CN112877341B

CN112877341B - 硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用

Info

Publication number: CN112877341B
Application number: CN202110361987.XA
Authority: CN
Inventors: 张园园; 何贻洲; 刘胜毅; 刘越英; 黄军艳; 程晓辉
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2041-04-02
Also published as: CN112877341A

Abstract

本发明公开了硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnaA09.GTR2进行编辑，获得了BnaA09.GTR2基因的纯合突变体，所述BnaA09.GTR2基因敲除突变体成熟种子中总硫苷含量显著降低，证明BnaA09.GTR2基因在硫苷从合成部位向种子转运的过程中发挥功能。能够用于油菜种子硫苷性状的改良，为甘蓝型油菜种子低硫苷性状的改良开发提供了理论依据，为以低硫苷性状改良为目标的油菜育种工作提供了一种新的途径。

Description

硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用

技术领域

本发明涉及油菜分子育种技术领域，特别涉及一种硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用。

背景技术

油菜(Brassica napus)是十字花科芸薹属植物中的一种重要的油料作物，是世界范围内广泛种植的主要油料作物，也是我国唯一的冬季油料作物。因此，国家把发展油菜生产作为保证食用油安全供应的重点，具有重要的现实意义。我国甘蓝型油菜由于具有抗病、产量高、适应性广、耐逆行性强等特点，成为主要栽培品种。油菜增产主要通过提高单位面积菜籽产量、提高菜籽含油量和扩大种植面积三种途径。油菜育种工作者现在的主要目标是努力提高含油量、产量和品质。

硫代葡萄糖苷(硫苷)是一类含氮、硫的植物次生代谢产物。油菜菜籽榨油后的饼粕含丰富的蛋白质，是良好的天然动物饲料。然而硫苷在甘蓝型油菜籽粒中却是一种有害成分，用含有高硫苷及其水解产物的油菜饼粕去饲养禽畜，会对禽畜造成毒害，所以油菜籽粒中硫苷含量的高低决定了油菜饼粕作为饲料的价值。

一方面，降低油菜籽粒中硫苷含量是改良菜籽油品质的重要育种目标之一。另一方面，硫苷的水解产物在油菜营养体中却可以对油菜起保护作用。因此，低硫苷油菜自身的抗虫抗病性随着籽粒硫苷含量的下降也显著的降低，不利于双低油菜的推广和应用。通过遗传育种的方法，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要的现实意义。

植物中硫苷的合成与积累部位并不一致，硫苷首先在嫩叶中大量积累，随着叶片逐渐老化，其硫苷含量下降，种子中的硫苷开始积累。研究表明拟南芥GTR1和GTR2基因在介导硫苷的这种长距离运输过程中起着重要作用。在GTR1和GTR2双突变体中，种子中的硫苷几乎完全消失，而在叶片中积累10倍以上。因此，阻断硫苷从合成部位往种子中运输，对降低种子中硫苷含量、提高植物抗虫抗病性具有重要作用。Nour-Eldin等成功将硫苷转运基因突变的gtr功能丧失表型从模式植物转移到芸苔属作物中，即通过对白菜中7个GTR同源基因中的一个(BrGTR2A2)和芥菜中12个GTR同源基因中的4个(Bj2A1/2A2/2B1/2B2)进行突变，分别使白菜和芥菜种子中的硫苷含量分别降低60-70％。从而证明这种“转运工程(transport engineering)”方法可广泛应用于降低其他油料作物(如异源四倍体油菜)种子硫代葡萄糖苷含量。因此，鉴定油菜GTR同源基因中负责硫苷往种子中转运的关键转运子，对甘蓝型油菜种子硫苷含量性状进行进一步研究，提高菜籽油品质，培育出高叶片硫苷但低籽粒硫苷含量的材料，具有重要意义，同时为揭示甘蓝型油菜中硫苷含量遗传机理和分子机制奠定基础。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnaA09.GTR2进行编辑，获得了BnaA09.GTR2基因的纯合突变体，所述BnaA09.GTR2基因敲除突变体成熟种子中总硫苷含量显著降低，证明BnaA09.GTR2基因是调控硫苷从合成部位转运到种子中的重要基因。

本发明提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，所述BnaA09.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因，所述BnaA09.GTR2基因的编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2蛋白，所述BnaA09.GTR2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。

本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因在油菜分子育种方面的应用，所述BnaA09.GTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因在油菜硫苷性状改良方面的应用，所述BnaA09.GTR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转入甘蓝型油菜能够获得种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体对甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因进行定向编辑，在甘蓝型油菜BnaA09.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点。

进一步的，所述靶位点的一条链具有5’-(N)XNGG-3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；优选的，所述靶位点序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供一种种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，所述甘蓝型油菜材料中的BnaA09.GTR2基因被敲除，所述基因敲除方法为CRISPR/Cas9基因编辑系统、EMS诱变、同源重组、T-DNA插入中的任意一种。

本发明还提供一种重组菌株，所述重组菌株中转入了所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体。

本发明还提供所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体在降低油菜种子中总硫苷含量中的应用，将所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转化微生物培养表达，转化目标植物，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体，所述转化方式为农杆菌介导、花粉管通道法、基因枪法、显微注射法中的任意一种。

本发明还提供一种降低油菜种子中总硫苷含量的方法，所述方法包括在油菜中转入所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)本发明鉴定到甘蓝型油菜中一个重要硫苷转运基因BnaA09.GTR2，该基因对硫苷从合成部位往种子中运输起重要作用，为油菜种子低硫苷、叶片高硫苷的育种工作提供了一种全新的途径，具有广阔的应用前景。

