物对AtGTR4e1f和AtGTR4e1r(SEQ ID NO：86和87)用于第一外显子、引物对AtGTR4e2f和AtGTR4e2r(SEQ ID NO：88和89)用于第二外显子、引物对AtGTR4e3f和AtGTR4e3r(SEQ ID NO：90和91)用于第三外显子、引物对AtGTR4e4f和AtGTR4e4r(SEQ ID NO：92和93)用于第四外显子，随后融合其来自基因组DNA的四个外显子。按照之前所述(Geu-Flores等，2007，NuclAcids Res35：e55)进行USER融合及克隆入pNB1u。
从分离自芜菁北京生态型叶的cDNA克隆BrGTR2-A2的编码序列(SEQ ID NO：65)。用引物BrGTR2-A2-f(SEQ ID NO：67)和BrGTR2-A2-r(SEQ ID NO：68)克隆CDS，并USER克隆入爪蟾属表达载体pNB1u(Nour-Eldin等，2006，Nucl Acids Res34：e122)。
使用引物T7(SEQ ID NO：96)和pNB1rev(SEQ ID NO：97)，通过PCR来产生用于体外转录的线性模板。按以下在50μl反应体积中体外转录cRNA：在T7RNA聚合酶转录缓冲液中37℃孵育1-5μg线性模板30分钟，该转录缓冲液包含80U T7RNA聚合酶(Fermentas)、0,01M DTT、0,1μg/μl BSA、60μM3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G RNA Cap StructureAnalog(New England Biolabs)、20U RibolockTM RNA酶抑制剂(Fermentas)、0,01U焦磷酸酶(Fermentas)、1mM rATP、rUTP、rCTP和0,05mM rGTP(LAROVA)。然后加入rGTP至1mM的终浓度，并孵育反应3小时。通过氯化锂沉淀来纯化RNA，并溶解在无核酸酶的H2O中至0,5μg/μl的终浓度。
爪蟾属卵母细胞中的GSL转运测定：
卵母细胞处理和注射：按照之前所述(1998，Methods Enzymol.296：17-52)制备卵母细胞，并用50ng cRNA注射。在17℃孵育卵母细胞3-4天，然后进行转运活性测定。
测定条件：在用TRIS调节至pH5的盐缓冲液kulori(90mM NaCl、1mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、5mM MES)中进行测定。在pH5的kulori缓冲液中预孵育卵母细胞5分钟来确保胞内稳态pH，随后转移至含有所示浓度的底物的500μl kulori pH5缓冲液，并在室温孵育1小时。在冰冷的kulori pH5缓冲液中洗涤卵母细胞四次。
转运定量：对于使用放射性标记底物的测定，通过摇动20-30分钟来在4ml闪烁管中的100μl10％SDS中破裂单卵母细胞。加入2.5mlEcoScintTM闪烁液(National Diagnostics)，并通过闪烁计数来定量输入的化合物。对于使用非标记底物的测定，通过LC-MS来分析卵母细胞提取物。以每个重复5个卵母细胞的批次分析卵母细胞。在100μl含有1mg/ml硫酸酯酶(Sigma A-25-120)的kulori pH5中匀浆经洗涤的卵母细胞，并在室温放置12小时。然后加入等体积的100％甲醇，-20℃孵育样品1小时，并以20000g离心15分钟。使用与Bruker HCT-Ultra离子阱质谱仪(Bruker Daltonics，Bremen，德国)连接的Agilent1100Series LC(AgilentTechnologies，德国)，通过分析型LC-MS来分析3μl含有脱硫芥子油苷的上清。按0,2ml/分钟的流速使用Zorbax SB-C18柱(Agilent；1,8mm、2，1mm X50mm)，烘箱温度维持在35℃。流动相是：A，含0,1％(v/v)HCOOH和50μM NaCl的水；B，含0,1％(v/v))HCOOH的乙腈。梯度程序是：0至0.5分钟，无梯度的2％B；0.5至7.5分钟，线性梯度2-40％B；7.5至8.5分钟，线性梯度40％至90％B；8.5至11.5分钟，无梯度的90％B；11.6至15分钟，无梯度的2％B。在11.2至13.5分钟期间将流速提高至0.3ml/分钟。质谱仪以正电喷雾模式运行。
实施例3：具有突变体GTR基因的植物和植物部分的产生和表征
具有突变体GTR基因的植物的产生和表征
从SALKT-DNA收集物(Alonso等，2003，Science301：653-657)分别鉴定了AtGTR1(atgtr1-1)、AtGTR2(atgtr2-1)和AtGTR3(atgtr3-1)的拟南芥属T-DNA突变体。计算机芯片上的基因组序列分析显示，atgtr1-1在第一外显子中包含T-DNA插入，而atgtr2-1在编码区的第四外显子中包含T-DNA插入，atgtr3-1在第三外显子中包含T-DNA插入。基因型分析[引物对AtGTR1_N879742_RP(SEQ ID NO：98)和AtGTR1_N879742_LP(SEQ ID NO：99)用于atgtr1；AtGTR2_N870210_RP(SEQ ID NO：100)和AtGTR2_N870210_LP(SEQ ID NO：101)用于atgtr2；AtGTR3_N409421_RP(SEQ ID NO：102)和AtGTR3_N409421_LP(SEQID NO：103)用于atgtr3]和RT-PCR分析[引物对AtGTR1_RT_fw(SEQID NO：104)和AtGTR1_RT_rev(SEQ ID NO：105)用于AtGTR1；AtGTR2_RT_fw(SEQ ID NO：106)和AtGTR2_RT_rev(SEQ ID NO：107)用于AtGTR2；AtGTR3_RT_fw(SEQ ID NO：108)和AtGTR3_RT_rev(SEQ ID NO：109)用于AtGTR3]显示，atgtr1、atgtr2和atgtr3纯合突变体是它们各自的AtGTR的无效突变体。通过使atgtr1突变体植物与atgtr2突变体植物杂交来产生双敲除突变体。从分离的F2群体针对野生型、atgtr1、atgtr2和atgtr1/atgtr2基因型中的每一个鉴定3个纯合品系。
使用SEQ ID NO：65的BrGTR2-A2序列及tilling引物BrGTR2-A2-Till-f(SEQ ID NO：69)、BrGTR2-A2-Till-r(SEQ ID NO：70)、BrGTR2-A2-Inner-fw(SEQ ID NO：71)、BrGTR2-A2-Inner-fw2(SEQID NO：72)和BrGTR2-A2-Inner-rv(SEQ ID NO：73)，通过TILLING来在突变的芜菁生态型R-0-18植物群体(RevGenUK)中鉴定BrGTR2-A2的芜菁取代突变体。发现了20个取代突变：7个沉默突变(核酸突变产生编码相同氨基酸的密码子)、8个不严重的突变(核酸突变产生编码隶属于同一功能种类的氨基酸的密码子)、4个严重突变(核酸突变产生编码隶属于不同功能种类的氨基酸的密码子，例如小变大、非极性变极性、脂肪族变非脂肪族、芳香族变非芳香族、疏水变极性、酸性侧链变非酸性侧链)和1个终止密码子突变。在来自芜菁生态型R-0-18的BrGTR2-A2的基因组DNA序列中发现的严重和终止突变体密码子的核苷酸位置以及在SEQID NO：66中对应的氨基酸位置显示在表7中。来自芜菁北京生态型的BrGTR2-A2中编码所示氨基酸的密码子可以在SEQ ID NO：65中所示的氨基酸位置上找到。用引物BrGTR2-A2-Inner-fw(SEQ ID NO：71)、BrGTR2-A2-Inner-fw2(SEQ ID NO：72)和BrGTR2-A2-Inner-rv(SEQID NO：73)针对每种突变鉴定纯合野生型和突变体芜菁植物，并测序所获得的扩增子来确定野生型或突变体密码子在表7中所示位置上的存在。栽培突变体植物，并测定不同植物部分中的GSL含量。
