CN111996177A

CN111996177A - 一种玉米waxy基因突变体及其分子标记和应用

Info

Publication number: CN111996177A
Application number: CN202010825290.9A
Authority: CN
Inventors: 骆美洁; 赵久然; 赵衍鑫; 卢柏山; 史亚兴; 张云霞
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN111996177B

Abstract

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种玉米waxy基因突变体及其分子标记和应用。本发明提供玉米WAXY蛋白突变体，其相对于野生型WAXY蛋白包含在第125位氨基酸后插入如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的突变，导致蛋白翻译提前终止。本发明还提供玉米waxy基因突变体，其相对于野生型waxy基因包含在第3个外显子的第43位核苷酸后插入如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的突变。本发明提供的WAXY蛋白突变体和waxy基因突变体可使得玉米籽粒的支链淀粉含量显著提高，籽粒呈现糯质性状。本发明还提供waxy基因突变体的分子标记，可实现糯玉米的苗期选择，极大地缩短了育种周期。

Description

一种玉米waxy基因突变体及其分子标记和应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种玉米waxy基因突变体及其分子标记和应用。

背景技术

玉米等谷物的籽粒中富含淀粉，淀粉的含量和组成(例如：直链淀粉和支链淀粉的含量)是影响谷物的营养价值、加工品质和经济价值的重要因素。糯玉米又称粘玉米，具有很高的营养、加工和经济价值。糯玉米籽粒胚乳中含有接近100％的支链淀粉，故而具有粘性。糯玉米在亚洲地区主要被作为食物消费，同时也是纺织和造纸工业的重要原料。糯玉米起源于中国，并于1908年被美国人Collins引入到美国，随后传播到世界各地。

玉米糯质性受waxy单基因隐性突变控制，该基因编码直链淀粉合成所必需的颗粒结合淀粉合成酶(GBSSI)。普通玉米waxy基因全长3.93kb，位于9号染色体上，由14个外显子组成。DNA序列的插入和缺失是造成玉米waxy基因突变的主要原因。在中国糯玉米中，主要存在wx-D7和wx-D10(分别为第7外显子的30bp缺失突变和第10外显子的15bp缺失突变)两种突变类型。此外研究人员还鉴定到3种转座子插入所造成的突变，它们分别为wx-Cin4(Cin4反转座子插入到第6个外显子)、wx-124(MITE转座子插入到第7外显子)和wx-Reina(Reina反转座子插入到第10个内含子)。除以上5种突变类型外，糯玉米种质仍可能存在未知的新的waxy基因突变类型，其中可能包含一些低频waxy基因突变类型，这些稀有的waxy基因突变在糯玉米种质选育和保存过程中容易丢失。因此，发掘新的waxy基因突变体并开发其分子标记，将为针对性地筛选、鉴定和选育糯玉米种质提供了有效方法，对于保护和利用珍稀糯玉米种质具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米waxy基因突变体及其蛋白突变体，本发明的另一目的是提供该基因突变体的分子标记。

为实现上述目的，本发明对糯玉米种质资源进行了大量的序列分析、遗传和性状研究，具体地，从玉米种质资源库中收集200份糯玉米自交系种质，利用4对引物对waxy基因从第1个外显子到第14个外显子区段进行PCR扩增，测序分析发现，200个糯玉米自交系种质中，有8份玉米材料携带一种新的waxy基因等位突变，将该新的waxy基因突变类型命名为wx-hAT。wx-hAT的具体特征为：waxy基因的第3个外显子的第43位核苷酸后面存在2286bp的hAT类转座子插入突变。cDNA序列分析发现2.2kb插入片段中有1179bp在wx-hAT类型糯玉米waxy基因转录过程中被外显子化，导致蛋白翻译提前终止，蛋白的氨基酸序列发生改变。支链淀粉含量测定结果表明这8份糯玉米籽粒中的支链淀粉含量均高于94.5％，颗粒结合淀粉合成酶活性显著低于普通玉米，这些表型特征均与对照糯玉米类似。进一步基于wx-hAT类型糯玉米和普通玉米在waxy基因第3个外显子的序列差异，开发位点特异性PCR功能分子标记PCR-hAT，该功能分子标记的特征为：在waxy基因wx-hAT纯合突变的玉米材料中，PCR扩增片段大小为608bp；在waxy基因野生型材料中的扩增片段大小为884bp；而在杂合型的玉米中可同时扩增出608bp和884bp片段。

基于上述发现，本发明提供以下技术方案：

本发明提供玉米WAXY蛋白突变体，以玉米野生型WAXY蛋白的氨基酸序列为参考序列，该WAXY蛋白突变体相对于野生型WAXY蛋白包含在第125位氨基酸后插入如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的突变。