(2)本发明鉴定了一个能改变甘蓝型油菜种子硫苷含量的重要转运子，并提供一个基于CRISPR/Cas9系统的靶位点，该靶位点可以定点编辑BnaA09.GTR2基因；通过CRISPR/Cas9系统获得甘蓝型油菜的种子低硫苷种质，为种子低硫苷的抗病种质的育种工作提供了一种全新的途径，具有广阔的应用前景。

(3)本发明利用基因编辑技术，将BnaA09.GTR2基因在甘蓝型油菜中特异敲除，经硫苷含量测定证明，与受体甘蓝型油菜相比，BnaA09.GTR2敲除突变体种子中硫苷的含量显著降低，证明BnaA09.GTR2在硫苷向种子中转运、硫苷在种子中积累的过程中起重要作用，这一发现不仅丰富了对甘蓝型油菜硫苷转运机制的认识，而且为甘蓝型油菜种子低硫苷育种的培育提供了理论依据。

(4)本发明利用基因编辑技术，将BnaA09.GTR2基因在甘蓝型油菜中特异敲除，为硫苷的理论研究和应用提供种质资源。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为BnGTR1.A09基因结构及CRISPR/Cas9靶位点示意图；

图2为CRISPR/Cas9重组载体示意图；

图3为BnGTR2s-Cas9转化植株T0代靶位点编辑情况；

图4为BnaA09.GTR2 CRISPR编辑植株T2代纯合突变株系成熟种子总硫苷含量分析。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明的目的在于鉴定甘蓝型油菜中负责硫苷从合成部位向成熟种子中转运的重要硫苷转运基因，并通过基于CRISPR/Cas9的方法特异敲除甘蓝型油菜中重要硫苷转运基因获得甘蓝型油菜种子硫苷含量显著降低的油菜新种质。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnaA09.GTR2进行编辑，并鉴定到BnaA09.GTR2基因特异敲除的移码突变体，通过种子中硫苷含量分析证明BnaA09.GTR2基因突变阻断了甘蓝型油菜硫苷从合成部位向种子中的运输，从而降低种子中硫苷的含量，提高油菜品质。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1利用CRISPR/Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因

(1)根据BnaA09.GTR2基因的编码区(CDS)设计了两个靶位点gRNA1和gRNA2，即在甘蓝型油菜BnaA09.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点，靶位点的一条链具有5’-(N)XNGG-3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；本实施例中两个靶位点gRNA1和gRNA2的序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，gRNA1靶向BnaA09.GTR2基因的第一个外显子，gRNA2靶向BnaA09.GTR2基因的第二个外显子，如图1所示；

(2)根据靶位点序列设计合成四条单链oligo DNA引物序列，分别为BnaA09.GTR2-DT1-F0、BnaA09.GTR2-DT1-BsF、BnaA09.GTR2-DT2-R0、BnaA09.GTR2-DT2-BsR，其序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

(3)以稀释100倍的pCBC-DT1T2(中国农业大学陈其军老师提供)为模板进行四引物PCR扩增获得sgRNA表达盒，其中BnaA09.GTR2-DT1-BsF/-BsR为正常引物浓度(10μmol/L)；BnaA09.GTR2-DT1-F0/-R0稀释20倍(0.5μmol/L)。PCR体系：pCBC-DT1T2载体(稀释100倍)1μl、BnaA09.GTR2-DT1-BsF 1μl、BnaA09.GTR2-DT2-BsR1μl、BnaA09.GTR2-DT1-F0 1μl、BnaA09.GTR2-DT2-R0 1μl、2×Phanta Max Master Mix(康为世纪)10μl、ddH₂O 5μl；PCR反应条件为：95℃ 3min；95℃ 15sec，58℃ 15sec，72℃ 45sec，32个循环；72℃ 7min。PCR扩增获得626bp的片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测并将目的条带切胶回收，用30μl ddH₂O溶解。

(4)将回收纯化的sgRNA表达盒(626bp)与pHSE401骨架载体(中国农业大学陈其军老师提供)采用边切边连的方法构建基因编辑载体CRISPR/Cas9载体。酶切-连接体系如下：纯化后的sgRNA表达盒6μl、pHSE401载体2μl、10×T4 ligase Buffer(New EnglandBiolabs,NEB)1.5μl、10×BSA(NEB)1.5μl、BsaI(NEB)1μl、T4 ligase(NEB)1μl、ddH₂O 2μl，反应体系为15μl。反应条件为：37℃5h，50℃5min，80℃10min。酶切-连接产物取5μl转化大肠杆菌感受态DH5α，Kan抗性平板筛选，U626-IDF(SEQ ID NO.10)和U629-IDR(SEQ IDNO.12)引物进行菌落PCR鉴定(726bp)，阳性克隆用U626-IDF(SEQ ID NO.10)和U629-IDF(SEQ ID NO.11)引物进行测序，测序正确的为构建好的CRISPR/Cas9载体，如图2所示。

(5)转农杆菌GV3101感受态细胞：感受态细胞冻融后加入10μL步骤(4)所得的包含CRISPR/Cas9载体的重组质粒，混匀，冰浴5min；液氮中冷冻5min；37℃恒温水浴锅水浴5min；加入新鲜的无抗生素的液体LB培养基，混匀后，28℃，220rpm/min活化2h。涂布于含卡那霉素和利福平的LB平板上，28℃，倒置暗培养2天，检测阳性单克隆，在卡那霉素和利福平抗性的液体LB培养基中扩增培养，用于甘蓝型油菜的遗传转化。