栽培突变体植物，并测定不同植物部分中的GSL含量。结果总结在表9中。与“真正的”WT芜菁种子以及BrGTR2S(W229X)WTS二者相比，来自Brgtr2敲除突变体(BrGTR2(W229X Mut1-9))的种子具有降低的芥子油苷含量。混合每种基因型的种子时，与BrGTR2(W229X-WT)植物相比，该降低是～80％。包含具有氨基酸突变G145R(G145R Mut1-4)的BrGTR2的芜菁植物显示高度可变的芥子油苷含量，这可能是由影响种子芥子油苷含量的基因中的其他EMS诱导的点突变的分离引起。
表7.来自芜菁生态型R-0-18的BrGTR2-A2中的取代和终止密码子突变
Figure BDA00002840656500861
突变体芜菁GTR2-A2蛋白质的功能表征
在爪蟾属卵母细胞中针对4-MTB的摄取活性单独测试了所鉴定的突变体BrGTR2-A2蛋白质。按照之前所述(Geu-Flores等，2007，Nucl AcidsRes35：e55)通过USER融合来在BrGTR2-A2中产生点突变。简言之，将编码序列PCR扩增为希望的突变位置侧翼的两个片段。各片段具有包含(embed)碱基取代的互补尾部。此外，每个尾部包含尿嘧啶残基，其在用尿嘧啶特异性切割试剂(USER)切割时产生长的单链突出端，该突出端容易且牢固地与来自其他片段的互补尾部退火。在各片段的远端，对位于突变上游的片段，用BrGTR2-A2-f引物作为正向引物，对位于突变下游的片段，用BrGTR2-A2-r作为反向引物。用于接头处的引物在SEQ IDNO：74和75(用于表7中所示的氨基酸126取代的正向和反向引物)中、SEQ ID NO：76和77(用于表7中所示的氨基酸145取代的正向和反向引物)中、SEQ ID NO：78和79(用于表7中所示的氨基酸192取代的正向和反向引物)中、SEQ ID NO：80和81(用于表7中所示的氨基酸229取代的正向和反向引物)中及SEQ ID NO：82和83(用于表7中所示的氨基酸359取代的正向和反向引物)中给出。插入pNB1u载体后通过测序来验证每个克隆，按上文所述制备RNA并注入卵母细胞。每个克隆的摄取活性在图2和表7中给出。
总之，包含终止密码子的BrGTR2无功能，表明截短形式的蛋白质在植物中无功能，而其余突变显示不同的转运活性。这些不同的转运活性表明，进行取代的氨基酸位置对BrGTR2转运活性重要。根据已提出的POT蛋白质模型，1、2、4、5、7、8、10和11号跨膜螺旋排列在转运蛋白的中央孔，且涉及转运机制。其余螺旋(3、6、9和12号)见于外周，且可以赋予结构稳定性。突变BrGTR2(G126R)和BrGTR2(S359F)分别在跨膜螺旋3和7中。螺旋3应不涉及转运机制；因此，可以假设，BrGTR2(G126R)可以严重破坏蛋白质三级结构，导致几乎无摄取活性。螺旋7排列在发生转运的中央孔；因此，针对此BrGTR2(S359F)观察到的提高的摄取活性可以归因于从小的侧链(丝氨酸)转换为大的侧链(苯丙氨酸)，导致孔扩大。S359F转换的极性变化可以进一步促成提高的活性。突变BrGTR2(G145R)未引起4-MTB摄取的显著变化。螺旋4和5之间的胞质环中的突变BrGTR2(E192K)似乎导致芥子油苷摄取降低。从带负电荷的谷氨酸至带正电荷的赖氨酸的氨基酸转变非常剧烈，可能可以破坏蛋白质结构。此外，已提出了AtGTR2的肽序列“ser-glu-ser-gly-lys-arg”上的磷酸化位点。AtGTR2和BrGTR2的比对显示，此序列保守，且该肽对应于BrGTR2中的残基191-196。因此，如果突变的谷氨酸(E192K)周围的丝氨酸(191和193)之一正常磷酸化(或去磷酸化)，则这可以通过转换为赖氨酸来防止；这可以转而降低摄取活性。
突变体GTR拟南芥属植物的种子中GSL含量的表征
来自杂合atgtr1、atgtr2和atgtr3突变体的分离后代的GSL分析显示，来自纯合atgtr3植物的种子包含野生型水平的总脂肪族和吲哚族GSL。类似地，atgtr1的每粒种子的总脂肪族和吲哚族芥子油苷含量无显著降低，而atgtr2种子的总脂肪族GSL浓度降低约50％(图4A-C和5A)。此外，在atgtr2种子中检测不到吲哚族GSL含量。每种植物分析20粒种子时，来自每个纯合atgtr1/atgtr2品系的种子中的GSL水平低于检测极限，表明AtGTR1和AtGTR2的组合活性在将GSL转运入种子中的重要作用。分析来自野生型和atgtr1/atgtr2植物的10mg种子时，可能以比野生型低250倍的水平在来自atgtr1/atgtr2植物的种子中检测到痕量的芥子油苷。
对于分子互补，分别将包含2kb启动子、与YFP融合的基因组序列和3’UTR的AtGTR1构建体及由2kb启动子后接着基因组序列的AtGTR2构建体引入atgtr1/atgtr2双突变体，且显示恢复了种子中的脂肪族和吲哚族GSL含量二者(图4E-F)。这表明，atgtr1/atgtr2突变体中不含GSL的种子表型由AtGTR1和AtGTR2转运蛋白的缺乏引起。
突变体GTR拟南芥属植物的叶中GSL含量的表征
在抽苔前、抽苔后和老化时测量整个莲座中的GSL水平。在来自野生型植物的莲座中，抽苔前和抽苔后测量脂肪族GSL含量分别为28±13和68±19nmol/莲座，老化莲座中为8±3nmol。相反，在来自atgtr1/atgtr2植物的莲座中，脂肪族GSL含量从抽苔前的27±11nmol/莲座显著提高至抽苔后的410±78nmol/莲座，并在老化时保持在161±31nmol/莲座。与atgtr1/atgtr2莲座相比，atgtr1和atgtr2单敲除品系莲座包含中间水平(图4B)。与脂肪族GSL相比，莲座组织中的吲哚族GSL含量显示更大的变化。但是，在抽苔后和老化时比较野生型和atgtr1/atgtr2莲座时，atgtr1/atgtr2莲座平均包含高2倍的吲哚族GSL。概括起来，这些观察结果表明，莲座组织持续合成和输出脂肪族和吲哚族GSL二者，并表明AtGTR1和AtGTR2二者都对野生型植物中的此活性至关重要。
突变体GTR拟南芥属植物的茎、花、叶、长角果和长角果壳中GSL含量的表征
从抽苔后的植物单独测定了花序(不含长角果和茎生叶)、茎生叶、整个完整长角果(包括种子)和来自单个裂开的长角果(最低和最高成熟度)的长角果壳中的GSL含量。此外，在老化时分析了单长角果壳。
在抽苔后的野生型植物中，不含长角果和茎生叶的花序每个花序包含200±46nmol脂肪族GSL，而来自atgtr1/atgtr2植物的花序包含61±28nmol脂肪族GSL，atgtr1和atgtr2植物的花序包含中间水平(图5C)。在来自抽苔后的野生型植物的茎生叶中，脂肪族GSL含量总计为每个总茎生叶59±15nmol，而atgtr1/atgtr2突变体在其茎生叶中包含181±20nmol(图5C)。还在长角果壳中观察到了提高含量的脂肪族GSL，其中，与来自野生型植物的2.9±0,8nmol/长角果壳相比，抽苔后的atgtr1/atgtr2植物中的浓度为8.8±3nmol/长角果壳。老化时，来自野生型的长角果壳中的GSL水平降低至0.3±0,13nmol/长角果壳，而atgtr1/atgtr2长角果壳保持3±0,78nmol(图5D)。