以上所述的玉米野生型WAXY蛋白，对于玉米自交系B73，WAXY蛋白的登录号为Zm00001d045462(MaizeGDB，https://www.maizegdb.org)。

SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中含有终止密码子，因此SEQ ID NO.1所示的氨基酸的插入导致WAXY蛋白的翻译提前终止。

具体地，所玉米WAXY蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于上述蛋白突变体，本发明进一步提供玉米waxy基因突变体，该基因突变体可为cDNA或基因组DNA序列。对于cDNA，以玉米野生型waxy的cDNA序列为参考序列，该waxy基因突变体相对于玉米野生型waxy基因的cDNA包含在起始密码子下游第376位后插入如SEQID NO.3所示的核苷酸序列的突变。对于基因组DNA，以玉米野生型waxy基因的基因组DNA核苷酸序列为参考序列，所述waxy基因突变体相对于野生型waxy基因的基因组DNA包含在第3个外显子的第43位核苷酸后插入如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的突变。

以上所述的野生型waxy基因，对于玉米自交系B73，waxy基因的登录号为Zm00001d045462(MaizeGDB，https://www.maizegdb.org)。

具体地，所述waxy基因突变体的起始密码子至第3个外显子的终点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

其中，SEQ ID NO.5所示的序列为突变体cDNA的起始密码子至第3个外显子的终点。SEQ ID NO.6所示序列为突变体基因组DNA的起始密码子至第3个外显子的终点。

以上所述的蛋白突变体可由所述基因突变体编码得到。

本发明还提供含有所述基因突变体的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。

上述表达盒可为将所述基因突变体与调控其转录或表达的元件连接得到的DNA片段。

上述载体可为克隆载体或表达载体。

上述宿主细胞可为微生物细胞或非繁殖性植物细胞。

本发明还提供包含所述基因突变体的玉米。

本发明还提供与玉米糯性相关的InDel分子标记，其为包含如SEQ ID NO.4所示序列的DNA片段，或为包含如SEQ ID NO.19所示序列的DNA片段；如SEQ ID NO.4所示序列的插入位置为玉米waxy基因第3个外显子的第43位核苷酸之后。

本发明还提供与玉米糯性相关的InDel分子标记，其为由SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示的引物扩增得到的DNA片段。

以上所述的InDel分子标记可用于检测所述waxy基因突变体。

本发明还提供用于检测以上所述的分子标记的引物组合，该引物组合包括SEQ IDNO.7-9所示的引物。

本发明提供所述玉米WAXY蛋白突变体或所述waxy基因突变体或含有waxy基因突变体的生物材料或所述分子标记或所述引物组合的如下任一种应用：

(1)在提高玉米籽粒的支链淀粉含量中的应用；

(2)在降低玉米籽粒的直链淀粉含量中的应用；

(3)在糯玉米遗传育种中的应用；

(4)在制备糯玉米中的应用；

(5)在鉴定或筛选糯玉米或其种质资源中的应用。

本发明提供一种制备糯玉米的方法，其为使玉米表达所述玉米WAXY蛋白突变体。

以上所述的方法可通过杂交、回交、自交的方法使玉米表达WAXY蛋白突变体。

本发明还提供一种鉴定糯玉米的方法，以待测玉米的DNA为模板，利用SEQ IDNO.7-9所示的引物组合进行PCR扩增，若PCR扩增片段大小为608bp，则待测玉米为所述waxy基因突变体的纯合基因型，鉴定为糯玉米；若扩增片段大小为884bp，则待测玉米不表达所述waxy基因突变体；若PCR扩增片段大小为608bp和884bp，则待测玉米为所述waxy基因突变体的杂合基因型。

本发明的有益效果在于：本发明提供了新的WAXY蛋白突变体以及waxy基因突变体wx-hAT，该突变体可使得玉米的颗粒结合淀粉合成酶活性显著降低，籽粒的支链淀粉含量显著提高，籽粒呈现糯质性状。

本发明还提供了与玉米糯性相关的InDel分子标记，该分子标记可用于携带wx-hAT突变的糯玉米种质的鉴别和育种，在早期(苗期)实现wx-hAT糯玉米的分子标记辅助选择，大大缩短了鉴别和育种进程，提高了育种效率，且该分子标记以DNA的形式表现，在玉米的各个组织中均存在，取材便利，适于推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用E1-4F/R引物对8个wx-hAT糯玉米自交系和3个普通玉米自交系waxy基因的第1个外显子到第4个外显子进行PCR扩增的电泳检测结果。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。M：DNA marker 5000。泳道1-9分别为SKN5,YN1M,HN2，80482,SKN6，SKN6，JN1，JN2和16-585，均为wx-hAT类型糯玉米自交系。泳道10-12分别为京2416，京464和MC01，均为普通玉米自交系。