(6)使用根癌农杆菌介导的方式将CRISPR/Cas9载体转化到甘蓝型油菜受体材料(高硫苷品种中油821)中，采用CTAB法提取转基因单株基因组DNA，通过载体特异性的引物筛选转基因阳性植株，鉴定所用上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.12所示；

(7)在转基因后代中筛选BnaA09.GTR2靶位点发生编辑的植株，根据鉴定引物扩增后的测序结果判断BnaA09.GTR2基因两个等位基因是否均被成功敲除；

BnaA09.GTR2基因的敲除，除了通过CRISPR/Cas9基因编辑系统，还可以采用EMS诱变、同源重组、T-DNA插入等方法，上述方法都能够实现BnaA09.GTR2基因的敲除，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体；且植物遗传转化方法不局限于农杆菌介导的转化方法，还可以通过花粉管通道法、基因枪法、显微注射法等遗传转化方法获得转基因植株。

实施例2 BnaA09.GTR2基因特异性敲除突变体的获得

提取T0代阳性单株的基因组DNA，分别以BnaA09.GTR2基因靶位点上下游特异引物进行PCR扩增，其中gRNA1上下游特异性引物为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，扩增后将PCR产物回收后用SEQ ID NO.15进行测序；其中gRNA2上下游特异性引物为SEQ ID NO.16和SEQID NO.17，扩增后将PCR产物回收后用SEQ ID NO.18进行测序。通过比较测序峰图确定BnaA09.GTR2敲除情况，将测序峰图通过DSDecodeM分析确定突变类型，如没有野生型的基因型存在，说明该拷贝发生了纯合或双等位/嵌合突变，并进一步通过TA克隆进行验证。如图3所示，T0代转化植株BnaA09.gtr2^CR-1、BnaA09.gtr2^CR-2、BnaA09.gtr2^CR-3、BnaA09.gtr2^CR ^-4和BnaA09.gtr2^CR-5在BnaA09.GTR2基因的两个靶位点上均发生了编辑，其中BnaA09.gtr2^CR-1、BnaA09.gtr2^CR-3靶位点1处分别两个碱基的缺失造成其编码的蛋白序列发生移码，产生27aa的短肽；BnaA09.gtr2^CR-2靶位点1处一个碱基发生同义替换，且靶位点2处2个碱基的缺失造成其编码的氨基酸序列自119位氨基酸开始发生移码突变，至174个氨基酸提前终止；BnaA09.gtr2^CR-4靶位点1处发生了一个碱基的同义替换，而靶位点2处1个碱基的删除造成其编码的氨基酸序列自120位开始发生移码突变，至131个氨基酸提前终止；BnaA09.gtr2^CR-5其靶位点1处一个碱基的缺失，致使其编码蛋白自第18位氨基酸发生移码，至72个氨基酸提前终止。

随后，使用CRISPR-GE在线软件(Xie et al.,2017)分别预测了gRNA1和gRNA2的潜在脱靶位点，并根据分值分别选择5个最有可能的脱靶位点进行测序，转基因植株BnaA09.gtr2^CR-1、BnaA09.gtr2^CR-2、BnaA09.gtr2^CR-3、BnaA09.gtr2^CR-4和BnaA09.gtr2^CR-5均未发现任何脱靶事件。

随后，通过自交的方法获得T1代植株，并使用Sanger测序或高通量测序(Hi-Tom，方法详见文献Liu et al.,2019)的方法，在gRNA1和gRNA2靶序列位置对T1代单株进行基因分型。BnaA09.gtr2^CR-1、BnaA09.gtr2^CR-2、BnaA09.gtr2^CR-3、BnaA09.gtr2^CR-4和BnaA09.gtr2^CR-5株系的BnaA09.GTR2基因的突变均能成功传至T1代，并在T1代中筛选到相应的纯合突变体进行后续分析。

综上所述，本实施例通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了BnaA09.GTR2特异敲除不同等位突变体，其编码的蛋白均发生提前终止。

实施例3转基因T2代纯合突变株系种子中硫苷含量分析

将上述BnaA09.GTR2基因编辑T1代植株自交并收获成熟的T2代家系种子，采用液相色谱(HPLC)法测定并分析种子中硫苷含量，以转基因受体材料中油821作为对照。硫苷含量采用中华人民共和国行业标准(NY/T1582-2007)油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定高效液相色谱方法进行测定。

结果如图4所示，BnaA09.gtr2^CR-1、BnaA09.gtr2^CR-2、BnaA09.gtr2^CR-3、BnaA09.gtr2^CR-4和BnaA09.gtr2^CR-5 5个转基因株系中成熟种子硫苷含量均显著降低，**代表P＜0.05，具有显著性差异，其成熟种子中平均硫苷含量分别为70.2±5.3、76.2±4.3、73.8±6.9μmol/g、84.5±6.2μmol/g、69.3±5.5μmol/g干种子，与ZY821(125.3±7.5μmol/g)相比，平均降低40.3±0.78％。因此，上述实验结果表明BnaA09.GTR2基因的突变是导致基因编辑材料BnaA09.gtr2^CR-1、BnaA09.gtr2^CR-2、BnaA09.gtr2^CR-3、BnaA09.gtr2^CR-4和BnaA09.gtr2^CR-5突变家系种子中总硫苷显著降低的原因。从而证明，在甘蓝型油菜中，硫苷转运基因BnaA09.GTR2为硫苷的重要转运基因，在负责硫苷从合成组织向成熟种子中积累的过程中发挥着重要作用。

