CN111349636A - 一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用。该基因位于2号染色体上，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码一个叶绿体、线粒体定位的MTP家族蛋白MTPC4，负责质体铁的外排，所述蛋白MTPC4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因的6个等位突变体分别在3‑10号外显子上存在G>A的变异。通过对该基因突变体研究，发现该基因是一个铁特异性转运蛋白，突变将造成玉米种子铁的积累，ROS积累增强，导致线粒体呈现铁死亡的特征，进而导致玉米胚乳部分损失，影响种子灌浆及降低玉米种子重量。阐明该基因通过影响玉米种子铁吸收及分布进而影响种子发育及种子灌浆的功能。

Description

一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用。

背景技术

种子灌浆是一个重要的生物学过程，玉米作为主要粮食、饲料及工业原料，在我国国民经济中占有重要的地位。尽管玉米作为我国第一大作物，种植面积全世界第一，却依旧难以满足玉米在全球范围内不断上涨的需求量。玉米的产量是受多基因调控的复杂数量性状，主要取决于粒重和穗粒数，而灌浆是影响粒重的重要因素，灌浆是指将光合作用产生的淀粉、蛋白质和积累的有机物质通过同化作用储存在种子中的过程，研究发现谷物干重基本与灌浆时间呈线性增长关系，表明种子粒重受灌浆速率和持续时间的影响，灌浆速率快、持续时间长的品种，种子就越饱满，百粒重也越高。种子灌浆是一个复杂的生理代谢过程，受多基因调控，具有复杂的遗传效应；同时还受光照、温度、水分、矿质元素、金属离子转运等多种因素的协同影响，表现出复杂的动态变化特征。目前玉米种子灌浆(图1)的研究主要集中在淀粉和蛋白的合成、积累，胚乳细胞的发育以及蔗糖转运等方面，但在矿质元素、金属离子转运协同调控方面的研究还很少，完整的灌浆调控机制仍需进一步深入研究。

淀粉合成缺陷影响种子灌浆：玉米种子胚乳中含有约70％的淀粉，淀粉是种子干重的主要构成部分。淀粉作为灌浆过程中主要的同化物，也是植物中重要的碳水化合物储存介质，淀粉合成是一个复杂的过程，涉及一系列生物合成酶的共同作用(图1，2)。蔗糖合酶SUS是调控种子灌浆的关键酶，SUS催化蔗糖裂解成果糖和UDP-葡萄糖，为淀粉合成提供原料，SUS活性与灌浆速率和淀粉积累量显著相关，在灌浆早期，优质种子的SUS活性高于的劣质种子，Tang等研究发现谷粒中蔗糖及ABA浓度的增加可增强种子中SUS活性和SUS蛋白的表达。ADP葡萄糖焦磷酸化酶AGPase是催化所有高等植物淀粉生物合成途径中的一个关键酶，玉米中AGPase的大亚基(LSU)突变后产生种子灌浆不饱满突变体shrunken2(sh2)，小亚基(SSU)突变后也会造成类似表型的突变体brittle2(bt2)。颗粒结合淀粉合成酶GBSS有两种类型，GBSSI主要在贮藏组织如种子胚乳中发挥作用，GBSSII在瞬时淀粉的积累及非贮藏植物组织中起作用，谷类作物中的GBSSI由Waxy(wx)基因编码，在水稻、玉米、大麦、小麦中，一旦Wx突变后将导致直链淀粉含量降低甚至完全缺失。淀粉分支酶BE也称为Q-酶，通过切割α-1,4-葡聚糖键并通过α-1,6-葡聚糖键重新连接来形成分支点，玉米ae1突变体内BE酶的缺失，使支链淀粉产量减少，导致直链淀粉积累高达50％。淀粉脱支酶DBE有两类，异淀粉酶(ISA)及支链淀粉酶(PUL)，两类酶通过水解1,6-葡萄糖键发挥作用，ISA主要去除植物糖原和支链淀粉，PUL仅作用于支链淀粉。水稻ISA1突变体su1支链淀粉生物合成降低，可能与DP12支链淀粉的比例下降有关。

玉米种子灌浆相关基因的研究进展：玉米中Mn1(Miniature 1)编码胚乳特异性细胞壁转化酶2(INCW2)，INCW2蛋白完全定位于基部胚乳转移细胞BETL，INCW2的主要生理功能是水解蔗糖，代谢释放的己糖。相对于正常发育的种子，mn1突变体中的基部胚乳的葡萄糖、果糖和山梨糖醇水平大大降低，蔗糖水平增加。另外，与mn1表型相似的Rgf1(Reducedgrainfilling 1)也在玉米种子基部胚乳转移细胞中特异表达，rgf1为一种有种子发育缺陷的突变体，厚壁细胞层(TWCL)缺失，导致粒重降低30％，rgf1种子具有不完整的纸质果皮的小胚乳，但胚发育不受影响，突变使花梗发育缺陷并大大降低基因在胚乳转移层的表达。虽然rgf1与mn1突变体表型十分相似，等位验证表明这两者由不同的基因调控(图3)。