图2为本发明实施例2中利用waxycDNAF2和WaxycDNAR2引物对wx-hAT类型糯玉米自交系HN2和普通玉米自交系B73中waxy基因cDNA扩增电泳检测。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。M：DNA marker 2000。泳道1和2分别为wx-hAT类型糯玉米自交系HN2和普通玉米自交系B73。

图3为本发明实施例2中wx-hAT类型糯玉米HN2中waxy基因的转录本。普通玉米waxy基因转录本包括14个外显子，在wx-hAT类型糯玉米HN2中，第3个外显子处插入的2.2kb片段中的1179bp被外显子化。箭头为扩增引物位置。

图4为本发明实施例3中用PCR-hAT标记的E1-4Fb，E1-4Rb和WaxyF2引物对wx-hAT类型糯玉米HN2，普通玉米自交系B73，及其杂交种的waxy基因DNA扩增电泳检测。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。M：DNA marker 2000。泳道1-3分别为普通玉米自交系B73,HN2×B73和wx-hAT类型糯玉米自交系HN2。

图5为本发明实施例3中PCR-hAT功能分子标记对6个wx-hAT糯玉米自交系及其与普通玉米B73的杂交种，以及3个普通玉米自交系waxy基因分型检测。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。M：DNA marker 2000。泳道1-6分别为SKN5,JN1,HN2,YN1M,16-585,80482。泳道7-12分别为SKN5×B73,JN1×B73,HN2×B73,YN1M×B73,16-585×B73,80482×B73。泳道13-15分别为京2416,MC01,京464。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1玉米waxy基因突变体wx-hAT的获得

从北京市农林科学院玉米研究中心玉米种质资源库收集200份糯玉米自交系种质，利用TianGen公司的植物DNA提取试剂盒提取玉米叶片DNA，利用4对引物(表1)对waxy基因从第1个外显子到第14个外显子区段进行扩增，测序分析发现，200个糯玉米自交系种质中，有8份玉米材料携带一种新的waxy基因等位突变。用E1-4F/R引物对这8份材料waxy基因的第1个外显子到第4个外显子进行PCR扩增。PCR扩增条件为:94℃、5min，然后94℃、60s,59℃、60s,72℃、2min进行34个循环，最后72℃延伸10min。电泳检测发现普通玉米中扩增片段大小为884bp，而这8份糯玉米材料中扩增片段大小为3.17kb(图1)。测序分析发现，这8份糯玉米材料中waxy基因的第3个外显子的第43个核苷酸后面存在2286bp插入突变，这是一种新的waxy基因突变类型。CENSOR软件(https://www.girinst.org/censor/index.php)分析发现，该2.2kb插入序列的第813bp到第1558bp属于hAT类转座子，故将该新的waxy基因突变体命名为wx-hAT。玉米waxy基因突变体的基因组DNA的起始密码子至第3个外显子的终点的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

表1 waxy基因扩增引物信息

利用Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/search/sequence)分析waxy基因的保守结构域，结果发现2.2kb的插入突变位于waxy基因的淀粉合成酶催化结构域内。用直链淀粉/支链淀粉检测试剂盒(Megazyme,Wicklow,Ireland)测定8份wx-hAT类型玉米(SKN5、SKN6、JN1、HN2、YN1M、JN2、16-585和80482)籽粒支链淀粉含量，结果表明这8份糯玉米籽粒中支链淀粉含量都很高(>94.5％)，显著高于普通玉米(郑58和京92)，并且与对照糯玉米(J6、JBN2、JKN1和JKNS5)的支链淀粉含量类似(表2)。用GBSS检测试剂盒(Ziker，深圳，中国)测定这些玉米籽粒中的GBSS酶活性，结果如表3所示，8份wx-hAT类型玉米的GBSS酶活性为19.9-28.1nmol/min/g，显著低于普通玉米(66.7-79.3nmol/min/g)。这些结果表明8份wx-hAT类型玉米waxy基因功能缺失与waxy基因的第3个外显子中的2.2kb插入有关，该插入突变导致玉米籽粒直链淀粉合成受阻，支链淀粉大量积累。