概括起来，这些观察结果表明，在此发育阶段，茎生叶和长角果壳以及莲座组织作为GSL源发挥作用，而整个花序或其部分似乎构成AtGTR1和AtGTR2介导的GSL转运的库。在分析长角果时，另外两个观察结果值得注意。首先，在分析来自抽苔后的野生型或atgrt1/atgtr2突变体的完整长角果时观察到GSL含量无显著差异(图5C)，这表明，在此发育阶段，完整长角果的GSL含量并非仅依赖于AtGTR1和AtGTR2的活性(图5D)。其次，与其他组织相比，抽苔后的atgtr1和atgtr2单突变体与atgtr1/atgtr2相比未显示中间表型，相反，atgtr1和atgtr2都类似于野生型，可能表明突变两种转运蛋白的有趣的协同效应(图5D)。
在计算抽苔后的植物的多种组织中的总脂肪族GSL含量的平衡时，观察到atgtr1/atgtr2植物与野生型相比在莲座和茎生叶中包含约460nmol的过量。由于仅通过atgtr1/atgtr2植物的茎和完整长角果中约160nmol的降低来满足此提高，这导致atgtr1/atgtr2植物与野生型相比每个总气生部分的总脂肪族GSL含量提高约300nmol(表8)。
表8.抽苔后的土壤栽培植物中每种组织的脂肪族芥子油苷含量(nmol/g)
野生型 atgtr1/atgtr2
莲座 68±19 410±78
茎生叶 59±15 181±20
完整长角果 83±25 67±22
茎 200±46 61±28
平衡 398±51 703±75
突变体GTR拟南芥属植物的根中GSL含量的表征
测量了来自抽苔前和抽苔后的水培植物的根、莲座和花序中的GSL浓度。抽苔前，野生型根中的脂肪族芥子油苷含量为1,75±0.28nmol/mg鲜重，而atgtr1/atgtr2根包含低20倍的脂肪族芥子油苷(0,08±0,06nmol/mg)。抽苔后，来自野生型植物的根包含0,8±0,14nmol/mg的脂肪族芥子油苷，而来自atgtr1/atgtr2植物的根包含0.2±0.06nmol/mg，即低4倍(图6A)。与土壤栽培的植物相比，来自抽苔前的水培植物的对应的莲座中的脂肪族芥子油苷含量在atgtr1/atgtr2植物(1,33±0,11nm/mg)中比在野生型(0,64±0,1nmol/mg)中高2倍(图6B)。抽苔后，来自野生型和atgtr1/atgtr2植物的莲座之间的倍数差异变得更显著，野生型植物包含0.35±0,13nmol/mg，而atgtr1/atgtr2莲座包含1.44±0,16nmol/mg，即，高4倍的浓度(图6B)。最后，在来自野生型和atgtr1/atgtr2植物的花序之间未观察到脂肪族芥子油苷浓度的显著差异(图6B)。总结起来，这些观察结果显示，atgtr1/atgtr2气生组织中提高的芥子油苷累积在很大程度上可以通过否则将转运至根的量来解释。因此，根构成芥子油苷转运的强而尚未鉴定的库。
AtGTR1&2在拟南芥属植物中的组织、细胞和亚细胞定位的表征
用2kb的各启动子来驱动β-D-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)的表达。抽苔前，pGTR1::GUS活性限于排水器周围的不同点。相反，抽苔后，在包括莲座叶的维管组织、叶肉和表皮的整个叶中检测到了pGTR1::GUS活性。在发育的花中，pGTR1::GUS活性见于萼片表皮中的各个细胞中，而发育的长角果在表皮中以及珠柄中显示活性。此表达模式表明，AtGTR1可以在抽苔后的整个叶的细胞之间转运芥子油苷中发挥广泛的作用。在表皮的定位表明，芥子油苷可以转运至叶的外周。
在pGTR2::NLS-GFP-GUS转基因植物中，整个发育过程中在维管组织中强烈和显著地检测到GUS活性，在叶的表皮中也检测到一些活性。还在萼片和花瓣的维管结构中及发育的花的花丝中检测到GUS活性。还在长角果壳的维管组织中及发育的种子的珠柄中检测到了表达。相比之下，在任意发育阶段的非转化植物的任意组织中都检测不到GUS活性。AtGTR2在维管组织中明显的限制性和组成性表达表明在转运芥子油苷跨过维管组织中的屏障以使得能够长距离转运至库中的主要作用。
材料和方法-实施例3：
植物材料和生长条件：对于地上组织中的GSL分析和表达定位，在20℃、16小时光照(700μtE＊m＊-2＊s-1)的生长室中将拟南芥属植物(生态型Columbia-0)栽培在4cm花盆中的土壤上。对于根中的GSL分析，将植物培养在(Lehmann等2009，Mol Plant2：390-406)中所述的水培系统中。简言之，使种子在放置于空吸头盒中的0.5ml microfuge管中的0.5％植物琼脂/50％Gibeaut’s营养液(Gibeaut等，1997，Plant Physiol115：317-319)上萌发。萌发约一周后，切去管底，用100％营养液装满盒子。约两周后将植物转至更大的容器，并在16小时：8小时光周期、20℃下培养。每周更换营养液，将基因型培养在分开的容器中。按照针对土壤栽培的植物所述进行用于芥子油苷分析的各个组织的收获。
从植物组织提取和分析GSL：在三个时间点分析源自atgtr1-1xatgtr2-1杂交的各基因型的代表性品系(每个基因型鉴定三个品系)中的GSL水平：1)抽苔前：3周龄植物(生长阶段1.10-1.12)，其特征在于花序出现前完全形成的具有10-14片叶的莲座；2)抽苔后：5周龄植物(生长阶段6.10-6.30)，其特征在于最低的长角果处于全长及存在至少7-10个发育的长角果；3)老化：8-9周龄植物(生长阶段9.7)，其特征在于老化干燥的绿色组织及发育的所有长角果包含成熟种子。生长阶段定义如之前所述(Boyes等，2001，Plant cell13：1499-1510)。还在抽苔前和抽苔后的水培植物中分析了各基因型的代表性品系的莲座、根和花序中的GSL水平。
为了在土壤栽培或水培的抽苔前和抽苔后的植物上进行的分析，收获新鲜组织并匀浆。具体而言，对于抽苔后的长角果壳的分析，在解剖为长角果壳和未成熟种子前冷冻干燥完整长角果。为了老化植物的分析，收获干燥组织并匀浆。为了成熟种子分析，分析了20粒种子。使用配有C-18反相柱(Supelcosil LC-18-DB，25cm×4.6mm，5μm颗粒大小，Supelco，Bellefonte，PA，USA)的来自Agilent的HP1200Series HPLC，以1ml/分钟(注射体积45μl)的流速使用水(溶剂A)-乙腈(溶剂B)梯度，按照之前所述(Hansen等2007，Plant J50：902-910)作为脱硫GSL提取和分析GSL。梯度如下：1.5-7％B(5分钟)、7-25％(6分钟)、25-80％(4分钟)、80％B(3分钟)、80-35％B(2分钟)、35-1.5％B(2分钟)和1.5％B(3分钟)。通过200和400nm之间(2nm间隔)的二极管阵列检测来监测洗脱液。根据保留时间和UV吸收光谱与已知标准(Reichelt等，2002)的保留时间和UV吸收光谱的比较来鉴定脱硫GSL。结果作为相对于响应因子(Brown等，2003；Fiebig和Arens，1992)计算的nmol给出。