综上所述，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对异源四倍体甘蓝型油菜中硫苷转运基因BnaA09.GTR2进行编辑，并鉴定到BnaA09.GTR2基因特异编辑的纯合突变体，成熟种子中硫苷含量的高效液相色谱分析表明BnaA09.GTR2基因敲除突变体中总硫苷含量相对转基因受体中油821发生显著降低，从而证明BnaA09.GTR2基因是硫苷从合成部位往种子中转运的重要基因，并获得了种子中硫苷含量显著降低的甘蓝型油菜新种质资源。本发明鉴定的BnaA09.GTR2基因对甘蓝型油菜中硫苷从合成部位往种子中运输过程中发挥重要作用，能够用于油菜种子中硫苷性状的改良，为甘蓝型油菜种子低硫苷性状的改良开发提供了理论依据，为以低硫苷性状改良为目标的油菜育种工作提供了一种新的途径。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别为本发明中BnaA09.GTR2基因组区和编码区的核苷酸序列，序列长度分别为2304bp和1839bp；SEQ ID NO.3是本发明中BnaA09.GTR2基因编码的氨基酸序列，序列长度为612aa。

SEQ ID NO.1

ATGGAGAGAAAGTCTCTAGAAGTCGAGTCTATGGATCACCAAAAACTTTCCTCCGCCGTGTACGATGGCTCTGTTACGGCCGTTGATTCTGTTAAAGAAGATGTTCAGGAGACCAAAGTCGTTTATAGAGGCTGGAAAGTCATGCCTTACATCATTGGTAACGCAATAATATTATCATTTACCGTGCTCTATAAACTTTCTTCTTTTTAATGTTAAAAAAAAACTTTCTTCTTTTGGAAACTATTTCTTTTGTCGTTTTGTTGTCTTAAGTTTTCACTTAGTCATAATATTGAAGTCTTATGATCTTGGTTAATCTTTGTTGTTGTTACCACCAGGAAATGAGACATTTGAGAAGCTTGGGATCATTGGAACACTATCAAACCTTCTGGTTTATTTAACTTCTGTCTTCAACATGAAGAGTGTCACAGCTGCAACAATCATCACTGCCTTTGCTGGCACAGTCAACTTCGGAACTTTCGTCGCTGCTTTCCTTTGCGACACTTACTTCGGTCGATACAAGACTCTTACCGTTGCGGTCCTCGCCTGTTTTCTTGTAAAGATCCATCCCCTCATAACTCTTTCTTCCTCTACAGGCAATATTGGTTTATAACCTAAAAAAAAAAATCTGGTTCTTGTTTTGTAGGGATCACTTGCGATACTATTGACTGCTGCAGTCCCACAACTACATCCAGTCCCATGCGGCACAGCGAGCTCGTGTATCGGGCCAAGTGGTGGCCAGATAGCGTTTCTACTGATGGGTCTTGGAATTCTTGTCGTGGGAGCAGGAGGGATTAGACCGTGCAATCTAGCTTTCGGAGCTGATCAGTTTAATCCGAAGAGCGGGTCAGGGAAGAGAGGGATTGATAGTTTCTTCAACTGGTACTTCTTTACCTTCACTTTCGCCCAGATCTTGTCTCTGACAGTAGTTGTCTATGTCCAGTCTAATGTCAGTTGGACCATCGGTTTAACCATCCCGGTTGTTCTAATGTTCTTGGCCTCCGTGATTTTCTTTGCGGGTGCTAAGTTGTATGTTAAGATCGAAGCCTCAGGTAGTCCATTGGCTAGCATAGCTCATGTTATAACGGCTTCTATCAAGAAACACAGGTTAGAGCCAGTGGAACAGCCTTGGCTGAACCTTTACAACTACTACCCATCAAAATACGCAAACGCCAAGCTCAAATACACCCAACAATTCAGGTAAACACACACTTTTAAACCGGTAAAAAAACACCGTTATATATATATATATTTTTTTTTTTTTGAGTGAATGAATGTTAAAATTATTCATATCAAAACTTTTTTACAATGACTGCATCTATAGTTGATATATATATACTTATACAATGTCTTTTTTTGATGCTTTATGTTTACTGAGAGAGATTCTTACTCGGCAGGTTTCTCGACAAGGCGGCGATCTTGACTCCTGAAGACAAGTTGGAGGCTGATGGTAAGCCTGTGAATCCGTGGAATCTATGTACAATGCAACAAGTTGAAGAAGTGAAGTGCATCATGAGAGTGCTTCCTATATGGTTTGCTTCATCGATCTACTACTTAACCATGGCGCAACAAATGACTTATCCTGTCTTCCAAGCTCTCCAGAGTGATCGTCGCCTAGGGTCCGGAGGTTTCATGATCCCGGCAGCCACCTATGTTGTCTTCTTGATGACTGGCATGACCCTCTTCATCATATTTTATGACCGTGTCTTGGTTCCTACATTTAAACGAATAACCGGTATAGAGACGGGTATAACGCTCTTGCAAAGAATTGGAGCCGGGATTTTTTTCGCCTTTTTAAGCTTAATTGTCTCTGGTTTCGTCGAGGAACGTAGGAGAACTTTAGCACTAACTCAACCGACACTCGGTTTAGCGCCACGGAAGGGAGAAATCTCCTCAATGTCGGCTATGTGGCTGATTCCGCAGCTTGTACTTGCTGGTATAGCCGACGCGTTTGGAGCTATTGGACAGATGGAGTTTTACTACAAGCAGTTCCCTGAGAACATGAGGAGTTTCGCTGGTTCTATCTTTTACGTAGGAGCAGGAGTTTCGAGTTACATCAGTAGCTTCTTGATCACAACGGTTCACAGGATGACGCAGAACTCGGCGGGTGGTAATTGGTTAGCTGAGGATTTGAACAAAGGGAGATTGGATTACTTCTATTTCTTGTTAGCTGGAATCTTGGCAGTTAATTTTGCTTACTTCTTGGTGATGGCAAGATGGTATAGGTACAAAGGAAGTGATGATGAAGAGACAAGTTATGAAACCAGTGGAGATATCATCAAAGAACAAGACAAGAACAAAGTCTGA