表2支链淀粉含量分析结果

表3 GBSS酶活性测定结果

实施例2玉米waxy基因突变体wx-hAT的cDNA序列分析

用Trizol法提取实施例1获得的wx-hAT类型糯玉米叶片RNA，用反转录试剂盒(Takara)将RNA反转录成cDNA。用waxycDNAF2和WaxycDNAR2引物对cDNA序列进行扩增(表4)。PCR扩增条件为：94℃、5min，然后94℃、60s,56℃、60s,72℃、2min进行38个循环，最后72℃延伸10min。电泳检测发现普通玉米自交系B73中扩增片段大小为163bp，而在wx-hAT类型糯玉米HN2中扩增片段大小为1342bp(图2)。测序分析发现2.2kb插入片段中有1179bp在wx-hAT类型糯玉米中被外显子化(图3)，被外显子化的序列中含有终止密码子，导致插入后蛋白的翻译提前终止。该结果进一步证实wx-hAT类型玉米waxy基因功能缺失与waxy基因的第三外显子中的2.2kb插入有关。玉米waxy基因突变体cDNA的起始密码子至第3个外显子的终点的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

表4 cDNA扩增引物信息

实施例3玉米waxy基因突变体wx-hAT的特异性功能分子标记的开发及其应用

基于wx-hAT类型糯玉米和普通玉米在waxy基因第3个外显子的序列差异，开发位点特异性PCR功能分子标记PCR-hAT，该分子标记的扩增引物信息见表5。

利用上述分子标记PCR-hAT的扩增引物进行PCR扩增的条件为：94℃、5min，然后94℃、60s,60℃、60s,72℃、2min进行34个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

表5功能分子标记PCR-hAT的引物信息

利用该分子标记的E1-4F，E1-4R和WaxyF2引物，在wx-hAT类型糯玉米HN2中的扩增片段大小为608bp，普通玉米自交系B73中的扩增片段大小为884bp，而在B73×HN2杂交种中可同时扩增出608bp和884bp(图4)。

用所开发的PCR-hAT功能分子标记对6个wx-hAT糯玉米自交系(SKN5,JN1,HN2,YN1M,16-585,80482)及其与普通玉米B73的杂交种(SKN5×B73,JN1×B73,HN2×B73,YN1M×B73,16-585×495B73,80482×B73)和3个普通玉米自交系(京2416,MC01,京464)进行基因分型检测。PCR扩增结果显示：6个wx-hAT糯玉米自交系均仅扩增出608bp的片段，3个普通米自交系均仅扩增出884bp的片段，而在杂交种中同时扩增出608bp和884bp(图5)。以上结果表明该PCR功能分子标记可以将携带wx-hAT纯合突变型，杂合型和野生型waxy基因的玉米材料区分开。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种玉米waxy基因突变体及其分子标记和应用

<130> KHP201114686.9

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Tyr Lys Gln Gly Arg Ile Tyr Arg Val Cys Arg Val Gly His Gly

1 5 10 15

Ile Pro Cys Arg Leu Gly Pro Asn

20

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Leu Ala Thr Ser Gln Leu Val Ala Thr Arg Ala Gly Leu

1 5 10 15

Gly Val Pro Asp Ala Ser Thr Phe Arg Arg Gly Ala Ala Gln Gly Leu

20 25 30

Arg Gly Gly Arg Thr Ala Ser Ala Ala Asp Thr Leu Ser Met Arg Thr

35 40 45

Ser Ala Arg Ala Ala Pro Arg Leu Gln His Gln Gln Gln Gln Gln Ala

50 55 60

Arg Arg Gly Ala Arg Phe Pro Ser Leu Val Val Cys Ala Ser Ala Gly

65 70 75 80

Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser Lys Thr

85 90 95

Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met Ala Ala

100 105 110

Asn Gly His Arg Val Met Val Val Ser Pro Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys

115 120 125

Gln Gly Arg Ile Tyr Arg Val Cys Arg Val Gly His Gly Ile Pro Cys

130 135 140

Arg Leu Gly Pro Asn

145

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtacaagca ggggcggatc tacagggtat gccgggtggg ccacggcata ccctgtagat 60