报道构建体和互补构建体的构建：将大肠杆菌(E.coli)菌株DH10B用于所有克隆。对于AtGTR1和AtGTR2启动子：报道构建体，从拟南芥属(Col-0)基因组DNA扩增启动子，引物AtGTR1pf(SEQ ID NO：110)和AtGTR1pr(SEQ ID NO：111)用于AtGTR1启动子，引物AtGTR2pf(SEQ ID NO：112)和AtGTR2pr(SEQ ID NO：113)用于AtGTR2启动子。将启动子片段USER克隆入pCambia3300u-NLS-GPF-GUS，使其处于核定位信号的上游，核定位信号后面跟随与β-D-葡萄糖醛酸苷酶融合的GFP(Chytilova等，1999，Ann.Bot.83：645-654)。对于互补构建体AtGTR2启动子-ATGTR2，用引物AtGTR2pf(SEQ ID NO：112)和AtGTR2pr(SEQID NO：113)PCR扩增基因组基因片段，并USER克隆入pCambia1300u。对于互补构建体AGTR1启动子-AtGTR1基因组基因-YFP-3’UTR，PCR扩增各片段，引物AtGTR1pf(SEQ ID NO：110)和AtGTR1r-YFP(SEQID NO：114)用于启动子-基因组基因片段，引物YFPf-AtGTR1-融合(SEQID NO：115)和YFPr-pot13’UTR融合(SEQ ID NO：116)用于YFP片段，引物AtGTR1(3’UTR)f-YFP融合(SEQ ID NO：117)和AtGTR1(3’UTR)r(SEQ ID NO：118)用于3’UTR片段。将片段USER融合入pCambia1300u载体。用植物表达质粒转化土壤杆菌属(GV3101)来进行稳定拟南芥属转化。
转基因拟南芥属植物的GUS活性染色：将X周龄拟南芥属GTR1prom-GFP-GUS和GTR2prom-GFP-GUS植物浸没在含有1mM X-GIc、0.5％Triton X-100、20％(v/v)甲醇、100mM Tris-HCl(pH7.5)和10mM维生素C的溶液中，并在37℃孵育16小时。通过在70％乙醇中洗涤和孵育来在染色后清除叶绿素。
实施例4：突变体芸苔属GTR基因及包含它们的植物和植物部分的产生和表征
使来自芸苔属植物的种子(M0种子)暴露于EMS。从诱变的种子(M1种子)培养M1植物，并自交产生M2种子。培养M2植物，并从植物样品制备DNA样品。通过用上述GTR特异性引物直接测序并针对点突变的存在分析序列来针对GTR基因中点突变的存在筛选DNA样品，该点突变导致GTR基因的蛋白质编码区中引入终止密码子、GTR蛋白质中取代氨基酸或剪接位点突变。对于在M2植物的DNA样品中鉴定的各突变体GTR基因，培养与包含GTR突变的M2植物衍生自同一M1植物的M2植物，并从各个M2植物的植物样品制备DNA样品。针对所鉴定的GTR点突变的存在筛选DNA样品。
分离了欧洲油菜中的以下突变体等位基因，并测试了M3湿种子中的总芥子油苷含量：
a)GTR2-C2-ems02
b)GTR2-C1-ems05
c)GTR2-C1-ems01
d)GTR2-A2-ems09
e)GTR2-A2-ems03
f)GTR2-A1-ems01
关于突变体等位基因的更多细节见表3a和3b。结果总结在图10中。对于单基因敲除，所观察到的总芥子油苷的最大降低为51％。所测试的各基因拷贝产生相似的作用。高水平的变异可以与非回交材料中大量不相关的背景突变相关。
因此产生并分离了突变体GTR等位基因。同样，可以按以下用包含这类突变体等位基因的植物来将所选择的突变体和/或野生型等位基因组合在植物(例如芸苔属繁殖品系)中：使包含突变体GTR基因的芸苔属植物(供体植物品系)与缺乏该突变体GTR基因的芸苔属植物(受体品系)杂交。使用以下渐渗方案(突变体GTR基因缩写为gtr，而野生型显示为GTR)：
初始杂交：gtr/gtr(供体植物)X GTR/GTR(受体植物，例如繁殖品系)
F1植物：GTR/gtr
BC1杂交：GTR/gtr X GTR/GTR(受体植物)
BC1植物：50％GTR/gtr和50％GTR/GTR
用突变体GTR等位基因(gtr)的分子标记(例如AFLP、PCR、InvaderTM等)选择50％GTR/gtr
BC2杂交：GTR/gtr(BC1植物)X GTR/GTR(受体植物)
BC2植物：50％GTR/gtr和50％GTR/GTR
用突变体GTR等位基因(gtr)的分子标记选择50％GTR/gtr。
反复回交，直到BC3至BC6
BC3-6植物：50％GTR/gtr和50％GTR/GTR
用突变体GTR等位基因(gtr)的分子标记选择50％GTR/gtr。为了减少回交次数(例如，直到BC3，而不是BC6)，可以使用对受体植物品系的遗传背景特异的分子标记。
BC3-6S1杂交：GTR/gtr X GTR/gtr
BC3-6S1植物：25％GTR/GTR和50％GTR/gtr和25％gtr/gtr
用突变体GTR等位基因(gtr)的分子标记选择包含gtr的植物。用突变体和野生型GTR等位基因的分子标记选择突变体GTR等位基因为纯合(gtr/gtr)的各BC3-6S1植物。
突变体GTR芸苔属植物的部分中GSL含量的表征
按上文所述针对突变体GTR拟南芥属植物在突变体GTR芸苔属植物中分析种子、茎、花、叶、根、长角果和长角果壳的GSL含量。选择包含突变体GTR基因的特定组合的芸苔属植物用于进一步繁殖、用于种子产生或用于作物栽培，该组合导致特定植物部分中的特定GSL含量。
生态型“R-0-18”(芜菁trilocularis亚种(Brassica rapa subsp.trilocularis))的WT和突变(通过定向诱导基因组局部突变，TILLING)芜菁种子购自Reverse Genetics UK(RevGenUK)。将种子播种在植物基底上，并用Bactimos(苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensisisraelensis))浇水；播种后，在4℃冷分层种子两天来获得高而均一的萌发率。最后，将正在萌发的种子转移至16小时日长和20℃温度的生长室。用于分析的芜菁植物为2.5月龄；它们具有包含未成熟的绿色种子的绿色长角果。用于实验的重复植物的数目为n＝5株植物。
称量芜菁叶和其他组织，并用研体(叶和根)或搅拌器(茎和长角果)在液氮中匀浆。在包含对-羟基苄基芥子油苷(pOHB)作为内部标准的85％甲醇中提取来自冰冷的匀浆植物材料的芥子油苷。将部分上清转移至装有45μl DEAE sephadexTM A-25柱材料的96孔滤板。芥子油苷结合于柱材料，而通过应用短暂的真空来抽吸样品通过滤板。然后，用70％甲醇和水洗涤柱。向柱中加入硫酸酯酶溶液(2mg/ml)，并使其在室温下过夜孵育。向柱中加入100μl水，短暂离心将脱硫芥子油苷洗脱入96孔板。在Agilenttechnologies1200系列HPLC-DAD系统上分析样品，并在Zorbax SB-AQ柱上分开。图12总结wt和敲除芜菁的不同组织中的芥子油苷浓度，而图13总结这些组织的重量。
实施例5：具有改变的磷酸化/去磷酸化状态的突变体GTR1和GTR2等位基因的产生和表征
根据可在http://phosphat.mpimp-golm.mpg.de/(收集磷酸蛋白质组学数据的数据库)中检索的经实验验证的磷酸化位点来构建模拟组成性磷酸化或去磷酸化的拟南芥GTR1和GTR2等位基因。通过用天冬氨酸取代可能的磷酸化位点氨基酸(S或T)来模拟磷酸化。通过取代为丙氨酸来模拟去磷酸化。制备了以下构建体：