SEQ ID NO.2

ATGGAGAGAAAGTCTCTAGAAGTCGAGTCTATGGATCACCAAAAACTTTCCTCCGCCGTGTACGATGGCTCTGTTACGGCCGTTGATTCTGTTAAAGAAGATGTTCAGGAGACCAAAGTCGTTTATAGAGGCTGGAAAGTCATGCCTTACATCATTGGAAATGAGACATTTGAGAAGCTTGGGATCATTGGAACACTATCAAACCTTCTGGTTTATTTAACTTCTGTCTTCAACATGAAGAGTGTCACAGCTGCAACAATCATCACTGCCTTTGCTGGCACAGTCAACTTCGGAACTTTCGTCGCTGCTTTCCTTTGCGACACTTACTTCGGTCGATACAAGACTCTTACCGTTGCGGTCCTCGCCTGTTTTCTTGGATCACTTGCGATACTATTGACTGCTGCAGTCCCACAACTACATCCAGTCCCATGCGGCACAGCGAGCTCGTGTATCGGGCCAAGTGGTGGCCAGATAGCGTTTCTACTGATGGGTCTTGGAATTCTTGTCGTGGGAGCAGGAGGGATTAGACCGTGCAATCTAGCTTTCGGAGCTGATCAGTTTAATCCGAAGAGCGGGTCAGGGAAGAGAGGGATTGATAGTTTCTTCAACTGGTACTTCTTTACCTTCACTTTCGCCCAGATCTTGTCTCTGACAGTAGTTGTCTATGTCCAGTCTAATGTCAGTTGGACCATCGGTTTAACCATCCCGGTTGTTCTAATGTTCTTGGCCTCCGTGATTTTCTTTGCGGGTGCTAAGTTGTATGTTAAGATCGAAGCCTCAGGTAGTCCATTGGCTAGCATAGCTCATGTTATAACGGCTTCTATCAAGAAACACAGGTTAGAGCCAGTGGAACAGCCTTGGCTGAACCTTTACAACTACTACCCATCAAAATACGCAAACGCCAAGCTCAAATACACCCAACAATTCAGGTTTCTCGACAAGGCGGCGATCTTGACTCCTGAAGACAAGTTGGAGGCTGATGGTAAGCCTGTGAATCCGTGGAATCTATGTACAATGCAACAAGTTGAAGAAGTGAAGTGCATCATGAGAGTGCTTCCTATATGGTTTGCTTCATCGATCTACTACTTAACCATGGCGCAACAAATGACTTATCCTGTCTTCCAAGCTCTCCAGAGTGATCGTCGCCTAGGGTCCGGAGGTTTCATGATCCCGGCAGCCACCTATGTTGTCTTCTTGATGACTGGCATGACCCTCTTCATCATATTTTATGACCGTGTCTTGGTTCCTACATTTAAACGAATAACCGGTATAGAGACGGGTATAACGCTCTTGCAAAGAATTGGAGCCGGGATTTTTTTCGCCTTTTTAAGCTTAATTGTCTCTGGTTTCGTCGAGGAACGTAGGAGAACTTTAGCACTAACTCAACCGACACTCGGTTTAGCGCCACGGAAGGGAGAAATCTCCTCAATGTCGGCTATGTGGCTGATTCCGCAGCTTGTACTTGCTGGTATAGCCGACGCGTTTGGAGCTATTGGACAGATGGAGTTTTACTACAAGCAGTTCCCTGAGAACATGAGGAGTTTCGCTGGTTCTATCTTTTACGTAGGAGCAGGAGTTTCGAGTTACATCAGTAGCTTCTTGATCACAACGGTTCACAGGATGACGCAGAACTCGGCGGGTGGTAATTGGTTAGCTGAGGATTTGAACAAAGGGAGATTGGATTACTTCTATTTCTTGTTAGCTGGAATCTTGGCAGTTAATTTTGCTTACTTCTTGGTGATGGCAAGATGGTATAGGTACAAAGGAAGTGATGATGAAGAGACAAGTTATGAAACCAGTGGAGATATCATCAAAGAACAAGACAAGAACAAAGTCTGA