种子必须高效地从成熟组织中吸收营养物质，以促进自身的发育。在玉米驯化的过程中，种子的大小是人们选育过程重点关注的性状，但糖类代谢和转运能力相关的研究却较少。研究表明可溶性糖转运到发育中种子的转运能力决定了种子细胞的大小和数目，最终影响种子的大小。SWEET通过介导己糖转运调控了种子灌浆过程，ZmSWEET4c编码一类糖转运蛋白，负责将韧皮部运输的糖类转运至周边的库器官，原位杂交及酵母缺陷互补实验表明该基因在转移层细胞膜上特异表达，介导葡萄糖和果糖等六碳糖向种子内部转运，SWEET基因的Mu转座子插入突变体zmsweet4c-umu1表现为“空果皮”的表型，即胚乳较胚与野生型相比变得更小，但胚仍能发育成一个可育的个体，表明ZmSWEET4c特异地影响种子的灌浆过程(图4)。比较发现ZmSWEET4c启动子序列在玉米和玉蜀黍中存在较大的差异，并在种子中高丰度表达，表明该基因可能是玉米驯化过程中的一类重要的糖类代谢或转运功能位点，参与调控种子的灌浆过程。

金属耐受蛋白家族(MTP)研究进展：植物需要金属离子时，根会从土壤表面吸收，并经过维管系统转移到叶片、果穗、种子中。当植物面对土壤和环境中过量金属离子的胁迫时，为防止重金属中毒带来的电子传递破坏，叶绿体膜受损，活性氧(ROS)增加，脂质过氧化、生物大分子退化、膜分解、离子泄漏和DNA链断裂等后果，植物依靠一系列防御机制来控制这些危险元素的吸收、积累和迁移，并通过排出细胞质中的游离离子形式来解毒。锌、锰、铁等二价金属微量元素对植物的新陈代谢和发育至关重要。阳离子扩散促进剂(Cationdiffusion facilitator，CDF)家族蛋白是二价金属阳离子转运蛋白，负责金属离子的稳态，该家族在植物中称为金属耐受蛋白家族(Metal tolerance protein，MTP)，MTP蛋白可将金属离子封存到液泡或囊泡中，也可通过细胞排出到胞外区域，在植物金属离子耐受和金属解毒方面发挥着关键作用。

植物MTP家族包括12个成员，根据金属特异性可分为三个不同的系统发育亚组：Zn-CDF，Fe/Zn-CDF和Mn-CDF亚组。这三个亚组分别承担不同的金属离子转运，Zn-CDF主要包括MTP1、2、3、4、5和12成员，负责Zn的转运；Fe/Zn-CDF主要包括MTP6和MTP7成员，负责Fe或者Fe、Zn转运；Mn-CDF主要包括MTP8、9、10和11成员，负责Mn、Fe的转运。Zn-CDF的MTP1定位在质膜或液泡膜上，MTP3定位在液泡膜上，在缺铁和锌供应过剩的情况下，可通过调节外排锌来维持金属稳态。细菌和酵母的MTP蛋白属于Fe/Zn-CDF；植物Fe/Zn-CDF家族仅有黄瓜MTP7蛋白得到验证，CsMTP7是一种线粒体转运蛋白，参与线粒体中铁的增加。Mn-CDF亚组的CsMTP8均定位在液泡膜上，CsMTP8参与了黄瓜根细胞内Mn稳态的维持；OsMTP11定位于高尔基体，AtMTP11定位于液泡膜前质体(PVC)，在减轻Mn毒性方面具有重要作用。