编码具有包含以下取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的GTR1蛋白质的构建体：
a)22位的S取代为A；
b)22位的S取代为D；
c)105位的T取代为A；
d)105位的T取代为D；
e)605位的S取代为A；
f)605位的S取代为D；
(其对应于具有以下取代的SEQ ID NO：142的氨基酸序列：
g)52位的S取代为A；
h)52位的S取代为D；
i)135位的T取代为A；
j)135位的T取代为D；
k)635位的S取代为A；
l)635位的S取代为D；
或编码具有包含以下取代的氨基酸序列SEQ ID NO：4的GTR2蛋白质的构建体：
m)58位的T取代为A；
n)58位的T取代为D；
o)117位的T取代为A；
p)117位的T取代为D；
q)323位的T取代为A；
r)323位的T取代为D。
还测试了GTR1或GTR2编码构建体，其中用亮氨酸取代492位(或522位)的脯氨酸。
在100μM的浓度下针对芥子油苷4-MTB(4-甲基亚磺酰基丁基芥子油苷)的质子依赖性输入测定了磷酸化/去磷酸化构建体。用构建体之一的cRNA(四次重复)(按100ng/μl)注射5个卵母细胞，并在17℃保持5天。在第5天，在Kulori pH5中预孵育卵母细胞5分钟，然后转移至测定培养基(含有浓度为100μM的4-MTB的Kulori pH5)。1小时后，从含有4-MTB的培养基取出卵母细胞，洗涤4次，然后在100％甲醇中提取。进行了检测4-MTB的摄取的LC-MC分析，结果显示在图11中。
可以观察到，GTR1在S22(S52＊)位上的组成性去磷酸化完全关闭了转运。同样，可以观察到，相同残基的磷酸化保持输入完整。此外，可以观察到，GTR2T58的去磷酸化保持转运活性完整，而相同残基的磷酸化失活转运。GTR1中的T105(T135＊)和GTR2中的T117的组成性磷酸化和去磷酸化都阻断转运活性。还可以观察到，GTR1P492(P522＊)和GTR3 P492突变为亮氨酸失活转运活性。总之，可以得出结论，特定残基上的磷酸化/去磷酸化调节GTR1和GTR2介导的芥子油苷转运。(＊所示的氨基酸位置参考包括N端30AA延伸的长版本GTR1)
实施例6：用dsRNA构建体下调芸苔属物种中的GTR1和/或GTR2表达
使用标准重组DNA技术，构建包含以下有效连接的DNA片段的编码dsRNA的重组基因：
a)下调GTR1的重组基因：
i.植物可表达的启动子，如CaMV35S；
ii.包含SEQ ID138的核苷酸序列的DNA区；
iii.转录终止和聚腺苷酸化区，如3’nos区；
b)下调GTR2的重组基因：
i.植物可表达的启动子，如CaMV35S；
ii.包含SEQ ID139的核苷酸序列的DNA区；
iii.转录终止和聚腺苷酸化区，如3’nos区；
c)下调GTR1/GTR2的重组基因：
i.植物可表达的启动子，如CaMV35S；
ii.包含SEQ ID140的核苷酸序列的DNA区；
iii.转录终止和聚腺苷酸化区，如3’nos区。
将这些编码dsRNA的重组基因(分别)与选择标记基因(如编码膦丝菌素(phosphinotricin)乙酰转移酶的选择标记基因)一起引入T-DNA载体的边界之间。用常规方法将T-DNA载体引入包含辅助Ti质粒的土壤杆菌属菌株中。基本上按De Block等(1989)，Plant Physiol.91：694所述获得、培养和转化欧洲油菜的下胚轴外植体来将嵌合基因转入欧洲油菜植物。
鉴定转基因欧洲油菜植物，并分析叶和种子中的芥子油苷含量。
因此，本发明包含以下段落中所述的实施方案：
1.用于改变十字花目植物或其部分中的芥子油苷(GSL)含量的方法，其包括改变该植物或该植物部分的细胞中至少一种芥子油苷转运(GTR)蛋白质的功能活性，该转运蛋白质包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：142具有至少33％序列同一性的氨基酸序列。
2.段落1的方法，其中该GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
3.段落1或2的方法，其中该GTR蛋白质包含与SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130、144、146、148或150中任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
4.段落1或2的方法，其中该GTR蛋白质包含选自SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130、144、146、148或150的氨基酸。
5.段落1至4中任一段的方法，其中该GTR蛋白质由与SEQ ID No.13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136、137、143、145、147或149中任意个具有至少80％序列同一性的核酸编码。
6.段落1至5中任一段的方法，其中该GTR蛋白质由选自SEQ ID No.13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136、137、143、145、147或149的核酸编码。
7.段落1至6中任一段的方法，其包括改变至少两种GTR蛋白质的功能活性。
8.段落7的方法，其中第一GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：2或SEQID NO：142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，且第二GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
9.段落7的方法，其中该第一GTR蛋白质包含与SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52、54或144、146、148或150中任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，且其中该第二GTR蛋白质包含与SEQ ID No.26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128或130中任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.段落7的方法，其中该第一GTR蛋白质包含选自SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52或54或144、146、148、150的氨基酸序列，且其中该第二GTR蛋白质包含选自SEQ ID No.26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128或130的氨基酸序列。
11.段落7的方法，其中该第一GTR蛋白质由与SEQ ID No.13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53或137或143、145、147、149中任一个具有至少80％序列同一性的核酸编码，且其中该第二GTR蛋白质由与SEQ ID No.25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136中任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