SEQ ID NO.3

MERKSLEVESMDHQKLSSAVYDGSVTAVDSVKEDVQETKVVYRGWKVMPYIIGNETFEKLGIIGTLSNLLVYLTSVFNMKSVTAATIITAFAGTVNFGTFVAAFLCDTYFGRYKTLTVAVLACFLGSLAILLTAAVPQLHPVPCGTASSCIGPSGGQIAFLLMGLGILVVGAGGIRPCNLAFGADQFNPKSGSGKRGIDSFFNWYFFTFTFAQILSLTVVVYVQSNVSWTIGLTIPVVLMFLASVIFFAGAKLYVKIEASGSPLASIAHVITASIKKHRLEPVEQPWLNLYNYYPSKYANAKLKYTQQFRFLDKAAILTPEDKLEADGKPVNPWNLCTMQQVEEVKCIMRVLPIWFASSIYYLTMAQQMTYPVFQALQSDRRLGSGGFMIPAATYVVFLMTGMTLFIIFYDRVLVPTFKRITGIETGITLLQRIGAGIFFAFLSLIVSGFVEERRRTLALTQPTLGLAPRKGEISSMSAMWLIPQLVLAGIADAFGAIGQMEFYYKQFPENMRSFAGSIFYVGAGVSSYISSFLITTVHRMTQNSAGGNWLAEDLNKGRLDYFYFLLAGILAVNFAYFLVMARWYRYKGSDDEETSYETSGDIIKEQDKNKV*

SEQ ID NO.4

CACGGCGGAGGAAAGTTTTTGG

SEQ ID NO.5

AAACAGGCGAGGACCGCAACGG

SEQ ID NO.6

TGCACGGCGGAGGAAAGTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

SEQ ID NO.7

ATATATGGTCTCGATTGCACGGCGGAGGAAAGTTTTGTT

SEQ ID NO.8

AACTTGCGGTCCTCGCCTGTTTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC

SEQ ID NO.9

ATTATTGGTCTCGAAACTTGCGGTCCTCGCCTGTTTCAA

SEQ ID NO.10

TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC

SEQ ID NO.11

TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC

SEQ ID NO.12

AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC

SEQ ID NO.13

CAACAGCTCCACCCAGGACT

SEQ ID NO.14

CAACAAAGATTAACCAAGATCATAAGAC

SEQ ID NO.15

CAACAGCTCCACCCAGGAC

SEQ ID NO.16

GTAAAGATCCATCCCCTCATAACTC

SEQ ID NO.17

TCTCTTCCCTGACCCGCTCTTCGGA

SEQ ID NO.18

ACTCTTTCTTCCTCTACAGGCAATA。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 硫苷转运相关的甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因及其应用