铁在地壳中的含量丰富,但地球上许多生物的生存却受缺铁在土壤中溶解度低的限制。铁作为植物的营养元素之一，其缺乏会影响植物的生长，植物缺铁不仅影响植物的生长发育,造成巨大的经济损失,而且也影响动物和人类对铁的获取,从而导致许多缺铁性疾病的发生，人类铁营养的缺乏已经成为当今世界严重的营养缺素症之一。但植物作为一个不可自然移动的单元，铁富集过量时也会破坏植物体内铁的平衡和稳态而受到铁毒害，导致植物过氧化增加，电子传递链受到破坏，同时还会引发植物的铁死亡。铁死亡(Ferroptosis)作为一种新的细胞死亡形式最早是2012年由Brent R.Stockwell团队在研究肿瘤时提出的。此前的研究发现Erastin(一种铁死亡激活剂，通过作用于线粒体外膜电压依赖性阴离子通道而起作用)可以特异性诱导携带致癌基因RAS的肿瘤细胞死亡，Erastin处理后的细胞没有典型的细胞凋亡特征，但对其作用机制认识还不清楚。BrentR.Stockwell团队发现，当细胞胱氨酸运输蛋白受到抑制(如Erastin)，胞内谷胱甘肽(GSH)会被耗尽，最终导致谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)的失活，导致脂质过氧化积累，达到一定程度即可诱发细胞死亡，GPX4酶(谷胱甘肽过氧化物酶4)抑制剂(如RSL3)也可以直接导致这一作用，铁离子螯合剂可以抑制这一过程。与经典的细胞凋亡不同，铁死亡过程中没有细胞皱缩，染色质凝集等现象。但会出现线粒体皱缩且膜密度增高，嵴减少的典型特征(图5)，细胞内也会出现脂质过氧化及ROS增加，一些特征基因表达发生变化的现象。传统的细胞凋亡，细胞自噬，细胞焦亡的抑制剂不能抑制铁死亡过程，但铁离子螯合剂可以抑制这一过程，说明铁死亡是铁离子依赖的过程。Nam-Soo Jwa在水稻-稻瘟病菌中报道了FerroptoticHR细胞死亡的作用机制(图6)，表明铁和ROS参与水稻的HR细胞死亡，且NADP-苹果酸酶2对Ferroptotic细胞死亡是必不可少的。

因此，本发明可通过铁富集玉米的研究为全球铁膳食营养强化提供新思路，为铁生物强化研究和利用提供理论依据。截至目前关于MTP家族蛋白介导种子灌浆的研究还未见报道，我们通过图位克隆获得了一个玉米种子铁营养强化及灌浆缺陷表型的基因(详见本发明具体实施方式)，该基因编码MTP家族蛋白，在玉米种子中该类蛋白的转运底物是哪种金属离子，该基因在种子灌浆过程的调控作用等都未知，对其开展系统、深入的研究非常必要。因此，深入开展玉米种子铁营养强化及灌浆基因的克隆、功能鉴定、调控机理的研究，探究其通过改变种子灌浆特性调控粒重，进而提高玉米产量，对种子性状改良及高产育种具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用，该基因是一个铁特异性转运蛋白，突变会引起玉米种子铁含量的积累，但铁平衡失调会导致ROS积累增强，进一步导致线粒体呈现铁死亡的特征，导致玉米胚乳部分损失及玉米种子重量的降低。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1，其位于2号染色体上，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

可选地，编码一个叶绿体定位的MTP家族蛋白MTPC4。

可选地，所述蛋白MTPC4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1的突变体，包括突变体qk1，qk1-1，qk1-2，qk1-3，qk1-4，qk1-5，qk1-6，分别在3-10号外显子上存在G>A的变异。

可选地，本发明以突变体qk1为实例，该突变体在4号外显子上存在一个G>A的变异，编码氨基酸由甘氨酸转变为天冬氨酸。

本发明还公开了一种含有上述的玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1的表达载体。

本发明还公开了一种上述的调控玉米种子灌浆调控基因ZmQK1在控制植株淀粉合成中的应用。

本发明还公开了一种上述的调控玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1在经济作物育种改良领域中的应用。

本发明还公开了一种上述的调控玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1在种子铁含量及铁营养强化中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明克隆了一个新的调控玉米种子灌浆的编码MTP蛋白的基因ZmQK1，同时获得了该基因的不同突变类型的突变体qk1，qk1-1，qk1-2，qk1-3，qk1-4，qk1-5，qk1-6，明确了ZmQK1基因的不同类型的变异都会导致种子灌浆缺陷，造成玉米产量降低。

2)在同化器官中，该基因主要在叶绿体及线粒体中行使功能，在发育的种子中，该基因在整个种子行使功能，其编码的蛋白MTPC4是一个铁特异性转运蛋白，调控胞内质体铁的转运，影响种子中铁的积累，进而影响胚乳细胞的离子平衡。

3)本发明ZmQK1的编码区序列变异将导致MTPC4蛋白质的序列及功能出现问题，造成玉米种子铁的过量积累，破坏种子中铁的平衡，引发ROS积累增强，进一步导致线粒体呈现铁死亡的特征，导致玉米胚乳部分损失，影响种子灌浆，产生灌浆缺陷型种子。

4)本发明为铁平衡在种子灌浆中的重要性提供了新的见解，高铁积累qk1突变体的鉴定也为选育高铁含量玉米提供了新的遗传资源，将该等位基因导入甜玉米以提高其铁含量是一种潜在的策略。考虑到甜玉米淀粉积累受阻，用qk1进行甜玉米育种时，qk1淀粉积累效率低下所造成的产量损失可能不显著。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明背景技术中的同化物产生运输及淀粉合成模式图；