12.段落7的方法，其中该第一GTR蛋白质由选自SEQ ID No.13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53或137或143、145、147、149的核酸编码，且其中该第二GTR蛋白质由选自SEQ ID No.25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136的核苷酸序列编码。
13.段落1至12中任一段的方法，其包括降低该植物或植物部分的细胞中的功能性GTR活性。
14.段落13的方法，其中降低植物种子中的GSL含量。
15.段落13的方法，其中增加绿色植物组织中的GSL含量。
16.段落9至12中任一段的方法，其中该功能性GTR活性的降低包括下调GTR基因表达。
17.段落1至16中任一段的方法，其中该功能性GTR活性的降低包括下调GTR蛋白质活性。
18.段落17的方法，其包括将RNA分子引入该植物或植物部分中，其中该RNA分子包含能够下调该GTR基因的表达的GTR抑制性RNA分子。
19.段落18的方法，其包括将嵌合DNA构建体引入该植物或植物部分中，其中该嵌合DNA构建体包含以下有效连接的DNA区：
a)在该植物或植物部分中有效的启动子；
b)转录DNA区，其在转录时产生GTR抑制性RNA分子，该GTR抑制性RNA分子能够下调该GTR基因的表达；
c)涉及转录终止和多聚腺苷化作用的DNA区。
20.段落19的方法，其中该转录DNA区编码有义RNA分子，该DNA区包含与该GTR基因的DNA链具有至少95％同一性的至少20个核苷酸的核苷酸序列。
21.段落19的方法，其中该转录DNA区编码反义RNA分子，该DNA区包含与该GTR基因的DNA链的互补序列具有至少95％同一性的至少20个核苷酸的核苷酸序列。
22.段落19的方法，其中该转录DNA区编码双链RNA分子，其包含：
a)含有与该GTR基因具有至少95％同一性的至少20个连续核苷酸的有义RNA区；
b)含有与该有义RNA区互补的至少20个核苷酸的反义RNA区；
其中该有义和反义RNA区能够形成双链RNA区，且其中该双链RNA分子能够下调该GTR基因的表达。
23.段落22的方法，其中该转录DNA区包含选自SEQ ID No.138、139或140的核苷酸序列的核苷酸序列。
24.段落19的方法，其中该转录DNA区编码前miRNA分子，其加工为能够指导切割转录自该GTR基因的mRNA的miRNA。
25.段落19至24中任一段的方法，其中该启动子是组织特异性启动子或诱导型启动子。
26.段落25的方法，其中该启动子是种子特异性启动子。
27.段落16或17的方法，其包括改变内源GTR基因的核苷酸序列。
28.段落27的方法，其中该GTR蛋白质是包含具有任意以下取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质：
a)22位的S取代为A；
b)22位的S取代为D；
c)105位的T取代为A；
d)105位的T取代为D；
e)605位的S取代为A；
f)605位的S取代为D；
或者其中该GTR蛋白质是包含具有任意以下取代的SEQ ID NO：142的氨基酸序列的蛋白质：
g)52位的S取代为A；
h)52位的S取代为D；
i)135位的T取代为A；
j)135位的T取代为D；
k)635位的S取代为A；
l)635位的S取代为D。
29.段落27的方法，其中该GTR蛋白质是具有包含以下取代的氨基酸序列SEQ ID NO：4的蛋白质：
a)58位的T取代为A；
b)58位的T取代为D；
c)117位的T取代为A；
d)117位的T取代为D；
e)323位的T取代为A；
f)323位的T取代为D。
30.段落27的方法，其中该GTR蛋白质由SEQ ID No.25的核酸编码，该核酸：
a)在1241至1243位包含终止密码子。
31.段落27的方法，其中该GTR蛋白质由SEQ ID No.31的核酸编码，该核酸：
a)在929至931位包含终止密码子；
b)在1145至1147位包含终止密码子。
32.段落27的方法，其中该GTR蛋白质由SEQ ID No.27的核酸编码，该核酸：
a)在870至872位包含终止密码子；
b)在1380至1382位包含终止密码子。
33.段落27的方法，其中该GTR蛋白质由SEQ ID No.33的核酸编码，该核酸：
a)在780至782位包含终止密码子。
34.段落27的方法，其中该GTR蛋白质是具有在任意以下位置包含突变的氨基酸序列SEQ ID NO：66的蛋白质：
a)Gly126
b)Gly145
c)Glu192
d)Trp229
e)Ser359
35.段落1至34中任一段的方法，其中该植物是芸苔属植物。
36.植物或植物部分，其可通过段落1至34中任一段的方法获得。
37.种子，其来自段落36的植物。
38.籽粕，其来自段落37的种子。
39.绿色植物组织，其来自段落36的植物。
40.油，其来自段落35的植物或段落37的种子。
41.段落36的植物或植物部分的用途，其用于动物饲料。
42.段落36的植物或植物部分的用途，其用于害虫防治，尤其是用于生物熏蒸消毒。
43.段落36的植物或植物部分的用途，其用于癌症预防。
44.编码GTR的核酸序列的用途，其用于获得植物或植物部分中改变的GSL含量。
45.用于产生种子或籽粕的方法，其包括培养具有降低的功能性GTR活性的植物，并从该植物回收种子。
46.段落19至32的任一段中所述的嵌合DNA构建体。
47.编码突变体GTR蛋白质的核酸，其中对应的野生型GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：142具有至少33％序列同一性的氨基酸序列。
48.段落33的核酸，其中野生型GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12或SEQ ID NO：142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
49.突变体GTR蛋白质，其由段落47或48的核酸编码。
50.用于在生物样品中鉴定段落47或48的核酸的方法，其包括测定突变DNA区在该样品的核酸中的存在，与编码对应的野生型GTR蛋白质的核酸相比，该突变DNA区在突变体GTR核酸中包含至少一个缺失、插入或取代的核苷酸。
51.用于在生物样品中鉴定段落45或46的核酸的试剂盒，其包含引物或探针的集合，该集合选自：
-引物或探针的集合，其中该引物或探针之一特异性识别突变DNA区5’侧翼的DNA区，且该引物或探针的另一个特异性识别突变DNA区3’侧翼的DNA区；
-引物或探针的集合，其中该引物或探针之一特异性识别突变DNA区5’或3’侧翼的DNA区，且该引物或探针的另一个特异性识别突变DNA区；
-引物或探针的集合，其中该引物或探针之一特异性识别突变DNA区5’或3’侧翼的DNA区，且该引物或探针的另一个特异性识别3’或5’侧翼区与突变DNA区之间的连接区；
-特异性识别突变DNA区5’或3’侧翼的DNA区与突变DNA区之间的连接区的探针。