taggcccaaa ctagcccata tatgaagaaa aataaaaaaa gtccagcttg tattggttcc 120

agacgtgggc gattaggcgt aggctaagct gcgaagcctt gggttcgtcc ggatttccgt 180

tccgtccgct cgtctttctg tttctgccgc cgccgagcgc cgtgtctgtt catgctaatc 240

tgactgccgc cgaccgccgc caagcgccaa gtctgctcat cttcatctac tgccggctgc 300

ctgccgccgc cgattgggct cgttgtttgg tctttgggct ttggcagcct gtcagtggct 360

gaactatgaa gaggaatagc gatattgcat cactttttca aaaacatgca gcaaagaagg 420

ctgctgctgc ttcatctcct tcgcctgcgg ctcaagagaa agagacaata gtggaaaaaa 480

ttatggatcc tatatcgcct cctattcctt cggttccact tgataatgtc tcaccaccgc 540

cacaatcagc cccaccagta tatgatatta atcgtcttcc acaagatcca ggtgaaagac 600

aggctattca aagctatgat gttaacgatc aagatgcaat tcgaagatca tatattctca 660

aaggtccatt gcaaccatat gcacatgatt ttccaaagag gaaaattggg aatagagatc 720

gtcaattcaa ttttgtatgg tttgcaaatc atcattggct tgaatatagt attaaaaagg 780

atgacgtgtt ttgctttgta tgctacttgt tcagagataa caaatgtaag ggcaagggtg 840

cagatacatt cattacagat ggttggagaa attggaatat aggaaataaa gccttactga 900

aacatgtggg ttctagtgca cacaaagcag ctcaagagag atacaatggc tttgtgaatc 960

ctactgcagc aattgattat cacattgaga aatggagtga tgaggatctt cgtctttata 1020

agatcagcaa atagtgaaga agtgaataag tatgttttga agaatgctcc agattgatga 1080

agatgatata atcaagaatt ttatggccat tagaaggcgc cgaccaaaca agaaggataa 1140

gaagtgatta tatattgatc tactacagat ccgccactg 1179

<210> 4

<211> 2286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtacaagca ggggcggatc tacagggtat gccgggtggg ccacggcata ccctgtagat 60