图2是本发明背景技术中淀粉合成详细途径；

图3是本发明背景技术中mn1及rgf1突变体表型及等位验证；；

图4是本发明背景技术中zmsweet4c-umu1突变体表型；

图5是本发明背景技术中铁死亡的线粒体特征；a，c为正常细胞线粒体，b，d为铁死亡的线粒体；

图6是本发明背景技术中水稻-稻瘟病菌相互作用中铁和ROS依赖性Ferroptotic细胞死亡模型；

图7是本发明qk1突变体表型；a-c为植株(a)，果穗(b)和种子(c)的表型比较，每张图片的左侧为野生型，右侧为突变体qk，深色三角形表示表型变异的位置；d为成熟种子百粒重比较；采用student’s t-test，n为组内重复，p为显著性检验；

图8是本发明石蜡切片观察不同发育阶段种子；15DAP时即可观察到种皮下缺陷的胚乳，箭头指示缺陷的部位。甲苯胺蓝缓冲液(TBO)染色。标尺：2mm。

图9是本发明15DAP石蜡切片和种子碘染色。15DAP WT(a)和qk1(b)的碘染色结果表明qk1胚乳中积累的淀粉较多。染色越深，淀粉含量越高。白色箭头表示淀粉积累受到影响的位置。15DAP WT(c)和qk1(d)胚乳细胞石蜡切片分析发现qk1中的淀粉体比WT少。深色小圆点代表淀粉体，网状不规则线代表细胞骨架。图的左下角显示了整种子。

图10是本发明不同发育阶段种子的扫描电镜分析。qk1淀粉体的形态和结构与WT相似。

图11是本发明qk1图位克隆及该基因不同变异类型突变体。a，qk1的图位克隆。ID：Indel标记，SSR：简单重复序列标记。开放式阅读框。N，所用F₂单株数；b，qk1及6个不同等位基因的基因结构和突变位点。每个等位基因下都标出了氨基酸的变化；c，qk1及6个等位基因的成熟果穗。6个等位突变体位点均表现出与qk1相似的灌浆缺陷表型。标尺：2cm。

图12是本发明蛋白质跨膜结构变异位点分析。QK1有7个跨膜结构域。QK1和QK1-1到QK1-6等位基因突变位点均分布在膜或膜内。

图13是本发明用最大似然法对ZmMTPC4进行系统发育分析。数值表示自展值，表示每个分支的可信度。ZmMTPC 4蛋白和CsMTP 7(已报道的ZmMTPC 4的同源基因)用方框进行了标记，同一分支的两个同源基因分别为SbMTP 7(高粱)和OsMTP 7(水稻)。

图14是本发明QK1的表达模式分析。a，QK1在13DAP和15DAP表达较高。18s rRNA作为内参。对于每组RNA样本，每个阶段进行三次生物学重复。误差线用SD分析的结果表示。b，QK1-eGFP在玉米原生质体中的瞬时表达的亚细胞定位结果。从上到下：分别观察QK1-eGFP融合蛋白在叶绿体平面和在线粒体平面的共定位；从左至右：明场图像、eGFP融合蛋白信号、叶绿素自身荧光或线粒体荧光染色(Mito-tracker-red)信号、合并图像。高亮部分为信号叠加的结果。标尺：10μm。

图15是本发明不同金属胁迫培养基上酵母突变体互补试验。WT+pYES2：野生型BY4741(酿酒酵母)用空pYES2载体转化；---Δ+pYES2：相应酵母突变体用空pYES2载体转化。---Δ+pYES2-ZmQK1：相应酵母突变体转化表达ZmQK1的pYES2，---Δ+pYES2-Zmqk1：相应酵母突变体转化为表达Zmqk1突变体基因的pYES2。zrc1Δ(锌敏感型)，cup2Δ(铜敏感型)，ycf1Δ(镉敏感型)，smf1Δ(镍敏感型)SCG培养基：含2％半乳糖的SC培养基。1、10^-1、10^-2、10^-3表示稀释倍数。

图16是本发明QK1的功能分析。a，不同铁含量选择性培养基上酵母突变体互补试验。WT+pYES2：野生型BY4741(酿酒酵母)用空pYES2载体转化；ccc1Δ+pYES2：耐铁酵母突变体ccc1Δ用空pYES2载体转化。ccc1Δ+pYES2-ZmQK1：ccc1Δ突变体转化为表达ZmQK1的pYES2，ccc1Δ+pYES2-Zmqk1：ccc1Δ突变体转化为表达Zmqk1突变体基因的pYES2。SCG培养基：含2％半乳糖的SC培养基。1、10^-1、10^-2、10^-3表示稀释倍数。标尺：1cm。b，用种子萌发袋对WT(b)和qk1(c)进行水培。图片左侧为纯水培养对照组，右侧为500μM铁(II)培养处理组。标尺：10cm。d，主根长度的比较。采用student’s t-test。e，突变体qk1，等位突变qk1-1及野生型铁含量的测定。采用student’s t-test。f，普鲁士蓝染色表明qk1在25DAP种子中的铁积累量高于WT，白色箭头和白色虚线表示铁(II)染色的部位，着色更深。标尺：5mm。g，用DAB法和NBT法分别检测到18DAP的qk1中过氧化氢(g)和超氧化物(h)的积累高于WT。标尺：5mm。i-l，13DAP的WT(i，k)和qk1(j，l)胚乳发育的透射电镜观察。白色箭头表示qk1线粒体异常(j)，qk1的核结构无明显变化(l)。M:线粒体、N:核、SB：淀粉体相似。标尺：5μm。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1qk1突变体表型观察