<130> 20210401

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2304

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 1

atggagagaa agtctctaga agtcgagtct atggatcacc aaaaactttc ctccgccgtg 60

tacgatggct ctgttacggc cgttgattct gttaaagaag atgttcagga gaccaaagtc 120

gtttatagag gctggaaagt catgccttac atcattggta acgcaataat attatcattt 180

accgtgctct ataaactttc ttctttttaa tgttaaaaaa aaactttctt cttttggaaa 240

ctatttcttt tgtcgttttg ttgtcttaag ttttcactta gtcataatat tgaagtctta 300

tgatcttggt taatctttgt tgttgttacc accaggaaat gagacatttg agaagcttgg 360

gatcattgga acactatcaa accttctggt ttatttaact tctgtcttca acatgaagag 420

tgtcacagct gcaacaatca tcactgcctt tgctggcaca gtcaacttcg gaactttcgt 480

cgctgctttc ctttgcgaca cttacttcgg tcgatacaag actcttaccg ttgcggtcct 540

cgcctgtttt cttgtaaaga tccatcccct cataactctt tcttcctcta caggcaatat 600

tggtttataa cctaaaaaaa aaaatctggt tcttgttttg tagggatcac ttgcgatact 660

attgactgct gcagtcccac aactacatcc agtcccatgc ggcacagcga gctcgtgtat 720

cgggccaagt ggtggccaga tagcgtttct actgatgggt cttggaattc ttgtcgtggg 780

agcaggaggg attagaccgt gcaatctagc tttcggagct gatcagttta atccgaagag 840

cgggtcaggg aagagaggga ttgatagttt cttcaactgg tacttcttta ccttcacttt 900

cgcccagatc ttgtctctga cagtagttgt ctatgtccag tctaatgtca gttggaccat 960

cggtttaacc atcccggttg ttctaatgtt cttggcctcc gtgattttct ttgcgggtgc 1020

taagttgtat gttaagatcg aagcctcagg tagtccattg gctagcatag ctcatgttat 1080

aacggcttct atcaagaaac acaggttaga gccagtggaa cagccttggc tgaaccttta 1140

caactactac ccatcaaaat acgcaaacgc caagctcaaa tacacccaac aattcaggta 1200

aacacacact tttaaaccgg taaaaaaaca ccgttatata tatatatatt tttttttttt 1260

tgagtgaatg aatgttaaaa ttattcatat caaaactttt ttacaatgac tgcatctata 1320

gttgatatat atatacttat acaatgtctt tttttgatgc tttatgttta ctgagagaga 1380

ttcttactcg gcaggtttct cgacaaggcg gcgatcttga ctcctgaaga caagttggag 1440

gctgatggta agcctgtgaa tccgtggaat ctatgtacaa tgcaacaagt tgaagaagtg 1500

aagtgcatca tgagagtgct tcctatatgg tttgcttcat cgatctacta cttaaccatg 1560

gcgcaacaaa tgacttatcc tgtcttccaa gctctccaga gtgatcgtcg cctagggtcc 1620

ggaggtttca tgatcccggc agccacctat gttgtcttct tgatgactgg catgaccctc 1680

ttcatcatat tttatgaccg tgtcttggtt cctacattta aacgaataac cggtatagag 1740

acgggtataa cgctcttgca aagaattgga gccgggattt ttttcgcctt tttaagctta 1800

attgtctctg gtttcgtcga ggaacgtagg agaactttag cactaactca accgacactc 1860

ggtttagcgc cacggaaggg agaaatctcc tcaatgtcgg ctatgtggct gattccgcag 1920

cttgtacttg ctggtatagc cgacgcgttt ggagctattg gacagatgga gttttactac 1980

aagcagttcc ctgagaacat gaggagtttc gctggttcta tcttttacgt aggagcagga 2040

gtttcgagtt acatcagtag cttcttgatc acaacggttc acaggatgac gcagaactcg 2100

gcgggtggta attggttagc tgaggatttg aacaaaggga gattggatta cttctatttc 2160

ttgttagctg gaatcttggc agttaatttt gcttacttct tggtgatggc aagatggtat 2220

aggtacaaag gaagtgatga tgaagagaca agttatgaaa ccagtggaga tatcatcaaa 2280

gaacaagaca agaacaaagt ctga 2304

<210> 2

<211> 1839

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 2

atggagagaa agtctctaga agtcgagtct atggatcacc aaaaactttc ctccgccgtg 60

tacgatggct ctgttacggc cgttgattct gttaaagaag atgttcagga gaccaaagtc 120

gtttatagag gctggaaagt catgccttac atcattggaa atgagacatt tgagaagctt 180

gggatcattg gaacactatc aaaccttctg gtttatttaa cttctgtctt caacatgaag 240

agtgtcacag ctgcaacaat catcactgcc tttgctggca cagtcaactt cggaactttc 300

gtcgctgctt tcctttgcga cacttacttc ggtcgataca agactcttac cgttgcggtc 360

ctcgcctgtt ttcttggatc acttgcgata ctattgactg ctgcagtccc acaactacat 420

ccagtcccat gcggcacagc gagctcgtgt atcgggccaa gtggtggcca gatagcgttt 480

ctactgatgg gtcttggaat tcttgtcgtg ggagcaggag ggattagacc gtgcaatcta 540

gctttcggag ctgatcagtt taatccgaag agcgggtcag ggaagagagg gattgatagt 600

ttcttcaact ggtacttctt taccttcact ttcgcccaga tcttgtctct gacagtagtt 660

gtctatgtcc agtctaatgt cagttggacc atcggtttaa ccatcccggt tgttctaatg 720

ttcttggcct ccgtgatttt ctttgcgggt gctaagttgt atgttaagat cgaagcctca 780

ggtagtccat tggctagcat agctcatgtt ataacggctt ctatcaagaa acacaggtta 840

gagccagtgg aacagccttg gctgaacctt tacaactact acccatcaaa atacgcaaac 900

gccaagctca aatacaccca acaattcagg tttctcgaca aggcggcgat cttgactcct 960

gaagacaagt tggaggctga tggtaagcct gtgaatccgt ggaatctatg tacaatgcaa 1020

caagttgaag aagtgaagtg catcatgaga gtgcttccta tatggtttgc ttcatcgatc 1080

tactacttaa ccatggcgca acaaatgact tatcctgtct tccaagctct ccagagtgat 1140

cgtcgcctag ggtccggagg tttcatgatc ccggcagcca cctatgttgt cttcttgatg 1200

actggcatga ccctcttcat catattttat gaccgtgtct tggttcctac atttaaacga 1260

ataaccggta tagagacggg tataacgctc ttgcaaagaa ttggagccgg gatttttttc 1320

gcctttttaa gcttaattgt ctctggtttc gtcgaggaac gtaggagaac tttagcacta 1380

actcaaccga cactcggttt agcgccacgg aagggagaaa tctcctcaat gtcggctatg 1440

tggctgattc cgcagcttgt acttgctggt atagccgacg cgtttggagc tattggacag 1500

atggagtttt actacaagca gttccctgag aacatgagga gtttcgctgg ttctatcttt 1560

tacgtaggag caggagtttc gagttacatc agtagcttct tgatcacaac ggttcacagg 1620

atgacgcaga actcggcggg tggtaattgg ttagctgagg atttgaacaa agggagattg 1680

gattacttct atttcttgtt agctggaatc ttggcagtta attttgctta cttcttggtg 1740

atggcaagat ggtataggta caaaggaagt gatgatgaag agacaagtta tgaaaccagt 1800

ggagatatca tcaaagaaca agacaagaac aaagtctga 1839

<210> 3

<211> 612

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 3

Met Glu Arg Lys Ser Leu Glu Val Glu Ser Met Asp His Gln Lys Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ala Val Tyr Asp Gly Ser Val Thr Ala Val Asp Ser Val Lys

20 25 30

Glu Asp Val Gln Glu Thr Lys Val Val Tyr Arg Gly Trp Lys Val Met

35 40 45

Pro Tyr Ile Ile Gly Asn Glu Thr Phe Glu Lys Leu Gly Ile Ile Gly

50 55 60

Thr Leu Ser Asn Leu Leu Val Tyr Leu Thr Ser Val Phe Asn Met Lys

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Thr Ile Ile Thr Ala Phe Ala Gly Thr Val Asn