52.分离的DNA序列，其编码SEQ ID No.2、4、6、8、10或12或142的氨基酸序列。
53.分离的DNA序列，其编码SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130或144、146、148或150的氨基酸序列。
54.分离的DNA序列，其包含SEQ ID No.25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136或143、145、147或149的核苷酸序列。
55.嵌合基因，其包含以下有效连接的DNA片段：
a)异源的植物可表达启动子；
b)编码SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130或142或144、146、148或150的氨基酸序列的DNA区；
c)在植物细胞中具有功能的转录终止和多腺苷酸化信号。
56.植物，其包含段落55的嵌合基因。
57.分离的蛋白质，其包含SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130或142或144、146、148或150的氨基酸序列。
58.突变体GTR等位基因，其编码具有与包含任意以下取代的SEQID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的GTR蛋白质：
a)22位的S取代为A；
b)22位的S取代为D；
c)105位的T取代为A；
d)105位的T取代为D；
e)605位的S取代为A；
f)605位的S取代为D；
或编码具有与包含任意以下取代的SEQ ID NO：142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的GTR蛋白质：
g)52位的S取代为A；
h)52位的S取代为D；
i)135位的T取代为A；
j)135位的T取代为D；
k)635位的S取代为A；
l)635位的S取代为D。
59.突变体GTR等位基因，其编码与包含以下取代的氨基酸序列SEQID NO：4具有至少80％序列同一性的GTR蛋白质：
a)58位的T取代为A；
b)58位的T取代为D；
c)117位的T取代为A；
d)117位的T取代为D；
e)323位的T取代为A；
f)323位的T取代为D。
60.突变体GTR等位基因，其与SEQ ID No.25的核酸具有至少80％序列同一性，该核酸：
a)在1241至1243位包含终止密码子。
61.突变体GTR等位基因，其与SEQ ID No.31的核酸具有至少80％序列同一性，该核酸：
a)在929至931位包含终止密码子；
b)在1145至1147位包含终止密码子。
62.突变体GTR等位基因，其与SEQ ID No.27的核酸具有至少80％序列同一性，该核酸：
a)在870至872位包含终止密码子；
b)在1380至1382位包含终止密码子。
63.突变体GTR等位基因，其与SEQ ID No.33的核酸具有至少80％序列同一性，该核酸：
a)在780至782位包含终止密码子。
64.突变体GTR等位基因，其编码与在任意以下位置包含突变的SEQID No：66的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的GTR蛋白质：
a)Gly126；
b)Gly145；
c)Glu192；
d)Trp229；
e)Ser359。
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Claims (28)

1.用于改变十字花目植物或其部分中的芥子油苷(GSL)含量的方法，其包括改变所述植物或所述植物部分的细胞中至少一种芥子油苷转运(GTR)蛋白质的功能活性，所述GTR转运蛋白质包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：142具有至少33％序列同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的方法，其中所述GTR蛋白质包含与SEQ ID No.2、4、6、8、10、12或142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的方法，其中所述GTR蛋白质包含与SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128或130或144、146、148或150中任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1或2的方法，其中所述GTR蛋白质包含选自SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128或130或144、146、148或150的氨基酸。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述GTR蛋白质由与SEQID No.13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136或137或143、145、147或149中任一个具有至少80％序列同一性的核酸编码。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述GTR蛋白质由选自SEQID No.13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136或137或143、145、147或149的核酸编码。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其包括改变至少两种GTR蛋白质的功能活性。
8.权利要求7的方法，其中第一GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，且第二GTR蛋白质包含与SEQ ID NO：4具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
9.权利要求7的方法，其中所述第一GTR蛋白质包含与SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52或54或144、146、148或150中任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，且其中所述第二GTR蛋白质包含与SEQ ID No.26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128或130中任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.权利要求7的方法，其中所述第一GTR蛋白质包含选自SEQ IDNo.14、16、18、20、22、24、38、40、42、50、52或54或144、146、
148或150的氨基酸序列，且其中所述第二GTR蛋白质包含选自SEQ IDNo.26、28、30、32、34、36、44、46、48、56、58、60、120、122、124、126、128或130的氨基酸序列。