在大田育种过程中，我们以西南优良自交系RP125为育种材料进行EMS诱变，发现一个纯合的种子灌浆缺口材料，将其命名为quekou 1(ZmQK1)，经多代自交发现其性状稳定，与野生型材料相比，突变体株型、果穗大小及种子大小未发生明显变化(图7a，7b)，但成熟种子顶部特定部位种皮下缺少胚乳细胞而变成透明状，出现由种子灌浆缺陷和胚乳缺失导致的缺口(图7c)。统计发现突变体籽粒百粒重较野生型显著下降(图7d)。

对不同发育时期进行石蜡切片观察，结果表明，野生型胚发育成熟，胚各部分的结构分化明显，且形态正常，突变体胚乳灌浆充实，结构整齐。而突变体qk1的肧及胚乳结构松散，切片时易破碎，qk1种子灌浆缺陷在15DAP才开始出现并增强，表型出现部位的胚乳细胞则随着种子成熟而死亡消失，在种子顶部种皮下形成空腔，造成种子缺口表型(图8)。

将表型出现(15DAP)时的种子纵切后用KI染色(淀粉遇碘呈显色反应)发现，野生型淀粉积累较多，分布在种子胚乳不同部位的细胞中，而突变体淀粉积累较少，主要分布在种子顶部，种子中下部几乎无淀粉积累(图9a，9b)。细胞学观察也得到了同样的结果，qk1(图9d)该部位淀粉积累少于野生型(图9c)，部分细胞无淀粉积累，胚乳结构松散，切片时易破碎。

进一步进行扫描电镜发现，与野生型相比，qk1胚乳细胞内的淀粉粒形态及大小并未发生明显改变(图10)。由此可见，ZmQK1突变后导致种子灌浆缺陷，未灌浆的部分胚乳细胞则死亡消失，粒重减小，但淀粉粒形态及大小并未发生明显改变。

实施例2ZmQK1突变基因的克隆

(1)构建定位群体：本发明构建了两个初级定位群体用于基因定位，将qk1与B73杂交后的F₁自交获得F₂分离群体，经表型鉴定共确定粒613个与突变体表型一致的种子，正常种子为1746粒，经卡方检验(χ²)可知，其χ² _c＝1.17<3.84_2(0.05,1)，差异不显著，符合单基因控制的孟德尔分离定律。同时将F₁材料与qk1回交构建BC群体，经表型鉴定共确定了362个与突变体表型一致的种子，正常种子为401粒，经卡方检验(χ²)可知，其χ² _c＝1.89<3.84² _(0.05,1)，差异不显著，符合单基因控制的孟德尔分离定律，该突变表型为单基因控制的隐性性状。

(2)突变体BSA混池筛选

设计合成基因组SSR引物(表1)，利用B73及qk1作为亲本筛选，选出亲本有差异的多态性引物。提取B73与qk1定位群体单株的DNA，选择20株隐性单株(突变表型)DNA构建混池，同时提取B73与qk1定位群体20株正常表型单株DNA构建混池，利用B73、qk1、隐性混池、显性混池用于筛选多态标记。选择隐性混池与qk1带型一致的分子标记，这些标记与目标基因连锁。

表1目标基因附近多态性引物序列

(3)突变体基因定位

用筛选到的BSA连锁的SSR标记检测了93个F₂定位群体单株，统计F₂群体交换率，将基因初步定位在ID-7755(2.68％)与ID-8378(1.07％)之间。在这两个标记之间开发新标记(表2)，新增定位群体单株数(882株)，PCR扩增及电泳检测F₂交换情况，最终将区段定位在ID-8067(0.054％)至ID-8178(0.107％)之间，区段大小为631.26Kb(图11a)。

表2精细定位分子标记

(4)突变基因克隆

根据定位结果结合本课题组前期测序组装的RP125基因组序列，搜索区段内编码基因，发现区段内共有4个ORFs，分别为Zm00001d004090，Zm00001d004091，Zm00001d004092，Zm00001d004093(图11a)，设计引物扩增、测序，序列比对发现4个ORFs仅Zm00001d004091的4号外显子存在一个G>A的非同义突变，该变异使编码的第177位氨基酸由甘氨酸转变为天冬氨酸，推测该基因即为导致突变体种子灌浆缺陷表型的基因ZmQK1(图11b)。ZmQK1全长28078bp，13个外显子，共6个转录本，最长转录本共有1754bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。从我们的EMS突变体库中进一步鉴定出6个与ZmQK1表型相似的等位基因(qk1-1至qk1-6)，表型与qk1类似(图11c)，这证实了我们克隆了正确的基因。蛋白跨膜分析发现这些等位变异分布在不同的跨膜结构域，但均分布在膜上或者膜内侧(图12)。