taggcccaaa ctagcccata tatgaagaaa aataaaaaaa gtccagcttg tattggttcc 120

agacgtgggc gattaggcgt aggctaagct gcgaagcctt gggttcgtcc ggatttccgt 180

tccgtccgct cgtctttctg tttctgccgc cgccgagcgc cgtgtctgtt catgctaatc 240

tgactgccgc cgaccgccgc caagcgccaa gtctgctcat cttcatctac tgccggctgc 300

ctgccgccgc cgattgggct cgttgtttgg tctttgggct ttggcagcct gtcaggtact 360

atactaccgt attatttgat tacttatttc tttatgactt tattggcttg caaataaatt 420

acgtgatgcc aaaaaatagt ttacaattag tttcatgtgt ggttcgtata tagcatatga 480

gtacagagta ctatacgcct atactactag taccaaatga tatatatata ttagaaacaa 540

atataattgc tactttgcta gttagatatt aaagaactgt ttgttgatgc gctgattttt 600

tttacagtgg ctgaactatg aagaggaata gcgatattgc atcacttttt caaaaacatg 660

cagcaaagaa ggctgctgct gcttcatctc cttcgcctgc ggctcaagag aaagagacaa 720

tagtggaaaa aattatggat cctatatcgc ctcctattcc ttcggttcca cttgataatg 780

tctcaccacc gccacaatca gccccaccag tatatgatat taatcgtctt ccacaagatc 840

caggtgaaag acaggctatt caaagctatg atgttaacga tcaagatgca attcgaagat 900

catatattct caaaggtcca ttgcaaccat atgcacatga ttttccaaag aggaaaattg 960

ggaatagaga tcgtcaattc aattttgtat ggtttgcaaa tcatcattgg cttgaatata 1020

gtattaaaaa ggatgacgtg ttttgctttg tatgctactt gttcagagat aacaaatgta 1080

agggcaaggg tgcagataca ttcattacag atggttggag aaattggaat ataggaaata 1140

aagccttact gaaacatgtg ggttctagtg cacacaaagc agctcaagag agatacaatg 1200

gctttgtgaa tcctactgca gcaattgatt atcacattga gaaatggagt gatgaggatc 1260

ttcgtcttta taagatcagg ttgacttatt cacttaaatg tttaaagttt cttttgcatc 1320

aaggattggc atttcgtgga catgatgaaa gtgaagagtc tagcaacaga ggtaacttcc 1380

ttgagctttt gaaatttctt gcagcaaata gtgaagaagt gaataagtat gttttgaaga 1440

atgctccagg taattgcacc ctaacttgcc cggatataca aaagcaaatt attcaatgtt 1500

gtgccataga aactagaaaa aaaattattg aagaacttgg tgatgagcac tatgcaatcc 1560

agttactttc ttgtatgtca gccttcaacc cgatcaattc atttgcttcc tttgatgccc 1620

aaaagatacg taggcttgct gagttctatc ctaatgacat catctcaaat gccaatttgc 1680

aaaagcttga gttgcaactt gataactata ttgatgacat aagacaagat gatagcttca 1740

aaagcctagg gaatcttgtt gatctctcag ttaagctcgt tgaaacaaag agacatatag 1800

tttatgattt ggtttacgtg cttctcaaat tagtattgct tctacctgtg gcaacagcta 1860

gtgttgagag ggtattttct gcaatgagtt tagtcaaaag taagttaaga aataagatgg 1920

gtgatagtct tttggatgat tgtcttgtca cgttcattga gagagatatt tttttcaaga 1980

ttgatgaaga tgatataatc aagaatttta tggccattag aaggcgccga ccaaacaaga 2040

aggataagaa gtgattatat attgatctac tacaggtgtg caatcttatt ttatgcacgt 2100

tttagattaa atatgttcaa actccactta tattgtaatt tgtgctggtt tctagctatt 2160

ttatatatgt gtaccgaatt gattggcaat ttgaagttat ctaccgattt tttatctgtt 2220

tttttaaatt gtatatgaaa atattagctc ggcatactct aacttaaaat cctagatccg 2280

ccactg 2286

<210> 5

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcggctc tagccacgtc gcagctcgtc gcaacgcgcg ccggcctggg cgtcccggac 60

gcgtccacgt tccgccgcgg cgccgcgcag ggcctgaggg ggggccggac ggcgtcggcg 120

gcggacacgc tcagcatgcg gaccagcgcg cgcgcggcgc ccaggctcca gcaccagcag 180

cagcagcagg cgcgccgcgg ggccaggttc ccgtcgctcg tcgtgtgcgc cagcgccggc 240

atgaacgtcg tcttcgtcgg cgccgagatg gcgccgtgga gcaagaccgg cggcctcggc 300

gacgtcctcg gcggcctgcc gccggccatg gccgcgaacg ggcaccgtgt catggtcgtc 360

tctccccgct acgaccagta caagcagggg cggatctaca gggtatgccg ggtgggccac 420

ggcataccct gtagattagg cccaaactag cccatatatg aagaaaaata aaaaaagtcc 480

agcttgtatt ggttccagac gtgggcgatt aggcgtaggc taagctgcga agccttgggt 540

tcgtccggat ttccgttccg tccgctcgtc tttctgtttc tgccgccgcc gagcgccgtg 600

tctgttcatg ctaatctgac tgccgccgac cgccgccaag cgccaagtct gctcatcttc 660

atctactgcc ggctgcctgc cgccgccgat tgggctcgtt gtttggtctt tgggctttgg 720

cagcctgtca gtggctgaac tatgaagagg aatagcgata ttgcatcact ttttcaaaaa 780

catgcagcaa agaaggctgc tgctgcttca tctccttcgc ctgcggctca agagaaagag 840

acaatagtgg aaaaaattat ggatcctata tcgcctccta ttccttcggt tccacttgat 900

aatgtctcac caccgccaca atcagcccca ccagtatatg atattaatcg tcttccacaa 960

gatccaggtg aaagacaggc tattcaaagc tatgatgtta acgatcaaga tgcaattcga 1020

agatcatata ttctcaaagg tccattgcaa ccatatgcac atgattttcc aaagaggaaa 1080

attgggaata gagatcgtca attcaatttt gtatggtttg caaatcatca ttggcttgaa 1140

tatagtatta aaaaggatga cgtgttttgc tttgtatgct acttgttcag agataacaaa 1200

tgtaagggca agggtgcaga tacattcatt acagatggtt ggagaaattg gaatatagga 1260

aataaagcct tactgaaaca tgtgggttct agtgcacaca aagcagctca agagagatac 1320

aatggctttg tgaatcctac tgcagcaatt gattatcaca ttgagaaatg gagtgatgag 1380

gatcttcgtc tttataagat cagcaaatag tgaagaagtg aataagtatg ttttgaagaa 1440

tgctccagat tgatgaagat gatataatca agaattttat ggccattaga aggcgccgac 1500

caaacaagaa ggataagaag tgattatata ttgatctact acagatccgc cactgagtac 1560

aaggacgcct gggacaccag cgtcgtgtcc gag 1593

<210> 6

<211> 2831

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcggctc tagccacgtc gcagctcgtc gcaacgcgcg ccggcctggg cgtcccggac 60