11.权利要求7的方法，其中所述第一GTR蛋白质由与SEQ ID No.13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53或137或143、145、147或149中任一个具有至少80％序列同一性的核酸编码，且其中所述第二GTR蛋白质由与SEQ ID No.25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136中任意个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列编码。
12.权利要求7的方法，其中所述第一GTR蛋白质由选自SEQ ID No.13、15、17、19、21、23、37、39、41、49、51、53或137或143、145、147或149的核酸编码，且其中所述第二GTR蛋白质由选自SEQ ID No.25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136的核苷酸序列编码。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中降低植物种子中的GSL含量。
14.降低植物的细胞中GTR活性的方法，其包括将RNA分子引入所述植物或植物部分中，其中所述RNA分子包含能够下调所述GTR基因的表达的GTR抑制性RNA分子。
15.权利要求14的方法，其包括将嵌合DNA构建体引入所述植物或植物部分中，其中所述嵌合DNA构建体包含以下有效连接的DNA区：
a)在所述植物或植物部分中有效的启动子；
b)转录DNA区，其在转录时产生GTR抑制性RNA分子，所述GTR抑制性RNA分子能够下调所述GTR基因的表达；
c)涉及转录终止和多聚腺苷化作用的DNA区。
16.降低植物的细胞中GTR活性的方法，其包括改变内源GTR基因的核苷酸序列。
17.权利要求16的方法，其中所述GTR蛋白质是包含具有任意以下取代的氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：142的蛋白质：
a.22位的S取代为A(对SEQ ID No142为52位)；
b.22位的S取代为D(对SEQ ID No142为52位)；
c.105位的T取代为A(对SEQ ID No142为135位)；
d.105位的T取代为D(对SEQ ID No142为135位)；
e.605位的S取代为A(对SEQ ID No142为635位)；
f.605位的S取代为D(对SEQ ID No142为635位)；
或者所述GTR蛋白质是具有包含以下取代的氨基酸序列SEQ ID NO：4的蛋白质：
a)58位的T取代为A；
b)58位的T取代为D；
c)117位的T取代为A；
d)117位的T取代为D；
e)323位的T取代为A；
f)323位的T取代为D；
或者所述GTR蛋白质由核酸SEQ ID No25编码，该核酸：
g)在1241至1243位包含终止密码子；
或者GTR蛋白质由核酸SEQ ID No31编码，该核酸：
h)在929至931位包含终止密码子；
i)在1145至1147位包含终止密码子；
或者GTR蛋白质由核酸SEQ ID No27编码，该核酸：
j)在870至872位包含终止密码子；
k)在1380至1382位包含终止密码子；
或者所述GTR蛋白质由核酸SEQ ID No33编码，该核酸：
l)在780至782位包含终止密码子；
或者所述GTR蛋白质是具有在任意以下位置包含突变的氨基酸序列SEQ ID NO：66的蛋白质：
m)Gly126；
n)Gly145；
o)Glu192；
p)Trp229；
q)Ser359。
18.权利要求1至37中任一项的方法，其中所述植物是芸苔属植物。
19.植物或植物部分，其可通过权利要求1至17中任一项的方法获得。
20.种子，其来自权利要求19的植物。
21.编码GTR的核酸序列的用途，其用于获得植物或植物部分中改变的GSL含量。
22.分离的DNA序列，其编码氨基酸序列SEQ ID No.2、4、6、8、10、12或142。
23.分离的DNA序列，其编码氨基酸序列SEQ ID No.14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128或130或144、146、148或150。
24.分离的DNA序列，其包含核苷酸序列SEQ ID No.25、27、29、31、33、35、43、45、47、55、57、59、119、121、123、125、127、129、131、132、133、134、135、136或143、145、147或149。
25.嵌合基因，其包含以下有效连接的DNA片段：
a)异源的植物可表达启动子；
b)编码氨基酸序列SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130或142或144、146、148或150的DNA区；
c)在植物细胞中具有功能的转录终止和多腺苷酸化信号。
26.植物，其包含权利要求25的嵌合基因。
27.分离的蛋白质，其包含氨基酸序列SEQ ID No.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、120、122、124、126、128、130或142或144、146、148或150。
28.突变体GTR等位基因，其编码包含与具有以下取代中任一个的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO142具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的GTR蛋白质：
a)22位的S取代为A(对SEQ ID No142为52位)；
b)22位的S取代为D(对SEQ ID No142为52位)；
c)105位的T取代为A(对SEQ ID No142为135位)；
d)105位的T取代为D(对SEQ ID No142为135位)；
e)605位的S取代为A(对SEQ ID No142为635位)；
f)605位的S取代为D(对SEQ ID No142为635位)；
或者与具有以下取代的氨基酸序列SEQ ID No.4具有至少80％序列同一性的GTR蛋白质：
g)58位的T取代为A；
h)58位的T取代为D；
i)117位的T取代为A；
j)117位的T取代为D；
k)323位的T取代为A；
l)323位的T取代为D；
或者突变体GTR等位基因，其与在1241至1243位包含终止密码子的核酸SEQ ID No.25具有至少80％序列同一性；
或者突变体GTR等位基因，其与核酸SEQ ID No.31具有至少80％序列同一性，该核酸：
m)在929至931位包含终止密码子；
n)在1145至1147位包含终止密码子；
或者突变体GTR等位基因，其与核酸SEQ ID No.27具有至少80％序列同一性，该核酸：
o)在870至872位包含终止密码子；
p)在1380至1382位包含终止密码子；
或者突变体GTR等位基因，其与核酸SEQ ID No.33具有至少80％序列同一性，该核酸：
q)在780至782位包含终止密码子；
或者突变体GTR等位基因，其编码与在任意以下位置包含突变的氨基酸序列SEQ ID NO：66具有至少80％序列同一性的GTR蛋白质：
r)Gly126；
s)Gly145Glu192；
t)Trp229；
u)Ser359。
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