表3定位区段内的全部编码基因

表4突变基因扩增及定量PCR引物

基于系统发育分析和蛋白质比对，ZmQK1被预测为编码474个氨基酸(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的金属耐受蛋白MTPC4(Metal tolerance protein C4)，属于MTP家族的与MTP6、MTP7同分支的Fe/Zn转运蛋白。黄瓜(CsMTP7)中的ZmMTPC4同源物(图13)被报道作为铁的转运蛋白，能够赋予酵母对铁过量的耐受性。

实施例3ZmQK1的表达分析

qRT-PCR分析结果显示ZmQK1为在授粉后13DAP、15DAP的种子之中表达量较高(图14a)。将该基因连接到含有GFP标签的亚细胞定位载体pM999中，转化玉米原生质体进行瞬时表达，观察其定位信号。结果表明ZmQK1蛋白定位于叶绿体及线粒体上(图14b)，推测其在叶绿体和线粒体中发挥功能。

表5 ZmQK1亚细胞定位引物

实施例4ZmQK1的功能分析

为了寻找QK1的转运底物，我们进行了酵母突变体互补实验。我们对一系列对不同金属敏感型的酿酒酵母(BY4741)突变体进行了异源表达。结果表明，QK1在高铁培养基上回补了ccc1Δ(铁敏感型)突变体的生长(图16a，表6)，但没有任何其他突变体，如zrc1Δ(锌敏感型)，cup2Δ(铜敏感型)，ycf1Δ(镉敏感型)，或smf1Δ(镍敏感型)在相应金属胁迫下生长(图15，表6)，表明玉米QK1是一个铁特异性转运蛋白。

对苗龄5-7d的幼苗进行铁胁迫处理，对照组以霍格兰半营养液，实验组再添加500μM的亚铁盐，正常光周期，28℃条件下胁迫下3-4d。结果发现，在野生型材料ZmQK1中，铁处理前后差异不明显，但主根长微短于对照(图16b，16d)，而在qk1突变体中，施用500μM的铁盐会显著抑制根系发育及主根伸长(图16c，16d)。这表明玉米qk1突变体的根系受到铁的抑制更为严重，突变体对高铁胁迫更为敏感。

进一步通过ICP-MS测量种子总铁含量，我们发现qk1及qk1-1种子中积累的铁含量显著高于WT(图16e)。为了解析铁在发育核种子中的分布规律，我们进行了普鲁士蓝染色。结果表明，在25DAP及后期，qk1表型出现部位胚乳可以检测到更多铁的积累，而在WT中则不可见(图16f)，表明ZmQK1功能丧失导致qk1胚乳中铁的积累增加。

有趣的是，我们发现qk1种子中的过氧化氢和超氧化物含量分别比WT高，这表明qk1铁稳态的破坏可能进一步触发活性氧物种积累的增加(图16g，h)。为了进一步剖析qk1细胞铁积累过多所造成的后果，我们用透射电镜观察了细胞形态。我们发现qk1的线粒体变得异常，体积变小，膜密度增加，线粒体嵴减少或消失，外膜断裂(图16i，j)，而qk1细胞核完整，没有可见的染色质凝结(图16k，l)。这些细胞特征共同类似于铁依赖性细胞死亡的现象。综上所述，我们的数据表明，铁的高积累导致胚乳中ROS的爆发和细胞的铁死亡，从而导致胚乳表型的部分缺失。

表6酿酒酵母突变体订购

综上，本发明鉴定并克隆了MTP家族基因ZmQK1，ZmQK1可直接影响籽粒内铁的富集。通过对ZmQK1突变体的研究表明ZmQK1突变会造成玉米种子铁的过量积累，破坏种子中铁的平衡，引发ROS积累增强，进一步导致胚乳线粒体呈现铁死亡的特征，导致玉米胚乳部分损失，影响种子灌浆及降低玉米种子重量。阐明该基因通过影响种子铁吸收及分布调控玉米胚乳发育和种子灌浆，影响种子粒重。

大量研究表明蔗糖、淀粉和玉米醇溶蛋白的合成、运输和积累会影响种子灌浆，而我们对ZmQK1的研究则为铁平衡在种子灌浆中的重要性提供了新的见解。人类缺铁是一个全球性的普遍问题，缺铁会引发包括贫血在内的多种疾病。高铁积累qk1突变体的鉴定也为选育高铁含量玉米提供了新的遗传资源。将该等位基因导入甜玉米以提高其铁含量是一种潜在的策略。考虑到甜玉米淀粉积累受阻，用qk1进行甜玉米育种时，qk1淀粉积累效率低下所造成的产量损失可能不显著。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 山东农业大学 四川农业大学