gcgtccacgt tccgccgcgg cgccgcgcag ggcctgaggg ggggccggac ggcgtcggcg 120

gcggacacgc tcagcatgcg gaccagcgcg cgcgcggcgc ccaggctcca gcaccagcag 180

cagcagcagg cgcgccgcgg ggccaggttc ccgtcgctcg tcgtgtgcgc cagcgccggc 240

atgaacgtcg tcttcgtcgg cgccgagatg gcgccgtgga gcaagaccgg cggcctcggc 300

gacgtcctcg gcggcctgcc gccggccatg gccgtaagcg cgcgcaccga gacatgcatc 360

cgttggatcg cgtcttcttc gtgctcttgc cgcgtgcatg atgcatgtgt ttcctcctgg 420

cttgtgttcg tgtatgtgac gtgtttgttc gggcatgcat gcaggcgaac gggcaccgtg 480

tcatggtcgt ctctccccgc tacgaccagt acaagcaggg gcggatctac agggtatgcc 540

gggtgggcca cggcataccc tgtagattag gcccaaacta gcccatatat gaagaaaaat 600

aaaaaaagtc cagcttgtat tggttccaga cgtgggcgat taggcgtagg ctaagctgcg 660

aagccttggg ttcgtccgga tttccgttcc gtccgctcgt ctttctgttt ctgccgccgc 720

cgagcgccgt gtctgttcat gctaatctga ctgccgccga ccgccgccaa gcgccaagtc 780

tgctcatctt catctactgc cggctgcctg ccgccgccga ttgggctcgt tgtttggtct 840

ttgggctttg gcagcctgtc aggtactata ctaccgtatt atttgattac ttatttcttt 900

atgactttat tggcttgcaa ataaattacg tgatgccaaa aaatagttta caattagttt 960

catgtgtggt tcgtatatag catatgagta cagagtacta tacgcctata ctactagtac 1020

caaatgatat atatatatta gaaacaaata taattgctac tttgctagtt agatattaaa 1080

gaactgtttg ttgatgcgct gatttttttt acagtggctg aactatgaag aggaatagcg 1140

atattgcatc actttttcaa aaacatgcag caaagaaggc tgctgctgct tcatctcctt 1200

cgcctgcggc tcaagagaaa gagacaatag tggaaaaaat tatggatcct atatcgcctc 1260

ctattccttc ggttccactt gataatgtct caccaccgcc acaatcagcc ccaccagtat 1320

atgatattaa tcgtcttcca caagatccag gtgaaagaca ggctattcaa agctatgatg 1380

ttaacgatca agatgcaatt cgaagatcat atattctcaa aggtccattg caaccatatg 1440

cacatgattt tccaaagagg aaaattggga atagagatcg tcaattcaat tttgtatggt 1500

ttgcaaatca tcattggctt gaatatagta ttaaaaagga tgacgtgttt tgctttgtat 1560

gctacttgtt cagagataac aaatgtaagg gcaagggtgc agatacattc attacagatg 1620

gttggagaaa ttggaatata ggaaataaag ccttactgaa acatgtgggt tctagtgcac 1680

acaaagcagc tcaagagaga tacaatggct ttgtgaatcc tactgcagca attgattatc 1740

acattgagaa atggagtgat gaggatcttc gtctttataa gatcaggttg acttattcac 1800

ttaaatgttt aaagtttctt ttgcatcaag gattggcatt tcgtggacat gatgaaagtg 1860

aagagtctag caacagaggt aacttccttg agcttttgaa atttcttgca gcaaatagtg 1920

aagaagtgaa taagtatgtt ttgaagaatg ctccaggtaa ttgcacccta acttgcccgg 1980

atatacaaaa gcaaattatt caatgttgtg ccatagaaac tagaaaaaaa attattgaag 2040

aacttggtga tgagcactat gcaatccagt tactttcttg tatgtcagcc ttcaacccga 2100

tcaattcatt tgcttccttt gatgcccaaa agatacgtag gcttgctgag ttctatccta 2160

atgacatcat ctcaaatgcc aatttgcaaa agcttgagtt gcaacttgat aactatattg 2220

atgacataag acaagatgat agcttcaaaa gcctagggaa tcttgttgat ctctcagtta 2280

agctcgttga aacaaagaga catatagttt atgatttggt ttacgtgctt ctcaaattag 2340

tattgcttct acctgtggca acagctagtg ttgagagggt attttctgca atgagtttag 2400

tcaaaagtaa gttaagaaat aagatgggtg atagtctttt ggatgattgt cttgtcacgt 2460

tcattgagag agatattttt ttcaagattg atgaagatga tataatcaag aattttatgg 2520

ccattagaag gcgccgacca aacaagaagg ataagaagtg attatatatt gatctactac 2580

aggtgtgcaa tcttatttta tgcacgtttt agattaaata tgttcaaact ccacttatat 2640

tgtaatttgt gctggtttct agctatttta tatatgtgta ccgaattgat tggcaatttg 2700

aagttatcta ccgatttttt atctgttttt ttaaattgta tatgaaaata ttagctcggc 2760

atactctaac ttaaaatcct agatccgcca ctgagtacaa ggacgcctgg gacaccagcg 2820

tcgtgtccga g 2831

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaagtgtac tgctccgtcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaacctgac cgtctcgtac 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtattgctt ctacctgtgg ca 22