85 90 95

Phe Gly Thr Phe Val Ala Ala Phe Leu Cys Asp Thr Tyr Phe Gly Arg

100 105 110

Tyr Lys Thr Leu Thr Val Ala Val Leu Ala Cys Phe Leu Gly Ser Leu

115 120 125

Ala Ile Leu Leu Thr Ala Ala Val Pro Gln Leu His Pro Val Pro Cys

130 135 140

Gly Thr Ala Ser Ser Cys Ile Gly Pro Ser Gly Gly Gln Ile Ala Phe

145 150 155 160

Leu Leu Met Gly Leu Gly Ile Leu Val Val Gly Ala Gly Gly Ile Arg

165 170 175

Pro Cys Asn Leu Ala Phe Gly Ala Asp Gln Phe Asn Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Ser Gly Lys Arg Gly Ile Asp Ser Phe Phe Asn Trp Tyr Phe Phe Thr

195 200 205

Phe Thr Phe Ala Gln Ile Leu Ser Leu Thr Val Val Val Tyr Val Gln

210 215 220

Ser Asn Val Ser Trp Thr Ile Gly Leu Thr Ile Pro Val Val Leu Met

225 230 235 240

Phe Leu Ala Ser Val Ile Phe Phe Ala Gly Ala Lys Leu Tyr Val Lys

245 250 255

Ile Glu Ala Ser Gly Ser Pro Leu Ala Ser Ile Ala His Val Ile Thr

260 265 270

Ala Ser Ile Lys Lys His Arg Leu Glu Pro Val Glu Gln Pro Trp Leu

275 280 285

Asn Leu Tyr Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Tyr Ala Asn Ala Lys Leu Lys

290 295 300

Tyr Thr Gln Gln Phe Arg Phe Leu Asp Lys Ala Ala Ile Leu Thr Pro

305 310 315 320

Glu Asp Lys Leu Glu Ala Asp Gly Lys Pro Val Asn Pro Trp Asn Leu

325 330 335

Cys Thr Met Gln Gln Val Glu Glu Val Lys Cys Ile Met Arg Val Leu

340 345 350

Pro Ile Trp Phe Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Leu Thr Met Ala Gln Gln

355 360 365

Met Thr Tyr Pro Val Phe Gln Ala Leu Gln Ser Asp Arg Arg Leu Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Phe Met Ile Pro Ala Ala Thr Tyr Val Val Phe Leu Met

385 390 395 400

Thr Gly Met Thr Leu Phe Ile Ile Phe Tyr Asp Arg Val Leu Val Pro

405 410 415

Thr Phe Lys Arg Ile Thr Gly Ile Glu Thr Gly Ile Thr Leu Leu Gln

420 425 430

Arg Ile Gly Ala Gly Ile Phe Phe Ala Phe Leu Ser Leu Ile Val Ser

435 440 445

Gly Phe Val Glu Glu Arg Arg Arg Thr Leu Ala Leu Thr Gln Pro Thr

450 455 460

Leu Gly Leu Ala Pro Arg Lys Gly Glu Ile Ser Ser Met Ser Ala Met

465 470 475 480

Trp Leu Ile Pro Gln Leu Val Leu Ala Gly Ile Ala Asp Ala Phe Gly

485 490 495

Ala Ile Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Lys Gln Phe Pro Glu Asn Met

500 505 510

Arg Ser Phe Ala Gly Ser Ile Phe Tyr Val Gly Ala Gly Val Ser Ser

515 520 525

Tyr Ile Ser Ser Phe Leu Ile Thr Thr Val His Arg Met Thr Gln Asn

530 535 540

Ser Ala Gly Gly Asn Trp Leu Ala Glu Asp Leu Asn Lys Gly Arg Leu

545 550 555 560

Asp Tyr Phe Tyr Phe Leu Leu Ala Gly Ile Leu Ala Val Asn Phe Ala

565 570 575

Tyr Phe Leu Val Met Ala Arg Trp Tyr Arg Tyr Lys Gly Ser Asp Asp

580 585 590

Glu Glu Thr Ser Tyr Glu Thr Ser Gly Asp Ile Ile Lys Glu Gln Asp

595 600 605

Lys Asn Lys Val

610

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 4

cacggcggag gaaagttttt gg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 5

aaacaggcga ggaccgcaac gg 22

Claims

1.一种基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转入甘蓝型油菜能够获得种子中总硫苷含量降低的甘蓝型油菜材料，其特征在于，所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体对甘蓝型油菜BnaA09.GTR2基因进行定向编辑，所述BnaA09.GTR2基因的基因组区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；在甘蓝型油菜BnaA09.GTR2外显子区域选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶位点；

所述靶位点的一条链具有5’-(N)XNGG-3’结构，其中(N)X中的X表示数目为X的一条碱基序列，(N)X中的N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，X为19或20；所述靶位点序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。

2.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中转入了权利要求1所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体。

3.权利要求1所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体在降低油菜种子中总硫苷含量中的应用，其特征在于，将所述基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体转化微生物培养表达，转化目标植物，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体，所述转化方式为农杆菌介导、花粉管通道法、基因枪法、显微注射法中的任意一种。

4.一种降低油菜种子中总硫苷含量的方法，其特征在于，所述方法包括在油菜中转入权利要求1所述的基因定向编辑CRISPR/Cas9重组载体，获得BnaA09.GTR2基因敲除突变体。