<120> 一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1及应用

<130> 2018

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1754

<212> DNA

<213> 玉米(corn)

<400> 1

agtctcggag agtcgctccg aggaatggga gtcgtgcccc accggcggca gcagcaccgg 60

tgacgccggc acgcctaaat gcgtcgtccc ctcgcctctg cggccctccg cctccgcttc 120

ttctcttcca cctcccctgc ccgccttctc tcgccctgcc cattccttct atcccgccgt 180

gacgacgacg gcggccgcga ggcctcctcg tcgccgctgc ccccgctccc gccttctggc 240

tcggctttct ccccacgccc gctcctcttc tctgcatcag ctgccgcggg cctcttcagc 300

ctccatggcg ggtggtggag gcaggctctt cctcctgcag cgtcgcggcc cctcggctcc 360

gtctctgacg cagctcccgt ccggctcacc atctcccgca gttattctct gcgtgtggcc 420

aagggcaaga agaaagcaca ttttgacgat gaacacagcc atcgagcggt taacatggca 480

ctatggtgca acttcctcgt tttctcccta aagtttggag tgtggatttc aacttcaagt 540

catgttatgc tagctgagct tgtgcattct gttgcagact ttgctaacca ggctcttctt 600

gcttatggtt tgagcagctc aagacgtgct ccagatgctc tacaccccta tggttattct 660

aaggaaagat ttgtatggtc tctcatatct gcagttggaa tattttgctt gggttccggt 720

gctacaattg tgcatggagt tcaaaattta tggaattctc atcctccaga gaatattcac 780

tgggctgcat tagtgattgg tgggtccttc ctaattgaag gtgcttcact gcttgttgct 840

ataaaggctg ttaggaaagg tgcagaagca gagggaatga gtatctggga ctatatctgg 900

cgtggtcatg atccaacttc cgttgctgtt atgactgaag atggtgctgc tgttacaggc 960

cttgctattg ctgcagcatc tttggtagct gttcaaatga caggaaatgc tatgtatgat 1020

ccaattggct caatcattgt tggcaattta ctggggatgg ttgctatttt tctcattcag 1080

aggaataggc atgctttaat tggccgggcc attgatgatc atgacatgca acgagtcctt 1140

gaatttctga agtctgatcc ggttgtagat gctctttatg attgcaaaag tgaggtgatt 1200

gggccaggtt tttttagatt caaggctgaa attgatttca atggagttgt tctggtacaa 1260

aattatttgg aaaggactgg acgtgggagt tgggcaaaac agttccggga agctgcaatg 1320

tccaaggatg atacggaatt gctaagggtc atggccaact acggggagga tgtagttgaa 1380

gctctgggat atgaagtgga tcggctggag tctgagatcc aaaagcttgt gcctgggatt 1440

aaacatgttg acatcgaggc acacaatccc gaaggacttg ctcttagagc agaagttttg 1500

tagattacct gtgtacattg catttgatta acactgttgc tggtcgctgc cagtttgatt 1560

tgggtccacc accattcgat aagattgtct tccattggca atgtaagaat cagatggctg 1620

ttgttgcgta gcgaggcggt atttttattt ggaagaagac gtggtcgcgc ctgacatgga 1680

aggctttatg ttcaaggttg gcatcagtat gtatttttgc cttgcgatgc agtcccataa 1740

gtattactcc ctcc 1754

<210> 2

<211> 474

<212> PRT

<213> 玉米(corn)

<400> 2

Met Arg Arg Pro Leu Ala Ser Ala Ala Leu Arg Leu Arg Phe Phe Ser

1 5 10 15

Ser Thr Ser Pro Ala Arg Leu Leu Ser Pro Cys Pro Phe Leu Leu Ser

20 25 30

Arg Arg Asp Asp Asp Gly Gly Arg Glu Ala Ser Ser Ser Pro Leu Pro

35 40 45

Pro Leu Pro Pro Ser Gly Ser Ala Phe Ser Pro Arg Pro Leu Leu Phe

50 55 60

Ser Ala Ser Ala Ala Ala Gly Leu Phe Ser Leu His Gly Gly Trp Trp

65 70 75 80

Arg Gln Ala Leu Pro Pro Ala Ala Ser Arg Pro Leu Gly Ser Val Ser

85 90 95

Asp Ala Ala Pro Val Arg Leu Thr Ile Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Arg

100 105 110

Val Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ala His Phe Asp Asp Glu His Ser His

115 120 125

Arg Ala Val Asn Met Ala Leu Trp Cys Asn Phe Leu Val Phe Ser Leu

130 135 140

Lys Phe Gly Val Trp Ile Ser Thr Ser Ser His Val Met Leu Ala Glu

145 150 155 160

Leu Val His Ser Val Ala Asp Phe Ala Asn Gln Ala Leu Leu Ala Tyr

165 170 175

Gly Leu Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Asp Ala Leu His Pro Tyr Gly