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacgagacgg tcaggttc 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtaggagat gttgtggat 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatttcatcg acgggtctgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tctgtccctc tcgtcaggat 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atcctgacga gagggacaga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caccgaacag cagggattat 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agtattgctt ctacctgtgg ca 22

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccgtgtcatg gtcgtctct 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caggaacagt gggtggtcaa 20

<210> 19

<211> 608

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agtattgctt ctacctgtgg caacagctag tgttgagagg gtattttctg caatgagttt 60

agtcaaaagt aagttaagaa ataagatggg tgatagtctt ttggatgatt gtcttgtcac 120

gttcattgag agagatattt ttttcaagat tgatgaagat gatataatca agaattttat 180

ggccattaga aggcgccgac caaacaagaa ggataagaag tgattatata ttgatctact 240

acaggtgtgc aatcttattt tatgcacgtt ttagattaaa tatgttcaaa ctccacttat 300

attgtaattt gtgctggttt ctagctattt tatatatgtg taccgaattg attggcaatt 360

tgaagttatc taccgatttt ttatctgttt ttttaaattg tatatgaaaa tattagctcg 420

gcatactcta acttaaaatc ctagatccgc cactgagtac aaggacgcct gggacaccag 480

cgtcgtgtcc gaggtacggc caccgagacc agattcagat cacagtcaca cacaccgtca 540

tatgaacctt tctctgctct gatgcctgca gatcaagatg ggagacaggt acgagacggt 600

caggttct 608

Claims

1.玉米WAXY蛋白突变体，其特征在于，以玉米野生型WAXY蛋白的氨基酸序列为参考序列，所述WAXY蛋白突变体相对于野生型WAXY蛋白包含在第125位氨基酸后插入如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列的突变。

2.根据权利要求1所述的蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.玉米waxy基因突变体，其特征在于，以玉米野生型waxy的cDNA序列为参考序列，所述waxy基因突变体相对于玉米野生型waxy基因的cDNA包含在起始密码子下游第376位后插入如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的突变，

或者，以玉米野生型waxy基因的基因组DNA序列为参考序列，所述waxy基因突变体相对于野生型waxy基因的基因组DNA包含在第3个外显子的第43位核苷酸后插入如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的突变。

4.根据权利要求3所述的基因突变体，其特征在于，所述waxy基因突变体的起始密码子至第3个外显子的终点的序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

5.含有权利要求3或4所述的基因突变体的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。

6.与玉米糯性相关的InDel分子标记，其特征在于，其为包含如SEQ ID NO.4所示序列的DNA片段，或为包含如SEQ ID NO.19所示序列的DNA片段；如SEQ ID NO.4所示序列的插入位置为玉米waxy基因第3个外显子的第43位核苷酸之后。

7.用于扩增权利要求6所述的分子标记的引物组合，其特征在于，包括SEQ ID NO.7-9所示的引物。

8.权利要求1或2所述的蛋白突变体或权利要求3或4所述的基因突变体或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的分子标记或权利要求7所述的引物组合的如下任一种应用：

(1)在提高玉米籽粒的支链淀粉含量中的应用；

(2)在降低玉米籽粒的直链淀粉含量中的应用；

(3)在糯玉米遗传育种中的应用；

(4)在制备糯玉米中的应用；

(5)在鉴定或筛选糯玉米或其种质资源中的应用。

9.一种制备糯玉米的方法，其特征在于，使玉米表达权利要求1或2所述的蛋白突变体。

10.一种鉴定糯玉米的方法，其特征在于，以待测玉米的DNA为模板，利用SEQ ID NO.7-9所示的引物组合进行PCR扩增，若PCR扩增片段大小为608bp，则待测玉米为权利要求3或4所述的基因突变体的纯合基因型，鉴定为糯玉米；若扩增片段大小为884bp，则待测玉米不表达权利要求3或4所述的基因突变体；若PCR扩增片段大小为608bp和884bp，则待测玉米为权利要求3或4所述的基因突变体的杂合基因型。