180 185 190

Tyr Ser Lys Glu Arg Phe Val Trp Ser Leu Ile Ser Ala Val Gly Ile

195 200 205

Phe Cys Leu Gly Ser Gly Ala Thr Ile Val His Gly Val Gln Asn Leu

210 215 220

Trp Asn Ser His Pro Pro Glu Asn Ile His Trp Ala Ala Leu Val Ile

225 230 235 240

Gly Gly Ser Phe Leu Ile Glu Gly Ala Ser Leu Leu Val Ala Ile Lys

245 250 255

Ala Val Arg Lys Gly Ala Glu Ala Glu Gly Met Ser Ile Trp Asp Tyr

260 265 270

Ile Trp Arg Gly His Asp Pro Thr Ser Val Ala Val Met Thr Glu Asp

275 280 285

Gly Ala Ala Val Thr Gly Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ser Leu Val Ala

290 295 300

Val Gln Met Thr Gly Asn Ala Met Tyr Asp Pro Ile Gly Ser Ile Ile

305 310 315 320

Val Gly Asn Leu Leu Gly Met Val Ala Ile Phe Leu Ile Gln Arg Asn

325 330 335

Arg His Ala Leu Ile Gly Arg Ala Ile Asp Asp His Asp Met Gln Arg

340 345 350

Val Leu Glu Phe Leu Lys Ser Asp Pro Val Val Asp Ala Leu Tyr Asp

355 360 365

Cys Lys Ser Glu Val Ile Gly Pro Gly Phe Phe Arg Phe Lys Ala Glu

370 375 380

Ile Asp Phe Asn Gly Val Val Leu Val Gln Asn Tyr Leu Glu Arg Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Ser Trp Ala Lys Gln Phe Arg Glu Ala Ala Met Ser Lys

405 410 415

Asp Asp Thr Glu Leu Leu Arg Val Met Ala Asn Tyr Gly Glu Asp Val

420 425 430

Val Glu Ala Leu Gly Tyr Glu Val Asp Arg Leu Glu Ser Glu Ile Gln

435 440 445

Lys Leu Val Pro Gly Ile Lys His Val Asp Ile Glu Ala His Asn Pro

450 455 460

Glu Gly Leu Ala Leu Arg Ala Glu Val Leu

465 470

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

attggaagga tctgcgtgac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cagctggtgg actgcatcta 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cctagcattt acgcggagga g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ctggtccgag gtctcgtctt c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gggacaaaag aagaagcaga g 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gaaatgggac agagacagac aat 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gagataagct tcgccctgta cctc 24

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ctcatcgcga tctcccagtc 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

agttagcatc ttcattcctt ggt 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

tgacaacagt aagggcgacg 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gcattcaaac gcccataaaa gc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

acggtaagtg atagtgtggt gt 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

catttgggca ttagcataac acag 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

agtgtcggtt actgagcttt ct 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ttctgcggtt gactctccac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

tagcgctacc aagagcaacc 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

aagcgacagt tggtttcagt tttc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

agttgcatga ccttgtcaac cttt 24

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

ctgggcatac aaagctcaca 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

tgcataaacc gtttccacaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

atgtgacaag tttggccggg 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

acccacatgg gttttcctcc t 21

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

agcacctaac agacaacagg att 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

tggtgggtcc ttcctaattg aag 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

acaacaaatc actgcagaag atct 24

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

acggtaactt ttcccctcta tcg 23

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

atgaattcgg taccgagctc atgcgtcgtc ccctcgc 37

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

cccatggctc tagagagctc acacatcccc agtaaatt 38

Claims (10)

1.一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1，其特征在于，其位于2号染色体上，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因ZmQK1，其特征在于，编码一个叶绿体、线粒体定位的MTP家族蛋白MTPC4。

3.根据权利要求2所述的基因ZmQK1，其特征在于，所述蛋白MTPC4的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

4.一种玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1的突变体，其特征在于，包括突变体qk1，qk1-1，qk1-2，qk1-3，qk1-4，qk1-5，qk1-6，分别在3-10号外显子上存在G>A的变异。

5.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于，突变体的ZmQK1在4号外显子上存在一个G>A的变异，编码氨基酸由甘氨酸转变为天冬氨酸。

6.含有权利要求1-3任一权利要求所述的玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1的表达载体。

7.根据权利要求1-3所述的基因ZmQK1的定位及克隆过程中涉及到的所有引物。

8.权利要求1-3任一权利要求所述的玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1在控制植株淀粉合成中的应用。

9.权利要求1-3任一权利要求所述的玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1在经济作物育种改良领域中的应用。

10.权利要求1-3任一权利要求所述的玉米种子铁营养强化及灌浆调控基因ZmQK1在种子铁含量及铁营养强化中的应用。

Images